KR101522954B1 - 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항체의 이종이중체 중쇄불변부위 형성 수율 증진을 위해 CH3 도메인에 돌연변이가 유도된, 항체 CH3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두 개의 항체 중쇄불변부위의 각각의 CH3 도메인간의 정전기적 상호작용으로 동종이중체를 형성을 유도하는 아미노산 잔기를 선택적 공간적 보완 소수성 결합 형성을 선택적으로 유도하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계와 CH3 도메인 간의 상호작용이 없던 아미노산 잔기를 장거리 정전기적 결합 형성을 선택적으로 유도하는 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 결합하여 CH3 도메인 이종 이중체가 형성이 선호되는 CH3 도메인 이종 이중체 및 이를 포함한 이종이중체 중쇄불변부위 (Fc) 쌍, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CH3 도메인 이종 이중체는, 이종이중체 중쇄불변부위를 90 내지 95% 이상의 고수율로 형성할 뿐 아니라, 열안정성이 뛰어나고, 상기 CH3 도메인 이종 이중체를 포함한 이종이중체 중쇄불변부위는 2종의 항원을 동시에 인지하는 이중특이 단일클론 항체를 구축할 수 있으며, 본 발명의 CH3 도메인 이종 이중체 및 이를 포함하는 이중특이적 항체, 또는 항체불변부위 융합 단백질은 타겟 항원 또는 타겟 단백질 관련 질병의 치료 또는 예방에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 CH3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도 {CH3 domain mutant pairs for the high yield formation of heterodimeric Fc of antibody, method of production and use thereof}

본 발명은 항체(immunoglobulin G, IgG)의 중쇄불변부위의 이종이중체 형성 수율 증진을 위한, CH3 도메인에 돌연변이를 유도한 CH3 도메인 변이체 쌍, 상기 CH3 돌연변이 쌍을 이용한 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 쌍 단백질,이중 특이성 항체, 및 융합 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 이종 이중체, 이를 포함하는 이종 이중체 중쇄불변부위 쌍, 이중 특이성 항체, 및 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항체 CH3 도메인 이종 이중체 중쇄불변부위의 형성이 선호되는 CH3 도메인 변이체 쌍 및 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

19세기 말 비-치사량의 디프테리아와 파상풍이 투여된 실험동물의 혈청을 다른 동물에게 투여함으로써 디프테리아와 파상풍으로부터 보호받을 수 있다는 사실이 발견된 이후 혈청 치료, 즉 항체 치료의 개념이 점차적으로 임상에 활용되기 시작하였다. 하지만, 초기의 항체 치료는 고순도의 항체 및 혈액 유래 전염성 매개체의 오염 등의 문제점으로 인하여 실용성이 극히 제한되었다. 이러한 전통적인 항체치료의 문제점은 1975년에 개발된 하이브리도마 융합 기술(hybridoma fusion technique)로 인해 순수한 형태의 설치류 기원 단클론 항체를 비교적 저렴한 가격으로 대량 생산할 수 있게 되어 새로운 전환점을 맞이하게 되었으나, 생쥐 기원의 단클론 항체가 인체 투여 시 일으키는 짧은 반감기, 항-생쥐 항체에 대한 면역반응, 효능저하, 치명적인 알레르기 반응 등 여러 단점 및 부작용으로 인해 임상에서의 사용이 제한되었다.

1980년대 바이오혁명의 시발점이 된 유전자 재조합 기술의 등장으로 생쥐 단클론 항체를 유전자 조작을 통해 인간화시키는 인간화 항체(humanized antibody)의 제작을 가능케 했으며, 환자 투여 시 발생했던 다양한 면역적 부작용을 최소화시켜 치료용 항체가 임상에 적극적으로 활용될 수 있는 기틀을 마련하였다. 한편, 1990년 중반부터 파지 디스플레이(phage display) 기술 혹은 유전자 이식 생쥐를 사용하여 완전한 인간 단클론 항체를 만들 수 있는 원천기술이 개발되었으며, 현재 국내외 많은 제약사들이 사활을 걸고 항체를 이용한 신약 개발에 막대한 연구와 투자를 진행하고 있다. 현재 약 26개의 항체 신약이 미국 식약청의 허가를 받아 전 세계적으로 시판되고 있으며, 300개 이상의 치료용 항체가 임상실험 단계에 있어 제약산업에서의 항체의 중요성을 잘 증명해주고 있다. 한편 최근 들어 표적선택성을 지닌 항체와 표적특이성이 없는 화학요법 치료제를 병행투여 함으로써 부작용을 억제하고 치료 효과가 개선된다는 전임상 및 임상실험 결과가 도출되고 있어 항암치료에 있어서 항체의 유용성이 더욱 확대될 예정이다.

한편, 현재의 항체 신약은 암, 자가면역질환 등을 주요 타겟으로 개발되었는데, 특히 고형암(solid tumor)의 경우 IgG 혹은 순수한 항체 형태의 항체 신약이 만족할 만한 치료 효과를 보이지 않고, 항체 생산의 고비용 문제 등이 항체 신약 개발에 걸림돌이 되고 있어, 기존 항체보다 생물학적 효능이 개선된 재조합 단백질 형태의 새로운 항체 신약 개발 시도가 꾸준히 진행되어 왔다. 그 중 하나가 특히 항암 치료에 활용하고자 1980년대 중반부터 연구가 시작된 한 개의 항체가 최소한 두 개 이상의 표적분자와 결합할 수 있는 이중특이성 항체라고 할 수 있다.

자연에 존재하는 항체(Immunoglobulin G (IgG), IgM, IgD, IgE, IgA)는 동일한 아미노산 서열을 가진 두 개의 중쇄와 동일한 서열을 가진 두 개의 경쇄가 조합(assembly)된 형태로 존재한다. 이때, 동일한 두 개의 중쇄간의 동종이중체(homodimer)는 항체의 불변영역(Fc, crystallizable fragment)의 마지막 도메인 (즉 IgG의 경우 CH3 도메인, IgM의 경우 CH4 도메인, IgD의 경우 CH3 도메인, IgE의 경우 CH2 및 CH4 도메인, IgA의 경우 CH3 도메인) 간의 상호작용을 통해 형성이 유도되고, 이어서 힌지(hinge) 영역간의 이황화 결합(disulfide bond)이 유도되어, 견고한 중쇄간의 동종이중체가 형성된다. 구체적으로, 인간 IgG1에 있어서 중쇄와 경쇄의 조합은 중쇄 힌지 영역의 5번째 Cys와 kappa 경쇄의 107번째 Cys 간의 이황화 결합에 의해 유도된다.

따라서, 자연에 존재하는 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb)는 1종의 항원에 대해 이가(bivalent)의 형태로 결합하는 특성을 보인다. 반면에 이중특이성 항체(bispecific antibody)는 하나의 단일분자 형태의 항체로 2종의 항원을 동시에(simultaneously) 또는 교차적으로(alternatively) 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이러한 이중특이성 항체는 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 이중- 또는 다중특이적 항체와 같은 조작된 단백질로 당 업계에 공지되어 있으며, 세포 융합, 화학적 접합, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작할 수 있다.

기존의 이중특이성 항체는 목적하는 특이성을 가지는 쥐 단일클론 항체를 발현하는 2개의 상이한 하이브리도마(hybridoma) 세포주의 체세포 융합을 이용한 쿼드로마(quadroma) 기술을 사용하여 제조되었는데(Milstein and Cuello 1983), 이 경우 쿼드로마 세포주 내에서 각기 다른 두 개의 경쇄가 무작위적으로 쌍을 이루어 최대 10가지 정도의 다양한 항체가 만들어지며, 이 항체 혼합물로부터 원하는 단 한가지의 이중특이성 항체를 분리 정제하는 것이 매우 어렵다는 단점이 있었다. 따라서 잘못된 쌍을 형성한 부산물 및 감소된 생산 수율에 의해 목적하는 이중항체만을 얻기 위해서는 복잡한 정제 과정들이 요구되었다(Morrison 2007).

이러한 문제를 해결하기 위한 하나의 방법으로, 경쇄와 중쇄의 항원결합부위 절편을 다양한 사슬로 연결하여 단일 구조체(single constructs)로 발현하는 형태의 이중특이성 항체가 개발되었으며, 이러한 형태에는 단일사슬 다이아바디(single chain diabodies), 탠덤(tandem) 단일사슬항체절편(scFv) 등의 형태가 포함된다 (Holliger and Hudson 2005). 또한, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 추가의 항원결합 항체 절편을 융합한 Ig와 유사한 형태의 이중특이성 항체 또한 제조되었다(Miller, Meng et al. 2003; Lu, Zhang et al. 2004).

그러나, 이러한 항체 절편 조합에 기반한 이중특이성 항체는 낮은 안정성으로 인한 발현 양의 감소, 항체 응집(aggregation) 형성 및 이로 인해 증가된 면역원성의 문제점이 존재한다(Chan and Carter 2010). 또한, 항체 절편 조합에만 기반한 이중특이성 항체는 항체의 중쇄불변부위(Fc)가 없어, Fc와 연관되어 증가되는 안정성, 증가된 크기와 Fc 수용체 (neonatal Fc receptor, FcRn)와의 결합으로 인한 혈청 내 반감기의 증가(long serum half-life), 정제과정에서의 결합부위 보존 (protein A and protein G)의 이점, 항체-의존성 세포의 세포독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity), 보체-의존성 세포의 세포독성 (complement-dependent cellular cytotoxicity)이 부재한 문제점이 있다(Chan and Carter 2010).

따라서, 이상적으로는 자연발생적 항체(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) 와 구조가 매우 유사하고, 서열에 있어 최소의 편차를 가진 이중특이성 항체를 개발하는 것이 요구되고 있다.

이 문제를 해결하기 위해, 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술을 이용한 이중특이적 항체의 개발이 시도되었는데, 이 기술은 유전자 조작을 통해 각기 다른 두 개의 Ig 중쇄의 CH3 도메인에 돌연변이를 유도하여, 하나의 Ig 중쇄의 CH3 도메인에는 hole 구조를, 또 다른 Ig 중쇄의 CH3 도메인에는 knob 구조를 만들어, 두 개의 Ig 중쇄가 이종 이중체 (heterodimer)를 형성하도록 유도하는 것이다(미국특허 US 7695936 B2; 대한민국 공개특허 10-2010-0087394). 이때, 인간 Ig 중쇄 CH3 도메인간의 동종이중체 형성에 기여하는 소수성 코어에 포함되는 아미노산 잔기는 Leu351, Thr366, Leu368, Tyr407으로, 상기 항체 사슬의 아미노산 숫자는 EU 넘버링에 의한 것이다(Cunningham, Pflumm et al. 1969). 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술은 CH3 도메인 상호작용부위의 소수성 코어에 위치에 있는 잔기들을 대해서, 한쪽 중쇄 CH3 도메인에는 측쇄의 크기가 큰 소수성 아미노산 잔기들을 측쇄가 작은 소수성 아미노산으로 치환하여 hole 구조로 만들고(Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val), 다른 중쇄 CH3 도메인에는 측쇄의 크기가 작은 소수성 아미노산 잔기들을 측쇄가 큰 소수성 아미노산으로 치환하여 knob 구조를 만들어(Thr366Trp), 2개의 돌연변이 쌍, 즉 CH3A(Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val)와 CH3B(Thr366Trp)가 도입된 중쇄 불변부위 돌연변이 쌍을 공동발현하였을 때, 동종이중체 중쇄불변부위보다는 이종이중체 중쇄불변부위 형성이 선호되는 것을 보고하였다(Ridgway, Presta et al. 1996). 하지만, 이러한 놉-인투-홀 기술은 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimer heterodimeric Fc)의 형성 수율이 약 80% 정도로 보고되어져 있으며(Ridgway, Presta et al. 1996), 이에 상기의 이종이중체의 안정화를 유도하기 위하여 파지디스플레이와 이황화 가교를 도입하여 상호작용을 더욱 증가시킨 구현이 있다(Atwell, Ridgway et al. 1997; Merchant, Zhu et al. 1998), 미국 등록특허 US5731168A).

이종이중체 중쇄불변부위(heterodimer heterodimeric Fc) 형성을 증진한 다른 방법으로는, CH3 도메인간의 상호작용면에 존재하는 전하를 띠는 아미노산에 돌연변이를 유도하여, 한쪽 불변 영역의 CH3 도메인은 모두 양전하를 갖는 측쇄 아미노산으로, 다른쪽 불변 영역의 CH3 도메인은 모두 음전하를 갖는 측쇄 아미노산으로 돌연변이를 유도하여, 정전기적 반발력에 의해서 동종이중체 형성은 저해되고, 정전기적 인력에 의해 이종이중체 형성을 증진시킨 예가 있다(Gunasekaran, Pentony et al. 2010); 미국 공개특허 US 2010/0286374 A1). 즉, 한쪽 CH3 도메인에는 Lys392Asp, Lys409Asp을, 다른 CH3 도메인에는 Glu356Lys, Asp399Lys을 치환하여 이종 이중체 형성을 유도하였다. 상기 CH3 도메인 돌연변이체의 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 형성 수율은 약 90 % 정도이다.

이종이중체 중쇄불변부위(heterodimer heterodimeric Fc) 형성을 증진한 다른 방법으로는, CH3 상호작용의 소수성 코어(hydrophobic core) 부분을 구성하는 부분에 소수성 아미노산 측쇄간끼리의 크기 차이에 의해 상호보완적인 돌연변이를 유도하여 이종이중체 형성을 증진시킨 예가 있다(Moore, Bautista et al. 2011); 미국공개특허 US 2011/0054151 A1). 구체적으로 한쪽 CH3 도메인에는 Ser364His, Phe495Ala을, 다른 CH3 도메인에는 Tyr349Thr, Thr394Phe을 유도하여 이종이중체 형성을 유도하였다. 상기 CH3 도메인 돌연변이체의 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc) 형성 수율은 약 80 내지 90 % 정도이다.

하지만, 상기 개발된 CH3 도메인 변이체 쌍을 포함하는 이종이중체 중쇄불변부위의 열역학적 안정성(thermodynamic stability)과 발현 수율(expression yield)은 야생형 항체와 비교하여 낮은 결과를 보여주고 있다.

따라서, 가능한 높은 이종이중체 형성수율을 나타내면서, 야생형과 비교하여 열역학적 안정성과 발현 수율이 비슷하거나 향상된 이종이중체 중쇄불변부위의 개발에 대한 필요성이 대두되고 있으나, 아직까지 이를 충족시킬 만한 보고는 이루어지지 않고 있는 실정이다.

Atwell, S., J. B. Ridgway, et al. (1997). "Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library." J Mol Biol 270(1): 26-35. Chan, A. C. and P. J. Carter (2010). "Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation." Nat Rev Immunol 10(5): 301-316. Cunningham, B. A., M. N. Pflumm, et al. (1969). "Subgroups of amino acid sequences in the variable regions of immunoglobulin heavy chains." Proc Natl Acad Sci U S A 64(3): 997-1003. Davis, J. H., C. Aperlo, et al. (2010). "SEEDbodies: fusion proteins based on strand-exchange engineered domain (SEED) CH3 heterodimers in an Fc analogue platform for asymmetric binders or immunofusions and bispecific antibodies." Protein Eng Des Sel 23(4): 195-202. Deisenhofer, J. (1981). "Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution." Biochemistry 20(9): 2361-2370. Feng Y. et al. (2011). "Design, expression and characterization of a soluble single-chain functional human neonatal Fc receptor." Protein Expression and Purification 79(1):66-71. Gunasekaran, K., M. Pentony, et al. (2010). "Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG." J Biol Chem 285(25): 19637-19646. Holliger, P. and P. J. Hudson (2005). "Engineered antibody fragments and the rise of single domains." Nat Biotechnol 23(9): 1126-1136. Idusogie, E. E., L. G. Presta, et al. (2000). "Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc." J Immunol 164(8): 4178-4184. Lee, S. H., D. W. Park, et al. (2010). "Humanization of an agonistic anti-death receptor 4 single chain variable fragment antibody and avidity-mediated enhancement of its cell death-inducing activity." Mol Immunol 47(4): 816-824. Lee, S. H. et al. (2011). "Tanibirumab (TTAC-0001): A Fully Human Monoclonal Antibody Targets Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR-2)" Arch Pharm Res 34(8):1223-1226. Lu, D., H. Zhang, et al. (2004). "Simultaneous blockade of both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor signaling pathways in cancer cells with a fully human recombinant bispecific antibody." J Biol Chem 279(4): 2856-2865. Martens T. et al. (2006). "A novel one-armed anti-c-Met antibody inhibits glioblastoma growth in vivo." Clin Cancer Res 15(12):6144-6152. Matsumiya, S., Y. Yamaguchi, et al. (2007). "Structural comparison of fucosylated and nonfucosylated Fc fragments of human immunoglobulin G1." J Mol Biol 368(3): 767-779. Merchant, A. M., Z. Zhu, et al. (1998). "An efficient route to human bispecific IgG." Nat Biotechnol 16(7): 677-681. Miller, K., G. Meng, et al. (2003). "Design, construction, and in vitro analyses of multivalent antibodies." J Immunol 170(9): 4854-4861. Moore, G. L., C. Bautista, et al. (2011). "A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens." MAbs 3(6): 546-557. Morrison, S. L. (2007). "Two heads are better than one." Nat Biotechnol 25(11): 1233-1234. Park, K. J., S. H. Lee, et al. (2007). "A human scFv antibody against TRAIL receptor 2 induces autophagic cell death in both TRAIL-sensitive and TRAIL-resistant cancer cells." Cancer Res 67(15): 7327-7334. Ridgway, J. B., L. G. Presta, et al. (1996). "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization." Protein Eng 9(7): 617-621. Roopenian, D. C. and S. Akilesh (2007). "FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age." Nat Rev Immunol 7(9): 715-725. Schroeder, H. W., Jr. and L. Cavacini (2010). "Structure and function of immunoglobulins." J Allergy Clin Immunol 125(2 Suppl 2): S41-52. Wines, B. D., M. S. Powell, et al. (2000). "The IgG Fc contains distinct Fc receptor (FcR) binding sites: the leukocyte receptors Fc gamma RI and Fc gamma RIIa bind to a region in the Fc distinct from that recognized by neonatal FcR and protein A." J Immunol 164(10): 5313-5318.

본 발명은 상기와 같이 항체의 이종이중체 중쇄불변부위 형성 수율을 90% 이상으로 안정적으로 증진시키는 기술을 개발하기 위해 안출된 것으로, 이종이중체 중쇄불변부위 형성 수율 증진을 위해 CH3 도메인에 돌연변이가 유도된, CH3 이종 이중체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 CH3 이종 이중체를 포함하는 이종 이중체 중쇄불변부위 쌍, 이중 특이성 항체, 및 융합단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 CH3 이종 이중체를 포함하는, 원래 야생형 항체의 발현, 생산수율 (production yield) 및 열역학적 안정성 (thermodynamic stability)과 비슷하거나, 향상된 특징을 보이는 이중특이성 항체 또는 항체불변부위 융합 단백질을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 CH3 이종 이중체를 포함하는, 원래 야생형 항체가 지니는 중쇄불변부위(Fc)의 고유기능, 즉 FcRn(neonatal Fc receptor), FcRs(Fc gamma receptors)과의 결합능이 유지되어 혈액 내 긴 반감기(long serum half-life)를 가지게 되고 효과 기능(effector function)을 유지하면서, 정제과정에서의 결합부위(protein A 및 protein G)가 보존되는 항체 또는 항체불변부위 융합 단백질을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 CH3 이종 이중체를 포함하는, 2종의 다른 항원을 동시에 표적할 수 있는 이중특이성 항체 또는 항체불변부위 융합 단백질을 제공하는 것이다.

아울러, 볼 발명의 또 다른 목적은 이종이중체 중쇄불변부위의 형성이 선호되는 CH3 도메인 변이체 (heterodimeric CH3) 쌍 및 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 쌍((hinge-CH2-CH3A) (Hinge-CH2-Ch3B)) 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기의 (a) 결합을 포함하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 제공한다.

(a) CH3 도메인 중 위치 Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 및 Lys409로 이루어진 제 1군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 1군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 알라닌 (A), 트레오닌 (T), 세린 (S), 발린 (V), 메티오닌 (M), 및 글라이신 (G)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산; 및

ⅱ) 상기 제 1군의 CH3 도메인 위치 중 1종 이상 선택된 위치에서 치환된, 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산

간의 결합.

(단, 상기 위치는 EU index에 따름)

본 발명의 일 구현예로, 상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 하기의 (b) 결합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다:

(b) CH3 도메인 중 위치 Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 및 Ser400으로 이루어진 제 2군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 2군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 라이신 (K) 또는 아르지닌 (R); 및

ⅱ) 상기 제 2군의 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)

간의 결합.

(단, 상기 위치는 EU index에 따름)

본 발명의 일 구현예로, 제1군의 위치는 Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 및 Lys409로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Lys409은 트립토판 (W)으로 치환되고;

다른 일 CH3 도메인의 Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Tyr349은 세린 (S)으로 치환되고;

다른 일 CH3 도메인의 Glu357는 트립토판 (W)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 제2군의 위치는 Gln347 또는 Lys360인 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Lys360은 글루탐산(E)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Gln347은 글루탐산 (E)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)으로 치환되고, 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Gln347은 글루탐산 (E)으로, Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)로 치환되고, 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 일 CH3 도메인의 Tyr349은 세린 (S)으로, Lys409은 트립토판(W)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Glu357은 트립토판 (W)으로, Asp399은 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 하기의 (c) 결합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다:

(c) CH3 도메인 중 위치 Tyr349 및 Ser354로 이루어진 제 3군의 위치에서,

ⅱ) 상기 제 3군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C); 및

ⅱ) 상기 제 3군의 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C)

의 결합.

(단, 상기 위치는 EU index에 따름)

본 발명에 따른 항체의 중쇄불변부위의 CH3 도메인 이종 이중체는 기존의 방법과는 다른 방법으로 돌연변이를 유도하여, 동종이중체의 형성은 최소화하고, 이종이중체의 형성 수율을 90 내지 95% 이상의 고수율로 제조할 수 있으며, 상기 CH3 도메인 이종 이중체를 이용해 제조된 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 쌍 단백질은 동물 세포에서 발현 생산시, 원래 야생형 항체의 발현, 생산 수율 및 열역학적 안정성이 비슷하거나, 향상된 특성을 가지게 된다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 CH3 도메인 이종 이중체를 이용해 제조된 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질은 원래 야생형 항체가 지니는 중쇄불변부위(Fc)의 고유기능, 즉 FcRn(neonatal Fc receptor), FcRs(Fc gamma receptors)과의 결합성이 유지되어, 혈액 내 긴 반감기(long serum half-life)를 가지게 되고, 정제과정에서의 결합부위(protein A 및 protein G)가 보존된다는 이점이 있을 뿐 아니라, 항체-의존성 세포의 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity)을 유지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 CH3 도메인 이종 이중체를 이용해 제조된 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질은 CH3 도메인 변이체 각각을 따로 발현하여 다시 합성하지 않고, 한 세포에서 동시에 발현하여, 고효율로 이종이중체 불변부위(heterodimeric Fc)을 90-95% 정도 이상의 고수율로 생산할 수 있다.

더불어 본 발명에 따라 제조되는 이종이중체 불변부위(heterodimeric Fc) 쌍 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 항원특이성이 다른 2종의 항체 절편 scFv이 융합된 scFv-Fc 형태, 2종의 scFab이 융합된 scIgG(scFab-Fc) 형태, 항원결합 Fv를 이루는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL) 쌍의 2종을 이종이중체 중쇄불변부위 N-말단, C-말단에 각각 융합된 (Fv)2-Fc 형태의 이중특이성 항체를 고효율 및 고수율로 제조할 수 있다. 또는, CH3 도메인 변이체 쌍이 포함된 두 개의 중쇄불변부위(Fc)로 이루어진 전형적인 IgG의 중쇄 C-말단에 가변 단일 항원 결합 도메인(VH, VL)을 각각 융합한 이중특이성 가변 부위 융합 단일 항체 mAb-Fv 형태의 이중특이성 항체를 고효율 및 고수율로 제조할 수 있다. 또는, CH3 도메인 변이체 쌍이 포함된 두 개의 중쇄불변부위(Fc)의 N-말단 또는 C-말단에 단일항원에 결합하는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL)를 융합하여 단일 항원에 1가(monovalent)로 결합할 수 있는 Fv-Fc 형태의 1가 항원 결합 항체를 고효율 및 고수율로 제조할 수 있다. 또는 특정 단백질과 결합할 수 있는 세포막 수용체 세포외 도메인, 펩타이드, 단일도메인 항체, 리간드, 독소 등을 융합하여, 1종 또는 2종의 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc) 등을 고효율 및 고수율로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 2종 항원을 동시에 표적할 수 있는 이중특이성 항체 또는 항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc)은, 발병 기전이 하나의 단백질에 의해 유도되는 것이 아니고, 여러 단백질이 중복적, 우회적, 단계적으로 작용하여 발생하는 종양 또는 면역질환 관련 2종 항원을 동시에 표적할 수 있으므로, 1종의 표적 단백질만 표적하는 단일클론항체보다 향상된 치료 효과를 높일 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따라 제조되는 단일항원에 결합하는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL)를 융합하여 단일항원에 1가(monovalent)로 결합할 수 있는 항체(Fv-Fc)는, 2가 결합 항체(bivalent binding mAb)로 표적하는 것에 비해, 1가 결합 항체(monovalent binding mAb)로 표적할 때 더 효과적으로 타겟 항원을 표적할 수 있어, 타겟 항원 관련 질병 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따라 제조되는 특정 단백질과 결합할 수 있는 세포막 수용체 세포외 도메인, 펩타이드, 단일도메인 항체, 리간드, 독소 등을 융합하여 1종 또는 2종의 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc)은, 기존 동종이중체 중쇄불변부위(homodimeric Fc)을 이용하여 표적할 수 있는 타겟 단백질을 효과적으로 표적할 수 있으므로, 타겟 단백질 관련 질병 치료에 높은 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 하나의 항원에 특이적인 자연적인 IgG1 항체의 구조를 도식화한 것이다. 야생형의 IgG1 항체는 동일한 아미노산 서열을 가진 두 개의 중쇄와 동일한 서열을 가진 두 개의 경쇄가 조합(assembly)된 형태이다. 두 쌍의 중쇄가 이중체를 이루기 위해서는 CH3 도메인 간의 상호작용으로 이중체 형성이 유도되고, 이어서 힌지 영역간의 이황화결합이 유도되어 견고한 중쇄간의 동종이중체가 형성된다. 중쇄와 경쇄의 조합은 중쇄 힌지 영역의 5번째 Cys와 kappa 경쇄의 경우 107번째 Cys 간의 이황화결합에 의해 유도된다.
도 2는 야생형의 IgG1 항체에서 CH3 도메인간의 상호작용면을 도식화하여 나타낸 것이다. 상호작용면의 내부에는 소수성 결합에 관여하는 잔기들과 정전기적 상호작용을 가지는 잔기가 존재하는데 이 잔기들은 CH3 도메인의 이중체 형성에 기여한다. 또한 상호작용면에는 위치하지만, 인접한 잔기와 상호작용 없이 이중체 형성에 기여하지 않거나 비교적 약한 비공유 결합으로 상호작용에 참가하는 잔기들도 존재한다.
도 3은 인간 IgG1 항체의 중쇄 구조의 CH3 도메인간의 상호작용면에서 돌연변이를 부여한 아미노산의 측쇄간의 상호작용을 나타낸 것이다. 기존에 알려진 인간항체의 Fc 절편 구조(PDB 코드: 1FC1 (Deisenhofer 1981), 1L6X(Idusogie, Presta et al. 2000), 3AVE (Matsumiya, Yamaguchi et al. 2007)들을 바탕으로 하여 CH3 도메인간의 상호작용면을 분석하였고, CH3 도메인간의 상호작용면에서 돌연변이를 부여한 아미노산의 측쇄간의 상호작용을 3AVE 구조를 기준으로 하여 나타내었다.
도 3의 (A) 도면은 야생형 인간 IgG1 항체의 CH3 도메인에서 CH3A 도메인에서는 Lys360, Lys409 아미노산의 측쇄를 나타내었고, CH3B 도메인에서는 Gln347, Asp399, Phe405 아미노산의 측쇄를 나타낸 것이다. 기존에 한쪽 CH3 도메인의 K360 아미노산은 다른 쪽 CH3 도메인의 Gln347 아미노산과 인접하고 있으나, CH3 도메인이 이중체를 형성하게 하는데 기여하는 상호작용은 존재하지 않는다. 또한, 한쪽 CH3 도메인의 Lys409와 다른 쪽 CH3 도메인의 Asp399는 정전기적 인력으로써 CH3 도메인 이중체를 형성하는 데 큰 기여를 하는 아미노산 잔기이다.
도 3의 (B) 도면은 CH3 도메인 돌연변이체의 CH3 도메인의 구조를 모델링을 통하여 예측하여 나타낸 것이다. 한쪽 CH3 도메인에서 Lys360Glu, Lys409Trp 돌연변이가 도입되었고, 다른 쪽 CH3 도메인에서 Gln347Arg, Asp399Val, Phe405Thr 돌연변이가 도입되었다. 따라서 기존의 Lys360과 Gln347은 Lys360Glu와 Gln347Arg로 치환됨으로써 서로 상호작용이 없던 잔기 사이에 선택적인 정전기적 결합이 생성되었다. 이러한 돌연변이 전략은 CH3 도메인의 이종이중체를 선택적으로 형성하는데 기여할 수 있다. 또한, Lys409Trp와 다른 쪽 CH3 도메인의 Asp399Val, Phe405Thr 돌연변이가 도입되어 기존의 정전기적 결합 대신 상호보완적인 소수성 결합을 유도하였다. 이는 CH3A:CH3A, CH3B:CH3B와 같은 동종 이중체 형성은 저해하고, CH3A:CH3B의 이종 이중체 형성을 유도하는 돌연변이 전략이다.
도 4는 돌연변이 전략 중 CH3A 도메인의 Lys409, CH3B 도메인의 Asp399, Phe405 잔기 간의 상호작용에 대해 나타내고 있다. 야생형 CH3 도메인 상호작용면에서 한쪽 도메인의 Lys409는 다른 쪽 도메인의 Asp399 잔기와 정전기적 결합으로써 도메인간의 이중체 형성에 기여하고 있으며, 따라서, 한 쪽 CH3 도메인에 Lys409Trp와 다른 쪽 CH3 도메인의 Asp399Val, Phe405Thr 돌연변이를 도입하여 기존의 정전기적 결합 대신 상호보완적인 소수성 결합을 이종이중체 사이에만 유도할 수 있는 돌연변이를 유도하였다. 이는 CH3A:CH3A, CH3B:CH3B와 같은 동종이중체 형성은 저해하고, CH3A:CH3B의 이종이중체 형성을 유도하는 돌연변이 전략이다.
도 5는 돌연변이 전략 중 CH3A 도메인의 Lys360Glu와 CH3B 도메인의 Gln347Arg 돌연변이의 상호작용에 대해 나타낸 것이다. 돌연변이 잔기들은 야생형에서는 인접해 있지만 기존에 CH3 도메인이 이중체를 형성하는 데 기여하는 상호작용은 존재하지 않는다. 여기에 장거리 정전기적 결합을 이종이중체 사이에만 유도할 수 있는 돌연변이인 Lys360Glu와 Gln347Arg 돌연변이를 유도하였다. 이는 CH3A:CH3A, CH3B:CH3B와 같은 동종이중체 형성은 저해하고, CH3A:CH3B의 이종이중체 형성을 유도하는 돌연변이 전략이다.
도 6은 돌연변이 전략 중 CH3A 도메인의 Gln347E 돌연변이와 CH3B 도메인의 Lys360 잔기 간의 상호작용에 대해 나타낸 것이다. 이 잔기들은 CH3 도메인의 상호작용면에서 도 5에서 나타난 Lys360Glu-Gln347Arg 상호작용 부위와 대칭되는 부위에 위치한다. 상기한 Lys360Glu-Gln347Arg 상호작용 부위와 마찬가지로 CH3A 도메인의 Gln347과 CH3B 도메인의 Lys360 잔기는 야생형에서는 인접해 있지만 기존에 CH3 도메인이 이중체를 형성하는 데 기여하는 상호작용은 존재하지 않는다. 여기에 Gln347Glu 돌연변이를 도입하여 다른 쪽 CH3 도메인에 존재하는 Lys360 잔기와 선택적인 정전기적 결합을 유도하였다. 이는 CH3A:CH3A, CH3B:CH3B와 같은 동종이중체 형성은 저해하고, CH3A:CH3B의 이종이중체 형성을 유도하는 돌연변이 전략이다.
도 7은 돌연변이 전략 중 CH3A 도메인의 Glu357, CH3B 도메인의 Tyr349, Lys370 잔기 간의 상호작용에 대해 나타내고 있다. 야생형 CH3 도메인 상호작용면에서 한쪽 도메인의 Glu357은 다른 쪽 도메인의 Lys370 잔기와 정전기적 결합으로써 도메인간의 이중체 형성에 기여하고 있으며, 다른 쪽 도메인의 Tyr349 잔기와도 인접해 있다. 따라서, 한 쪽 CH3 도메인에 Glu357Trp와 다른 쪽 CH3 도메인의 Tyr349Ser 돌연변이를 도입하여 기존의 Glu357과 Lys370의 정전기적 결합 대신 상호보완적인 소수성 결합을 이종이중체 사이에만 유도할 수 있는 돌연변이를 유도하였다. 이는 CH3A:CH3A, CH3B:CH3B와 같은 동종이중체 형성은 저해하고, CH3A:CH3B의 이종이중체 형성을 유도하는 돌연변이 전략이다.
도 8은 본 발명에 따른 돌연변이가 도입된 CH3 도메인 돌연변이 쌍(CH3A 와 CH3B)이 CH3A:CH3A 또는 CH3B:CH3B의 상호작용에 의한 중쇄불변부위 동종이중체의 생성은 배제되고 CH3A:CH3B의 상호작용에 의한 이종이중체 중쇄불변부위 형성을 유도함을 도식화하여 나타낸 그림이다.
도 9은 본 발명에 따른 이종이중체 형성 CH3 돌연변이 쌍(CH3A:CH3B)을 항체 중쇄불변부위 hinge-CH2 도메인의 C-말단에 연결하여 생성되는 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)를 이용하여 제조할 수 있는 이중특이성 항체 및 Fc-융합 단백질을 도식화한 것이다. 이종이중체 중쇄불변부위에 항원결합 특이성이 다른 2종의 단일사슬항체절편(scFv)을 각 아미노 말단(N-말단)에 융합한 이중특이성 단일사슬 항체 절편 면역글로불린(scFv-Fc), 항원결합 특이성이 다른 2종의 단일사슬항원결합절편(Fab)을 각 아미노 말단(N-말단)에 융합한 이중특이성 단일사슬면역글로불린(single chain immunoglobulin, scFab-Fc), 서로 다른 항원을 인지하는 항체에서 유래한 중쇄 및 경쇄의 가변단일항원결합도메인(VH, VL)의 2종을 각각 중쇄불변부위 N-말단, C-말단에 쌍으로 융합한 이중특이성 가변부위융합면역글로불린 (Fv)2-Fc, 전형적인 IgG의 중쇄 C-말단에 가변단일항원결합도메인(VH, VL)을 각각 융합한 이중특이성 가변부위융합단일항체 mAb-Fv, 1종의 항원을 인지하는 항체에서 유래한 중쇄 및 경쇄의 가변단일항원결합도메인(VH, VL)을 중쇄불변부위 N-말단에 융합한 1가 항원 결합 가변부위융합면역글로불린(Fv-Fc), 및 리간드를 특이적으로 인지하는 세포막단백질 외부 도메인(extracellular domain), 펩타이드, 1종의 항원을 인지하는 단일도메인항체(single domain antibody), 단일도메인항체(single domain antibody), 펩타이드, 리간드 단백질, 독소 단백질 등의 2종을 각각 중쇄불변부위 N-말단에 융합된 항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc)을 제조할 수 있다.
도 10는 인간 항체의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 쥐 항체의 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3의 CH3도메인의 서열을 비교한 것이다. 진하게 강조한 Gln347, Lys360, Asp399, Phe405, Lys409 잔기들이 돌연변이가 도입된 잔기들이다. 돌연변이가 도입된 잔기는 인간 항체 및 쥐 항체 IgG의 아류형(subtype)에 관계없이 거의 유사한 잔기로 보존되어 있는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서 이종이중체 CH3 돌연변이체 쌍 형성을 위해 유도되는 돌연변이는 인간 항체 IgG1에 한정되지 않음을 알 수 있다.
도 11 및 도 12은 본 발명에서 구현하여 발현 정제를 수행한 이종이중체 중쇄불변부위에서, 그 형성 수율을 비교한 5가지 CH3 돌연변이 쌍을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 13 및 도 14은 제작된 CH3 돌연변이 쌍에 의해 항체 중쇄불변부위의 이종이중체의 형성 수율을 평가하기 위해 구축된 단일 사슬 항체 절편(scFv)이 융합된 scFv-Fc 및 단독 Fc(dummy Fc)를 동물 세포 발현 벡터인 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하기 위해 구축한 도식도 및 벡터 맵(map)이다.
도 15는 도 13 및 도 14에서 구축된 scFv-Fc 및 단독 Fc 동물 세포 발현 벡터를 동물세포에서 공동트랜스펙션(cotransfection)하여 발현하면 동종이중체와 이종이중체가 서로 다른 크기의 항체로 발현이 되므로, 크기 및 조합형태 분석을 통하여 CH3 돌연변이체 쌍에 의한 이종이중체 생성 수율을 평가할 수 있음을 설명한 그림이다.
도 16 및 19는 도 13 및 도 14에서 제작한 CH3 돌연변이 쌍을 도 15에서 기술한 이종이중체의 형성능 평가를 위해 동물세포 발현벡터에 도입한 후, HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 이종이중체 항체 형성능을 평가를 위해 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 크기 및 조합형태를 분석한 결과이다. 이때, 음성대조군으로 야생형 CH3가 이용된 항체를, 양성대조군으로는 놉-인투-홀 이중특이성 항체를 이용하였으며, 분석에 이용된 단백질의 양은 각각 10 μg이다.
도 17 및 도 18은 도 13 및 도 14에서 제작한 CH3 돌연변이 쌍을 HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 후, 정제된 이종이중체 항체를 인간 Fc 부분을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot)으로 크기 및 조합형태를 분석한 결과이다. 이때, 음성대조군으로 야생형 CH3가 이용된 항체 및 양성대조군으로 놉-인투-홀 이중특이 항체를 이용하였고, 도 17은 비환원 조건에서, 도 18은 환원조건에서 수행한 결과이며, 분석에 이용한 단백질 양은 각각 0.1 μg이다.
도 20은 돌연변이체의 CH3 도메인이 도입된 Fc 이중체 단백질의 2차 구조가 야생형의 형태와 동일하게 보존되어 있는지를 확인하기 위하여 야생형과 돌연변이체 EW-RVT, 양성대조군 놉-인투홀의 Fc 이중체를 도 13에서 구축된 형태로 발현한 후 원이색성(Circular dichroism)을 측정한 결과이다. 그 결과, CH3 돌연변이체가 도입된 Fc 이중체는 야생형의 Fc 이중체와 동일한 원이색성을 가짐으로써, 단백질의 2차 구조가 변형 없이 그대로 유지되는 것을 확인하였다.
도 21는 돌연변이체의 CH3 도메인이 도입된 Fc 이중체가 FcRn에 대한 결합능이 보존되어 있는지를 확인하기 위하여 돌연변이체 EW-RVT를 도 14에서 서술된 이종이중체 형태로 발현한 후 SPR(Surface plasmon resonance)을 수행한 결과이다. 돌연변이 CH3 도메인을 포함한 항체는 야생형 CH3 도메인을 포함한 항체와 마찬가지로 FcRn에 대한 결합능을 그대로 유지하고 있는 것을 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로는 인간항체 IgG1을 포함한 항체인 Remicade (Infliximab, Janssen Biotech)를 이용하였다.
도 22의 (A)는 본 발명에서 제작한 CH3 돌연변이체 쌍이 scFv-Fc의 형태에 도입된 이중특이성 항체를 도식화한 그림이다. 표적 항원 DR4에 특이적으로 결합하는 인간화 hAY4a scFv 항체와(Lee, Park et al. 2010), 표적 항원 DR5에 특이적으로 결합하는 인간 HW1 scFv 항체(Park, Lee et al. 2007)의 친화도 향상된 AU5H scFv 항체를 CH3 도메인 변이체가 사용된 Fc의 N-말단에 융합하여 scFv-Fc 형태의 DR4 x DR5 이중특이성 항체를 구축하였다. (B)는 이중특이성 scFv-Fc 항체를 발현하는 벡터를 HEK293F 세포에 공동 형질전환하여 일시적으로 도입하여 발현, 정제한 것을 비환원성 조건의 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 구축한 CH3 도메인 돌연변이체 쌍 EW-RVT를 중쇄에 도입하였으며, 양성대조군으로 놉-인투-홀 이중특이 항체를 이용하여 구축하였다. (C)는 발현정제된 이중 특이성 scFv-Fc 항체의 자연(native) 상태에서의 크기를 확인하기 위하여 크기 배제 크로마토그로피를 수행한 결과이다. 대조군과 동일하게, 기대되는 103 kD의 크기의 단백질만이 검출된 것을 확인하였다.
도 23의 (A)는 본 발명에서 제작한 CH3 돌연변이체 쌍이 scFab-Fc (scIgG)의 형태에 도입된 이중특이성 항체를 도식화한 그림이다. 사용한 모항체는 도 20의 scFv-Fc 형태의 이중항체에서 사용한 것과 동일한 인간화 hAY4a 항체와 AU5H 항체이며, VH-CH 도메인과 VL-CL 도메인을 26개의 아미노산 사슬 링커로 연결한 형태의 단일사슬화 Fab(scFab)를 Fc 부분의 N-말단에 융합하여 scFab-Fc 형태의 DR4 x DR5 이중특이성 항체를 구축하였다. (B)는 이중특이성 scFab-Fc 항체를 발현하는 벡터를 HEK293F 세포에 공동 형질전환하여 일시적으로 도입하여 발현, 정제한 것을 비환원성 조건과 환원성 조건의 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 구축한 CH3 도메인 돌연변이체 쌍 EW-RVT를 중쇄에 도입하였으며, 양성대조군으로 놉-인투-홀 이중특이성 항체를 이용하여 구축하였다. 대조군과 동일하게 목적한 이중항체가 주요하게 생성된 것을 확인할 수 있다. (C)는 도 20에서 정제된 DR4 x DR5 이중특이성 scFv-Fc 항체 및 도 21에서의 DR4 x DR5 이중특이성 scFab-Fc 항체의, DR4 및 DR5 항원에 대한 결합능 및 특이성을 확인하기 위하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 수행한 결과이다. 그 결과, 제조한 이중항체가 항원인 DR4와 DR5에 특이성을 지니는 것을 확인하였으며, 이때 DR4 및 DR5의 유사항원으로는 DcR1 및 DcR2을 대조 항원으로 이용하였다.
도 24는 도 20에서 정제된 DR4 x DR5 이중특이성 scFv-Fc 항체 및 도 21에서의 DR4 x DR5 이중특이성 scFab-Fc 항체의 암 세포 사멸능을 확인하기 위하여 HCT116과 HeLa 세포주에서 세포독성실험(MTT assay)을 수행한 결과이다. 제조한 두 가지 형태의 이중항체는 모항체인 hAY4 IgG와 AU5H scFv와 비교하여 세포독성이 좀 더 증가하고, 양성대조군으로 이용한 TRAIL과 세포독성이 비슷하거나 조금 더 우수한 것으로 나타났다.

자연 상태에서 항체의 중쇄는 동종이중체로 존재한다. 이때 중쇄 간 이중체의 형성은 중쇄불변영역의 CH3-CH3 도메인간의 비공유결합 상호작용에 의해 이중체가 생성되면서 hinge 지역의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 안정화된다(Schroeder and Cavacini 2010)(도 1 참조). 중쇄불변부위의 CH3 도메인 간 이중체의 생성은 한 중쇄의 베타-시트(beta-sheet) 잔기들이 맞은 편 베타-시트(beta-sheet) 잔기들의 측쇄 사이에 비공유결합함으로써 이루어지고, 이를 통해 열역학적으로 안정된 동종이중체가 형성된다(Schroeder and Cavacini 2010).

IgG 항체의 중쇄불변부위의 동종이중체를 형성케하는 CH3 도메인간의 상호작용 분석은 X-ray 결정구조를 보고 분석하였는데, 이용된 구조는 PDB code = 1FC1, 1L6X 및 3AVE이다.

CH3 도메인 간 상호작용면의 잔기를 분석한 결과, 상호작용면의 내부에는 소수성 결합으로써 동종이중체의 형성에 가장 크게 기여하는 소수성 결합 코어구조가 존재하는데, 이는 Leu351, Thr366, Leu368, Tyr407 잔기이다. 또한, 상호작용면 상에서 정전기적 상호작용으로 CH3 도메인간의 이중체 형성에 기여하는 Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, Lys409, Lys439 잔기가 존재한다. 특히, 한 중쇄의 CH3 도메인의 Lys409 잔기와 맞은편 다른 중쇄의 CH3 도메인의 Asp399 잔기 간의 정전기적 인력(electrostatic interactions)과, 한 중쇄의 CH3 도메인의 Glu357 잔기와 맞은 편 다른 중쇄의 CH3 도메인의 Lys370 잔기 간 정전기적 인력(electrostatic interactions)은 CH3 도메인 간의 내부에 존재하면서 정전기적 인력을 통한 동종이중체의 형성 증진에 기여한다.

또한, 상호작용면에는 존재하나, 인접한 아미노산 잔기와 소수성 결합이나 정전기적 결합과 같은 CH3 도메인 간의 이중체 형성증진에 크게 기여를 하는 상호작용이 존재하지 않는 잔기인 Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, 400S가 존재한다(도 2 참조). 이들 잔기 중 일부는 비교적 약한 비공유결합으로 도메인 간 상호작용에 기여한다.

이때, 상기 용어 "비공유결합(non-covalent interaction)"은 원자 또는 분자가 공유결합 이외의 상호작용에 의해 집합체를 형성할 때 결합력이 약한 상호작용을 의미하는 것으로, 정전기적 결합(electrostatic interation), 소수성 결합(hydrophobic interaction), 수소 결합(hydrogen bonding), 반데르발스 결합(Van Der Waals interation)에 의한 상호작용을 포함한다.

상기 용어 "정전기적 결합(electrostatic interation)"은 반대 전하를 갖는 이온 사이의 전기적 인력에 의존하는 결합을 의미하고, 상기 용어 "소수성 결합(hydrophobic interaction)"은 극성 용매와의 상호작용을 피하고 열역학적으로 안정화하기 위한 소수성 분자들의 경향에 따른 결합을 의미하며, 상기 용어 "수소 결합(hydrogen bonding)"은 수소와 플루오린, 산소, 질소가 만나 생긴 극성 공유 결합 분자 사이에 생기는 쌍극자 쌍극자간 상호작용을 의미한다. 또한, 상기 용어 "반데르발스 결합(Van Der Waals interaction)"은 Van Der Waals 힘에 의해 분자에 극성이 생겨 상호간에 인력과 척력의 작용으로 이루어지는 결합을 의미한다.

또한, 상기 용어 "동종이중체"는 동일한 아미노산 서열을 지닌 항체 도메인 또는 이를 포함하는 항체의 일부 또는 전체의 이중체를 의미하며, 구체적으로 항체의 중쇄불변부위의 CH3 도메인간의 이중체 또는 이 동일한 CH3 도메인을 포함한 항체 중쇄불변부위 이중체를 의미한다.

또한, 상기 용어 "동종이중체 중쇄불변부위(homodimeric Fc)"는 동일한 아미노산 서열을 지닌 중쇄불변부위 (hinge-CH2-CH3)간의 이중체를 의미한다.

본 발명에서는 CH3 도메인 간 상호작용에 기여하는 아미노산 잔기를 변형하여, 한 중쇄의 CH3 도메인인 'CH3A', 다른 중쇄의 CH3 도메인인 'CH3B'가 비공유결합을 통해 서로 선택적으로 상호작용할 수 있는 쌍(CH3A:CH3B)의 형성을 유도함으로써, CH3 돌연변이 쌍이 힌지(hinge)-CH2의 C-말단에 융합된 중쇄불변부위 쌍, 즉 hinge-CH2-CH3A 및 hinge-CH2-CH3B 사이에 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)가 형성되는 수율을 증진시키고자 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

이때, 상기 용어 "이종이중체"는 아미노산 서열이 서로 다른 2종의 항체 도메인 또는 이를 포함하는 항체의 일부 또는 전체로 이루어진 이중체를 의미하며, 구체적으로 항체의 중쇄불변부위의 서열이 다른 CH3 도메인 쌍의 이중체 또는 서열이 다른 CH3 도메인 쌍을 포함하는 항체의 일부 또는 전체로 이루어진 이중체를 의미한다.

또한, 상기 용어 "이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)"는 아미노산 서열이 다른 CH3A, CH3B을 각각 포함하는 중쇄불변부위(hinge-CH2-CH3)간의 이중체를 의미한다.

또한, 상기 용어 "이종이중체 중쇄불변부위 형성 수율"은 CH3 도메인 돌연변이 쌍이 포함된 중쇄불변부위 쌍을 HEK293F 동물세포에 동시에 형질전환하여 발현하고 정제하였을 때, 전체 중쇄불변부위 이중체(homodimer, heterodimer) 또는 단일체(monomer)의 합에서 이종이중체로 형성된 중쇄불변부위의 비율을 백분율로 나타낸 것을 의미한다.

본 발명은 하기의 (a) 결합을 포함하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 제공한다:

(a) CH3 도메인 중 위치 Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 및 Lys409로 이루어진 제 1군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 1군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 알라닌 (A), 트레오닌 (T), 세린 (S), 발린 (V), 메티오닌 (M), 및 글라이신 (G)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산; 및

ⅱ) 상기 제 1군의 CH3 도메인 위치 중 1종 이상 선택된 위치에서 치환된, 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산

간의 결합.

(단, 상기 위치는 EU index에 따름)

상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 하기의 (b) 결합을 추가로 포함할 수 있다.

(b) CH3 도메인 중 위치 Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 및 Ser400으로 이루어진 제 2군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 2군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 라이신 (K) 또는 아르지닌 (R); 및

ⅱ) 상기 제 2군의 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)

간의 결합.

(단, 상기 위치는 EU index에 따름)

상기 제1군의 위치는 Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 및 Lys409로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Lys409은 트립토판 (W)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Tyr349은 세린 (S)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Glu357는 트립토판 (W)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 제2군의 위치는 Gln347 또는 Lys360인 것을 특징으로 하는, 항체 CH3의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Lys360은 글루탐산(E)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Gln347은 글루탐산 (E)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Gln347은 글루탐산 (E)으로, Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 CH3 도메인의 Tyr349은 세린 (S)으로, Lys409은 트립토판(W)으로 치환되고; 다른 일 CH3 도메인의 Glu357은 트립토판 (W)으로, Asp399은 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 하기의 (c) 결합을 추가로 포함할 수 있다:

(c) CH3 도메인 중 위치 Tyr349 및 Ser354로 이루어진 제 3군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 3군의 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C); 및

ⅱ) 상기 제 3군의 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C)의 결합.

또한, 상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린의 Fc 부분에 포함되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 IgG는 인간 IgG인 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 이종의 CH3 도메인인 CH3A와 CH3B에 유도되는 돌연변이 쌍은 기존의 전략과는 다른 방법으로, 이종이중체 형성 수율이 증진되고, 안정화된 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)가 형성되게 하기 위하여, CH3 도메인 변이체 쌍을 고안하였다.

구체적으로, CH3 도메인 간의 상호작용면의 내부에 위치하여 외부에 노출되지 않은 아미노산 잔기 중에서, CH3 도메인 간의 이중체 형성에 기여도가 높은 소수성 코어를 그대로 유지하면서, 상호작용면 내부에 존재하며, 정전기적 상호작용으로 CH3 도메인간의 동종이중체 형성에 기여하는 아미노산 잔기 Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, Lys409 잔기에 돌연변이를 유도하여, 한 중쇄의 상호작용면의 소수성 잔기가 맞은 편 다른 중쇄의 상호작용면의 소수성 잔기 사이에 삽입될 수 있도록 공간보완적인 소수성 결합 돌연변이를 갖는 돌연변이체 쌍을 제작하였다. 이러한 접근은 기존의 CH3 도메인간의 동종이중체 형성에 기여하는 상호작용을 제거하고, 이종이중체에서만 소수성 인력 형성을 유도할 수 있는 상호작용으로 치환함으로써, 보다 높은 이종이중체의 형성능을 증진을 기대할 수 있다. 또한, 이러한 접근 방식은 야생형 CH3 도메인 상호작용 소수성 코어 아미노산 잔기를 최대한 보존한 것이며, 이를 통해 생성될 이종이중체의 안정성을 향상시킬 수가 있을 뿐 아니라, 기존의 소수성 코어부분에 선택적인 소수성 결합이 형성되어 이종이중체 항체를 제작한 놉-인투-홀 기술과는(Ridgway, Presta et al. 1996) 차별화된 전략이다.

또한, CH3 도메인간의 상호작용면에 존재하나, 인접한 아미노산 잔기와 소수성 결합이나 정전기적 결합과 같은 CH3 도메인간의 이중체 형성증진에 크게 기여하지 않는 잔기인 Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, Ser400 잔기에 한 중쇄의 아미노산 잔기의 전하와 맞은 편 다른 중쇄의 잔기의 전하를 상반되게 가지는 선택적인 정전기적 결합 돌연변이 쌍을 유도하였다. 이를 통해 동종 CH3 도메인 간에는 상호작용이 배제되고, 이종이중체의 형성을 증가시킬 수 있는 장거리 정전기적 결합이 선택적으로 형성되게 유도하였다. 이러한 접근 방식은 아미노산 잔기들이 서로 마주한 맞은 편 CH3 도메인의 잔기들과 비교적 먼 거리에서도 상호작용할 수 있도록 정전기적 인력을 도입함으로써, 새로운 상호작용을 부여한 것이며, 이는 선택적인 이종이중체의 형성에 기여하게 된다.

또한, 상기와 같은 접근 방법에 있어, CH3 도메인간의 상호작용면 내부에 위치하는 소수성 코어부분을 보존한 이종이중체 CH3 도메인 변이체 쌍은, 야생형과 비슷한 열열학적 안정성, 면역원성, 동물세포에서의 발현 생산성을 유지할 수가 있다.

또한, 기존의 FcRn(neonatal Fc receptor)이 결합하는 부위인 Thr250, Met252, Ile253, Ser254, Thr256, Thr307, His310, Glu380, Met428, His433, Asn434, His435, Tyr436과 FcgR(fc gamma receptors) 결합 부위인 Leu234, Leu235, Gly236, Gly237는 보존하여, 항체 중쇄와 FcRn 또는 FcgR의 결합에 따른 혈액 내 반감기의 증진(long serum half-life), 항체-의존성 세포 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity) 등의 항체의 고유한 활성을 유지할 수 있다(Wines, Powell et al. 2000; Roopenian and Akilesh 2007).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서, 고안된 CH3 도메인 변이체의 이종이중체 형성능을 평가할 수 있는 시스템을 구축하였다. 구체적으로, 상기 시스템은 각각의 CH3 도메인 변이체 쌍이 포함되는 항체의 중쇄불변부위가 융합된 항체를 동물세포에서 발현 정제하고, 이때 돌연변이체 쌍에서 CH3A 도메인이 포함된 한쪽 중쇄 불변부위에만 단일사슬항체절편(scFv)을 융합하여 발현되도록 하고, CH3B 도메인이 포함된 중쇄 불변 부위는 항체 절편의 융합 없이 단독으로 발현될 수 있도록 하였다. 이를 통해, CH3A 도메인이 포함된 중쇄는 CH3B 도메인이 포함된 중쇄에 비해 큰 분자량을 가지게 되고, 따라서 이종이중체(scFv-Fc:Fc)와 동종이중체(scFv-Fc:scFv-Fc, Fc:Fc)가 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 서로 다른 이동속도를 가지게 되어 발현정제 된 항체 중 이종이중체 (heterodimer)의 양을 상대적으로 비교할 수 있다(도 15 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 일실시예에서, 상기 구축된 이종이중체 형성능 평가 시스템으로, 본 발명에 따른 CH3 도메인 변이체 쌍을 포함한 항체의 경우, 그 형성 수율이 약 90~95%로, 기존 놉-인투 홀 기술을 이용한 이종이중체 형성 수율에 비해, 현저히 높음을 확인하였다(도 16 및 17 참조).

또한, 본 발명은 상기 CH3 도메인의 이종 이중체를 포함하는 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc) 쌍 및 상기 CH3 도메인의 이종 이중체를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.

상기 이중특이적 항체는 scFv-Fc, scIgG(scFab-Fc), (Fv)₂-Fc, mAb-Fv 및 Fv-Fc로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 융합 단백질은 Protein-Fc 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄불변부위 CH3 도메인에 돌연변이가 유도된 CH3 이종 이중체는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질을 구성할 수 있으며, 상기 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질은 항원 특이성이 다른 항체를 중쇄가변부위(VH), 경쇄가변부위(VL), 단일사슬항체절편(scFv) 또는 단일사슬항체절편(scFab) 형태로 융합하여 두 가지 다른 항원에 동시에 결합할 수 있는 이중특이성 항체 및 전형적인 IgG의 중쇄 C-말단에 가변단일항원결합도메인 (VH, VL)을 각각 융합한 이중특이성 가변부위융합단일항체 (mAb-Fv)의 다양한 형태의 이중특이성 항체, 또는 단일항원에 결합하는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL)을 융합하여 단일 항원에 1가(monovalent)로 결합할 수 있는 항체(Fv-Fc), 특정 단백질과 결합할 수 있는 세포막 수용체 세포외 도메인, 펩타이드, 단일도메인 항체, 리간드, 독소 등을 융합하여, 1종 또는 2종의 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc)의 형태일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 CH3 도메인 변이체 쌍을 이용하여, scFv 형태 및 scFab 형태의 항-DR4 x DR5 이중특이성 항체를 제작하고, 상기 이중특이성 항체가 각각 표적분자 DR4 및 DR5에 대한 특이성을 지님을 확인하였으며(도 22 및 23 참조), 이를 통해, 본 발명의 CH3 도메인 변이체 쌍을 이용하여 제조된 이중특이성 항체는 항원 결합부위의 결합능을 그대로 유지함을 알 수 있었다.

이때, 상기 용어 "단일사슬항체절편(scFv)"는 1 개의 VH와 1 개의 VL 을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(L)를 사용하여 연결한 VH-L-VL 내지 VL-L-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미한다.

또한, 상기 용어 단일사슬항체절편(scFab)는 1 개의 VH부터 CH1까지 발현된 중쇄절편과, 1개의 VL과 CL 부분이 포함된 경쇄에 34잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(L)를 사용하여 연결한 VL-CL-L-VH-CH1 내지는 VH-CH1-L-VL-CL 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 의미한다.

또한, Fv는 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 용어 "Fv-Fc"는 단일 항원에 결합하는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL)을 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합하여 단일 항원에 1가(monovalent) 형태로 결합할 수 있는 항체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용된 상기용어 "mAb-Fv"는 전형적인 형태의 IgG 중쇄 C-말단에 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL)이 각각 융합하여, 항원에 3가(trivalent) 형태로 결합할 수 있는 항체, 또는 mAb항원에 2가로 Fv 항원에 1가로 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용된 상기 용어 "항체불변부위 융합 단백질(Protein-Fc)"은 본 발명에 따른 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 특정 단백질과 결합할 수 있는 세포막 수용체 세포외 도메인, 펩타이드, 단일도메인 항체, 리간드, 독소 등이 융합되어, 1종 또는 2종의 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 융합 단백질을 의미한다.

아울러, 본 발명은 상기 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 의해 제조된 이중특이성 항체 또는 융합 단백질은 종양 또는 면역질환과 관련된 항원 또는 단백질을 특이적으로 표적할 수 있으므로, 상기 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약학적 조성물에 유용하게 쓰일 수 있다.

이때, 본 발명에 의해 제조된 이중특이성 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 하나의 단백질에 의해 발병 기전이 유도되는 것이 아닌, 여러 단백질이 중복적, 우회적, 단계적으로 작용하여, 발생하는 종양 또는 면역질환과 관련된 2종의 항원을 동시에 표적할 수 있으므로, 1종의 표적 단백질만 표적하는 단일클론항체를 포함하는 약학적 조성물에 비해 질환의 치료 효과를 높일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서, 본 발명에서 제조된 항-DR4 x DR5 scFv-Fc 및 scFab-Fc 이중특이항체의 암 세포 사멸능을 확인하기 위하여, 인간유래 암세포인 HCT116(colorectal carcinoma)과 HeLa(adenocarcinoma) 세포주에서 세포독성 실험(MTT assay)을 수행하였으며, 상기 두 가지 형태의 이중특이항체는 모항체인 인간화항체 hAY4a IgG와 인간항체 AU5H-scFv와 비교하여 암 세포 사멸능이 증가하였으며, 양성대조군으로 이용한 TRAIL과 비교하여 세포독성이 비슷하거나 조금 더 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 24 참조).

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 당 0.01g 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 CH3 도메인 변이체 (heterodimeric CH3)쌍의 제조 방법을 제공한다:

(a) CH3 도메인 중 위치 Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 및 Lys409로 이루어진 제 1군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 1군의 위치 중 1 종 이상 선택된 위치를, 알라닌 (A), 트레오닌 (T), 세린 (S), 발린 (V), 메티오닌 (M), 및 글라이신 (G)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환하고;

ⅱ) 상기 제 1군의 위치 중 1종 이상 선택된 위치를, 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환하여 돌연변이 쌍을 제조하는 단계;

(b) CH3 도메인 중 위치 Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 및 Ser400으로 이루어진 제 2군의 위치에서,

ⅰ) 상기 제 2군의 위치 중 1 종 이상 선택된 위치를, 라이신 (K) 또는 아르지닌 (R)으로 치환하고;

ⅱ) 상기 제 2군의 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치를 아스파르트산(D) 또는 글루탐산 (E)으로 치환하여 돌연변이 쌍을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 (a) 및 (b) 돌연변이 쌍을 결합하는 단계.

또한, 본 발명은

(d) 상기 제조된 CH3 도메인 변이체 쌍이 항체 중쇄불변부위 야생형 힌지(hinge)-CH2 도메인의 C-말단에 각각 융합된 형태의 핵산(nucleic acids)을 포함하는, 재조합 중쇄불변부위 (Fc) 쌍 단백질 발현벡터를 제조하는 단계;

(e) 상기 제조된 발현벡터를 세포에 공동 형질전환하여 재조합 중쇄불변부위 (Fc) 쌍 단백질을 발현하는 단계; 및

(f) 상기 공동 발현된 재조합 중쇄불변부위 쌍 단백질을 정제 및 회수하는 단계를 포함하는,

이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 쌍((hinge-CH2-CH3A) (Hinge-CH2-Ch3B)) 단백질의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 항체 중쇄불변부위 이종이중체 형성능 증진을 위한 CH3 도메인 변이체의 고안

인간 항체 IgG1의 중쇄불변부위 (Fc)의 이종이중체 형성을 위한 CH3 도메인 돌연변이체 유도를 위해서, 상술한대로 먼저 CH3 도메인간의 상호작용에 주요하게 작용하는 비공유결합 쌍 아미노산 잔기를 분석하고, 이를 토대로 CH3 도메인 간 동종이중체 형성은 배제되고 이종이중체 형성이 열역학적으로 선호되는 돌연변이 쌍을 고안하였다. 즉 CH3 도메인간의 상호작용에 기여하는 아미노산 잔기들의 변형을 통하여 하나의 중쇄의 CH3 도메인인 'CH3A' 다른 쪽 중쇄의 CH3 도메인인 'CH3B'가 서로 선택적인 상호작용이 증진될 수 있는 비공유결합 생성 아미노산 잔기 치환을 CH3A, CH3B에 유도하여 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc)인 CH3A:CH3B 형성을 유도하고자 하였다. 이때 이종의 CH3A:CH3B에 유도되는 돌연변이 쌍은 기존의 문헌 또는 특허에 공개된 중쇄불변부위 이종이중체 형성을 증진시키기 위한 돌연변이 쌍과는 다른 전략으로 CH3A:CH3B 형성이 고수율로 형성되도록 하고, 안정되게 유지되도록 고안하였다. 또한, 돌연변이 아미노산 잔기는 잠재적인 면역원성을 최소화하기 위하여 CH3 도메인간의 상호작용면에 존재하는 잔기로 제한하였으며, FcRn 및 FcRs 결합부위 잔기의 돌연변이도 배제하여, 항체 중쇄불변부위 고유기능을 유지시키고자 하였다(Roopenian and Akilesh 2007). 또한, CH3A:CH3B에 최소한의 돌연변이 쌍과 이들의 조합으로 구성된 CH3A:CH3B로 생성되는 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 형성 수율을 평가하여 가장 높은 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)형성 수율를 보이는 CH3A:CH3B 돌연변이체 쌍을 개발하고자 하였다.

이를 위해, CH3 도메인 간의 상호작용면에 위치하는 아미노산 잔기 중에서,

1) CH3 도메인 상호작용 내부의 정전기적 결합으로 CH3 도메인 동종이중체 형성에 기여하는 잔기들을 공간적 보완 소수성 결합을 생성할 수 있는 아미노산 잔기 돌연변이 쌍으로 치환하여 동종이중체(homodimer) 형성은 배제되고 이종이중체(heterodimer) 형성이 선호되는 돌연변이 쌍과,

2) CH3 도메인 간의 이중체 형성에 크게 기여하지 않은 아미노산 잔기들을 장거리 정전기적 인력이 선택적으로 형성되는 아미노산 잔기 돌연변이 쌍으로 치환하여 동종이중체 형성은 배제되고, 이종이중체의 형성이 열역학적으로 선호되는 CH3 돌연변이체 쌍을 구상하고 구축하였다.

즉, CH3 도메인 상호작용 내부의 선택적인 공간적 보완 소수성 결합 돌연변이 쌍 유도를 위해서는 CH3 도메인간의 상호작용면 내부에 위치하는 친수성, 소수성 아미노산 잔기의 위치 및 상호결합을 분석하여, 이들 중 이종이중체 형성을 위한 공간적으로 선택적인 소수성 결합 형성이 선호되는 돌연변이 쌍을 CH3A:CH3B에 도입하였다.

또한, CH3 도메인 상호작용면에 새로운 장거리 정전기적 결합 돌연변이 쌍을 유도하기 위하여 상호작용면 내부의 소수성 결합부위 및 이미 정전기적 결합에 참여하고 있는 잔기를 제외한, CH3 도메인 상호작용면에는 존재하나 인접한 잔기와 상호작용이 없거나, 비교적 약한 수소결합이나 반데르발스인력에 의한 상호작용을 하는 잔기들 및 비교적 인접한 잔기와 측쇄간의 거리가 멀어 상호작용에 적합하지 않은 잔기들의 위치와 상호결합을 분석하여 이들 중 이종이중체 형성을 위한 선택적인 장거리 정전기적 결합의 형성이 선호되는 돌연변이 쌍을 CH3A:CH3B에 도입하여 이종이중체 형성을 유도하였다.

CH3 도메인 상호작용 내부의 소수성 결합 코어 아미노산 잔기 외에 정전기적 결합을 대체하는 선택적인 소수성 결합을 생성할 수 있는 아미노산 돌연변이 쌍 및 새로운 정전기적 인력을 상호작용면에 도입한 아미노산 돌연변이 쌍은 다음과 같이 분석하고 구축하였다.

[ CH3A ( Lys409Trp ) : CH3B ( Asp399Val , Phe405Thr )]

CH3A의 Lys409는 CH3도메인 상호작용 내부에 위치하면서 CH3B의 Leu368, Asp399, Phe405, Tyr407와 인접해 있다. 이 중 Lys409와 다른 사슬의 Asp399의 정전기적 인력은 CH3 도메인끼리의 상호작용에 기여하고 있다. CH3B의 Asp399는 CH3A의 Lys392, Lys409와 인접해있으며, 이들간의 정전기적 인력은 CH3 도메인간의 상호작용에 기여하고 있다. 이러한 CH3 도메인간 상호작용 소수성 코어에 인접해 있는 정전기적 인력을 선택적인 소수성 결합이 형성되도록 치환하면 기존에 CH3 도메인간의 동종이중체 형성에 기여하던 정전기적 결합은 사라지고, 공간 보완적인 소수성 결합에 의해 선택적으로 CH3 도메인간의 이종이중체 형성이 유도되어 이종이중체 형성능의 증진을 기대할 수 있다. 이를 위해 CH3A에 Lys409Trp와 CH3B에 Asp399Val 돌연변이 쌍을 유도하였다(도 4).

또한, CH3B의 Phe405는 CH3A의 Lys392, Thr394, Lys409와 인접하고 있는데, 돌연변이가 유도된 CH3A의 Lys409Trp의 측쇄가 CH3B의 Phe405의 큰 소수성 측쇄와의 공간적인 충돌로 이종이중체의 형성이 저해될 수 있다. 따라서 측쇄와 공간적으로 배치되면서 소수성결합이 유지되도록 Phe405Thr 돌연변이를 유도하였다.

CH3A 도메인의 Lys409를 트립토판(W)으로 치환하면 CH3A 도메인 간의 동종이중체의 생성이 저해된다. 이는 기존의 Lys409:Asp399의 정전기적 결합을 유지할 수 없을 뿐 아니라, 인접한 다른 체인의 Phe405, Tyr407의 측쇄에 의해 CH3 도메인 경계면 내의 공간배치가 어려워지기 때문이다.

CH3B 도메인의 Asp399를 발린(V)으로 치환하면 기존의 Asp399:Lys392, Asp399:Lys409쌍의 정전기적 인력이 사라져 동종이중체의 생성을 상대적으로 저해할 수 있다.

또한, CH3B 도메인의 Phe405를 트레오닌(T)로 치환하면 동종이중체의 생성을 상대적으로 저해하는 효과는 없으나 이종이중체의 형성 시 CH3A 도메인의 Lys409Trp과 소수성 결합에 기여할 수 있다.

따라서, CH3A 도메인의 Lys409Trp 치환과 CH3B의 Asp399Val 치환의 조합 및 CH3A 도메인의 Lys409Trp 치환과 CH3B도메인의 Phe405Thr 치환의 조합은 CH3 도메인 간의 상호작용 경계면에서 가장 적절한 거리를 유지하면서 상호 보완적인 소수성 결합을 유지하게 되어 CH3A:CH3B의 이종이중체 생성이 선호된다.

[ CH3A ( Lys360Glu ) : CH3B ( Gln347Arg )]

CH3A의 Lys360는 CH3도메인 상호작용 외부에 위치하면서 CH3B의 Gln347, Tyr349의 측쇄와 인접해 있는데, 거리가 멀어서 매우 약한 수소결합으로 CH3 도메인간의 상호작용에 기여한다. 따라서 CH3A의 Lys360, CH3B의 Gln347 잔기에 측쇄가 크며, 서로 반대 전하를 띠는 아미노산 잔기로 바꾸면, 장거리 정전기적 인력에 의해 이종이중체 형성이 선호된다. 따라서 CH3A의 Lys360을 Glu로 치환하고, CH3B의 Gln347를 아르지닌(R)으로 치환하면, CH3A의 Glu360와 CH3B의 Arg347간의 상호작용으로 CH3A:CH3B 형성이 선호된다. 하지만, CH3B의 경우는 Lys360:Gln347Arg 쌍의 정전기적 반발로 동종이중체의 형성이 저해된다(도 5).

[ CH3A ( Gln347Glu ) : CH3B ( Lys360 )]

상기한 CH3A 도메인의 Lys360과 CH3B 도메인의 Gln347 측쇄간의 약한 상호작용과 마찬가지로 CH3A 도메인의 Gln347 측쇄와 CH3B 도메인의 Lys360 측쇄간에 먼 거리의 약한 수소결합으로 CH3 도메인간의 상호작용에 기여한다. 따라서 서로 반대 전하를 띠는 아미노산 잔기로 바꿈으로써 비교적 장거리 정전기적 인력을 도입하여 이종이중체 형성을 도울 수 있다. 이때 상기한 CH3A 도메인의 Lys360Glu와 CH3B 도메인의 Gln347Arg 돌연변이체 쌍과 함께 이용하기 위해서 CH3A 도메인의 Gln347에는 Glu로 치환하여, CH3B 도메인의 Lys360과 상호작용할 수 있도록 하였다(도 6).

따라서, 상기한 CH3A 도메인의 Lys360Glu와 CH3B 도메인의 Gln347Arg 돌연변이 쌍과 CH3A 도메인의 Gln347Glu와 CH3B 도메인의 Lys360 돌연변이 쌍은 각각의 정전기적 상호작용으로 인하여 이종이중체의 형성이 선호됨과 동시에 CH3A 도메인끼리는 Gln347Glu과 Lys360Glu간의 정전기적 반발력으로 인하여 동종이중체의 형성이 저해되고, CH3B 도메인끼리는 Gln347Arg과 Lys360간의 정전기적 반발력으로 인하여 동종이중체의 형성이 저해된다.

[ CH3A ( Tyr349Ser ) : CH3B ( Glu357Trp )]

CH3A의 Tyr349는 CH3도메인 상호작용 외부에 위치하면서 CH3B의 Ser354, Asp356, Glu357, Lys360의 측쇄와 인접해 있다. CH3B의 Glu357은 CH3도메인 상호작용 외부에 위치하면서 CH3A의 Tyr459, Lys370의 측쇄와 인접해 있으며, 이 중 Lys370과 장거리 정전기적 결합으로 CH3 도메인간의 상호작용에 참여하고 있다.

따라서 CH3A의 Tyr349를 세린(S)으로 치환하고, CH3B의 Glu357을 트립토판(W)으로 치환하면 기존 CH3B의 Glu357과 CH3A의 Lys370과의 정전기적 결합이 없어지고 CH3A의 Tyr349Ser과 Glu357Trp 간의 측쇄의 크기에 따른 상호보완적인 작용으로 CH3A:CH3B의 형성이 선호된다 (도 7).

또한 CH3B의 Glu357Trp은 CH3A Lys370와의 정전기적 결합을 제거하는 역할 외에도 CH3B의 Tyr349와도 인접하게 되어 도메인 경계면 내의 공간배치가 어려워져 CH3B 도메인 간의 동종이중체의 생성을 저해할 수 있다.

[ CH3A ( Ser354Cys ) : CH3B ( Tyr349Cys ) / CH3A ( Tyr349Cys ) : CH3B ( Ser354Cys )]

CH3A 도메인의 Ser354는 CH3B 도메인의 Tyr349와 인접해 있으며, 두 잔기를 모두 시스테인(C)으로 치환하면 도메인 간의 이황화 가교가 생성된다. 이황화 가교의 도입을 통해 생성된 이종이중체의 안정화를 도모할 수 있으며, 도입한 하나의 이황화 가교는 CH3 도메인 상호작용면에 비대칭적으로 존재하므로 이종이중체 생성 수율을 향상하는 데에 도움을 준다. CH3A 도메인의 Tyr349와 CH3B 도메인의 Ser354 잔기를 시스테인(C)으로 치환하는 것도 같은 역할을 할 수 있다.

< 실시예 2> 항체 중쇄불변부위 이종이중체 형성능 증진을 위한 CH3 도메인 돌연변이체 구축방법

상기 실시예 1에서 고안된 CH3 도메인 돌연변이체 쌍은 각각, 또는 조합으로 구성된 CH3A:CH3B로 구축되어, 5종의 CH3A:CH3B 이종이중체 쌍을 구축하였으며, 구축한 이종이중체 쌍의 안정화 및 이종이중체 생성 수율의 향상을 위하여 이황화 가교를 도입한 돌연변이체 2종을 구축하였다 (도 11 및 표 1).

CH3A 및 CH3B 돌연변이체는 IgG1의 중쇄 불변부위 CH3도메인 염기서열을 기반으로, 고안된 돌연변이가 유도되도록 DNA를 합성(Bioneer, Korea)하였다. 염기서열은 시퀀싱을 통해 확인하였으며(Macrogen, Korea), 구축한 CH3A:CH3B 돌연변이 쌍은 하기 [표 1]과 같다.

인간 CH3 도메인 이종이중체 형성을 위해 구축된 돌연변이 쌍(CH3A:CH3B) 및 각 도메인에 도입된 돌연변이 쌍

Mutant name	CH3A	CH3B
E-R	K360E	Q347R
W-VT	K409W	D399V/F405T
EW-RVT	K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
EW-RVT (S-S)	Y349C/K360E/K409W	Q347R/S354C/D399V/F405T
EEW-RVT	Q347E/K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
SW-WVT	Y349S/K409W	E357W/D399V/F405T
SW-WVT (S-S)	Y349S/S354C/K409W	Y349C/E357W/D399V/F405T

< 실시예 3> 본 발명에서 제작한 CH3 도메인 변이체의 이종이중체 형성능 평가시스템 구축

상기 <실시예2>에서 제작한 CH3 도메인 돌연변이체의 이종이중체 형성 수율을 평가하기 위하여 구축된 CH3A 도메인은 scFv-Fc포멧으로, CH3B 도메인은 dummy-Fc 포멧으로 발현되도록 동물발현벡터에 클로닝하였다(도 13 및 14). 사용한 scFv 항체는 DR4에 특이적으로 결합하는 인간화항체 hAY4의 친화도가 향상된 버전인 hAY4a의 VH와 VL 부위를 연결한 항체이다(Lee, Park et al. 2010).

hAY4a scFv-Fc와 dummy-Fc를 CMV 프로모터를 지닌 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 signal sequence-hAY4a scFv-Hinge-CH2-CH3 또는 signal sequence-Hinge-CH2-CH3를 가지도록 인 프레임(in-frame)으로 SacI/XbaI을 이용하여 클로닝 하였다.

상기와 같이 CH3A 도메인은 scFv-Fc 포멧으로, CH3B 도메인은 dummy-Fc 포멧으로 발현하면, 정제된 항체를 SDS-PAGE 상에서 동종이중체와 이종이중체의 수율을 확인할 수 있다. 이는 scFv-Fc의 형태가 dummy-Fc의 형태보다 분자량이 크기 때문에, scFv-Fc 동종이중체와 scFv-Fc/dummy-Fc 이종이중체, dummy-Fc 동종이중체의 분자량이 각각 다르게 나타나고, SDS-PAGE 상에서 밴드 이동 정도의 차이에 따라 구별이 가능한 원리를 이용한 것이다(도 15). 하기 [표 2]는 구축한 scFv-Fc/dummy-Fc CH3 도메인 돌연변이체 쌍을 나타낸 것으로, 구축된 CH3 도메인 돌연변이 쌍을 포함한 중쇄불변부위의 이종이중체 형성능 평가를 위한 scFv-Fc 및 dummy-Fc 발현 형태를 나타내었으며, KiH은 대조군으로 사용하였다.

이종이중체 형성능 평가 시스템에 이용된 돌연변이쌍

Mutant name	scFv - Fc ( CH3A )	dummy - Fc ( CH3B )
E-R	K360E	Q347R
W-VT	K409W	D399V/F405T
EW-RVT	K360E/K409W	Q347R /D399V/F405T
EW-RVT (S-S)	Y349C/K360E/K409W	Q347R/S354C/D399V/F405T
EEW-RVT	Q347E/K360E/K409W	Q347R /D399V/F405T
SW-WVT	Y349S/K409W	E357W/D399V/F405T
SW-WVT (S-S)	Y349S/S354C/K409W	Y349C/E357W/D399V/F405T
KiH (Genentech)	T366S/L368A/Y407V	T366W

< 실시예 4> CH3 도메인 변이체를 포함한 항체의 발현 및 정제

HEK293-F 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 상기 <실시예 3>에서 구축된 각각의 플라스미드 CH3A 변이체를 포함하는 중쇄 및 CH3B 변이체를 포함하는 중쇄의 일시적 형질감염(transient transfection)을 이용하여 이중특이적 항체를 생성시켰다. 진탕 플라스크 또는 교반 발효기에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen)를 2개의 발현 플라스미드 및 Polyethylenimine(PEI, Polyscience)의 혼합물로 형질감염하였다. 1 L 진탕 플라스크(Corning)의 경우, HEK293-F 세포를 200 mL 중 1.0E*6 세포/mL의 밀도로 파종하고, 120 rpm, 8% CO₂에서 배양하였다. 하루 후, 세포를 약 2.0E*6 세포/mL의 세포 밀도에서 같은 몰 비율로, CH3A 변이체를 포함하는 중쇄 및 CH3B 변이체를 포함하는 중쇄를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 총 400 (2 /mL)을 함유하는 10 mL FreeSytle 293 발현 배지 (Invitrogen) 및 10 mL FreeSytle 293 발현 배지 + 800 PEI (4 /mL)의 약 21 mL 혼합물로 트랜스펙션하였다. 상청액을 5일 후에 채취하였다.

표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1M 글리신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉각적으로 중화하였다. 용리한 항체 분획은 Pierce Dextran Desalting Column (5K MWCO)를 이용하여 PBS (pH7.4)로 완충액을 교환한 후, MILLIPORE Amicon Ultra (10 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고, 정제된 Fc 변이체 항체는 BCA 기법을 통해 정량하였다.

< 실시예 5> CH3 도메인 변이체를 포함한 항체의 이종이중체 형성능 평가와 수율비교 , 단백질 2차 구조 및 FcRn에 대한 결합능 분석

상기 <실시예 4>에서 정제된 CH3 돌연변이 쌍이 삽입된 항체 10 g을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 16). CH3A 변이체의 동종이중체는 103 kD, CH3B 변이체의 동종이중체는 53kD, CH3B 변이체의 단량체는 25 kD에서 관찰되었으며, CH3A 변이체와 CH3B 변이체의 이종이중체는 78 kD에서 관찰되었다.

CH3A 변이체를 포함하는 중쇄 및 CH3B 변이체를 포함하는 중쇄 플라스미드 DNA를 같은 몰농도로 일시적 형질감염하여 발현 정제하였을 때 대조군인 야생형 CH3 도메인이 도입된 이종이중체와 비교하여 돌연변이체의 이종이중체 형성능이 더 높은 것을 확인하였다. E-R 변이체 및 W-VT 변이체에 비하여 두 쌍을 모두 조합한 EW-RVT 및 EEW-RVT 변이체의 이종이중체 형성능이 각각 91% 정도로 더 증가한 것을 확인하였으며, 상기 두 변이체는 대조군인 놉-인투-홀의 이종이중체 형성능 약 86% 보다도 이종이중체의 형성능이 증가한 것으로 나타났다(표 3). 또한 야생형 항체를 포함한 모든 변이체에서 Fc 단량체가 소량 관찰되었는데, 이는 중쇄간의 발현 정도 차이로 인한 것으로 예상된다.

또한, E-R 변이체의 경우 scFv-Fc/Fc 이종이중체의 형성이 약 53%로 나타나고, W-VT 변이체의 scFv-Fc/Fc 이종이중체의 형성능이 약 77%로 나타나는 것을 확인함으로써, 이종이중체의 형성능의 증가는 장거리 정전기적 결합을 새로 추가함으로써도 기여할 수 있지만, 상호작용면 내부에 기존 동종이중체 형성능에 작용하던 상호작용을 제거하고 선택적인 공간보완적 소수성결합을 추가한 전략이 비교적 더 많이 기여한 것을 확인할 수 있었다.

또한, CH3 도메인의 상호작용면 내부에 추가적인 공간적 보완 소수성 결합을 도입하는 전략이나, 상호작용면에 새로운 장거리 정전기적 인력 돌연변이 쌍을 추가적으로 도입하는 전략을 단독으로 수행하는 것보다, 두 가지 전략을 동시에 수행하는 것이 이종이중체 형성능 증진에 도움을 주는 것을 확인하였다.

그리고 구축된 CH3 돌연변이 쌍이 도입된 중쇄불변부위 Fc 이중체 단백질이, 야생형 중쇄불변부위 Fc와 같이, 단백질 A 레진으로 잘 정제되는 것은, CH3 돌연변이 쌍에 도입된 돌연변이가 단백질 A와 중쇄불변부위 사이의 상호작용에는 영향을 주지 않았음을 시사한다.

또한, 정제된 야생체 및 돌연변이체 CH3 도메인이 포함된 이종이중체 항체 0.1 g을 각각 비환원성 및 환원성 조건에서 웨스턴블랏(western blot)으로도 확인하였다(도 17 및 도 18). 상기의 방법으로 SDS-PAGE를 수행한 겔을 PVDF 막에 옮겨 goat 항-human IgG (Sigma), 항-goat IgG HRP (SantaCruz)를 표지하였고, PowerOpti-ECL reagent (Animal Genetics Inc)로 검출하였으며, 분석은 ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare)를 이용하였다. 웨스턴 블랏으로 이종이중체 형성을 확인한 결과 상기한 SDS-PAGE 상에서 확인된 결과와 유사하게(도 16), E-R 변이체 및 W-VT 변이체와 대조군 놉-인투-홀에 비하여 두 쌍을 모두 조합한 EW-RVT 및 EEW-RVT 변이체의 동종이중체의 형성이 저해된 것을 확인할 수 있었다.

상기한 실험에서 이종이중체의 형성능의 증가는 장거리 정전기적 결합을 새로 추가하였을 때보다, 상호작용면 내부에 기존 동종이중체 형성능에 작용하던 상호작용을 제거하고 선택적인 공간보완적 소수성결합을 추가한 전략이 비교적 더 많이 기여한 것을 확인하였기 때문에 (도 16), W-VT 변이체에 추가적인 공간보완적 결합쌍 (Tyr349Ser:Glu357Trp)을 조합한 SW-WVT 변이체를 구축하여 이종이중체의 형성능을 확인하였다 (도 19). SW-WVT 변이체의 경우 EW-RVT 변이체와 비교하여 동종 이중체의 형성능은 다소 감소하였으나, Fc 단량체가 관찰되어 약 89%의 이종이중체 형성능을 가지는 것을 확인하였다 (표 3). 이는 중쇄간의 발현 정도의 차이에 의한 것으로 형질감염시 플라스미드의 몰 비율을 조절함으로써 이종이중체 형성능을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.

또한 EW-RVT 변이체와 SW-WVT 변이체에 이황화 가교를 도입하여 이종이중체 형성능을 비교하였다 (도 19). EW-RVT 변이체의 경우에는 도입된 E-R 돌연변이 쌍 (Lys360Glu:Gln347Arg)에 의한 장거리 정전기적 결합이 CH3 도메인 상호작용면의 외곽 부위에 비대칭적으로 존재하므로, 반대편의 정전기적 결합이 존재하지 않는 부위에 이황화 가교를 도입하기 위하여 CH3A 도메인에 Tyr349Cys, CH3B 도메인에 Ser354Cys 돌연변이를 도입하였다. SW-WVT 변이체에 이황화 가교를 도입하는데 있어서는 S-W 돌연변이 쌍 (Tyr349Ser:Glu357W)에 의해 도입된 공간보완적 결합에 영향을 주지 않도록 하기 위하여 CH3A 도메인에 Ser354Cys, CH3B 도메인에 Tyr349Cys 돌연변이를 도입하였고, S-W 돌연변이 쌍이 위치한 곳의 반대편 CH3 도메인 상호작용면에 이황화 가교가 생성되었다.

이황화 가교가 도입된 변이체는 도입되지 않은 변이체에 비해 EW-RVT의 경우 약 3 %, SW-WVT의 경우 약 9 %가 증가한 것을 확인하였으며 (표 3), 이황화 가교의 도입이 이종이중체 형성능의 향상에 기여를 하는 것을 확인하였다. SDS-PAGE 상에서 이황화 가교가 도입된 변이체가 도입되지 않은 변이체에 비해 더 작은 크기로 확인이 되는데, 이는 이종이중체가 SDS 변성조건에서 이황화 가교에 의해 비교적 밀집한 형태로 존재하기 때문에 PAGE 상의 이동능의 차이를 지니는 것이지 실제로 자연적인 상태에서의 이종이중체의 크기 차이는 아닌 것으로 판단된다.

또한 각각의 돌연변이체가 포함된 이종이중체를 반복하여 발현 정제하여 ImageJ 프로그램(Wayne Rasband, NIH)을 이용하여 SDS-PAGE상의 각 밴드(band)의 밀도 (density)를 분석한 결과 기존 양성대조군의 놉-인투-홀 이종이중체 수율이 약 85~90% 정도인 것에 비하여 EW-RVT 및 EEW-RVT 돌연변이가 포함된 이종이중체 형성 수율이 약 90~95% 정도로 높은 것을 확인할 수 있었다(표 3). 하기 [표 3]은 구축된 CH3 도메인 돌연변이 쌍을 포함한 중쇄불변부위의 이종이중체 형성능을 비교한 것으로, KiH를 대조군으로 사용하였으며, 결과 값은 3회 이상의 독립적인 실험을 수행한 후 평균의 표준오차 (meanS.E.M)로 나타내었다.

이종이중체 수율 (SDS-PAGE 결과 분석)

Mutant name	AA Homodimer	AB Heterodimer	BB Homodimer	BMonomer
	( CH3A : CH3A )	( CH3A : CH3B )	( CH3B : CH3B )	( CH3B )
	( scFv - Fc )2	( scFv - Fc )( Fc )	( Fc )2	Fc
E-R	5.7 ± 2.6	52.7 ± 2.3	32.0 ± 2.4	9.6 ± 3.2
W- VT	ND	77.3 ± 1.5	16.0 ± 1.4	6.7 ± 2.8
EW - RVT	0.5 ± 0.6	91.4 ± 1.2	1.6 ± 0.6	6.6 ± 1.3
EW - RVT (S-S)	0.6 ± 0.4	94.2 ± 0.4	2.2 ± 0.4	3.0 ± 1.2
EEW - RVT	ND	90.9 ± 5.7	6.3 ± 3.7	5.5 ± 2.1
SW - WVT	0.1 ± 0.1	89.2 ± 1.2	1.7 ± 0.2	9.0 ± 1.4
SW - WVT (S-S)	ND	98.6 ± 0.8	0.8 ± 1.1	0.6 ± 0.5
KiH	4.4 ± 1.8	86.4 ± 1.7	5.9 ± 1.3	3.2 ± 1.1

CH3 도메인 변이체가 포함된 이종이중체 단백질의 발현 수율을 확인하였다(표 4). HEK293 세포에 일시적 형질감염하여 약 20 ml의 배양액 량으로 5일 간 발현하였으며, 정제 과정이 끝난 후의 단백질의 농도와 부피를 정량하여 단백질의 발현 수율을 계산하였다. 실험은 3~5회 반복하여 수행한 것을 평균평균의 표준오차(meanS.E.M)로 나타낸 것이다.

그 결과 CH3 도메인 변이체가 포함된 이종이중체 단백질은 야생형 CH3 도메인을 포함한 이종이중체에 비하여 수율이 다소 감소하였고, 대조군 놉-인투-홀보다는 비슷하거나 약간 높은 정도의 수율을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이를 통하여 CH3 도메인에 도입된 돌연변이 쌍은 야생형 항체와 비교하였을 때 단백질의 안정성을 크게 저해하지 않는다고 판단할 수 있다.

Total protein 수율(scFv-Fc/Fc-heterodimer, HEK293 cell, ~5 days expression)

Mutant name	Final product after buffer change ( mg / culture volume 20 ml )
Wild type	0.33 ± 0.16
E-R	0.49 ± 0.05
W-VT	0.14 ± 0.05
EW-RVT	0.37 ± 0.12
EW-RVT (S-S)	0.27 ± 0.05
EEW-RVT	0.44 ± 0.12
SW-WVT	0.29 ± 0.01
SW-WVT (S-S)	0.22 ± 0.03
KiH	0.31 ± 0.08

돌연변이 쌍을 포함한 CH3 도메인의 단백질 2차 구조가 야생형의 CH3 도메인의 단백질 2차 구조와 동일하게 보존되어 있는지를 확인하기 위하여 원이색성(Circular dichroism)을 측정하였다. CH3A 도메인 및 CH3B 도메인을 각각 dummy-Fc 벡터로 구축하여 Fc 도메인 이중체를 생산하여 분석에 이용하였다(도 14). Chirascan plus 기기(AppliedPhotophysics, UK)를 이용하였으며, 분석 온도는 25 ℃에서 수행하였다. 측정 완충액 조건은 PBS (pH 7.4)를 이용하였고 195 nm에서 260 nm의 구간에서 분석하였다.

그 결과 EW-RVT 돌연변이 쌍이 도입된 CH3 도메인을 지닌 Fc 이중체는 야생형 CH3 도메인을 지닌 Fc 이중체와 동일한 값의 평균 잔여 타원율 (mean residue ellipticity)를 지니는 것을 확인할 수 있었다. 이는 돌연변이 쌍이 도입되어도 단백질의 2차 구조에는 변화가 없음을 나타낸다(도 20).

또한 돌연변이 쌍이 도입된 CH3 도메인을 포함한 항체가 야생형 CH3 도메인을 지닌 항체와 비교하여 FcRn에 대한 결합능을 그대로 유지하고 있는지 확인하기 위하여 SPR (Surface plasmon resonance)을 수행하였다. Biacore2000 기기(GE healthcare, USA)를 이용하였으며, EW-RVT 돌연변이쌍 CH3 변이체가 포함된 이종이중체 항체와 대조군으로 야생형 CH3 도메인을 지닌 IgG1 항체인 Remicade (Inflilximab, Janssen Biotech)를 sFcRn (Feng et al., 2011)에 대하여 결합능을 분석하였다. sFcRn을 10 mM Na-아세테이트 완충액 (pH 4.0)에 희석하여 CM5 센서칩 (GE healthcare, USA)에 약 1000 반응단위 (reponse units, RU)로 고정화하였다. running 완충액으로는 Tween 20이 0.005% 포함된 PBS (pH 6.0) 및 HBS-EP 완충액 (pH 7.4)을 이용하였으며, CH3 돌연변이체를 0.625, 1.25, 2.5, 5 μM의 농도로 분석하였다.

그 결과 돌연변이 쌍이 도입된 CH3 도메인을 포함한 항체는 야생체 CH3 도메인을 포함한 항체와 마찬가지로 FcRn에 대한 결합능을 그대로 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 21).

< 실시예 6> scFv 형태의 항- DR4 x DR5 항체가 융합된 형태의 CH3 도메인 변이체를 이용한 항- DR4 x DR5 scFv-Fc 이중특이항체의 발현 및 정제 분석

표적 항원 DR4에 특이적으로 결합하는 인간화 hAY4a scFv 항체(Lee, Park et al. 2010)와, 표적 항원 DR5에 특이적으로 결합하는 인간 HW1 scFv 항체(Park, Lee et al. 2007)의 친화도 향상 버전인 AU5H scFv 항체를 CH3 도메인 변이체가 사용된 Fc의 N-말단에 융합하여 이중특이항체를 구축하였다(도 22-A).

이때 사용한 돌연변이체 쌍은 EW-RVT 쌍이며, 구축한 scFv-Fc 형태의 이중특이항체는 상기 <실시예 5>에서와 같은 방법으로 발현 및 정제하였고 SDS-PAGE 상에서 단백질을 분석하였다. 돌연변이체 쌍이 도입된 scFv-Fc 형태의 항-DR4 x DR5 이중특이항체는 대조군인 놉-인투-홀을 도입한 scFv-Fc 형태의 항체와 비교하여 목적 항체가 이중체의 형태로 조합(assembly)되지 않거나, 단백질 불안정성에 따른 잘려진 부산물 없이 정제되는 것을 확인하였다(도 22-B).

또한, 이중특이항체의 결합 상태를 측정하기 위하여 HPLC(The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 10/300GL, GE Healthcare, Sweden)을 수행하였다. 용출 완충액은 PBS(pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)을 이용하였으며 유속은 0.5 ml/min이었다. 단백질 크기 마커로 IgG(150 kD), 알부민(66 kDa), 탄산무수화 효소 (carbonic anhydrase) (29 kDa) 단백질을 이용하였다. M7 돌연변이체 쌍이 도입된 scFv-Fc 형태의 항-DR4 x DR5 이중특이항체는 크기 배제 크로마토그래피 상에서도 대조군인 놉-인투-홀을 도입한 scFv-Fc 형태의 항체와 비교하여 이중체의 형태로 조합(assembly)되지 않거나, 단백질 불안정성에 따른 잘려진 부산물 없이 정제되는 것을 확인하였다(도 22-C).

< 실시예 7> scFab 형태의 항- DR4 x DR5 항체가 융합된 형태의 CH3 도메인 변이체를 이용한 항- DR4 x DR5 scFab-Fc 이중특이항체의 제조 및 이중특이항체의 항원에 대한 결합능 분석

제작한 CH3 돌연변이체 쌍을 도입하여 scFab-Fc (scIgG)의 형태로 이중특이성 항체를 구축하였다. 사용한 모 항체는 상기 <실시예 6>의 scFv-Fc 형태의 이중항체에서 사용한 것과 동일한 인간화 hAY4a 항체와 AU5H 항체이며, VH-CH 도메인과 VL-CL 도메인을 26개의 아미노산 사슬로 연결한 형태의 단일사슬화 Fab(scFab)를 Fc 의 N-말단에 융합하여 제작하였다(도 23-A).

이때 사용한 돌연변이체 쌍은 EW-RVT 쌍이며, 구축한 scFab-Fc 형태의 이중특이항체는 실시예 6에서와 같은 방법으로 발현 및 정제하였고 SDS-PAGE상에서 단백질을 분석하였다. 비환원성 조건에서 돌연변이체 쌍이 도입된 scFab-Fc 형태의 이중특이항체가 대조군인 놉-인투-홀이 도입된 이중특이항체와 동일하게 목적하는 이가(bivalent) 형태로 결합(assembly)된 항체로 주요하게 정제되는 것을 확인하였으며, 환원성 조건에서 목적하는 이중특이항체의 단량체(monomer)가 응집반응(aggregation)이나 절단 (cleavage)없이 정제된 것을 확인하였다(도 23-B).

정제된 Fc 변이체 이중특이항체의 이중특이 결합능을 측정하기 위하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 수행하였다. 표적분자 BSA, DR4, DR5와 대조군인 DcR1, DcR2를 96 well EIA/RIA 플레이트 (COSTAR Corning In., USA)에 1시간 동안 37 ℃에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어내었다. 5% Skim milk (5 % Skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분간 3회 씻어내었다. 정제된 Fc 변이체 이중특이항체를 결합시킨 후 0.1 % PBST로 10분 간 3회 씻어내었다. AP가 접합된 항 인간 항체 (alkaline phosphatase-conjugated anti-human mAb, Sigma, USA)로 결합시킨 후 pNPP (p-nitrophenyl palmitate, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다. ELISA 결과를 통해 발현 정제한 scFv-Fc형태와 scFab-Fc형태의 이중특이항체가 각각 표적분자 DR4와 DR5에 대한 특이성을 지닌 것을 확인하였다 (도 23-C). 돌연변이체 쌍 M7이 도입된 scFv-Fc 형태와 scFab-Fc 형태의 이중특이항체는 대조군인 놉-인투-홀이 도입된 이중특이항체와 비교하여 유사한 정도의 표적분자인 DR4와 DR5에 대한 결합력을 가지고 있으며, DcR1과 DcR2에는 교차 반응성 없이 표적분자에 대한 특이성이 유지되었다. 이를 통해 개량된 CH3 도메인 돌연변이쌍을 도입하는 것이 항원 결합부위의 결합능에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

< 실시예 8> 항- DR4 x DR5 항체가 융합된 형태의 CH3 도메인 변이체를 이용한 항- DR4 x DR5 scFv - Fc 및 scFab-Fc 이중특이항체의 세포독성평가

상기 <실시예 6>과 <실시예 7>에서 제조된 항-DR4 x DR5 scFv-Fc 및 scFab-Fc 이중특이항체의 암 세포 사멸능을 확인하기 위하여, 인간유래 암세포인 HCT116(colorectal carcinoma)과 HeLa(adenocarcinoma) 세포주에서 세포독성 실험(MTT assay)을 수행하였다.

구체적으로, 96 well plate에 암 세포주를 well당 1x10⁴ cells로 시딩 (seeding)을 한 후, 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 1.5일 배양 후, 모항체인 항-DR4 인간화항체 hAY4a IgG와 항-DR5 인간항체 AU5H-scFv, 제조된 scFv-Fc 및 scFab-Fc 형태의 이중항체와, 양성 대조군으로 DR4 및 DR5의 ligand인 TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)을 배양기에서 20시간 배양하였다. 이때 TRAIL은 대장균에서 발현 정제한 것을 이용하였다. 이 후 5 mg/ml의 MTT solution (Sigma)을 well 당 20 μl 처리한 후 34 시간 배양하고, well 내의 배양액을 제거하고 100 μl의 DMSO로 formazan을 용해하여 595 nm에서 용해된 formazan의 흡광도를 측정하여 세포독성을 정량하였다.

그 결과, 상기 두 가지 형태의 이중특이항체는 모항체인 인간화항체 hAY4a IgG와 인간항체 AU5H-scFv와 비교하여 암 세포 사멸능이 증가하였으며, 양성대조군으로 이용한 TRAIL과 비교하여 세포독성이 비슷하거나 조금 더 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 24).

하기 표 5는 본 발명의 항체 CH3 도메인의 이종 이중체 및 이종 이중체 중쇄불변부위 쌍의 서열 정보를 나타낸다.

Mutant name	CH3A ( EU numbering 341~447)	CH3B ( EU numbering 341~447)
Wild type	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 1)	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 2)
E-R	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 3)	(EU number 341) GQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 4)
W-VT	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 5)	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 6)
EW-RVT	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 7)	(EU number 341) GQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 8)
EW-RVT (S-S)	(EU number 341) GQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 9)	(EU number 341) GQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 10)
EEW-RVT	(EU number 341) GQPREPEVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 11)	(EU number 341) GQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 12)
SW-WVT	(EU number 341) GQPREPQVSTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 13)	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDWLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 14)
SW-WVT (S-S)	(EU number 341) GQPREPQVSTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 15)	(EU number 341) GQPREPQVCTLPPSRDWLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 16)
KiH (Genentech)	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 17)	(EU number 341) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 18)
	Fc (A chain ) ( EU numbering 225~447)	Fc (B chain ) ( EU numbering 225~447)
Wild type	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 19)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 20)
E-R	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 21)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 22)
W-VT	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 23)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 24)
EW-RVT	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 25)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 26)
EW-RVT (S-S)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 27)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 28)
EEW-RVT	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPEVYTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 29)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 30)
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SW-WVT (S-S)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVSTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 33)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDWLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 34)
KiH (Genentech)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 35)	(EU number 225) TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (EU number 447) (서열번호 36)

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> CH3 domain mutant pairs for the high yield formation of heterodimeric Fc of antibody, method of production and use thereof <130> 38-1 <150> KR 10-2012-0135586 <151> 2012-11-27 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type CH3A (EU numbering 341~447) <400> 1 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type CH3B (EU numbering 341~447) <400> 2 Gly Gln 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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 26 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EW-RVT Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 26 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 27 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EW-RVT (S-S) Fc (A chain) (EU numbering 225~447) <400> 27 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 28 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EW-RVT (S-S) Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 28 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 29 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EEW-RVT Fc (A chain) (EU numbering 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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 30 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EEW-RVT Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 30 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 31 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SW-WVT Fc (A chain) (EU numbering 225~447) <400> 31 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 32 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SW-WVT Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 32 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 33 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SW-WVT (S-S) Fc (A chain) (EU numbering 225~447) <400> 33 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 34 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SW-WVT (S-S) Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 34 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 35 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KiH 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Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 36 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KiH (Genentech) Fc (B chain) (EU numbering 225~447) <400> 36 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

Claims (27)

1. 하기의 결합 중 1 종 이상의 결합을 포함하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체:
   (a-1) 일 CH3 도메인의 Lys409에서 치환된 트립토판 (W)과
   다른 일 CH3 도메인의 Asp399에서 치환된 발린 (V) 및 Phe405에서 치환된 트레오닌 (T)의 결합; 및
   (a-2) 일 CH3 도메인의 Tyr349에서 치환된 세린 (S)과
   다른 일 CH3 도메인의 Glu357에서 치환된 트립토판 (W)의 결합.
   (단, 상기 위치는 EU index에 따름)
2. 청구항 1에 있어서, 하기의 결합 중 1 종 이상의 결합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 CH3 도메인의 이종 이중체:
   (b-1) 일 CH3 도메인의 Lys360에서 치환된 글루탐산(E)과
   다른 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 아르지닌 (R)의 결합; 및
   (b-2) 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 글루탐산 (E) 및 Lys360에서 치환된 글루탐산과
   다른 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 아르지닌 (R)의 결합.
   (단, 상기 위치는 EU index에 따름)
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 청구항 2에 있어서,
   일 CH3 도메인의 Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)으로 치환되고,
   다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
10. 청구항 2에 있어서,
    일 CH3 도메인의 Gln347은 글루탐산 (E)으로, Lys360은 글루탐산 (E)으로, Lys409은 트립토판 (W)로 치환되고,
    다른 일 CH3 도메인의 Gln347은 아르지닌 (R)으로, Asp399는 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
11. 청구항 1에 있어서,
    일 CH3 도메인의 Tyr349은 세린 (S)으로, Lys409은 트립토판(W)으로 치환되고;
    다른 일 CH3 도메인의 Glu357은 트립토판 (W)으로, Asp399은 발린 (V)으로, Phe405는 트레오닌 (T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
12. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    하기의 (c) 결합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 CH3 도메인의 이종 이중체:
    (c) CH3 도메인 중 위치 Tyr349 및 Ser354 위치에서,
    ⅰ) 상기 CH3 도메인 위치 중 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C); 및
    ⅱ) 상기 CH3 도메인 위치 1 종 이상 선택된 위치에서 치환된, 시스테인 (C)
    의 결합.
    (단, 상기 위치는 EU index에 따름)
13. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체 CH3 도메인의 이종 이중체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린의 Fc 부분에 포함되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 IgG는 인간 IgG인 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 CH3 도메인의 이종 이중체.
16. 청구항 1 또는 2의 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 포함하는 이종이중체 중쇄불변부위 (heterodimeric Fc) 쌍.
17. 청구항 1 또는 2의 항체 CH3 도메인의 이종 이중체를 포함하는, 이중 특이성 항체.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 항체는 scFv-Fc, scIgG(scFab-Fc), (Fv)2-Fc,및 mAb-Fv 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 scFv-Fc는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 항원 특이성이 다른 2종의 항체 절편 scFv가 융합된 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
20. 청구항 18에 있어서, 상기 scIgG(scFab-Fc)는 2종의 scFab가 융합된 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
21. 청구항 18에 있어서, 상기 (Fv)2-Fc는 항원 결합 Fv를 이루는 중쇄가변부위(VH) 및 경쇄가변부위(VL) 쌍의 2종이 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 융합된 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
22. 청구항 18에 있어서, 상기 mAb-Fv 형태는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍 단백질로 이루어진 IgG의 중쇄 C-말단에 가변 단일 항원 결합도메인 (VH 또는 VL)이 각각 융합된 이중특이성 가변 부위 융합 단일 항체의 형태인 것을 특징으로 하는, 이중특이성 항체.
23. 청구항 16의 이종이중체 중쇄불변부위 쌍을 포함하는 1가 항원 결합 항체로서, 상기 항체는 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 또는 C-말단에 단일 항원에 결합하는 중쇄가변부위 (VH) 및 경쇄가변부위 (VL)을 융합하여 단일 항원에 1가(monovalent)로 결합할 수 있는 Fv-Fc 형태인 것을 특징으로 하는, 항체.
24. 청구항 16의 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 N-말단 또는 C-말단에 2종의 단백질이 융합된 융합 단백질.
25. 삭제
26. (a) CH3 도메인 중
    (a-1) 일 CH3 도메인의 Lys409을 트립토판 (W)으로 치환하고
    다른 일 CH3 도메인의 Asp399을 발린 (V)으로, Phe405을 트레오닌 (T)으로 치환; 또는
    (a-2) 일 CH3 도메인의 Tyr349을 세린 (S)으로 치환하고,
    다른 일 CH3 도메인의 Glu357을 트립토판 (W)으로 치환하여,
    돌연변이 쌍을 제조하는 단계;
    (b) CH3 도메인 중
    (b-1) 일 CH3 도메인의 Lys360을 글루탐산(E)으로 치환하고
    다른 일 CH3 도메인의 Gln347을 아르지닌 (R)으로 치환; 또는
    (b-2) 일 CH3 도메인의 Gln347을 글루탐산 (E)으로, Lys360을 글루탐산으로 치환하고
    다른 일 CH3 도메인의 Gln347을 아르지닌 (R)으로 치환하여,
    돌연변이 쌍을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 및 (b) 돌연변이 쌍을 결합하는 단계;를 포함하는, 이종이중체 중쇄불변부위 쌍이 형성될 수 있는 CH3 도메인 변이체 (heterodimeric CH3) 쌍의 제조 방법.
27. (d) 청구항 26에 의해 제조된 CH3 도메인 변이체 쌍이 항체 중쇄불변부위 야생형 힌지(hinge)-CH2 도메인의 C-말단에 각각 융합된 단백질을 발현하는 핵산(nucleic acids)을 포함하는, 재조합 중쇄불변부위 (Fc) 쌍 단백질 발현벡터를 제조하는 단계;
    (e) 상기 제조된 발현벡터를 세포에 공동 형질전환하여 재조합 중쇄불변부위 (Fc) 쌍 단백질을 발현하는 단계; 및
    (f) 상기 공동 발현된 재조합 중쇄불변부위 쌍 단백질을 정제 및 회수하는 단계를 포함하는, 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 쌍((hinge-CH2-CH3A) (Hinge-CH2-Ch3B)) 단백질의 제조 방법.

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