CN118339299A - 基于黄瓜花叶病毒的改良重组载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于黄瓜花叶病毒的改良重组载体。根据一实施例的重组载体可显著增加外源蛋白在植物中的表达效率，并且相对于现有重组载体，外源蛋白表达效率更为显著，因此可广泛应用于多种植物中有用蛋白质的生产及其研究中。
Description
技术领域
本申请要求以2022年11月11日申请的韩国专利申请第10-2022-0150990号及2023年3月23日申请的韩国专利申请第10-2023-0038110号为优先权，所述说明书整体为本申请的参考文献。
本发明涉及一种基于黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)的基因重组载体。
背景技术
当植物病毒感染宿主植物体时，其在几天内引起全身感染，并且利用宿主的成分来增殖自身的基因组。在这种增殖过程中，病毒在植物细胞内大量表达自身的蛋白质。另外，病毒的基因组较小，因此可通过分子生物学操作来调节其基因组结构或基因表达机制。
因此，利用这种植物病毒的特性正积极进行着将其开发成基因转移载体的研究，即以能够使外源基因***及表达的方式操作病毒的基因组结构，但需要持续开发更有效的载体。
在这种背景下，本发明人为了开发适合显著增加靶蛋白的表达水平的载体而努力研究的结果，确认了基于黄瓜花叶病毒的重组载体可显著增加靶蛋白的表达，并完成了本发明。
发明内容
发明要解决的问题
一方面，本发明提供一种黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)重组载体，所述黄瓜花叶病毒重组载体包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸。
另一方面，本发明提供一种转化微生物，所述转化微生物通过所述重组载体转化。
另一方面，本发明提供一种蛋白质生产方法，所述方法包括如下的步骤：制备包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸的黄瓜花叶病毒重组载体；将所述重组载体转化到细菌中；以及将所述转化的细菌接种到植物中。
然而，本发明要解决的问题并不限于如上所述的问题，本领域技术人员可从以下记载中清楚地理解未提及的其他问题。
用于解决问题的手段
一方面，本发明提供一种黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)重组载体，所述黄瓜花叶病毒重组载体包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸。
所述黄瓜花叶病毒重组载体还可包含由SEQ ID NO.2组成的核苷酸，并且还可包含由SEQ ID NO.3组成的核苷酸。尽管不限于此，但所述黄瓜花叶病毒重组载体可包含由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3组成的核苷酸。
所述黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)是一种在韩国辣椒栽培过程中发生频率最高且带来严重危害的病毒，CMV的宿主范围广，其可感染65个属885种植物，并且其是由3个片段基因组组成的正义单链RNA(positive-sense single stranded RNA)病毒。CMV的分离株可按碱基序列分为亚群(subgroup)IA、IB及II，而CMV分离株中，P0型CMV-Fny(CMV-Fny菌株(strain))属于亚群(Subgroup)IA，并且P1型CMV-GTN菌株(CMV-GTN strain)属于亚群IB。在本说明书中，就所述CMV-GTN而言，其是高致病性P1型，并且是指2013年在忠清北道槐山郡的辣椒种植农场培育的辣椒品种“青阳”中纯化分离的(Res.Plant Dis.21(2)：99-102(2015))。
根据一实施例，所述SEQ ID NO.1的核苷酸可包含可操作地连接的多克隆位点(multi-cloning site，MCS)，以能够使外源基因***，为了检测及提取表达的外源蛋白，在MSC后面还可包含2xFLAG标签(tag)及6xHIS标签(tag)。由此，通过所述重组载体制备的蛋白质可在C末端包含2xFLAG标签及6xHIS标签。
在本说明书中，术语“重组载体”作为可在宿主细胞中表达目标外源基因的载体，其是指包含以能使基因***物表达的方式可操作地连接的必要调节元件的载体。合适的载体除了表达调节序列之外(如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号及增强子)，还包含用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，并且可根据其目的，以多种方式制备。
在本说明书中，术语“可操作地连接的”是指需要表达的基因与其调节序列相互结合，以能够表达基因的方式连接。
另一方面，本发明提供一种转化微生物，所述转化微生物通过所述重组载体转化。
在所述转化微生物中，将省略与所述重组载体重复的部分的说明。
根据一实施例，所述微生物可以是农杆菌属(Agrobacterium)。
另一方面，本发明提供一种蛋白质生产方法，所述方法包括如下的步骤：制备包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸的黄瓜花叶病毒重组载体；将所述重组载体转化到细菌中；以及将所述转化细菌接种到植物中。
通过所述蛋白质生产方法制备的蛋白质可在C末端包含2xFLAG标签及6xHIS标签。
在所述蛋白质生产方法中，将省略与所述重组载体及转化微生物重复的部分的说明。
发明效果
通过根据一方面的基于黄瓜花叶病毒的重组载体，可显著增加外源蛋白在植物中的表达效率。相对于现有重组载体，根据实施例的重组载体的外源蛋白表达效率更为显著，因此可广泛应用于多种植物中有用蛋白质的生产及其研究中。
附图说明
图1a是示出基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的pCMV-GTN-R1、pCMV-GTN-R2及pCMV-GTN-R3的构成的图。
图1b是示出基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的pCMV-R3V的构成的图。
图1c是示出基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的pCMV-R2V-B2的构成的图。
图1d是示出为了确认基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的pCMV-R3V的效果而将其与荧光结合的pCMV-R3V-GFP的构成的图。
图1e是示出基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的pCMV-Fny-R1及pCMV-Fny-R2的构成的图。
图1f是示出基于黄瓜花叶病毒的改良载体的构成中的根据一实施例的PZP-GFP的构成的图。
图2a是为了评价CMV-GTN-GFP组合载体(pCMV-GTN-R1+pCMV-GTN-R2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率而与PZP-GFP进行比较实验的图。
图2b是为了评价CMV-GTN-GFP组合载体(pCMV-GTN-R1+pCMV-GTN-R2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率而与pCMV-Fny-R1+pCMV-Fny-R2+pCMV-R3V-GFP组合载体进行比较实验的图。
图3a是为了评价CMV-GTN-B2-GFP组合载体(pCMV-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率，用荧光测定设备确认GFP表达水平的图。
图3b是示出为了评价CMV-GTN-B2-GFP组合载体(pCMV-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率，在接种后第2天从接种部位提取蛋白质来进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析的结果的图。
图3c是为了评价CMV-GTN-B2-GFP组合载体(pCMV-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率，使用ImageJ进行GFP条带定量分析的图。
图3d是为了评价CMV-GTN-B2-GFP组合载体(pCMV-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)的表达效率而示出基于鲜重的GFP表达水平的图。
具体实施方式
以下，将通过实施例对本发明进行更详细地说明。然而，这些实施例仅用于示例性地说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
除非上下文中另有明确指出，如本说明书中所使用的单个数量的形式可包括多个数量的形式。另外，本说明书中使用的“包括(comprise，include)”和/或“包含(comprising，including)”是所提及的形状、数字、步骤、动作、构件、要素和/或其组合的存在，但并不用于排除一种以上的其他形状、数字、动作、构件、要素和/或其组合的存在或附加。
实施例
1.基于黄瓜花叶病毒的改良载体的制备
以下，针对实施例的改良载体的制备方法，将参照图1进行说明。图1简要示出了实施例的基于黄瓜花叶病毒的改良载体的制备方法。具体地，示出了为CMV感染性cDNA克隆、重组载体及GFP过表达而制备的重组克隆的示意图。
作为用于制备基于黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)的基因过表达载体的双元(binary)载体，使用了pCass-Rz载体。pCass-Rz载体可依次包含T-DNA的左边界(left border)、CaMV的双35S启动子(double35S promoter)、多克隆位点(multiplecloning site，MCS；StuI、KpnI、XbaI及BamHI)、顺式剪切核酶序列(cis-cleavingribozyme sequence，Rz)、35S终止子(35S terminator)(T)、T-DNA的右边界(rightborder)，因此将其转化到农杆菌(Agrobacterium)中，可通过农杆菌渗入法(agroinfiltration)将对象基因传递到植物中。另外，pCass-Rz载体可包含卡那霉素(Kanamycin)抗性基因，由此在转化到大肠杆菌及农杆菌(Agrobacterium)时，可选择培养转化子。
为了制备基于CMV的重组蛋白质过表达载体，使用了已分离的CMV-GTN(辣椒中分离的黄瓜花叶病毒(Res.Plant Dis.21(2):99-102(2015))***的感染性cDNA克隆(参见Virus Evolution,Volume 6,Issue 2,July 2020,veaa070)。CMV的基因组由作为RNA片段的RNA1、RNA2及RNA3组成。RNA1编码参与RNA复制的1a基因，并且RNA2编码作为复制酶的2a基因及作为基因沉默抑制因子的2b基因。RNA3编码病毒的移动蛋白(MP)基因及外壳蛋白(CP)基因。
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别对从韩国包装的辣椒中分离的高致病性CMV-GTN***的RNA1、RNA2及RNA3的基因组DNA进行扩增。对各基因组RNA的聚合酶链式反应(PCR)产物使用pCass-RZ载体的多克隆位点(multi-cloning site，MCS)中存在的限制性酶切位点分别进行克隆。将最终获得的CMV-GTN RNA1、RNA2及RNA3的感染性cDNA克隆分别命名为pCMV-GTN-R1(SEQ ID NO.3)、pCMV-GTN-R2(SEQ ID NO.4)及pCMV-GTN-R3(SEQ IDNO.5)。在此基础上，pCMV-R3V是指SEQ ID NO.6的序列、pCMV-R3V-GFP是指SEQ ID NO.7的序列、pCMV-Fny-R1是指SEQ ID NO.8的序列、pCMV-Fny-R2是指SEQ ID NO.9的序列及PZP-GFP是指SEQ ID NO.10的序列。
使用CMV-GTN***的感染性克隆，开发了用于过表达外源蛋白的基于CMV的载体，所述基于CMV的载体通过操作可预料外源基因高表达效率的RNA3的CP开放阅读框(openreading frame，ORF)的基因组序列来进行了开发。
具体地，从RNA3 CP ORF中去除CP基因，作为可***外源基因的多克隆位点(multi-cloning site，MCS)，导入了SpeI及MluI位点(site)，并且，为了检测及提取表达的外源蛋白，在MSC后面导入了2xFLAG标签及6xHIS标签。因此，当使用MCS进行克隆时，表达的蛋白质在C末端包含2xFLAG标签及6xHIS标签。将以这种方式制备的基于CMV-GTN RNA3的载体克隆命名为pCMV-R3V(SEQ ID NO.1)。
CMV RNA2编码作为基因沉默抑制因子的2b基因，而在实施例中，制备了重组CMVRNA2感染性克隆，其中，将2b基因替换为已知为更强效的基因沉默抑制因子的弗洛克豪斯病毒(flock house virus，FHV)的B2基因，并将所述重组CMV RNA2感染性克隆命名为pCMV-R2V-B2(SEQ ID NO.2)。
具体地，去除CMV RNA2的2b ORF的C末端，在该位点导入了***病毒(foot andmouth disease virus，FMDV)的自剪切肽(self-cleaving peptide)(LLNFDLLKLAGDVESNPG/P)、MluI位点及FHV B2序列。B2基因通过2b ORF的翻译(translation)来表达，通过***病毒自剪切肽(FMDV self-cleaving peptide)切割，并在N末端包含一个额外的脯氨酸(proline，P)氨基酸。
2.改良载体的表达效率评价
(1)制备用于评价表达效率的克隆
为了评价使用所述实施例1中制备的基于CMV-GTN的载体的植物中的外源基因表达效率，使用pCMV-R3V的SpeI及MluI限制性酶切位点，制备了***绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆。为此，使用引物(5'-GGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'及5'-AACGACGCGTGAGGATCCCCTTGTACAGCTC-3')通过PCR扩增GFP基因后，用SpeI及MluI限制性内切酶进行处理，并***到pCMV-R3V载体的SpeI及MluI限制性酶切位点。将以这种方式***GFP的克隆命名为pCMV-R3V-GFP(参照图1)。另外，为了制备针对CMV-Fny***(而非高致病性CMV***)的感染性克隆，使用pCass-Rz载体，通过与pCMV-GTN-R1及pCMV-GTN-R2相同的克隆方法，针对CMV-Fny RNA1及RNA2分别制备了pCMV-Fny-R1及pCMV-Fny-R2。为了用作对照组，制备并准备了将GFP***到PZP载体中的PZP-GFP。PZP载体可依次包含T-DNA的左边界(left border)、CaMV的双35S启动子(double 35S promoter)、翻译增强子元件(Translation enhance element，TE)、多克隆位点(multiple cloning site，MCS；StuI、SpeI)、35S终止子(35S terminator)(T)、T-DNA的右边界(right border)，因此将其转化到农杆菌(Agrobacterium)中，可通过农杆菌渗入法(agroinfiltration)将对象基因传递到植物中。另外，PZP载体可包含奇霉素(Spectinomycin)抗性基因，由此在转化到大肠杆菌及农杆菌(Agrobacterium)时，可选择培养转化子。使用PZP载体的StuI及SpeI限制性酶切位点来***GFP基因，从而制备了PZP-GFP克隆。
将具有图1a至图1f的结构的pCMV-GTN-R1、pCMV-GTN-R2、pCMV-R3V-GFP、pCMV-R2V-B2、pCMV-Fny-R1、pCMV-Fny-R2及PZP-GFP克隆的质粒DNA分别转化到农杆菌菌株EHA10(Agrobacterium strain EHA10)中。在30℃的温度条件下，将转化的农杆菌(Agrobacterium)在5ml的YEP液体培养基(包含100μg/ml的卡那霉素(kanamycin)及50μg/ml的利福平(rifampicin))中振荡培养16小时后，将1ml的原代培养液接种到50ml的新YEP培养基(包含100μg/ml的卡那霉素(kanamycin)、50μg/ml的利福平(rifampicin)及20uM的乙酰丁香酮(acetosyringone))中，并在30℃的温度条件下，振荡培养6小时。在4800G条件下，将培养液离心10分钟，使农杆菌(Agrobacterium)沉淀，以600nm的波长条件下O.D.0.7的浓度重悬于MMA渗透(infiltration)缓冲液(MS盐(salts)、10mM的MES、pH5.6，200uM的乙酰丁香酮(acetosyringone))中。然后，在30℃的温度条件下，将悬浮液振荡培养4小时。
*将通过各个克隆转化的农杆菌(Agrobacterium)悬浮液使用1ml的注射器按照如下所示等比例混合或者单独来使其通过压力渗透(infiltration)到烟草植物(本氏烟草(N.benthamiana))叶子的远轴面。
1)CMV-GTN-GFP：将分别通过pCMV-GTN-R1、pCMV-GTN-R2及pCMV-R3V-GFP转化的农杆菌(Agrobacterium)悬浮液(O.D.0.7)等比例混合并利用其进行渗透(infiltration)。
2)PZP-GFP：将通过PZP-GFP转化的农杆菌(Agrobacterium)悬浮液(O.D.0.7)单独进行渗透(infiltration)。
3)CMV-Fny-GFP：将分别通过pCMV-Fny-R1、pCMV-Fny-R2及pCMV-R3V-GFP转化的农杆菌悬浮液(O.D.0.7)等比例混合并利用其进行渗透(infiltration)。
4)CMV-GTN-B2-GFP：将分别通过pCMV-GTN-R1、pCMV-R2V-B2及pCMV-R3V-GFP转化的农杆菌悬浮液(O.D.0.7)等比例混合并利用其进行渗透(infiltration)。
(2)GFP表达效率的评价
1)CMV-GTN-GFP组合载体的表达效率
在接种各组合的农杆菌悬浮液后，使用荧光测定设备(整体荧光成像***(FOBIsystem))观察了在接种部位上的GFP表达随时间的变化。
图2a是比较分析CMV-GTN-GFP组合(pCMV-GTN-R1+pCMV-GTN-R2+pCMV-R3VGFP)与PZP-GFP之间的GFP表达效率的图。
相对于使用包含广泛用于植物转化的35S启动子的双元(binary)载体来制备的PZP-GFP，就CMV-GTN-GFP组合(pCMV-GTN-R1+pCMV-GTN-R2+pCMV-R3V-GFP)而言，确认了GFP表达量非常多(参照图2a)。确认了通过CMV-GTN-GFP组合表达的GFP量在接种后第2天(2dpi)最多，并且随着时间的流逝逐渐减少(参照图2a)。
通过如上所述的结果，确认了包含由SEQ ID NO.1表示的pCMV-R3V的载体可显著增加外源蛋白在植物中的表达。
另外，为了确认实施例中新制备的高致病性CMV-GTN***作为载体与其他CMV***相比是否具有更高的外源蛋白表达效率，比较了CMV-GTN-GFP组合与CMV-Fny-GFP组合(pCMV-Fny-R1+pCMV-Fny-R2+pCMV-R3V-GFP)。
图2b是对CMV-GTN-GFP组合与CMV-Fny-GFP组合(pCMV-Fny-R1+pCMV-Fny-R2+pCMVR3V-GFP)之间的GFP表达效率进行的比较分析。在接种各组合的农杆菌(Agrobacterium)悬浮液后，使用荧光测定设备(FOBI system)观察了在接种部位上的GFP表达随时间的变化。
结果可确认，相对于CMV-Fny-GFP组合，CMV-GTN-GFP组合具有显著优异的GFP表达效率(参照图2b)。这种结果表明，将不同的CMV***用作载体时，外源基因过表达效率出现差异，并且表现出实施例中使用的CMV-GTN***作为外源基因过表达载体具有优异的效果。
2)CMV-GTN-B2-GFP组合载体的表达效率
接着，为了确认在使用pCMV-R2V-B2(为了表达更强效的基因沉默抑制因子而用FHV B2基因代替CMV 2b基因)时是否能增加表达效率，比较了CMV-GTN-GFP组合与CMV-GTN-B2-GFP组合(pCMV-GTN-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)。
图3a示出了在接种各组合的农杆菌悬浮液后，使用荧光测定设备(FOBI system)观察的在接种部位上的GFP表达随时间的变化。图3b示出了在接种第2天从接种部位提取全部蛋白质来进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析。图3c是使用ImageJ对B的GFP条带进行定量比较分析的结果。图3d是针对基于重组CMV GTN的载体的GFP表达量(与植物鲜重相比)的定量分析结果。
使用荧光测定设备(FOBI)确认接种的烟草植物中的表达效率的结果，相对于CMV-GTN-GFP组合，可确认CMV-GTN-B2-GFP组合具有略高的表达效率(参照图3a)。为了更准确地比较两个组合之间的GFP表达效率，在接种后第2天从接种部位提取全部蛋白质来进行了SDS-PAGE分析。结果可确认使用基于CMV-GTN的载体表达的GFP蛋白量在整个提取蛋白中占很大比重，另外，相对于CMV-GTN-GFP组合，确认了CMV-GTN-B2-GFP组合诱导了略多的GFP表达(图3b)。使用作为图像定量分析程序的ImageJ进行分析的结果，确认了CMV-GTN-B2-GFP组合具有增加约30％的GFP表达效率(参照图3c)。
为了以与植物鲜重(fresh weight)比较的方式分析基于CMV-GTN的载体的GFP表达量，在接种后第2天从接种部位提取细胞质蛋白，并使用绿色荧光蛋白定量试剂盒(GFPQuantification Kit)(艾博康(abcam)，英国(UK)，产品编号ab235672)对其进行GFP定量分析。就CMV-GTN-GFP组合而言，每1mg的鲜重表现出2846ng的GFP表达效率，就CMV-GTN-B2-GFP组合而言，每1mg的鲜重表现出3444ng的GFP表达效率，增加了约20％(参照图3d)。
因此，将GFP基因克隆到各载体中并在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)植物中表达后，对表达量进行比较分析的结果，可以确认：与通常广泛用于研究中的CMV-Fny***相比，高致病性的基于CMV-GTN的载体表现出显著高水平的GFP表达量。另外，相对于野生型CMV RNA2感染性克隆(pCMV-GTN-R2)，确认了在使用pCMV-R2V-B2时GFP的表达量增加约12％。
通过如上所述的结果可知，实施例的CMV-GTN-B2-GFP组合(pCMV-GTN-R1+pCMV-R2V-B2+pCMV-R3V-GFP)的载体在植物中的外源蛋白表达过程中表现出显著提高的表达效率。
上述实施例的说明只是示例性的，只要是本领域普通技术人员就可理解具有多种变形及等同的其他实施例。因此本发明的真正的保护范围应通过所附的权利要求书来确定，并且与权利要求书中记载的内容等同范围内的所有差异应解释为包括在由权利要求书确定的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种黄瓜花叶病毒重组载体，其中，
所述黄瓜花叶病毒重组载体包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒重组载体，其中，
还包含由SEQ ID NO.2组成的核苷酸。
3.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒重组载体，其中，
还包含由SEQ ID NO.3组成的核苷酸。
4.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒重组载体，其中，
所述黄瓜花叶病毒是P1型黄瓜花叶病毒。
5.根据权利要求4所述的黄瓜花叶病毒重组载体，其中，
所述P1型黄瓜花叶病毒是CMV-GTN菌株。
6.一种转化微生物，其中，
所述转化微生物通过权利要求1所述的黄瓜花叶病毒重组载体转化。
7.一种蛋白质生产方法，其中，
所述方法包括如下的步骤：
制备包含由SEQ ID NO.1组成的核苷酸的黄瓜花叶病毒重组载体；
将所述重组载体转化到细菌中；以及
将所述转化的细菌接种到植物中。
8.根据权利要求7所述的蛋白质生产方法，其中，
通过所述蛋白质生产方法制备的蛋白质在C末端包含2xFLAG标签及6xHIS标签。
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