KR101544254B1 - 쿠커비투릴[7]을 이용한 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쿠커비투릴[7]을 이용하여 아밀로이드-베타 단백질의 나노섬유화 수준을 제어하고 또한 나노섬유들을 서로 분산할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아밀로이드-베타의 나노섬유화 정도가 제어됨에 따라 다양한 크기의 나노섬유를 조성할 수 있고, 또한 나노섬유간 분산을 유도함에 따라 단백질 나노섬유의 제조과정에서 섬유의 길이 제어 및 섬유간 분산이 필요할 경우 사용할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

쿠커비투릴[7]을 이용한 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법{Cucurbiturill[7] as amyloid-beta nanofibril controller and dispersing agent}

본 발명은 아밀로이드-베타 단백질의 나노섬유화 제어 및 나노섬유들을 서로 분산시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아밀로이드-베타 단백질의 (Aβ 1-40, 1-42) 나노 섬유화 정도를 제어하여 다양한 크기의 나노섬유를 조성하고, 또한 나노섬유간 분산을 유도하여 단백질 나노섬유의 제조과정에서 섬유의 길이 제어 및 섬유간 분산이 필요할 경우 사용할 수 있는 방법에 관한 것이다.

아밀로이드 단백질군은 (amyloid proteins) 베타 평판 구조의 형태로 서로 엉겨 응집되는 단백질들을 의미하는데, 아밀로이드 단백질들의 베타 평판 응집현상은 다수의 질병과 관련된다.

대표적인 예로서 본 발명의 대상인 아밀로이드-베타 단백 (비특허문헌 1, 2) 및 타우 단백은 (비특허문헌 3) 치매와 (Alzheimer's disease) 연관되어 있으며, 이형 당뇨의 경우에도 아밀린의(Amylin) (비특허문헌 4, 5) 응집이 연관되어 있다. 심지어는 동맥경화의 경우에도 아포지방단백질 A1의 (apolipoprotein A1) 응집이 관련이 되어있음이 보고되어 있다 (비특허문헌 6, 7).

대한민국 특허 공개 10-2006-93399호에 기재된 바와 같이, 상술한 베타아밀로이드는 알츠하이머병 환자에서 발견되는 단백질로, 아밀로이드 단백질 전구체(APP)에서 유래된 39-43개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다(Seubert, P., C. Vigo-Pelfrey, et al.(1992)."Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids." Nature 359(6393): 325-7., Shoji, M., T. E. Golde, et al.(1992). "Production of the Alzheimer amyloid beta protein by normal proteolytic processing." Science 258(5079):126-9., Busciglio, J., D. H. Gabuzda, et al. (1993). "Generation of beta-amyloid in the secretory pathway in neuronal and nonneuronal cells." Proc Natl Acad Sci USA 90(5):2092-6). 아밀로이드 단백질 전구체(APP)는 β-, γ-분해효소(β-, γ-secretase) 중 β-분해효소에 의하여 베타아밀로이드 40 또는 42(Aβ40 또는 Aβ42) 단량체(monomer)가 된 후 집적하여 올리고머(oligomer)를 형성하고 이 올리고머의 집적으로 피브릴(fibril)의 단계를 거치게 된다. 이러한 여러 단계의 베타아밀로이드 중에서 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키게 된다(Walsh, D. M., I. Klyubin, et al. (2002). "Naturally secreted oligomers of amyloid betaprotein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo." Nature 416(6880):535-9., Stine, W. B., Jr., K. N. Dahlgren, et al. (2003). "In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis." J Biol Chem 278(13):11612-22., Ferreira, S. T., M. N. Vieira, et al. (2007). "Soluble protein oligomers as emerging toxins in Alzheimer's and other amyloid diseases." IUBMB Life 59(4-5):332-45). 그러므로 집적된 베타아밀로이드를 분해하거나 집적을 억제하는 것이 알츠하이머병을 치료하는데 중요하다. 집적된 아밀로이드에서 대부분을 이루고 있는 베타아밀로이드의 동종형(isoform)은 아미노산 40개와 42개로 이루어진 베타아밀로이드 40과 42이며(Huang, T. H., D. S. Yang, et al. (2000). "Structural studies of soluble oligomers of the Alzheimer beta-amyloid peptide." J Mol Biol 297(1):73-87., Bitan, G., M. D. Kirkitadze, et al. (2003). "Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways." Proc Natl Acad Sci USA 100(1):330-5), 이들이 집적될 때 관여하는 여러 요인들 중 집적을 도와주는 물질로 글루코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)과 프로테오글리칸(proteoglycan, PG)이 있다. 세포막에 존재하고 있는 글루코사미노글리칸/프로테오글리칸은 베타아밀로이드와 결합하여 구조적 변화를 일으켜 베타아밀로이드가 집적되도록 도와주고 있다. 특히 글루코사미노글리칸/프로테오글리칸의 황산염 구조(sulfate moiety) 부분이 베타아밀로이드의 40 혹은 42개의 아미노산 중 13-16번째에 해당하는 HHQK 부분에 결합하여 집적을 시키는 중요한 요인으로 작용하게 된다(Giulian, D., Haverkamp, L.J., Yu, J., Karshin, W., Tom, D., Li, J., Kazanskiaia, A., Kirkpatrick, J., and Roher, A.E. (1998). "The HHQK domain of betaamyloid provides a structural basis for the immunopathology of Alzheimer's disease. J Biol Chem 273, 29719-29726).

한편, 이러한 아밀로이드성 나노섬유는 (amyloid fibril) 새로운 나노소재로서의 가능성이 보고되고 있는데, 이는 강철에 비견되는 인장력을 (tensile strength) 가진 것으로 알려진 거미줄이 아밀로이드성 나노섬유와 (spider silk) 유사한 물리적 성질을 가지는 것이나 (비특허문헌 8), 인슐린 나노섬유의 기계적 강도가 (0.4 - 0.6 GPa) 거미줄 (0.9 - 1.5 GPa) 및 강철에 비교할 만하다는 것이 (0.6 - 1.8 GPa) 그 예이다. (비특허문헌 9) 이외에도 아밀로이드성 나노섬유화는 자가조립 능력과 더불어 정렬된 나노구조를 형성할 수 있는 것들이 대표적인 예라 할 수 있다 (비특허문헌 10).

이외에도 아밀로이드성 나노섬유는 세포접착제로 사용될 수도 있는데, 예를 들어 장내세균이 컬리 (curli) 섬유를 만들어 장내세균을 보호하는 필름이 됨과 동시에 세균의 접착능력을 증대시키는 반응이 일어나며 (비특허문헌 11, 12), 인위적인 반응으로는 아밀로이드 수화젤 (hydrogel)을 만들어 신경세포의 접착 및 생장증가에 이용하는 방법 (비특허문헌 13) 등이 알려져 있다.

이에 따라, 아밀로이드성 나노섬유의 질병 유발을 방지하고, 산업상 유용성을 높일 수 있는 새로운 방안에 대한 요구가 계속되고 있다.

[비특허문헌]

1. HARDY, John. The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics, Science, 2002, 297, ISSN 0036-8075, 353-356

2. FERREIRA, S.T. Soluble Protein Oligomers as Emerging Toxins in Alzheimer's and Other Amyloid Diseases. IUBMB Life, 2007, 59 (4-5), ISSN 1521-6551, 332-345

3. BALLATORE, Carlo. Tau-mediated Neurodegeneration in Alzheimer's Disease and Related Disorders. Nature Reviews Neuroscience, 2007, 8, ISSN 1471-003X, 663-672

4. HAATAJA, Leena. Islet Amyloid in Type 2 Diabetes, and the Toxic Oligomer Hypothesis. Endocrine Reviews, 2008, 29 (3), ISSN 0163-769X, 303-316

5. HOPPENER, J.W. Islet Amyloid and Tpye 2 Diabetes Mellitus. The New England Journal of Medicine, 2000, 343 (6), ISSN 0028-4793, 411-419

6. WESTERMARK, Per. Apolipoprotein A1-Derived Amyloid in Human Aortic Atherosclerotic Plaques. American Journal of Pathology, 1995, 147 (5), ISSN 0002-9440, 1186-1192

7. RAMELLA, N.A. Human Apolipoprotein A-I-Derived Amyloid: Its Association with Atherosclerosis, MUCCHIANO, G.I. Apolipoprotein A-1-Derived Amyloid in Atherosclerosis. American Journal of Clinical Pathology, 2001, 115 (2), ISSN 1943-7722, 298-303

8. KENNEY, J.M. Amyloidogenic Nature of Spider Silk, Eurupean Journal of Biochemistry, 2002, 269, ISSN 0014-2956, 4159-4163.

9. SMITH, J.F. Characterization of the Nanoscale Properties of Individual Amyloid Fibrils, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103, ISSN 0027-8424, 15806-15811

10. CHERNY, Izhack. Amyloids: Not Only Pathological Agents but Also Ordered Nanomaterials, Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, ISSN 1433-7851, 4062-4069

11. BARNHART, M.M. Curli Biogenesis and Function, Annual Review of Microbiology, 2006, 60, 0066-4227, 131-147.

12. COSTERTON, J.W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections, Science, 1999, 284, ISSN 0036-8075, 1318-1322

13. HOLMES, T.C. Extensive Neurite Outgrowth and Active Synapse Formation on Self-assembling Peptide Scaffolds, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97, ISSN 0027-8424, 6728-6733.

본 발명은 아밀로이드성 나노섬유의 산업적 이용과정에서 원하는 성질을 얻기 위해 나노섬유의 나노섬유화의 정도를 제어할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명은 일 측면에서 아밀로이드성 나노섬유의 산업적 이용과정에서 원하는 성질을 얻기 위해 나노섬유의 나노섬유화 정도 및 결정의 크기 및 분산을 제어할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 아밀로이드-베타 단백질에 쿠커비투릴[7]을 혼합하여 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화를 제어하는 것을 특징으로 한다.

상기 쿠커비투릴은 1905 년 베렌드 (R. Behrend), 마이어 (E. Meyer), 러쉐에 (F. Rusche) 의하여 최초로 보고된 물질로서, 이후 1981 년 목(W. Mock)과 공동 연구자들을 이 물질이 여섯 개의 단량체가 모여 고리를 이룬 거대고리 화합물로 C36H36N24O12의 화학식을 갖는다는 사실을 밝혔으며 X-선 회절법에 의해 그 구조를 확인하였다(J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7367). 여기서, 쿠커비투릴[6]의 개선된 합성 방법이 공지되었다 (DE 196 03 377 A1). 또한 온도를 낮춰서 반응조건을 조절하여 다양한 쿠커비투릴의 동족체들의 합성방법이 보고되었다 (US 제6,365,734호). 또한 이러한 쿠커비투릴의 동족체외에 수용성 및 지용성 쿠커비투릴의 화합물과 (PCT/KR02/01259) 그 제조방법이 개시되었으며, 대한민국 특허 공개 10-2005-0103364, WO 2000/068232(2000.11.16) 등이 제조 방법이 개시된 화합물이다. 상기 쿠커비투릴 화합물들은 상업적으로 구입하여 사용할 수 있으며, 상기 쿠커비투릴[7]도 상업적으로 구입이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 아밀로이드-베타 단백질은 아미노산이 40개 배열된 서열번호 1-40의 단백질, 아미노산이 42개 배열된 서열번호 1-42의 단백질이 적합하다. 본 발명에 있어서, 상기 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화의 제어는 생성되는 아밀로이드 나노섬유의 길이와 크기의 제어 및/또는 나노 섬유간 분산 제어를 포함하며, 또한 아밀로이드-베타가 나노섬유화 되는 조건에서의 나노 섬유화 반응의 억제나 추가적인 섬유화의 억제 또는 지체, 나노 섬유간 분산도의 향상을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에서 제시하는 예로서는 아밀로이드-베타 단백질은 서열번호 1-40의 단백질과, 서열번호 1-42의 단백질이 사용되었으나, 이론적으로는 쿠커비투릴[7]과 아밀로이드-베타 단백질의 주인-손님 화학을 통하여 40 개 미만의 아미노산이 배열된 아밀로이드-베타에 대해서도 아밀로이드-베타의 섬유화 정도를 제어할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아밀로이드-베타 단백질 나노섬유화의 제어는 쿠커비투릴[7]의 농도 및 투입 시간의 제어에 의해서 이루어질 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 아밀로이드-베타 나노섬유화의 적절한 제어를 위해서 쿠커비투릴[7]의 농도는 아밀로이드-베타 단백질 농도의 1-2000 배인 것이 좋다.

본 발명의 바람직한 실시에 있어서, 상기 아밀로이드-베타의 나노 섬유화의 억제를 위해서 쿠커비투릴[7]은 나노섬유화의 시작 전에 투입되는 것이 바람직하다. 또한, 아밀로이드-베타의 나노 섬유화가 진행되는 도중 추가적인 나노 섬유화의 억제 및/또는 분산을 위해서 쿠커비투릴[7]은 반응 시작 후 8 시간 이내, 바람직하게는 3 시간 이내, 보다 더 바람직하게는 1 시간 이내에 투입되는 것이 좋다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 쿠커비투릴[7]의 아밀로이드-베타의 나노 섬유화 제어물질로서의 용도를 개시하며, 예를 들어, 반응 억제제 또는 분산 재재로서의 용도를 개시한다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 쿠커비투릴[7]을 특징으로 하는 아밀로이드-베타 단백질의 나노섬유화 억제제 또는 분산제를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 분산제는 생성되는 아밀로이드-베타 나노섬유의 분산성을 향상시키는 제재로 이해된다.

위의 과제들에 대해 본 발명은 쿠커비투릴[7]과 아밀로이드-베타 단백질의 주인-손님 화학을 통하여 아밀로이드-베타의 나노섬유화 정도를 제어할 수 있음을 밝히고 있으며, 이에 따라 아밀로이드성 나노섬유의 제조에서 그 크기를 제어하고 필요에 따라 나노섬유의 분산을 일으키는 방법을 제시하고 있다.

도 1은 pH ~ 7.4, 37 ℃의 20 mM 인산나트륨 완충용액에서 아밀로이드-베타 5 μM과 아밀로이드-베타 1-40 에 쿠커비투릴[7] 50 μM를 섞었을 때의 시간에 따른 나노섬유화 진행정도를 형광의 세기에 대한 정보로 얻은 데이터이다.
도 2는 아밀로이드-베타 1-40 5 μM에 쿠커비투릴[7]를 농도별로 첨가했을 때의 나노섬유화 진행정도를 형광의 세기에 대한 정보로 얻은 데이터이다.
도 3는 아밀로이드-베타 1-40 5 μM에 쿠커비투릴[7]를 시간별로 첨가했을 때의 나노섬유화 진행정도를 형광의 세기에 대한 정보로 얻은 데이터이다.
도 4은 아밀로이드-베타 1-40 5 μM에 쿠커비투릴[7]를 농도별로 첨가했을 때의 나노섬유화 진행정도를 투과전자현미경 이미지로 얻은 데이터이다.
도 5은 아밀로이드-베타 1-40 10 μM에 쿠커비투릴[7]를 시간별로 첨가했을 때의 나노섬유화 진행정도를 투과전자현미경 이미지로 얻은 데이터이다.
도 6는 아밀로이드-베타 1-42 5 μM에 쿠커비투릴[7]를 농도별로 첨가했을 때의 나노섬유화 진행정도를 형광의 세기에 대한 정보로 얻은 데이터이다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다.

Thioflavin T의 (이하 ThT)는 베타 판상구조에 선택적인 결합이 가능하므로, 나노섬유화 정도의 측정 수단으로 ThT 형광이 많이 이용된다. pH를 ~ 7.4, 온도를 37 ℃로 조정하여 체내와 유사한 환경을 조성하고, 아밀로이드-베타 1-40, 1-42 에 쿠커비투릴[7]을 넣음으로서 발명의 실현이 가능하다. 쿠커비투릴[7]은 Sigma-Aldrich Korea에서 구매하였다.

실시예 1

위의 조건에서 아밀로이드-베타 1-40 5 μM 의 농도에 대해 쿠커비투릴[7] 50 μM 투입하였을 때의 실험 결과가 도 1에 제시되어 있다. 여기서 쿠커비투[7]릴의 투입 시 형광의 증가량이 없으므로 나노섬유화 반응이 억제되는 것을 알 수 있다.

실시예 2

도 2에서 보이는 것처럼 나노섬유 제조 시작 시점에서의 아밀로이드-베타 1-40 농도 대비 쿠커비투릴[7] 농도비를 조절함으로써 나노섬유화의 정도를 제어할 수 있다. 쿠커비투릴[7]은 아밀로이드-베타의 10배의 농도로도 (50 μM) 충분한 효과를 발휘할 수 있으며, 쿠커비투릴[7]의 농도에 따라 나노섬유화의 정도가 제어되었다.

실시예 3

도 3에서 보듯이 일정 시간 이상 나노섬유화를 진행시킨 이후에 쿠커비투릴[7]을 투여함으로서 추가적인 나노섬유화를 제한시킬 수 있다. 이때 투여한 농도는 아밀로이드-베타 1-40의 400 배이다 (2 mM). 투여 농도를 조절하거나 투여 시간을 조절하여 나노섬유화의 정도를 제한할 수 있으며, 이를 이용해 아밀로이드성 나노섬유의 제조과정에서 필요에 따라 능동적으로 크기를 제어하거나 나노섬유화를 정지시킬 수 있다.

실시예 4

도 2로부터 형광 측정을 통한 나노섬유화 정도의 변화를 확인하기 위해 아밀로이드-베타 1-40의 투과전자현미경 및 광학현미경 이미지를 얻었다. 도 4는 각각 쿠커비투릴[7]의 농도를 조절하였을 때의 이미지를 보이며, 쿠커비투릴[7]의 농도를 감소시킨 경우, 나노섬유의 전반적인 길이가 길어짐을 확인할 수 있고, 동시에 나노섬유간의 분산효과도 감소하였다 이는 도 2의 형광 내용과도 일치한다.

실시예 5

마찬가지로 도 5은 섬유화 과정 진행중의 아밀로이드-베타 1-40에 대해 쿠커비투릴[7]의 투여시간을 조절하였을 때의 이미지이다. 쿠커비투릴[7]의 투여시간을 늦게 만든 경우 평균적인 길이가 증가함과 동시에 나노섬유간의 분산효과가 감소하였고, 도 3의 내용에 부합한다.

실시예 6

도 6은 나노섬유 제조 시작 시점에서의 아밀로이드-베타 1-40 농도 대비 쿠커비투릴[7] 농도비를 조절함으로써 나노섬유화의 정도를 제어할 수 있음을 보여준다. 쿠커비투릴[7]은 아밀로이드-베타의 10 배의 농도로도 (50 μM) 충분한 효과를 발휘할 수 있으며, 쿠커비투릴[7]의 농도에 따라 나노섬유화의 정도가 제어되었다.

Claims (10)

1. 쿠커비투릴[7]을 아밀로이드-베타 단백질과 혼합하거나 아밀로이드-베타 단백질의 나노섬유화 진행 중에 투입하는 것을 특징으로 하는 인체 외에서의 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 쿠커비투릴[7]의 농도를 조절하거나 투입시점을 조절하여 제어하는 특징으로 하는 인체 외에서의 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 쿠커비투릴[7]의 농도는 아밀로이드-베타 단백질 농도의 1-2000 배인 것을 특징으로 하는 인체 외에서의 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 나노 섬유화는 아밀로이드성 나노 섬유화인 것을 특징으로 하는 인체외에서의 아밀로이드-베타 단백질의 나노 섬유화 제어 방법.
9. 쿠커비투릴[7]을 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드-베타 단백질의 섬유화 반응 조절제.
10. 제9항에 있어서, 아밀로이드-베타 단백질의 섬유화 반응을 억제하거나 아밀로이드-베타 나노 섬유 간의 분산을 향상시키는 것을 특징으로 하는 아밀로이드-베타 단백질의 섬유화 반응 조절제.

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