KR101545068B1

KR101545068B1 - Ｃｄｄｏ 에틸 에스테르의 다형체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101545068B1
Application number: KR1020137013073A
Authority: KR
Inventors: 시아오홍 쟝; 송 뤼; 원동 순; 카이양 리우; 츈레이 한
Original assignee: 베이징 즈지엔진루이 셩우이야오 커지 요우시엔공스; 왕, 즈지엔; 시아오홍 쟝
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2015-08-17
Also published as: JP2014534208A; US20170355666A1; EP2739639A4; AU2012324029A1; EP2739639A1; WO2014048033A1; AU2012324029B2; US9656951B2; JP5972986B2; KR20140051813A; US20140315997A1; JP2016145212A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물(즉, 에틸 2-시아노-3,12-디옥솔레아나-1,9(11)-디엔-28-오에이트(CDDO 에틸 에스테르))의 다형체 형태 및 이를 이용하여 암 및 염증 관련 상태와 같은 여러 가지 질병 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>

Description

ＣＤＤＯ 에틸 에스테르의 다형체 및 이의 용도 {POLYMORPHS OF CDDO ETHYL ESTER AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2012년 9월 28일자 출원된 PCT 국제 출원 PCT/CN2012/082278호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 트리테르페노이드 화합물인 에틸 2-시아노-3,12-디옥솔레아나(dioxooleana)-1,9(11)-디엔-28-오에이트(CDDO 에틸 에스테르)의 다형체 형태들 및 이들 중 적어도 하나를 이용하여 일반적으로 염증과 관련된 여러 가지 질병 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

트리테르페노이드는 스쿠알렌의 고리화를 통해 식물에서 생합성된다. 의약용 후보물질이긴 하지만, 이들 천연 분자는 비교적 약한 생물학적 활성을 나타낸다. 따라서, 화학자들은 향상된 효능의 유사체를 합성하려 노력하여 왔다(Honda 등, 1997 및 1998).

몇몇의 합성 유사체는 IFN-γ 또는 LPS에 의해 자극되어진 대식 세포에서 시토킨 유도성 산화질소 합성 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 새로운 합성을 억제하는 것으로 보고되고 있다(Suh 등, 1998; Honda 등, 2002). 이들 중에서, 2-시아노-3,12-디옥솔레아나-1,9(11)-디엔-28-오에이트(CDDO)는 항염 및 항증식 활성을 나타낸다(Honda 등, 1998 및 2000). 나타낸 바와 같이, iNOS 활성의 억제제로서 및 특히 NO 생성의 억제에서 트리테르페노이드의 연구는 CDDO 및 CDDO 메틸 에스테르의 높은 효능을 입증하여 왔다(IC₅₀ < lnM 수준). Honda 등 (2000) 참조. 그러나, 이들의 치료 능력은 여전히 충분히 이용되지 않았었고, CDDO 에틸 에스테르의 경우에도 그다지 이용되지 않았었다.

화학식 1에서 나타낸 CDDO 에틸 에스테르의 치료 능력을 실현하기 위하여, 본 발명자들은 상기 화합물의 다형체 형태를 조사했다. 결과적으로, 본 발명자들은 약물 개발을 위한 이상적인 후보물질이 되도록 유리한 특성(예를 들어, 더 좋은 약동학적 프로필 및 더욱 큰 전신 노출)을 갖는 CDDO 에틸 에스테르의 세 개의 다형체 형태를 발견했다.

발명의 요약

일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물의 다형체 및/또는 이의 수화물 및/또는 용매화물을 제공한다:

특히, 이들 다형체에는 화학식 1의 화합물의 적어도 두 개의 실질적으로 순수한 결정 형태 및 하나의 실질적으로 순수한 유리질 고체 형태가 포함된다. 편의상, 이들 두 개의 결정 형태는 본원에서는 형태 I 및 형태 II라고 나타낸다.

몇몇 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태이고 약 52℃ ± 10℃의 Tg를 갖는다는 것에 특징이 있다.

몇몇의 다른 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태이고 대략 14.3°의 회절각 2θ의 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태는 85% 이상(즉, 적어도 85%)의 순도에 특징이 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 순도는 적어도 95% 또는 99%이다.

몇몇의 다른 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체 형태 I로서, 대략 10.3°, 14.1° 및 14.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체 형태 I로서, 대략 10.3°, 14.1°, 14.6°, 15.8°, 16.6° 및 19.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체 형태 I로서, 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 약 8.6Å, 6.3Å 및 6.1Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 상기 다형체는 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체 형태 I로서, 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 8.6Å, 6.3Å, 6.1Å, 5.6Å, 5.3Å, 및 4.5Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

본 발명의 다형체의 구체예들의 또 다른 서브세트는 결정 형태 I을 갖는다.

이러한 구체예들 중 몇몇에 있어서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I은 대략 10.3°, 14.1°, 14.6°, 15.7° 및 16.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I은 그의 X-선 분말 회절 패턴에서 대략 9.3° 및 19.6°의 회절각 2θ에서 추가의 특징적 피크를 갖는다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I은 174 내지 177℃의 융점에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I은 85% 이상(즉, 적어도 85%)의 순도에 의해 특징지어진다. 몇몇의 다른 구체예에서, 그 순도는 적어도 95% 또는 99%이다.

본 발명의 다형체의 구체예들의 또 다른 서브세트는 결정 형태 II를 갖는다.

이러한 구체예들 중 몇몇에 있어서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 대략 10.4°, 12.1° 및 13.4°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 그의 X-선 분말 회절 패턴에서 대략 15.4°, 17.8° 및 18.8°의 회절각 2θ에서 추가의 특징적 피크를 갖는다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 8.5Å, 7.3Å 및 6.6Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 5.7Å, 5.0Å 및 4.7Å에서 추가의 특징적 피크를 갖는다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 209 내지 212℃의 융점에 의해 특징지어진다.

몇몇의 다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 85% 이상(예를 들어 적어도 95% 또는 적어도 99%)의 순도를 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법의 일 구체예는 CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 헵탄 또는 이들의 혼합물의 용매에서 과량의 상기 화합물을 적어도 24 시간 동안 슬러리화하는 단계와, 얻어지는 결정성 다형체 또는 유리질 고체 형태를 회수하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시예에서, 상기 얻어지는 결정 형태는 형태 I 또는 형태 II일 수 있다.

몇몇의 다른 실시예에서, 화학식 1의 화합물은 실온 또는 50℃에서 혼합 용매에서 슬러리화된다.

몇몇의 다른 실시예에서, 화학식 1의 화합물은 적어도 48 시간 동안 슬러리화된다.

상기 용매는 에틸 아세테이트/헵탄 혼합물 또는 에탄올/헵탄 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 에틸 아세테이트/헵탄 혼합물은 1:10 (w/w 또는 v/v)의 비율로 에틸 아세테이트 및 헵탄을 가질 수 있다.

본 발명의 다형체를 제공하기 위하여, 적어도 하나의 용매를 포함하는 적당한 용매계로부터 화학식 1의 화합물을 결정화하는 것은 용매계에서의 과포화를 달성하기 위하여 자발적인 침전(증발), 냉각 또는 항-용매(여기서 본 발명의 화합물이 비교적 더 낮은 용해도를 갖는다) 첨가의 방법을 통해 달성될 수 있다. 또한, 결정화는 본 발명의 화합물을 결정화하는데 적당한 결정 종자(crystal seed)를 이용하거나 이용하지 않고 달성될 수 있다.

몇몇의 다른 실시예에서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 실온에서 헵탄 용매에 용해된 다음, 자발적으로 침전되어, 174 내지 177℃의 융점을 갖는 원하는 결정 형태 I을 얻는다.

몇몇의 다른 실시예에서, 본 발명의 화학식 1의 과량의 화합물의 슬러리 현탁액은 실온 또는 50℃의 온도에서 적어도 48 시간 동안 에틸 아세테이트/헵탄(1:10 w/w 또는 v/v)의 혼합 용매에서 교반되어, 209 내지 212℃의 융점을 갖는 원하는 결정 형태 II를 얻는다.

몇몇의 다른 실시예에서, 본 발명의 화학식 1의 과량의 화합물의 슬러리 현탁액은 실온 또는 50℃의 온도에서 디클로로메탄 용매에 용해된 다음, 용매를 증발시켜서 52℃ ± 10℃ 범위의 Tg를 갖는 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태를 얻는다.

또한, 본 발명은 신체 장애 또는 상태, 특히 염증과 관련된 것들을 치료하거나, 신체 장애 또는 상태, 예를 들어 급성 또는 만성 산화성 스트레스를 수반하는 것들 및 염증, 특히 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 또는 유도성 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 과발현에 의해 부분적으로 특징지어지는 것들을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 화학식 1의 화합물의 다형체(결정 형태 I 및 II 및 유리질 고체 형태를 포함)의 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명은 적어도 본 발명의 치료적 유효량의 결정 형태 I 또는 II 또는 유리질 고체 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 보조제 또는 담체를 각각 포함하는 약학적 조성물 또는 의약에 관한 것이기도 하다. 선택적으로, 상기 조성물 또는 의약은 적어도 한 종의 추가의 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 의약은 치료될 상태 또는 질병에 적절한 형태 또는 제형(예를 들어, 정제 또는 캡슐)일 수 있고, 당업계에 알려진 방식, 예를 들어 경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 의약은 화학식 1의 화합물의 다형체(예를 들어, 결정 형태 I, 결정 형태 II 또는 유리질 고체 형태)를 1 내지 99 중량%(예를 들어, 1 내지 70 중량%, 10 내지 30 중량%)로 포함할 수 있다.

본 발명의 모든 다형체들(결정 형태 및 유리질 형태를 포함)은 실질적으로 또는 거의 순수하다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "거의 순수한"은 적어도 85 중량%(예를 들어, 적어도 95 중량% 또는 적어도 99 중량%)의 화학식 1의 화합물이 본 발명의 다형체, 특히 결정 형태 I 또는 II에 존재하는 것을 의미한다.

상기의 결정 형태 및 유리질 고체 형태 다형체에서 기재된 주요 피크들은 재현가능한 것으로, 오차 범위 내에 있다(기재된 값 ± 0.2).

본 발명에 있어서, "도 1에서와 같이 도시한 X-선 분말 회절 패턴"은 도 1에서와 같은 주요 피크들을 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 의미하는 것으로, 상기 주요 피크들은 도 1에서의 (100%로 나타낸 상대적 강도를 갖는) 최고 피크를 기준으로 10% 초과, 바람직하게는 30% 초과의 상대적 강도를 갖는 것들을 의미한다. 마찬가지로, 본 발명에 있어서, 도 2에서와 같이 도시한 X-선 분말 회절 패턴은 도 2에서와 같은 주요 피크들을 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 의미하고, 상기 주요 피크들은 각각 도 2에서의 (100%로 나타낸 상대적 강도를 갖는) 최고 피크를 기준으로 10% 초과, 바람직하게는 30% 초과의 상대적 강도를 갖는 것들을 의미한다.

또한, 화학식 1의 화합물의 제조 방법들도 본 발명의 범위 내에 있으며, 상기 방법들은 각각 하기의 반응식에 도시한 단계들을 포함한다:

또한, 본 발명은 대식 세포에서 IFN-γ 유도 NO 생성을 억제하거나, 암의 치료, 또는 루퍼스 또는 류머티스성 관절염, 크론병 또는 궤양성 대장염, 심혈관 질환, 당뇨, 1종 이상의 당뇨 합병증으로서, 비만, 고혈압, 죽상동맥경화증, 관상 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 고혈압, 신장병증, 신경병증, 근육괴사, 망막병증 및 대사성 증후군(증후군 X)로 이루어진 군에서 선택된 합병증, 또는 이들 중 둘 이상의 조합과 같은, 염증 성분을 갖는 질병, 장애 또는 상태의 치료를 위한, 화학식 1의 화합물, 또는 이의 결정 형태 I, 결정 형태 II, 유리질 고체 형태로부터 선택된 다형체 또는 형태의 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 질병, 또는 질병 또는 장애의 임상적 증상들 중 적어도 하나를 치료하기 위해 개체(subject)에게 투여시 이러한 질병, 장애 또는 증상의 치료에 작용하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 화합물, 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상, 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상의 심각성, 치료될 개체의 연령, 및/또는 치료될 개체의 체중에 따라 변화할 수 있다. 임의의 경우의 적절한 양은 당업자에게 명백할 수 있거나 통상의 실험을 통해 결정될 수 있다. 병용 요법(즉, 본 발명의 다형체 외에도 적어도 또 다른 활성 성분을 가짐)의 경우, 용어 "치료적 유효량"은 질병, 장애 또는 상태의 효과적인 치료를 위한 조합 성분들의 총량을 의미한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 치료를 필요로 하는 개체에게 경구, 흡입, 직장, 비경구 또는 국소 투여될 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 약학적 조성물은 정제, 분말, 과립, 캡슐 등과 같은 일반적인 고체 제형, 물 또는 오일 현탁액과 같은 액체 제형, 또는 시럽, 용액, 현탁액 등과 같은 다른 액체 제형일 수 있고, 비경구 투여의 경우, 상기 약학적 조성물은 용액, 수용액, 오일 현탁액 농축물, 동결건조 분말 등일 수 있다. 바람직하게, 상기 약학적 조성물의 제형은 정제, 코팅 정제, 캡슐, 좌제, 비강 스프레이(nasal spray) 또는 주사액으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 정제 또는 캡슐로부터 선택된다. 상기 약학적 조성물은 정확한 투여량을 갖는 단일 단위 투여 형태일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 모든 제형들은 제약 분야에서 알려진 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성 성분을 1종 이상의 부형제와 혼합하여 원하는 제형을 제조할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 원하는 약학적 제형에 적당한 통상적인 약학적 담체를 의미하고, 그 예로는 희석제, 물, 여러 가지 유기 용매 등과 같은 비히클, 전분, 수크로스 등과 같은 충진제, 셀룰로오스 유도체, 알기네이트, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 바인더, 글리세롤과 같은 습윤제, 아가, 탄산칼슘 및 중탄산나트륨과 같은 붕해제, 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 증진제, 헥사데칸올과 같은 계면활성제, 카올린 및 비누 클레이(soap clay)와 같은 흡수 담체, 탤크, 스테아르산칼슘, 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 윤활제가 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 분산화제(decentralized agent), 안정화제, 증점제, 착화제, 완충제, 투과 향상제, 중합체, 방향제, 감미제 및 염료와 같은 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 부형제는 원하는 제형 및 투여 형태에 적당하다.

본원에서 사용되는 용어 "용매화물"은 용매와 화합물의 상호작용에 의해 형성된 화학적 실체(entity)를 의미한다. 적당한 용매화물은 일수화물 및 반수화물을 비롯한 수화물과 같은 약학적으로 허용가능한 용매화물이다.

본원에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 생물학적 활성을 갖는 화학적 실체를 나타내기 위해 사용된다. 특정의 구체예에서, "활성 성분"은 약학적 유용성을 갖는 화합물이다. 예를 들어, 활성제는 항암 치료제일 수 있다.

용어 "질병" 또는 "장애" 또는 "상태"는 임의의 질병, 불편함, 병, 증상 또는 징후를 의미한다.

도 1은 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I의 X-선 분말 회절 패턴을 도시한다.
도 2는 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II의 X-선 분말 회절 패턴을 도시한다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태의 X-선 분말 회절 패턴을 도시한다.
도 4는 유리질 고체 형태의 열 흐름(w/g)을 도시한다.
도 5는 마우스의 대식세포 17에서 IFN-g에 의해 유도된 산화질소 생성에 대한 화학식 1의 화합물(CDDO 에틸 에스테르)의 결정 형태 II의 억제 효과를 도시한다.

도 1, 2 및 3에서와 같이 도시한 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 엠피리언 콘솔(Empyrean console)을 갖는 PANalytical X-선 회절 시스템 상에 생성했다. 회절 피크 위치는 28.443도의 2θ 값을 갖는 단결정 규소를 이용하여 검정했다. 엠피리언 Cu LEF X-선 튜브의 K-알파 방사선을 X-선의 광원으로 사용했다.

본 발명을 하기의 실시예들을 통해 더욱더 예시하지만 이들 실시예들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서, 기법 또는 방법은 달리 특별히 언급하지 않는 경우 당업계에 알려진 통상적인 기법 또는 방법이다.

실시예 1: 화학식 1의 화합물의 합성

단계 1: APSN13B-1의 합성

DMF (12 L)에 용해된 올레아놀산(1000 g, 2.2 mol) 및 탄산칼륨(604 g, 4.4 mol)의 용액에 요오드화에틸(376 g, 2.4 mol)을 첨가했다. 그 혼합물을 45℃에서 밤새 교반했다. HPLC에 의한 검출시 올레아놀산이 사라진 후, 그 혼합물을 실온으로 냉각하고 물(120 L)에 부었다. 얻어지는 현탁액을 30 분간 교반했다. 원심분리를 통해 고체를 수집하고, 물(1L)로 세척하고, 50℃에서 진공 건조하여 976 g의 APSN13B-1을 얻어서 나중에 사용했다. 수율은 92%였다.

단계 2: APSN13B-2의 합성

THF (6 L)에 용해된 APSN13B-1(975 g, 2 mol), 피리딘(474 g), DMAP(24.4 g, 0.2 mol)의 혼합물에 45℃에서 아세트산 무수물(612 g, 6 mol)을 첨가했다. 그 용액을 밤새 교반했다. 반응이 완료된 후, 그 용액을 물(60 L)에 부었다. 원심분리를 통해 고체를 수집하고, 45℃에서 진공 건조하여 847 g의 APSN13B-2를 얻어 나중에 사용했다. 수율은 80%였다.

단계 3: APSN13B-3의 합성

DCM (5 L)에 용해된 APSN13B-2(846 g, 1.6 mol), 포름산(1 L)의 용액에 실온에서 과산화수소(30%, 수용액)(453 g, 4 mol)을 서서히 첨가하고 밤새 교반했다. 그 용액에 물(2 L)을 첨가하고 DCM으로 추출했다. 수상이 중성이 될 때까지 유기상을 포화 수성 NaHCO₃으로 세척한 다음 염수로 세척하고 무수 Na₂SO₄위에서 건조시켰다. 그 유기상을 여과하고, 그 여액을 진공 증발시켜서 871 g의 APSN13B-3을 얻었다(100% 수율). 이 물질은 추가의 정제 없이 다음 반응에 사용했다.

단계 4: APSN13B-4의 합성

아세트산(5 L)에 용해된 APSN13B-3(871 g, 1.6 mol)의 용액에 45℃에서 아세트산(40%) 중의 브롬화수소산(30 ml)의 용액을 첨가한 다음, 아세트산(700 ml)에 용해된 브롬(256 g)의 용액을 서서히 첨가했다. 그 혼합물을 45℃에서 30 분간 교반했다. 아세트산(1.3 L)에 용해된 브롬(512 g)의 또 다른 용액을 서서히 첨가하고 실온에서 밤새 계속 교반했다. 반응이 종료된 때, 그 혼합물을 차가운 물(35 L)에 부었다. 고체를 수집하고, 포화 아황산나트륨 용액으로 세척하고 진공 건조시켜서 841 g의 APSN13B-4를 황색 고체로서 얻었다(97% 수율).

단계 5: APSN13B-5의 합성

EtOH(4.5 L)에 용해된 APSN13B-4(840 g, 1.56 mol) 및 KOH(263 g, 4.7 mol)의 용액을 30분간 환류 하에 가열했다. 진공에서 EtOH의 제거 후, 얻어지는 혼합물을 6 N HCl 수용액으로 산성화했다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 L)로 추출했다. 유기 상을 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 위에서 건조시켰다. 그 유기 상을 여과하고, 그 여액을 진공 증발시켜서 928 g의 APSN13B-5를 얻었다(100% 수율).

단계 6: APSN13B-6의 합성

빙조에서 아세톤(5 L)에 용해된 APSN13B-5(927 g, 1.8 mol)의 용액에 Jones 시약(400 ml)을 적가했다. 그 혼합물을, TLC로 검출시 APSN13B-5가 사라질 때까지 실온에서 교반했다. 아세톤의 제거 후, 얻어지는 혼합물에 물을 첨가했다. 그 수성 혼합물을 DCM으로 추출했다. 그 유기 상을 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 위에서 건조시키고 여과했다. 그 여액을 진공 증발시켜서 조질의APSN13B-6을 얻었다. 석유 및 에틸 아세테이트에서 재결정화를 통해 498 g의 순수한 APSN13B-6을 얻었다(54% 수율).

단계 7: APSN13B-7의 합성

건조 톨루엔(2 L)에 용해된 APSN13B-6(496 g, 1 mol)의 용액에 에틸 포름에이트(185 g, 2.5 mol) 및 CH₃ONa(216 g, 4 mol)를 첨가했다. 그 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반했다. 다음에, 그 혼합물을 에틸 아세테이트(1 L)로 희석하고 5% HCl 수용액으로 3회 세척했다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 다시 추출하고, 합쳐진 유기 층들을 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 위에서 건조시키고 여과했다. 그 여액을 진공 증발시켜서 497 g의 APSN13B-7을 얻었다(95% 수율).

단계 8: APSN13B-8의 합성

EtOH(2.5 L) 및 물(200 ml)에 용해된 APSN13B-7(496 g, 0.94 mol)의 용액에 히드록실아민 히드로클로라이드(98 g, 1.4 mol)를 첨가했다. 그 혼합물을 2 시간 동안 환류 하에 가열했다. 그 혼합물을 진공 농축하고 물(2 L)을 첨가했다. 그 혼합물을 EA로 3회 추출했다. 합쳐진 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 위에서 건조시키고 여과했다. 그 여액을 진공 증발시켜서 453 g의 APSN13B-8을 얻었다(92% 수율).

단계 9: APSN13B-9의 합성

빙조에서 EtOH(1.5 L)에 용해된 APSN13B-8(452 g, 0.86 mol)의 용액에 CH₃ONa(56 g, 1.04 mol)를 첨가했다. 그 혼합물을 실온에서 1 시간 교반했다. 그 혼합물을 진공 농축하고 에틸 아세테이트(2 L)를 첨가했다. 그 혼합물을 5% HCl 수용액으로 3회 세척했다. 수상을 EA로 재추출하고 합쳐진 유기 층들을 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 위에서 건조시키고 여과했다. 그 여액을 진공 증발시켜서 429 g의 APSN13B-9를 얻었다(95% 수율).

단계 10: APSN13B-10 (화학식 1의 화합물)의 합성

톨루엔(2.5 L)에 용해된 APSN13B-9(428 g, 0.82 mol) 및 DDQ(205 g, 0.90 mol)의 혼합물을 환류 하에 밤새 가열했다. 불용성 물질을 여과를 통해 제거한 후, 그 여액을 진공 증발시켜서 조질의 고체를 얻었다. 그 고체를 플래시 칼럼 크로마토그래피하여 341 g의 APSN13B-10을 얻었다(80% 수율). 그 생성물을 에틸 아세테아트 및 석유에서 재결정화를 통해 추가로 정제하여 화학적 순도의 생성물을 얻었다. 최종 생성물의 최대 불순도는 0.1% 미만이었다.

실시예 2: 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I의 제조

상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조한 화학식 1의 화합물을 실온에서 헵탄 용매에 용해시킨 다음, 자발적으로 침전시켜서 174 내지 177℃의 융점을 갖는 원하는 결정 형태 I을 얻었다.

도 1에서 도시한 상기 생성물의 X-선 회절 패턴이 하기 표 1에 요약되어 있다.

실시예 3: 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II의 제조

1. 상기 실시예 1에서 기재된 방법으로부터 제조한 과량의 화학식 1의 화합물의 슬러리 현탁액을 실온 또는 50℃에서 에틸 아세테이트/헵탄(1:10 w/w 또는 v/v)에서 적어도 48 시간 동안 교반하여, 209 내지 212℃의 융점을 갖는 결정 형태 II를 얻었다.

도 2에서 도시한 상기 생성물의 X-선 회절 패턴이 하기 표 2에서 요약되어 있다.

실시예 4: 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태의 제조

상기 실시예 1에서 기재된 방법으로부터 제조한 과량의 화학식 1의 화합물의 슬러리 현탁액을 실온 또는 50℃에서 디클로로메탄 용매에 용해시킨 다음, 용매를 증발시켜서 52 ± 10℃의 Tg를 갖는 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태를 얻었다.

도 3은 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태의 X-선 분말 회절 패턴을 도시한다. 도 4는 유리질 고체 형태의 열 흐름 (w/g)을 도시한다.

실시예 5: 화학식 1의 화합물의 다형체의 예비 약동학적 특성

CD-1 암컷 마우스에게, DMSO-크래모포어-PBS에 용해된 화학식 1의 화합물(CDDO 에틸)의 세 개의 다형체 및 메틸 2-시아노-3,12-디옥솔레아나-1,9(11)-디엔- 28-오에이트(CDDO 메틸)(1:1:8 w/w 또는 v/v)을 10 mg/kg의 양으로 복막내 (ip) 주사했다. 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 24 시간째에 혈액 시료를 수집했다. 그 수준을 표준용 대조군 혈액에 첨가된 화합물을 이용하여 HPLC/MS를 통해 정량했다. PK 결과는 하기 표 3에서 도시되어 있다. CDDO 에틸의 화학식 1의 화합물의 세 개의 다형체의 전신 노출은 CDDO 메틸의 것보다 높았다. 그 순서는 다음과 같다: CDDO 에틸의 유리질 고체 형태> CDDO 에틸의 결정 형태 II > CDDO 에틸의 결정 형태 I > CDDO 메틸.

실시예 6: 결정 형태의 안정성 측정

실시예 3에서 기재된 바와 같이 제조한 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II를 25℃/60% 상대습도 및 40℃/75% 상대습도에서 시험했다. 모든 시료의 XRD의 유의한 변화는 없었다. 본 발명의 다른 다형체들은 본 연구에서 유사하게 사용되었다. 본 발명의 다른 다형체와 비교하여, 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II는 본 연구에서 열역학적으로 가장 안정한 결정 형태인 것으로 확인되었다.

실시예 7: 유리질 고체 형태의 안정성 측정

실시예 4에서 기재한 바와 같이 제조한 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태를 25℃/60% 상대습도 및 40℃/75% 상대습도에서 1주간 시험했다. 모든 시료의 XRD의 유의한 변화는 없었다.

실시예 8: 화학식 1의 화합물의 결정 형태 II로 처리한 RAW 264.7 세포에서 NO의 측정

검정 과정

RAW264.7 세포 배양

1. 37℃ 및 5% CO₂에서 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 RAW264.7 세포를 유지했다.

2. 현미경을 이용하여 배양액을 관찰하여 컨플루언시(confluency)의 정도를 평가하고 세균 및 진균 오염물의 부재를 확인했다.

3. 소비된 배지를 제거했다.

4. 세포 단일층을 미리 가온한 D-PBS로 세척했다.

5. 피펫을 이용하여, 세척된 세포 단일층 상으로 3 ml 트립신/EDTA를 이동시키고, 플라스크를 회전시켜서 단일층을 트립신으로 덮었다.

6. 현미경을 이용하여 세포를 조사하여 모든 세포가 떨어져 있고 부유하고 있다는 것을 확인했다.

7. 작은 체적의 신선한 혈청-함유 배지에 세포를 재현탁하여 트립신을 불활성화시켰다.

8. 실온에서 5 분간 1000 rpm으로 원심분리를 통해 세포를 수확했다.

9. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 배양했다.

RAW264.7 세포에서 NO의 유도

1. 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 1x10⁵/웰의 밀도로 분주했다.

2. 37℃ 및 5% CO₂에서 2 시간 배양한 후, 비부착 세포들을 흡입을 통해 제거하고, 10 ng/ml IFN-γ 및 희석된 화합물을 갖는 새로 제조한 완전 배지를 첨가했다.

3. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 48 시간 동안 배양했다.

RAW 세포에서 NO의 측정

1. 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상층 배지를 수집했다.

2. 실험 시료에 사용된 기질 또는 완충액에 제공된 0.1 M 아질산염 표준물을 1:1,000으로 희석하여 1 ml의 100 μM 아질산염 용액을 제조했다.

3. 아질산염 표준물 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 및 0 μM, 50 ㎕/웰을 제조했다.

4. 설파닐아미드 용액 및 NED 용액을 실온에서 15 내지 30 분간 평형시켰다.

5. 50 ㎕의 각각의 실험 시료를 웰에 이중으로 첨가했다.

6. 다중 채널 피펫을 이용하여, 50 ㎕의 설파닐아미드 용액을 모든 실험 시료 및 아질산염 표준물에 대한 일련의 희석물을 함유하는 웰에 제공했다.

7. 빛이 차단된 조건 하에서 실온에서 5 내지 10 분간 배양했다.

8. 다중 채널 피펫을 이용하여 50 ㎕의 NED 용액을 모든 웰에 제공했다.

9. 빛이 차단된 조건 하에서 실온에서 5 내지 10 분간 배양했다. 자주색/마젠타색이 즉시 형성되기 시작했다.

10. 520 nm 내지 550 nm에서 필터를 구비한 플레이트 리더를 이용하여 30분 이내에 흡광도를 측정했다.

마우스 대식세포 17에서 IFN-g에 의해 유도된 NO 생성에 대한 화학식 1의 화합물(CDDO 에틸 에스테르)의 결정 형태 II의 억제 활성(IC₅₀ (nM) 값으로 측정됨)이 도 5에 도시되어 있다. 화학식 1의 화합물(CDDO 에틸 에스테르)의 결정 형태 II의 IC₅₀은 34 nM이었다. 화학식 1의 화합물(CDDO 에틸 에스테르)의 유리질 고체 형태의 IC₅₀은 32 nM이었다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물의 다형체:
<화학식 1>

i) 유리질 고체 형태이고 유리 전이 온도(Tg)가 52℃ ± 10℃이거나;
ii) 10.3°, 14.1° 및 14.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 I이거나; 또는
iii) 10.4°, 12.1° 및 13.4°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 II이다.
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제 1 항에 있어서, 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 8.6Å, 6.3Å 및 6.1Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 I인 다형체.
제 1 항에 있어서, 10.3°, 14.1°, 14.6°, 15.8°, 16.6° 및 19.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 I인 다형체.
제 5 항에 있어서, 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 8.6Å, 6.3Å, 6.1Å, 5.6Å, 5.3Å 및 4.5Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 I인 다형체.
제 1 항에 있어서, 결정 형태 I이고, 10.3°, 14.1°, 14.6°, 15.7° 및 16.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 다형체.
제 7 항에 있어서, 9.3° 및 19.6°의 회절각 2θ에서 추가의 특징적 피크를 갖는 다형체.
제 1 항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정 형태 I이고, 174 내지 177℃의 융점에 의해 특징지어지는 다형체.
제 1항 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 유리질 고체 형태 또는 결정 형태 I이고, 85% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
제 10 항에 있어서, 95% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
제 11 항에 있어서, 99% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
삭제
제 1 항에 있어서, 결정 형태 II이고, 상기 X-선 분말 회절 패턴은 15.4°, 17.8° 및 18.8°의 회절각 2θ에서 추가의 특징적 피크를 갖는 다형체.
제 1 항에 있어서, 결정 형태 II이고, 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 8.5Å, 7.3Å 및 6.6Å에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 다형체.
제 15 항에 있어서, 상기 X-선 분말 회절 패턴은 결정면간 거리로 환산하여 나타낼 때 5.7Å, 5.0Å 및 4.7Å에서 추가의 특징적 피크를 갖는 다형체.
제 1항 및 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정 형태 II이고, 209 내지 212℃의 융점에 의해 특징지어지는 다형체.
제 1항 및 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정 형태 II이고, 85% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
제 18 항에 있어서, 95% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
제 19 항에 있어서, 99% 이상의 순도에 의해 특징지어지는 다형체.
하기 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체의 제조 방법으로서, CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 헵탄 또는 이들의 혼합물의 용매에서 과량의 상기 화합물을 적어도 24 시간 동안 슬러리화하는 단계와, 얻어지는 결정성 다형체 또는 유리질 고체 형태를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
<화학식 1>
제 21 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체는
10.3°, 14.1° 및 14.6°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 I이거나, 또는
10.4°, 12.1° 및 13.4°의 회절각 2θ에서 특징적 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴에 의해 특징지어지는 결정 형태 II인 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 실온 또는 50℃에서 혼합 용매에서 슬러리화되는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 적어도 48 시간 동안 용매에서 슬러리화되는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 용매는 CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 헵탄, 에탄올/헵탄 혼합물, 에틸 아세테이트/헵탄 혼합물, 또는 이들의 혼합물인 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 에탄올/헵탄 혼합물은 1:10 w/w 또는 v/v의 비율로 에탄올 및 헵탄을 갖는 방법.
하기 화학식 1의 화합물의 결정성 다형체의 제조 방법으로서, 실온에서 에탄올과 헵탄의 혼합 용매에 상기 화합물을 용해하는 단계와, 상기 화합물을 결정성 다형체로 자발적으로 침전시키는 단계와, 얻어지는 상기 결정성 다형체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
<화학식 1>
하기 화학식 1의 화합물의 유리질 고체 형태의 제조 방법으로서, 실온 또는 50℃에서 디클로로메탄 용매에 상기 화합물을 용해시키는 단계와, 상기 용매를 증발시켜서 유리질 고체 형태를 얻는 단계를 포함하는 방법.
<화학식 1>
제 1 항, 제 4 항 내지 제 8 항, 및 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 다형체와, 약학적으로 허용가능한 부형제, 보조제 또는 담체를 포함하는,
암 또는 염증 관련 상태의 치료를 위한, 약학적 조성물.
제 29 항에 있어서, 추가의 활성 성분을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 29 항에 있어서, 상기 다형체가 화학식 1의 화합물의 결정 형태 I 또는 II인 약학적 조성물.
제 29 항에 있어서, 경구 투여되는 것인 약학적 조성물.
제 32 항에 있어서, 정제 또는 캡슐 형태로 사용되는 약학적 조성물.
제 29 항에 있어서, 1 내지 99 중량%의 상기 다형체를 포함하는 약학적 조성물.
제 34 항에 있어서, 1 내지 70 중량%의 상기 다형체를 포함하는 약학적 조성물.
제 35 항에 있어서, 10 내지 30 중량%의 상기 다형체를 포함하는 약학적 조성물.
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삭제
제 29 항에 있어서, 상기 염증 관련 상태가 루퍼스 또는 류머티스성 관절염, 크론병 또는 궤양성 대장염, 심혈관 질환, 당뇨 또는 당뇨 관련 상태인 것인 약학적 조성물.
제 39 항에 있어서, 상기 당뇨 관련 상태가 비만, 고혈압, 죽상동맥경화증, 관상 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 신장병증, 신경병증, 근육괴사, 망막병증, 대사성 증후군(증후군 X), 또는 이들의 조합인 것인 약학적 조성물.
삭제
인간을 제외한 개체에서 암 또는 염증 관련 상태를 치료하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 인간을 제외한 개체에게 제 1 항, 제 4 항 내지 제 8 항, 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 다형체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 42 항에 있어서, 상기 염증 관련 상태가 루퍼스 또는 류머티스성 관절염, 크론병 또는 궤양성 대장염, 심혈관 질환, 당뇨 또는 당뇨 관련 상태인 방법.
제 43 항에 있어서, 상기 당뇨 관련 상태가 비만, 고혈압, 죽상동맥경화증, 관상 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 신장병증, 신경병증, 근육괴사, 망막병증, 대사성 증후군(증후군 X), 또는 이들의 조합인 방법.
하기 반응식에 도시한 바와 같은 단계들을 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조 방법:
<화학식 1>

1) 올레아놀산과 요오드화에틸을 반응시켜 APSN13B-1을 얻는 단계;
2) APSN13B-1과 아세트산 무수물을 반응시켜 APSN13B-2를 얻는 단계;
3) APSN13B-2에 과산화수소를 반응시켜 APSN13B-3을 얻는 단계;
4) 아세트산 중의 APSN13B-3에 브롬화수소산, 및 브롬을 첨가하여 APSN13B-4를 얻는 단계;
5) APSN13B-4와 KOH을 반응시켜 APSN13B-5를 얻는 단계;
6) APSN13B-5의 용액에 Jones 시약을 적가하여, APSN13B-6을 얻는 단계;
7) APSN13B-6의 용액에 에틸 포름에이트 및 CH₃ONa를 첨가하여 APSN13B-7을 얻는 단계;
8) APSN13B-7의 용액에 히드록실아민 히드로클로라이드를 첨가하여 APSN13B-8을 얻는 단계;
9) APSN13B-8의 용액에 CH₃ONa를 첨가하여 APSN13B-9를 얻는 단계;
10) APSN13B-9 및 DDQ의 혼합물을 환류 하에 가열하여 APSN13B-10을 얻는 단계.