JP4628674B2 - 診断および治療の方法ならびにそのために有用な作用物質 - Google Patents
診断および治療の方法ならびにそのために有用な作用物質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4628674B2 JP4628674B2 JP2003527424A JP2003527424A JP4628674B2 JP 4628674 B2 JP4628674 B2 JP 4628674B2 JP 2003527424 A JP2003527424 A JP 2003527424A JP 2003527424 A JP2003527424 A JP 2003527424A JP 4628674 B2 JP4628674 B2 JP 4628674B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lmo4
- cell
- cells
- breast
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
Description
本発明は一般的に、対象における、または前記対象からの生物試料における、異常細胞、より詳細には異常上皮細胞を検出するための方法、およびそのために有用な作用物質(agent)に関する。より詳細には、本発明は、異常***上皮細胞を検出するための方法に関する。異常細胞または異常細胞の群の存在は、特定の疾患もしくは状態があること、または疾患もしくは状態を発症する性向があることを判定する指標となる。より詳細には、本発明は、LM04タンパク質もしくは関連タンパク質の存在の相対的増加、またはLM04活性の相対的増加、またはLM04タンパク質もしくは関連タンパク質をコードする遺伝子による発現産物の存在の相対的増加を判定することによって、対象または前記対象からの生物試料における、乳癌と関連のある細胞または乳癌へと進展する性向のある細胞を検出するための方法を考えている。本発明はさらに、1個の細胞もしくは細胞の群におけるLM04もしくは関連タンパク質の上方制御、またはLM04もしくは関連タンパク質をコードする遺伝子配列の発現産物の存在の上方制御に関するスクリーニングにより、対象または前記対象からの生物試料における、癌または癌性増殖、特に乳癌の存在を診断するための方法を提供する。本発明は、LM04またはLM04をコードする遺伝物質の発現産物を検出するために有用な診断薬を提供する。このような診断薬は、LM04遺伝子の発現産物を検出するための抗体および遺伝子プローブなどの免疫相互作用性分子を含む。本発明はさらに、LM04レベルの変化を示す遺伝子改変動物も提供する。このような動物は抗癌剤のスクリーニングのためのモデルとして有用である。
本明細書中に著者および数字の両方によって言及した刊行物の書誌的詳細は、本明細書の末尾に収録してある。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈が別のものを要求しない限り、「含む(comprise)」という用語、ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの変形物は、言及した整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を含むものの、他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を除外しないことを意味するものと解釈される。
(1)LM04またはその抗原決定基に対して特異的なモノクローナル抗体を、前記LM04を含む細胞を含むことが疑われる生物試料と接触させる段階;および
(2)段階(1)で形成された複合体をシグナル検出の段階に供する段階、
を含むアッセイ法を考えている。
本発明は、一部には、癌細胞、特に上皮癌細胞、最も具体的には乳癌細胞において、正常***細胞と対比してLM04発現が上方制御されているという判定所見を根拠に置く。この癌特異的マーカーの同定により、癌造影剤および治療的に有用な癌標的指向性薬剤(cancer targeting agent)を含むさまざまな診断薬の開発が可能になる。これらの判定所見により、異常なまたは不要なLM04調節性増殖を特徴とするものなどの状態を治療するための治療的および/または予防的方法の合理的設計も可能になる。
(3)LM04またはその抗原決定基をに対して特異的なモノクローナル抗体を、前記LM04を含む細胞を含むことが疑われる生物試料と接触させる段階;および
(4)段階(3)で形成された複合体をシグナル検出の段階に供する段階、を含むアッセイ法を考えている。
(a)レポーター分子の抗体との直接的な結合;
(b)レポーター分子の抗体との間接的な結合;すなわち、レポーター分子と、後に抗体に結合させる別のアッセイ試薬との結合;および
(c)抗体の以後の反応産物との結合。
(i)LM04遺伝子の、またはその発現産物がLM04発現を調節する遺伝子の、転写および/または翻訳の調節を変化させるタンパク質性または非タンパク質性分子を細胞内に導入すること。
(ii)LM04と、そのリガンド(例えば、bdb1、Nb1、CL1M、CtIPまたはBRCA1)の1つまたは複数との間の相互作用に拮抗するタンパク質性または非タンパク質性分子を細胞内に導入すること。
LIMドメインタンパク質LM04は***上皮細胞のインビトロでの分化を阻害し、乳癌内で過剰発現される
材料および方法
細胞系
大部分の細胞系は以前の研究で引用されている(Douglas, A.M.、Grant, S. L.、Goss, G.A.、Clouston, D.R.、Sutherland, R. L. & Begley, C. G. (1998) Int J Cancer 75、64-73)。SCp2***上皮細胞(Desprez, P.-Y.、Roskelley, C.、Campisi, J. & Bissell, M. J. (1993) Mol. Cell. Diff 1、99-110)はM. Bissell博士から寄贈いただいた。
マウスLmo4は、ウサギ抗Ldb1抗血清を用いるアフィニティークロマトグラフィーによってマウスT細胞から単離した(19)。Lmo4の精製およびクローニングは別の箇所に記載されている(K. H.)。完全長ヒトLMO4(ATCCから、アクセッション番号T09407)またはマウスLmO4 cDNAをBluescript SKII(Stratagene)中にクローニングした。アンチセンスおよびセンスリボプローブはT3またはT7 RNAポリメラーゼ(Promega)をジゴキシゲニン-UTP(Roche)とともに用いて作製した。標準的なインサイチューハイブリダイゼーションを記載の通りに行った(Wilkinson, D. (1992)「In Situ Hybridisation」(IRL、New York))。乳癌組織アレイは、Clinomics社から購入するか、Peter MacCallum Cancer Institute(PMCI)(Melbourne、Australia)の乳癌試料から調製した。標本はすべて匿名の保存組織標本であった。Peter MacCallumの組織内審査委員会が組織アレイ分析のためのPMCI標本の使用を承認している。
SCp2***上皮細胞(Desprez, P.-Y.、Roskelley, C.、Campisi, J. & Bissell, M. J. (1993) Mol. Cell. Diff 1: 99-110)を、DMEM-HAM、10%FCSおよびインスリン5μg/ml(Sigma)を含むDMEM-F12培地中で継代した。Lmo4またはLdb1に対応する完全長マウスcDNAを、pEF1a-puroおよびpEF1a-Flag-puro哺乳動物発現ベクターの両方にクローニングした(Huang, D.C.、Cory, S. & Strasser, A. (1997) Oncogene 14、405-14)。タンパク質発現は293T細胞の一過性トランスフェクションによって確認した。線状化発現ベクター(10μg)を、Superfect(Qiagen)を用いてSCp2細胞に導入し、ピューロマイシン中に8〜10日おいて選択した。続いて、適切な遺伝子またはベクターのみ(対照)を発現する安定的トランスフェクタントのプールを、本質的には記載された通りに分化アッセイ法に用いた(Desprez, P.-Y.、Roskelley, C.、Campisi, J. & Bissell, M. J. (1993) Mol. Cell. Diff 1: 99-110)。A. Parlow博士(National Hormone and Pituitary Program)に寄贈いただいた、インスリン(5μg/ml)、ヒドロコルチゾン(1μg/ml)およびプロラクチン(5μg/ml)を含むDMEM-F12の添加によってトランスフェクタントの分化を誘導した。96時間後に細胞をRNA抽出のためにそのまま収集した。
ポリ(A)+ RNAのノーザン分析は以前の記載の通りに行った(Visvader, J.、Begley, C. G. & Adams, J. M. (1991) Oncogene 6、187-94)。ECM上にあるSCp2細胞からRNAzol(Tel-Test)を用いて全RNAを単離した。cDNA合成およびPCRは、β-カゼイン、WapおよびHprtに対するプライマーを用いて(Weiss, M.J.、Keller, G. & Orkin, S. H. (1994) Genes Dev 8、1184-97)、以前の記載の通りに行った(Weiss, M.J.、Keller, G. & Orkin, S. H. (1994) Genes Dev 8、1184-97)。β-カゼインプライマーの配列は以下の通りとした:順方向
および逆方向
。Wapプライマーの配列は以下の通りとした:順方向
および逆方向
。試料をアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色し、ブロッティングを行った上で特異的内部オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
安定的にトランスフェクトされたSCp2プールから、細胞をプロテアーゼ阻害薬を含むKALB可溶化バッファー(Nicholson, S.E.、Wilison, T.A.、Farley, A.、Starr, R.、Zhang, J.G.、Baca, M.、Alexander, W.S.、Metcalf, D.、Hilton, D. J. & Nicola, N. A. (1999) EMBO J 18、375-85)中で溶解させることにより、全細胞可溶化物を作製した。タンパク質を抗Flag M2(Sigma)およびプロテインGセファロース(Pharmacia)を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGE(Novex)によって分離した。移行させた後にフィルターをブロットし、完全長マウスLmo4またはC末端Ldb1ポリペプチドに対するウサギ抗血清とともにインキュベートした(19)。抗体結合はECL(Amersham)によるペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体によって可視化した。
免疫染色のために、組織アレイ(Clinomics)を、ラット抗LMO4モノクローナル抗体を含む上清とともにインキュベートし、続いてビオチン化抗ラットIgGおよびHRP-Streptavidin(Dako)とともにインキュベートした後に、DAB(Dako)による検出を以前の記載の通りに行った(Armes, J.E.、Trute, L.、White, D.、Southey, M.C.、Hammet, F.、Tesoriero, A.、Hutchins, A.M.、Dite, G.S.、McCredie, M.R.、Giles, G.G.、Hopper, J. L. & Venter, D. J. (1999) Cancer Res 59、2011-7)。LMO4モノクローナル抗体の作製は別の箇所に記載されている。用いた他の一次モノクローナル抗体は以下の通りである:抗ERα(1D5)、抗PgR(636)および抗ErbB2(いずれもDako)。
LMO4はマウス乳腺において発生段階に伴う調節を受ける
インサイチューハイブリダイゼーション分析により、Lmo4が妊娠期間中に乳腺の腺房小葉単位で顕著に発現されることが判明した(図1A)。この時期には腺房小葉の形成および拡張を伴う急速な増殖がみられる。単層として認められる未***体の乳腺、授乳初期および退縮期の乳腺の乳管上皮内に存在したLmo4 mRNAはそれよりも低いレベルであった。未***体の乳腺では周囲間質の染色も明らかであった。妊娠体の乳腺における高レベルのLmo4(図1A)がノーザン分析によって確認され、それにより、妊娠中期(第12日)をピークとして妊娠後期まで高値を保つ(図1B)2種類の主な転写物(約1.8および2.3kb)のレベルが判明した。興味深いことに、Lmo4発現は授乳期には低下したが、これは退縮期には上方制御されるように思われた。
LMO4遺伝子およびLDB1遺伝子の強制的発現によって***上皮細胞におけるβ-カゼイン合成が阻害される
Lmo4は、いくつかのLIMドメイン含有タンパク質のアダプターとして働く核タンパク質であるLdb1と高い親和性で結合する。Lmo4およびそのパートナータンパク質であるLdb1の***分化における役割を検討するために、本発明者らは、Lmo4およびLdb1 RNAを中等度レベルで発現するSCp2***上皮細胞にこれらの遺伝子を導入した(図3)。SCp2細胞系は妊娠中期マウスの乳腺から当初単離されたもので、細胞外マトリックス(ECM)および泌乳刺激の存在下で***分化の本質的な特徴を再現する(Desprez, P.-Y.、Roskelley, C.、Campisi, J. & Bissell, M. J. (1993) Mol. Cell. Diff. 1、99-110)。SCp2細胞の分化はβ-カゼインおよび乳清酸性タンパク質(Wap)などの乳タンパク質の産生を伴うことから、本発明者らは今回これらを分子マーカーとして用いた。Lmo4またはLdb1 cDNA(エピトープ標識したもの、または標識していないもの)をピューロマイシン耐性マーカーとともに有するSCp2細胞の安定的トランスフェクタントを作製し、細胞のプールを分化能力に関してアッセイした。後者のアッセイ法に関しては、トランスフェクタントを、泌乳刺激(プロラクチン、インスリンおよびヒドロコルチゾン)の存在下または非存在下にてECM上にプレーティングした。
乳癌細胞株および原発性浸潤癌におけるLMO4の過剰発現
種々のヒト***上皮癌細胞系の間にはLMO4 RNAレベルに著しい差がある(図3)。10種類の乳癌細胞株のうち5種では高レベルのLMO4 mRNAが検出された。興味深いことに、転写物レベルは不死化細胞株184では低かったが、この細胞系の形質転換バリアントである184B5ではかなり高かった(Douglas, A.M.、Grant, S.L.、Goss, G.A.、Clouston, D.R.、Sutherland, R. L. & Begley, C. G. (1998) Int J Cancer 75、64-73)。LDB1は一群の乳癌細胞株において2つの主要転写物(2.3kbおよび3.5kb)として発現され、発現の程度に関する差異はわずかであった。SCp2(図3)、HC11およびEpH4(非提示)マウス***上皮細胞におけるLmo4およびLdb1転写物のサイズは対応するヒトRNAよりも小さく、種差を反映している。
LIMドメインタンパク質LMO4はコリプレッサーCtIPおよび腫瘍抑制因子BRCA1と相互作用し、BRCA1活性を阻害する
材料および方法
プラスミド
pGBT9-LMO4ベイトプラスミドを、以下のプライマーを用いる、pSP72におけるマウスLMO4のPCR増幅によって作製した:
順方向
および逆方向
;その結果生じた産物をpGBT9(Clontech)のBamHI部位にクローニングした。LMO4の第1のLIMドメイン(残基1〜82)を、順方向プライマー
および逆方向プライマー
を用いてPCR増幅し、続いてFlag-pEF1α-puroベクター(Huang, D.C.、Cory, S.およびStrasser, A. (1997) Oncogene 14 (4)、405-14)のBamHI部位にクローニングした。LMO4の第2のLIMドメイン(残基79〜165)は、順方向プライマー
および逆方向プライマー
を用いてPCR増幅した後に、Flag-pEF1α-puroベクターのBamHI部位にクローニングした。Lhx1またはLhx3(pSV-sport-Flag)をコードする発現ベクターおよびLMK1はそれぞれA. AgulnickおよびO. Bernard氏に寄贈いただいた。マウスまたはヒトのLMO4のコード領域に対応する完全長cDNAをFlag-pEF 1α-puro発現ベクター中にクローニングし、0.7kbのマウスLMO4 cDNA断片をpEF1α-puroベクター中にクローニングした。ヒトCtIPの残基45〜897(pCMVHA-ns311)、ヒトBRCA1(pcDNA3-HA-BRCA1)およびマウスLMO2(pEF1α-Flag-LMO2)をコードする発現プラスミドは以前に記載されている(Visvader, J.E.、Mao, X.、Fujiwara, Y.、Hahm, K.およびOrkin, S. H. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(25)、13707-12; 19;Scully, R.、Chen, J.、Plug, A.、Xiao, Y.、Weaver, D.、Feunteun, J.、Ashley, T.およびLivingston, D. M. (1997) Cell 88 (2)、265-75)。HA標識したCtIP欠失変異体はPCR増幅またはプラスミドから発現ベクターHA-pcDNA3.1またはHA-EF1α-puroへのサブクローニングによって作製した(Yu, X.、Wu, L.C.、Bowcock, A.M.、Aronheim, A.およびBaer, R. (1998) J Biol Chem 273 (39)、25388-92)。BRCA1のSZ断片(残基1528〜1863)はpCMV-Gal4b-BR-SZ(Yu, X.、Wu, L.C.、Bowcock, A.M.、Aronheim, A.およびBaer, R. (1998) J Biol Chem 273 (39)、25388-92)からHA-pcDNA3.1へと再クローニングした。野生型および変異型BRCA1のMyc標識誘導体をpcDNA3.0(J. C.、未発表)にクローニングした。
pGBT9-LMO4ベイトプラスミド(残基15〜165)を用いて、標準的プロトコールに従って(Clontech Matchmaker Two-Hybrid System)、原発性***腺癌cDNAライブラリー(Byrne, J.A.、Nourse, C.R.、Basset, P.およびGunning, P. (1998) Oncogene 16 (7)、873-81)由来の8.4×106個の形質転換体をスクリーニングした。
完全長マウスLMO4 cDNAをPCRによって増幅し、pGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech.)中にサブクローニングした。このGST-LMO4融合タンパク質を細菌株UT5600内で発現させ、標準的なプロトコールに従って精製し(Smith, D. B.およびJohnson, K. S. (1988) Gene 67 (1)、31-40)、これをウサギへの注入に用いてポリクローナル抗血清を産生させた。ラットLMO4特異的モノクローナル抗体の作製は別の箇所に記載されている。
ヒト胚腎臓293T細胞(10cmプレート)に対して、リン酸カルシウム沈降法を用いて、4μgの各発現構築物および/またはエンプティベクターによる一過性トランスフェクションを行った。細胞抽出物(0.5ml)を、プロテアーゼ阻害薬(1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1μg/mlロイペプチン、1μg/mlペプスタチン、1μg/mlアプロチニン)を含む全細胞可溶化バッファー(150mM NaCL、5mM EDTA、50mM トリス pH7.5、1% ノニデット(Nonidet) P-40、1mM DTT)中に調製し、ブラッドフォード分析(BioRad)による評価により、タンパク質濃度を標準化した。タンパク質を抗Flag M2(Sigma)または抗myc 9E10およびプロテインGセファロース(Amersham Pharmacia Biotech.)によって免疫沈降させ、SDS-PAGE(Novex)によて分離した。PVDF膜(Millipore)に移行させた後に、フィルターのブロッティングを行い、CtIPまたはLdb1に対するウサギ抗血清(Visvader, J.E.、Mao, X.、Fujiwara, Y.、Hahm, K.およびOrkin, S. H. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(25)、13707-12)またはマウス抗BRCA1モノクローナル抗体MS110(Oncogene Research Products)とともにインキュベートした。続いてフィルターをHRP結合二次抗体とともにインキュベートし、ECL(Amersham Pharmacia Biotech.)によって現像した。
35S標識BRCA1(C末端残基1528-1863)のインビトロ合成を、TNT T7結合網状赤血球溶解液システム(Promega)を用いて、HA-pCDNA3.1-BRCA1-SZのインビトロ転写/翻訳によって行った。結合アッセイ法は、35S標識BRCA1-SZで感作させた可溶化物の10μlアリコートおよび100μl(GST-セファロースビーズの50%スラリー;Amersham Pharmacia)のGST-LMO4またはGST-のみのタンパク質を用い、GST相互作用バッファー(150mM NaC1、10mM トリス pH 8、0.3%NP-40、1mM DTT、0.25%BSAおよび0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド)中にて4℃で2時間かけて行った。続いてビーズをBSAを含むGST相互作用バッファーで2回洗い、その後にBSAを含まないGST相互作用バッファーでさらに2回洗った。最後に、ビーズを30μlのローディングバッファー中で5分間煮沸することによって結合したBRCA1C末端ポリペプチドを溶出させ、SDS-PAGEによって分析した。
以前の研究で引用されているヒトおよびマウスの***上皮細胞系からポリ(A)+ RNAを単離し(Douglas, A.M.、Grant, S.L.、Goss, G.A.、Clouston, D.R.、Sutherland, R. L.およびBegley, C. G. (1998) Int J Cancer 75 (1)、64-73)、ノーザン分析を行った(Visvader, J.E.、Elefanty, A.G.、Strasser, A.およびAdams, J. M. (1992) Embo J 11(12)、4557-64)。
酵母転写アッセイ法は酵母株BJ5462において行った。これに対してLacZレポータープラスミド、YepΔ62(P. Vaughan氏から寄贈いただいた)およびpGBT9-BRCA1(AD)を同時トランスフェクトし、leuおよびtrpを欠く培地上でコロニーを選択した。続いて、これらの形質転換体にpYX212-LMO4発現プラスミドまたはエンプティベクターによる形質転換をさらに行い、ura、trpおよびleuを欠く培地上で選択した。o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド(ONPG)液体培養アッセイ法を標準的なプロトコールに従って(CLONTECH Yeast Protocols Handbook)行い、β-ガラクトシダーゼ活性を評価した。
CTIPのLMO4相互作用性タンパク質としての同定
本発明者らは、***上皮におけるLMO4相互作用性タンパク質を同定するために酵母ツーハイブリッドシステムを用いた。原発性***腺癌cDNAライブラリーの8.4×106個の形質転換体のスクリーニングにより、800個を上回るHis+コロニーが得られた。659個のβ-ガラクトシダーゼ陽性クローンを単離し、続いて、既知のLMO4関連タンパク質であるLdb1および異型上皮自己調節性因子(Deformed Epidermal Autoregulation Factor)(DEAF1)ならびに既知の偽陽性物を表すcDNAプローブを用いる酵母コロニーハイブリダイゼーションを行った(Kenny, D.A.、Jurata, L.W.、Saga, Y.およびGill, G. N. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 (19)、11257-62;Sugihara, T.M.、Bach, I.、Kioussi, C.、Rosenfeld, M. G.およびAndersen, B. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(26)、15418-23;Grutz, G.、Forster, A.およびRabbitts, T. H. (1998) Oncogene 17 (21)、2799-803)。これらのクローンの約60%はLdb1/Ldb2(30%)またはDEAF1(30%)に対応した。150種のcDNAクローンのシークエンシングを行ったところ、22種はLdb1またはLdb2に対応し、20種はDEAF1をコードし、少なくとも70種は偽陽性物(例えば、リボソームタンパク質、ミトコンドリアタンパク質および細胞外マトリックスタンパク質)に対応するが、残りの38種のcDNAは9種の異なる遺伝子またはESTであることが明らかになった。これらのクローンの1つは、転写コリプレッサーCtBP(アデノウイルスE1A C末端結合タンパク質)との相互作用に基づいて当初同定された補助因子であるCtIP(CtBP相互作用性タンパク質)の完全コード配列に対応していた(Schaeper, U.、Subramanian, T.、Lim, L.、Boyd, J.M.およびChinnadurai, G. (1998) J Biol Chem 273 (15)、8549-52)。
LMO4とCTIPとのインビボでの会合
CtIPとLMO4との間の特異的相互作用が哺乳動物細胞で確かめられた。それぞれFlag-エピトープまたはmyc-エピトープをN末端に有する、LMO4、LMO2または異種LIMドメインタンパク質をコードする発現ベクターを、CtIP(残基45〜897)を有する発現ベクターとともに、293T細胞に一過的にトランスフェクトした。全細胞抽出物を、免疫共沈降/ウエスタンブロット複合アッセイ法を用いて分析した。図6Aに示されているように、Flag-LMO4およびCtIPがインビボで特異的に会合することが相互免疫共沈降実験によって明らかになった(レーン1および4)。Flag-LMO4のみを発現する細胞(レーン3)またはアイソタイプを一致させた対照抗体を用いたものではCtIPは免疫共沈降しなかった。LMO4の単一のLIMドメイン(アミノ酸1〜82)があれば哺乳動物細胞におけるCtIPとの相互作用に十分であることが判明した(図6B、レーン1)。CtIPと会合できたのはLMO4の第2のLIMドメイン(アミノ酸79〜165)ではなく第1のLIMドメインのみであった(レーン2)。CtIPは近縁のLIMドメインタンパク質LMO2(5)とも共沈降した(図6A、レーン2)が、核内LIMホメオドメインタンパク質であるLhx1およびLhx3(図6C、レーン2および3)ならびにLIM-キナーゼ(LMK1)とは共沈降しなかった(図6C、レーン4)。
***上皮細胞系におけるLMO4およびCTIPの同時発現ならびにLMO4の細胞内局在
LMO4遺伝子およびCtIP遺伝子はいずれも数多くの異なる組織および細胞種で発現されることが報告されている(
)。本発明者らは、その大半はヒト乳癌に由来するが不死化ヒト細胞(184)も含んでいる、一群の***上皮細胞系におけるそれらの発現を調べた。ノーザン分析により、CtIP RNA(3.6kb)レベルは比較的均一であるが、LMO4転写物(1.8kbおよび2.3kb)の発現には著しい差があることが判明した(図8)。本発明者らが最近報告したように(Visvader, J.E.、Venter, D.、Hahm, K.、Santamaria, M.、Sum, E. Y. M.、O'Reilly, L.、White, D.、Williams, R.、Armes, J.およびLindeman, G. J. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (25)、14452-14457)、BT-549、BT-474、HS-578T、MDA-MB361、T-47DおよびZR-75Bを含む多くのヒト乳癌細胞株では高レベルのLMO4が認められ(図8)、これに対して不死化184細胞では低レベルであった。ヒト乳癌において、LMO4遺伝子の過剰発現はRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方で観察されている(Visvader, J.E.、Venter, D.、Hahm, K.、Santamaria, M.、Sum, E. Y. M.、O'Reilly, L.、White, D.、Williams, R.、Armes, J.およびLindeman, G. J. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(25),14452-14457)。
LMO4はCTIP内の2つの異なるドメインと相互作用する
CtIPの機能は不明であるが、これはBRCA1、アデノウイルスE1A C末端結合タンパク質(CtBP)、網膜芽細胞種タンパク質(Retinoblastoma)(Rb)およびp130ポケットタンパク質を含む、いくつかの核調節タンパク質に対する補助因子として働くように思われる(
)。CtIPは、図7Aに示したように、これらのタンパク質と相互作用する規定された領域に加えて、ロイシンジッパーと考えられる2つのドメインを含む(120〜141および740〜761)(Fusco, C.、Reymond, A.およびZervos, A. S. (1998) Genomics 51 (3)、351-8)。LMO4との相互作用を媒介するCtIP内部のドメインを明確にするために、それぞれN末端HA-エピトープタグと連結させた一連のCtIP欠失変異体(図7A)を、Flag-LMO4とともに293T上皮細胞に対して同時トランスフェクトした。図8Bに示されているように、HA-CtIP(45〜371)、HA-CtIP(371〜897)、HA-CtIP(45〜897)およびHA-CtIP(620〜897)タンパク質はFlag-LMO4と会合可能であった(レーン2、4、5および6)。これに対して、HA-CtIP(59〜320)およびHA-CtIP(281〜620)変異体は抗Flag抗体と免疫沈降した(それぞれレーン1および3)。このため、CtIP内にはLMO4との相互作用を媒介しうる2つの領域、すなわちN末端(残基45〜59)の小規模ドメインおよびロイシンジッパーモチーフと推定されるものを含むC末端領域(残基620〜897)があるように思われる(図8A)。これらの領域は、CtBP(アミノ酸392〜396)、Rb(153〜157)およびBRCA1(133〜369)と会合するものとは異なる(
)。
LMO4は***腫瘍および卵巣腫瘍の抑制因子であるBRCA1と相互作用する
最近、CtIPが***腫瘍抑制因子BRCA1と相互作用することが示されたため(
)、本発明者らはLMO4、CtIPおよびBRCA1が多タンパク質複合体に加わるか否かについて検討した。CtIPおよびLMO4はいずれも、myc標識BRCA1、Flag標識LMO4およびCtIPを発現する293T細胞由来の抗myc抗体と免疫共沈降した(図9A、レーン2)。この所見により、この3種のタンパク質が多タンパク質複合体をインビボで形成しうることが明らかになった。図9Aに示されているように(レーン1)、外因性CtIPの存在は抗myc抗体によるLMO4の免疫沈降に必要ではなかった。これらの結果から、LMO4がBRCA1と直接会合するという可能性が示された(以下を参照)。
BRCA1のBRCTドメインはLMO4と直接相互作用する
BRCA1のC末端の335アミノ酸(SZ断片、残基1528〜1863)だけで、トランスフェクト細胞におけるLMO4との相互作用(図10A)を媒介するには十分であった。この領域は、BRCA1が腫瘍形成の抑制に働くために必要な2つの縦列BRCTモチーフを含む(
)。本発明者らは、LMO4とBRCA1との会合をインビトロ結合アッセイ法を用いて確認した。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として発現させた完全長LMO4をグルタチオンセファロースビーズ上に固定化し、インビトロ翻訳させた35S-メチオニン標識BRCA1-SZポリペプチド(1528〜1863)とともにインキュベートした。図10Bに示されているように、BRCA1はGST-LMO4とは特異的に会合したが、GST単独とは相互作用しなかった。
BRCA1における腫瘍由来の変異はLMO4結合に影響を及ぼさない
遺伝性乳癌患者のかなりの割合で腫瘍に関連した変異が同定されている。このような異常にはミスセンス変異(P1749R、M1775R)、およびBRCA1のC末端の11アミノ酸を欠失させるナンセンス変異(Y1853Δ)が含まれる(Yu, X.、Wu, L.C.、Bowcock, A.M.、Aronheim, A.およびBaer, R. (1998) J Biol Chem 273(39)、25388-92;Li, S.、Chen, P.L.、Subramanian, T.、Chinnadurai, G.、Tomlinson, G.、Osborne, C.K.、Sharp, Z. D.およびLee, W. H. (1999) J Biol Chem 274 (16)、11334-8)。これらの腫瘍関連変異はBRCA1のCtIPとの結合性を失わせることが示されている(Yu, X.、Wu, L.C.、Bowcock, A.M.、Aronheim, A.およびBaer, R. (1998) J Biol Chem 273 (39)、25388-92;Li, S.、Chen, P.L.、Subramanian, T.、Chinnadurai, G.、Tomlinson, G.、Osborne, C.K.、Sharp, Z. D.およびLee, W. H. (1999) J Biol Chem 274 (16)、11334-8)。BRCA1-LMO4相互作用に対するそれらの影響を評価するために、これらの変異を含むmyc標識BRCA1発現構築物が293T細胞においてFlag標識LMO4と結合する能力を調べた。野生型BRCA1ポリペプチドで観察されているのと同じく、すべての変異体がLMO4と相互作用することが見いだされた(図11)。このため、遺伝子性乳癌患者でBRCA1内部に生じている変異は、BRCA1とLMO4との相互作用に影響を及ぼさずにCtIPとの結合性を消失させることができる。
LM04はBRCA1の転写活性を抑制する
BRCA1のC末端(BRCT)ドメインは異種DNA結合ドメインを介してプロモーターと連結されると転写を活性化することが以前に示されている(Chapman, M. S.およびVerma, I. M. (1996) Nature 382 (6593)、678-9;34)。C末端のさらに詳細な特徴分析により、2つの隣接した活性化ドメインAD1(残基1293〜1558)およびAD2(残基1560〜1863)が一緒になって571アミノ酸のADドメインを構成することが明らかになった(Hu, Y.F.、Miyake, T.、Ye, Q.およびLi, R. (2000) J Biol Chem 275(52)、40910-5)。酵母および哺乳動物細胞のいずれにおいてもAD1とAD2との機能的協同作用がみられ、このためにAD領域はいずれかのドメインのみの場合よりも強力な転写活性化因子となる(Hu, Y.F.、Miyake, T.、Ye, Q.およびLi, R. (2000) J Biol Chem 275 (52)、40910-5)。BRCA1による転写の活性化に対するLMO4の影響を明らかにするために、本発明者らはまず、BRCA1のC末端AD領域をGal4 DNA結合ドメインと融合させたものを用いて酵母を用いる転写アッセイ法を行った。このプラスミドをLMO4酵母発現ベクターまたはエンプティベクターとともに、LacZレポータープラスミドを有するBJ5462酵母株に導入した。BRCA1-ADは強力なトランス活性化因子であり、基礎的なGal4 DNA結合活性よりも400〜600倍高い転写を誘導した(図12A)。この活性化はLMO4によって顕著に抑制され、BRCA1-ADによる活性化のレベルは80%低下した(図12A)。BRCA1-ADの発現にはLMO4をコードするプラスミドの有無の別による差がなかった(図12A、下のパネル)。
Claims (38)
- 対象または対象からの生物試料における異常細胞または異常細胞の発生に対する素因を検出するための方法であって、該対象または生物試料からの***細胞または***細胞抽出物を、LMO4またはその抗原性部分に対して特異的な免疫相互作用性分子と接触させること、および免疫相互作用性分子-LMO4複合体の形成レベルに関するスクリーニングを行うことを含み、正常***細胞と対比して複合体の存在量が多いことによって異常細胞が示されるような方法。
- 対象または対象からの生物試料における異常細胞または異常細胞の発生に対する素因を検出するための方法であって、該対象または生物試料からの***細胞または***細胞抽出物におけるLMO4をコードする遺伝子の転写産物のレベルに関するスクリーニングを行うことを含み、正常***細胞のレベルと比較して発現産物のレベルが高いことによって異常細胞が示されるような方法。
- 対象における異常細胞増殖または異常細胞増殖の発生に対する素因の存在をインビトロで決定するための方法であって、該対象または該対象からの生物試料からの***細胞または***細胞抽出物を、LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有する抗体のLMO4結合有効量と接触させること、および続いてLMO4-抗体複合体のレベルを定量的または定性的に決定することを含み、正常***細胞と比較した複合体のレベルの高さの存在によって異常増殖の存在が示されるような方法。
- 対象における異常細胞増殖または異常細胞増殖の発生に対する素因の存在をインビトロで決定するための方法であって、該対象または該対象からの生物試料からの***細胞または***細胞抽出物からmRNAを入手すること、ならびにmRNAを、LMO4をコードするヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の全体または一部とハイブリダイズしうる、および/またはそれを増幅しうる遺伝子プローブと接触させること、ならびに続いて該mRNAのレベルを検出することを含み、正常***細胞と比較した該mRNAのレベルの高さの存在によって異常増殖の存在が示されるような方法。
- 対象における異常細胞増殖または異常細胞増殖の発生に対する素因の存在をインビトロで決定するための方法であって、該対象または該対象からの生物試料からの***細胞または***細胞抽出物からmRNAを入手すること、cDNAを作製すること、ならびにcDNAを、LMO4をコードするヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の全体または一部とハイブリダイズしうる、および/またはそれを増幅しうる遺伝子プローブと接触させること、ならびに続いて該cDNAのレベルを検出することを含み、正常***細胞と比較した該cDNAのレベルの高さの存在によって異常増殖の存在が示されるような方法。
- 異常細胞が新形成細胞である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 新形成細胞が乳癌を特徴づけるものである、請求項6記載の方法。
- 新形成細胞が***細胞である、請求項6記載の方法。
- 新形成細胞が***上皮細胞である、請求項6記載の方法。
- ECACC受託番号03052001によって特定されるハイブリドーマ16H2またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体。
- ECACC受託番号03052002によって特定されるハイブリドーマ20F8またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体。
- ECACC受託番号03052001によって特定されるハイブリドーマ細胞系16H2またはその変異体もしくはバリアント。
- ECACC受託番号03052002によって特定されるハイブリドーマ細胞系20F8またはその変異体もしくはバリアント。
- 免疫相互作用性分子が以下から選択されるものである、請求項1記載の方法:
(a) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有する抗体;
(b) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体;
(c) ECACC受託番号03052001によって特定されるハイブリドーマ16H2またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体;および
(d) ECACC受託番号03052002によって特定されるハイブリドーマ20F8またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体。 - LMO4を検出するためのアッセイ法であって、
(i)請求項10または11記載のモノクローナル抗体を、LMO4を含む細胞を含むことが疑われる生物試料と接触させる段階;および
(ii)段階(i)で形成された複合体をシグナル検出の段階に供する段階、
を含むアッセイ法。 - 抗体が請求項10または11記載の抗体である、請求項3記載の方法。
- 試料におけるLMO4またはその断片、バリアントもしくは誘導体を検出する方法であって、対象からの生物試料からの***細胞または***細胞抽出物をLMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有する抗体またはその断片もしくは誘導体と接触させること、ならびに該抗体およびLMO4またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む複合体のレベルを正常***細胞と比較して検出することを含み、LMO4のレベルが高いことによって癌の増殖が示されるような方法。
- 抗体が請求項10または11記載の抗体である、請求項17記載の方法。
- 対象における異常細胞増殖の発生または進行をモニターする方法であって、該対象または該対象からの生物試料からの***細胞または***細胞抽出物におけるLMO4またはLMO4をコードする遺伝子の転写産物のレベルに関するスクリーニングを行うことを含み、正常***細胞のレベルと比較してLMO4または転写産物のレベルが高いことによって異常細胞増殖が示されるような方法。
- 異常細胞が新形成細胞である、請求項19記載の方法。
- 新形成細胞が乳癌を特徴づけるものである、請求項20記載の方法。
- 新形成細胞が***細胞である、請求項20記載の方法。
- 新形成細胞が***上皮細胞である、請求項20記載の方法。
- 患者の***からの新形成細胞と疑われる細胞におけるLMO4の相対レベルを、インビトロで定量的または半定量的に決定するためのキットの製造における、LMO4に対するモノクローナル抗体の使用。
- 抗体が請求項10または11記載の抗体である、請求項24記載の使用。
- 異常な、不要なまたは不適切なLMO4調節性細胞増殖を調節する方法であって、***細胞を、LMO4の発現またはLMO4の機能活性を調節するのに十分な時間および条件の下で作用物質の有効量と接触させることを含み、該LMO4の発現もしくは活性の、阻害または拮抗によって該細胞増殖が下方制御されるものであり、かつ該作用物質はLMO4またはその抗原性部分に対して特異的な免疫相互作用性分子である、方法。
- 免疫相互作用性分子が以下から選択されるものである、請求項26記載の方法:
(a) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有する抗体;
(b) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体;
(c) ECACC受託番号03052001によって特定されるハイブリドーマ16H2またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体;および
(d) ECACC受託番号03052002によって特定されるハイブリドーマ20F8またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体。 - 細胞が新形成細胞である、請求項26記載の方法。
- 新形成細胞が乳癌を特徴づけるものである、請求項28記載の方法。
- 新形成細胞が***細胞である、請求項28記載の方法。
- 新形成細胞が***上皮細胞である、請求項28記載の方法。
- 哺乳動物の***における、異常な、不要なまたは不適切なLMO4調節性増殖細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための医薬品の製造における、LMO4の発現またはLMO4の機能活性を調節することができる作用物質の使用であって、該医薬品は、LMO4の発現またはLMO4の機能活性を調節するのに十分な時間および条件の下で、該作用物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む方法において用いられるものであり、ここで該LMO4の発現もしくは活性の、阻害または拮抗によって該細胞増殖が下方制御されるものであり、かつ該作用物質はLMO4またはその抗原性部分に対して特異的な免疫相互作用性分子である、使用。
- 哺乳動物の***における、異常な、不要なまたは不適切なLMO4調節性細胞増殖を特徴とする状態の治療のための医薬品の製造における作用物質の使用であって、該作用物質はLMO4の発現またはLMO4の活性を調節するものであり、該LMO4の発現もしくは活性の、阻害または拮抗によって該細胞増殖が下方制御されるものであり、かつ該作用物質はLMO4またはその抗原性部分に対して特異的な免疫相互作用性分子である、使用。
- 免疫相互作用性分子が以下から選択されるものである、請求項32または33記載の使用:
(a) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有する抗体;
(b) LMO4またはその抗原決定基もしくはエピトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体;
(c) ECACC受託番号03052001によって特定されるハイブリドーマ16H2またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体;および
(d) ECACC受託番号03052002によって特定されるハイブリドーマ20F8またはその変異体もしくはバリアントによって分泌されるモノクローナル抗体。 - 細胞が新形成細胞である、請求項32または33記載の使用。
- 新形成細胞が乳癌を特徴づけるものである、請求項35記載の使用。
- 新形成細胞が***細胞である、請求項35記載の使用。
- 新形成細胞が***上皮細胞である、請求項35記載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPR761801 | 2001-09-12 | ||
PCT/AU2002/001246 WO2003023404A1 (en) | 2001-09-12 | 2002-09-12 | A method of diagnosis and treatment and agents useful for same |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005502066A JP2005502066A (ja) | 2005-01-20 |
JP2005502066A5 JP2005502066A5 (ja) | 2006-04-27 |
JP4628674B2 true JP4628674B2 (ja) | 2011-02-09 |
Family
ID=3831521
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003527424A Expired - Fee Related JP4628674B2 (ja) | 2001-09-12 | 2002-09-12 | 診断および治療の方法ならびにそのために有用な作用物質 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7700271B2 (ja) |
EP (1) | EP1436624B1 (ja) |
JP (1) | JP4628674B2 (ja) |
AT (1) | ATE550662T1 (ja) |
AU (1) | AU2002322199B2 (ja) |
CA (1) | CA2460092C (ja) |
NZ (1) | NZ569653A (ja) |
WO (1) | WO2003023404A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9815877B2 (en) | 2012-06-07 | 2017-11-14 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Controlled gene expression methods |
CN109979526B (zh) * | 2014-03-25 | 2023-11-24 | 凡弗3基因组有限公司 | 用于功能证实癌症突变的rna分析的***和方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998001460A1 (en) * | 1996-07-08 | 1998-01-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Brca1 compositions and methods for the diagnosis and treatment of breast cancer |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5837821A (en) | 1992-11-04 | 1998-11-17 | City Of Hope | Antibody construct |
AUPP713498A0 (en) | 1998-11-17 | 1998-12-10 | Chandler, Howard Milne | A method of detecting blood |
WO2001038878A2 (en) * | 1999-11-29 | 2001-05-31 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Pin1 as a marker for abnormal cell growth |
US20030092009A1 (en) * | 2000-11-16 | 2003-05-15 | Kaia Palm | Profiling tumor specific markers for the diagnosis and treatment of neoplastic disease |
AU2002950778A0 (en) * | 2002-08-15 | 2002-09-12 | The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland | A method of characterizing dendritic cells |
JP5339676B2 (ja) | 2003-02-21 | 2013-11-13 | メドベット サイエンス ピーティーワイ. リミテッド | 細胞を検出する方法、およびこれに有用な薬剤 |
-
2002
- 2002-09-12 EP EP02753953A patent/EP1436624B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-12 CA CA2460092A patent/CA2460092C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-12 AU AU2002322199A patent/AU2002322199B2/en not_active Ceased
- 2002-09-12 JP JP2003527424A patent/JP4628674B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-12 NZ NZ569653A patent/NZ569653A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-09-12 AT AT02753953T patent/ATE550662T1/de active
- 2002-09-12 WO PCT/AU2002/001246 patent/WO2003023404A1/en active Application Filing
-
2004
- 2004-03-12 US US10/799,797 patent/US7700271B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998001460A1 (en) * | 1996-07-08 | 1998-01-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Brca1 compositions and methods for the diagnosis and treatment of breast cancer |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003023404A8 (en) | 2003-05-08 |
ATE550662T1 (de) | 2012-04-15 |
CA2460092C (en) | 2013-05-21 |
US7700271B2 (en) | 2010-04-20 |
CA2460092A1 (en) | 2003-03-20 |
AU2002322199B2 (en) | 2009-06-04 |
US20050048528A1 (en) | 2005-03-03 |
WO2003023404A1 (en) | 2003-03-20 |
EP1436624A1 (en) | 2004-07-14 |
NZ569653A (en) | 2011-03-31 |
EP1436624A4 (en) | 2005-05-25 |
JP2005502066A (ja) | 2005-01-20 |
EP1436624B1 (en) | 2012-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101549245B1 (ko) | Wnt 단백질 및 암의 검출 및 치료 | |
JP5847755B2 (ja) | 細胞を検出する方法、およびこれに有用な薬剤 | |
JP2011501741A (ja) | がんの診断および治療のためのtaz/wwtr1 | |
US7285382B2 (en) | Compositions and methods for treatment of cancer | |
KR101560843B1 (ko) | 페리오스틴의 Exon-17 부위에 의해 코드되는 펩티드에 대한 항체를 함유하는 암 치료제 | |
US20100286362A1 (en) | Mammalian MDM2 Binding Proteins and Uses Thereof | |
EP1062514B1 (en) | C-myc coding region determinant-binding protein (crd-bp) | |
JP5756014B2 (ja) | がんの診断および治療のためのvhz | |
KR102550489B1 (ko) | 암 진단에 유용한 항체 | |
US8853183B2 (en) | Prognosis and treatment of breast cancer | |
JP2010535503A (ja) | 癌の診断および治療のためのvhz | |
JP4628674B2 (ja) | 診断および治療の方法ならびにそのために有用な作用物質 | |
US9944713B2 (en) | Antibody specific to the AIMP2-DX2 | |
US20080241066A1 (en) | Anti-PRL-3 antibodies and methods of use thereof | |
EP0960337B1 (en) | Cathepsin K and breast cancer | |
JP2004538452A (ja) | 診断法と診断薬 | |
RU2815883C1 (ru) | Антитела, пригодные в диагностике рака | |
JP3750945B2 (ja) | がん関連遺伝子mina53、タンパク質Mina53およびそのモノクローナル抗体 | |
EP1338655A1 (en) | Substance inhibiting the binding of signal transducing molecule to kdr/flk-1 phosphorylated at tyrosine at the 1175-position and method of using the same | |
AU2002322199A1 (en) | A method of diagnosis and treatment and agents useful for same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050912 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20050912 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060309 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070409 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080910 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081211 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081216 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081218 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090206 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090216 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090310 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091001 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100127 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100421 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100428 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100525 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100625 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101108 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101110 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |