KR101516485B1 - Method of immunoassay using nanofiber - Google Patents

Abstract

본 발명은, 항원 항체 반응을 이용한 면역검사방법에 있어서, 전기방사를 통하여 제조된 나노섬유시트를 적용하여 면역검사를 수행하는 나노섬유를 이용한 면역검사방법을 제공한다.
따라서 전기방사에 의해 제조되는 나노섬유는 짧은 시간동안 매우 많은 나노섬유들이 생성되고, 또한 표면에 항원-항체를 고정시키기 위한 복잡한 화학적 반응(chemical reaction)이 필요하지 않으며, 3D구조의 넓은 표면적(surface area)를 갖고 있을 뿐만 아니라, 자유롭게 나노섬유의 직경(diameter)을 조절할 수 있음은 물론 매우 길게 뽑아낼 수 있기 때문에, 공정이 간단하여 제조가 용이하고, 면역검사에 대응되도록 용이하게 직경 및 밀도를 조절할 수 있어 맞춤형 디바이스(Device)제작이 용이하며, 나노섬유는 시트(sheet)형태로 얻어지기 때문에 쉽게 다른 기판으로의 전이 또는 쉽게 원하는 크기로 잘라낼 수 있어 자유롭게 원하는 디바이스 플랫폼에 집적이 가능하고, 면역검사 시 매우 높은 감응비를 얻을 수 있다. The present invention provides a method for immunoassay using nanofibers for immunoassay by applying a nanofiber sheet manufactured through electrospinning in an immunoassay method using an antigen-antibody reaction.
Thus nanofibers produced by electrospinning do not require a complex chemical reaction to create very large numbers of nanofibers in a short time and also to immobilize the antigen-antibody on the surface, and the large surface area of the 3D structure the diameter of the nanofibers can be adjusted freely and the nanofibers can be extracted very long. Therefore, the process is simple and easy to manufacture, and the diameters and the densities Since the nanofibers are obtained in sheet form, they can be easily transferred to other substrates or can be easily cut to a desired size, so that they can be freely integrated in a desired device platform, A very high response ratio can be obtained at the time of inspection.

Description

나노섬유를 이용한 면역검사방법 {Method of immunoassay using nanofiber}TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunoassay using nanofibers,

본 발명은 나노섬유를 이용한 면역검사방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 높은 표면적을 갖는 나노섬유를 이용하여 높은 감응비를 갖는 나노섬유를 이용한 면역검사방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of immunoassay using nanofibers, and more particularly, to a method of immunoassay using nanofibers having a high response ratio using nanofibers having a high surface area.

일반적으로 면역검사(Immunoassay)는 96-well plate 등 플라스틱 기판을 사용하지만, 나노물질을 사용하면 높은 표면적으로 인하여 매우 높은 감응비(Sensitivity)를 가지게 되어 적은 양의 분석물질(Analyte)도 검출할 수 있는 뛰어난 능력을 갖게 된다. 나노 물질 중에 티타늄옥사이드 (TiO2)는 항체(Antibody)를 고정화(Immobilization)시키는 표면 개질(Surface modification)이 쉽다는 장점과, 생체 적합성(Biocompatibility), 광화학 안정성(Photochemical stability), 그리고 단백질 변성을 일으키지 않는(Negligible protein denaturation) 장점을 가지고 있을 뿐만 아니라, 제작이 용이하고 제조비용을 저감(Easy and low-cost fabrication)시킬 수 있으며, 재활용 효과(Self-recycling effect ;reusable)을 가지고 있다.In general, Immunoassay uses a plastic substrate such as a 96-well plate. However, when a nanomaterial is used, it has a very high sensitivity due to its high surface area, so that a small amount of analyte can be detected You will have an outstanding ability. Among the nanomaterials, titanium oxide (TiO2) has advantages such as easy surface modification that immobilize an antibody, biocompatibility, photochemical stability, and does not cause protein denaturation. It has advantages of negligible protein denaturation, easy fabrication, low cost fabrication, and self-recycling effect (reusable).

한편, 전기방사(Electrospinning)방법으로 제작되는 나노섬유(Nanofiber)들은 평균 100nm의 직경(Diameter)을 가지며, 섬유(Fiber)들이 매우 밀집하여 덩굴모양의 형태를 이루고 있는 구조를 가지고 있기 때문에, 매우 높은 표면적(Surface area)을 갖는다. 이러한 전기방사를 이용한 나노섬유의 제조기술에 대하여 대한민국공개특허 제10-2012-0117912호에는 전기방사 장치 및 이로부터 제조된 나노섬유가 개시된 바 있다. 따라서 상기한 TiO2를 나노섬유로 제작하여 면역검사를 수행하면 높은 표면적으로 인하여 상당히 높은 감응비를 얻을 수 있다. On the other hand, nanofibers produced by electrospinning have diameters of 100 nm on average and fibers are very dense and have a vine shape, And has a surface area. With respect to a manufacturing technique of nanofibers using such electrospinning, Korean Patent Laid-Open No. 10-2012-0117912 discloses an electrospinning device and nanofibers produced therefrom. Therefore, when the above-mentioned TiO 2 is fabricated from nanofibers and immunoassay is performed, a considerably high response ratio can be obtained due to high surface area.

그런데, 상기한 TiO2 나노섬유는 하소 (Calcination) 공정 후에 매우 쉽게 부서지기(Brittle) 때문에, 핸들링 하기가 매우 어려운 문제점이 있다.
However, since the TiO2 nanofiber is easily brittle after the calcination process, it is very difficult to handle the TiO2 nanofiber.

본 발명은, TiO2 나노섬유가 안정적으로 집적되도록 하여 공정 시 핸들링을 용이하게 하고, 높은 감응비를 얻을 수 있는 나노섬유를 이용한 면역검사방법을 제공하는데 목적이 있다.
An object of the present invention is to provide an immunoassay method using nanofibers capable of stably integrating TiO2 nanofibers, facilitating handling during processing, and achieving a high response ratio.

본 발명은, 항원 항체 반응을 이용한 면역검사방법에 있어서, 전기방사를 통하여 제조된 나노섬유시트를 적용하여 면역검사를 수행하는 나노섬유를 이용한 면역검사방법을 제공한다. The present invention provides a method for immunoassay using nanofibers for immunoassay by applying a nanofiber sheet manufactured through electrospinning in an immunoassay method using an antigen-antibody reaction.

여기서, 상기 나노섬유시트는, TiO2(타이타늄 다이옥사이드) 나노섬유시트인 나노섬유를 이용하는 것이 바람직하며, 상기 TiO2 나노섬유시트는, 합성된 TiO2/PVP 전구체 용액을 실린지에 넣고 일정 전기장 하에서 균일한 속도로 밀어내어 TiO2/PVP 나노섬유를 뽑아내는 단계; 및 뽑아낸 상기 나노섬유를 기판 상에 증착시키는 단계, 열분해 공정을 통해 TiO2나노섬유시트를 얻는 단계를 포함하며, 상기 나노섬유시트를 표면 개질하는 단계를 더 포함한다. The TiO 2 nanofiber sheet is prepared by placing the synthesized TiO 2 / PVP precursor solution in a syringe and heating the nanofiber sheet at a uniform rate under a constant electric field. The nanofiber sheet is preferably a nanofiber sheet of TiO 2 (titanium dioxide) Extruding TiO2 / PVP nanofibers; And depositing the extracted nanofibers on a substrate, and obtaining a TiO2 nanofiber sheet through a pyrolysis process, and further comprising the step of modifying the surface of the nanofiber sheet.

여기서, 상기 표면 개질하는 방법은, 산소플라즈마(Oxygen plasma) 처리를 실시하는 단계와, 에탄올에 들어있는 GPDES ((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane)에 상기 TiO2 나노섬유시트를 담그는 단계와, 상기 TiO2 나노섬유시트를 꺼내어 세정한 뒤 베이킹(Baking)하는 단계와, 베이킹(Baking) 후 에탄올 용액에 담근 후 초음파처리(sonication)하는 단계와, 세정 후 건조하는 단계와, 진공상태에서 건조시키는 단계와, 표면 개질 후 상기 나노섬유시트 상에 항체를 고정하는 항체고정단계를 더 포함한다. The method for surface modification includes the steps of: performing oxygen plasma treatment; immersing the TiO 2 nanofiber sheet in GPDES (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxysilane contained in ethanol; and immersing the TiO 2 nanofiber Baking after taking out the sheet, baking, baking and soaking in an ethanol solution, sonication, washing and drying, drying in a vacuum state, and surface modification And then immobilizing the antibody on the nanofiber sheet.

여기서, 상기 항체 고정 단계는, 완충용액(Buffer solution)을 통해 상기 나노섬유시트 상에 코팅할 항체(Antibody)의 농도(Concentration)를 희석(Dilution) 시키는 단계와, 상기 완충용액을 상기 나노섬유시트에 디스펜싱(Dispensing)하는 단계와, 상기 나노섬유시트가 접착된 기판을 가습챔버 안에 넣어 인큐베이팅(Incubating)하는 단계와, 상기 기판을 세정 후 완충용액에서 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. The antibody fixing step may include diluting the concentration of the antibody to be coated on the nanofiber sheet through a buffer solution, diluting the buffer solution with the nanofiber sheet, Dispensing the nanofibrous sheet to the substrate, incubating the nanofibrous sheet in a humidification chamber by incubating the nanofibrous sheet on the substrate, and incubating the substrate in the buffer solution after washing.

한편, 상기 나노섬유시트는 고분자층을 통하여 기판에 집적되며, 상기 고분자층에 상기 나노섬유시트를 집적하는 방법은, 기판의 상면에 고분자층을 형성하는 단계; 상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계; 상기 고분자층의 상면에 상기 나노섬유시트를 접착하는 단계; 및 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계를 포함한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method of integrating a nanofiber sheet on a substrate through a polymer layer, the method comprising: forming a polymer layer on an upper surface of the substrate; Pre-curing the polymer layer; Bonding the nanofiber sheet to an upper surface of the polymer layer; And main-curing the polymer layer and the nanofiber sheet so that the polymer layer and the nanofiber sheet are fixed to each other.

여기서, 상기 고분자층은, 고분자용액과 경화제를 10 : 1의 중량비로 혼합하고, 상기 고분자용액과 상기 경화제가 혼합된 혼합액을 상기 기판의 상면에 15㎛ 내지 25㎛의 두께가 되도록 스핀 코팅하여 제조될 수 있다. The polymer layer is formed by mixing a polymer solution and a curing agent at a weight ratio of 10: 1 and spin-coating a mixture of the polymer solution and the curing agent on the upper surface of the substrate to a thickness of 15 μm to 25 μm .

또한, 상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계는, 상기 고분자층을 60℃ 내지 70℃도에서 9분 내지 11분 동안 경화하는 것이 바람직하다. In the pre-curing of the polymer layer, the polymer layer is preferably cured at 60 ° C to 70 ° C for 9 minutes to 11 minutes.

또한, 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계는, 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트를 60℃ 내지 70℃에서 210분 내지 270분 동안 경화하거나, 또는 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트를 75℃ 내지 85℃에서 30분 내지 90분 동안 경화하는 것이 바람직하다.
The step of main curing the polymer layer and the nanofiber sheet to fix the polymer layer and the nanofiber sheet together may include curing the polymer layer and the nanofiber sheet at 60 ° C to 70 ° C for 210 minutes to 270 minutes, Or the polymer layer and the nanofiber sheet are cured at 75 DEG C to 85 DEG C for 30 minutes to 90 minutes.

본 발명에 따른 나노섬유를 이용한 면역검사방법은 다음과 같은 효과를 제공한다. The immunoassay method using nanofibers according to the present invention provides the following effects.

첫째, 전기방사에 의해 제조되는 나노섬유는 짧은 시간동안 매우 많은 나노섬유들이 생성되고, 또한 표면에 항원-항체를 고정시키기 위한 복잡한 화학적 반응(Chemical reaction)이 필요하지 않으며, 3D구조의 넓은 표면적(Surface area)를 갖고 있을 뿐만 아니라, 자유롭게 나노섬유의 직경(Diameter)을 조절할 수 있음은 물론 매우 길게 뽑아낼 수 있기 때문에, 공정이 간단하여 제조가 용이하고, 면역검사에 대응되도록 용이하게 직경 및 밀도를 조절할 수 있어 맞춤형 디바이스(Device)제작이 용이하다.First, nanofibers produced by electrospinning do not require a complex chemical reaction to produce very large numbers of nanofibers in a short period of time and also to immobilize the antigen-antibody on the surface, and the large surface area of the 3D structure Surface area), it is possible to adjust diameters of nanofibers freely as well as to be pulled out very long, so that the process is simple and easy to manufacture, and the diameters and density It is easy to manufacture a customized device.

둘째, 기판(bottom substrate)에 씨드(Seed)를 깔거나 박막필름(Thin film)을 스핀-코팅(Spin-coating)하는 과정을 거쳐 제조되기 때문에, 기판과 강한 접착력을 갖게 되어 다른 디바이스 플랫폼으로의 전이(Transfer)가 불가능했던 나노와이어와 나노튜브와는 달리, 나노섬유는 시트(Sheet)형태로 얻어지기 때문에 쉽게 다른 기판으로의 전이 또는 쉽게 원하는 크기로 잘라낼 수 있어 자유롭게 원하는 디바이스 플랫폼에 집적이 가능하다.Secondly, since seeds are formed on the bottom substrate or spin-coating is performed on the thin film, strong adhesive force with the substrate is obtained, and thus, Unlike nanowires and nanotubes, which are not transferable, nanofibers are obtained in sheet form, so they can easily be transferred to other substrates or easily cut to the desired size, allowing them to be freely integrated into the desired device platform. Do.

셋째, TiO2 나노섬유시트(TiO2 nanofiber mats)를 이용하기 때문에, 면역검사 시 매우 높은 감응비를 얻을 수 있다. Third, because TiO2 nanofiber mats are used, a very high response ratio can be obtained in immunoassay.

넷째, PDMS를 이용한 고분자층을 통하여 면역검사 시 TiO2 나노섬유시트를 안정적인 상태로 유지할 수 있다.
Fourth, TiO2 nanofiber sheet can be kept stable during immunoassay through polymer layer using PDMS.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 나노섬유를 이용한 면역검사방법을 개략적으로 나타내는 구성도이다.
도 2는 도 1의 나노섬유의 표면을 나타내는 확대사진이다.
도 3은 도 1의 고분자층과 나노섬유시트의 구조를 나타내는 SEM사진이다.
도 4 및 도 5는 도 1의 나노섬유를 이용한 면역검사방법의 결과 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a method of immunoassay using nanofibers according to an embodiment of the present invention; FIG.
Fig. 2 is an enlarged photograph showing the surface of the nanofiber of Fig. 1;
3 is a SEM photograph showing the structure of the polymer layer and the nanofiber sheet of FIG.
FIGS. 4 and 5 are graphs showing results of the immunoassay using the nanofibers of FIG.

이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 실시예에 따른 나노섬유를 이용한 면역검사방법은, 전기방사를 통하여 제조된 나노섬유시트를 적용하여 면역검사를 수행하며, 상기 나노섬유시트는, TiO2(타이타늄 다이옥사이드) 나노섬유시트를 적용한다. In the immunofluorescent test using nanofibers according to an embodiment of the present invention, immunofluorescence is performed by applying a nanofiber sheet manufactured through electrospinning, and the nanofiber sheet is coated with a TiO2 (titanium dioxide) nanofiber sheet do.

여기서, 상기 TiO2 나노섬유시트는, 전기방사를 통하여 제조되며, 상세하게는 합성된 TiO2/PVP 전구체 용액을 실린지에 넣고 일정 전기장 하에서 균일한 속도로 밀어내어 TiO2/PVP 나노섬유를 뽑아내고, 이렇게 뽑아낸 상기 나노섬유를 기판 상에 증착시켜 제조한 후 열분해 공정을 통하여 TiO2 나노섬유시트를 제작한다.. The TiO 2 / PVP nanofiber sheet is prepared by electrospinning. Specifically, the synthesized TiO 2 / PVP precursor solution is poured into a syringe at a uniform rate under a constant electric field to extract the TiO 2 / PVP nanofiber. And the TiO 2 nanofiber sheet is manufactured through a thermal decomposition process.

그런 다음, 상기 나노섬유시트를 표면 개질하는 단계를 거치는데, 이때 상기 표면 개질하는 방법은, 산소플라즈마(Oxygen plasma) 처리를 실시하는 단계와, 에탄올에 들어있는 GPDES에 상기 TiO2 나노섬유시트를 담그는 단계와, 상기 TiO2 나노섬유시트를 꺼내어 세정한 뒤 베이킹(Baking)하는 단계와, 베이킹(Baking) 후 에탄올 용액에 담근 후 초음파처리(sonication)하는 단계와, 세정 후 건조하는 단계와, 진공상태에서 건조시키는 단계를 포함하여 실시한다. Thereafter, the surface of the nanofiber sheet is modified. The surface modification method may include: performing an oxygen plasma treatment; and immersing the TiO 2 nanofiber sheet in GPDES contained in ethanol Removing the TiO2 nanofiber sheet, cleaning and baking, baking and soaking in an ethanol solution, sonication, washing and drying, and drying in a vacuum state, Followed by drying.

상기한 바와 같이 표면 개질을 실시한 후에는 상기 나노섬유시트 상에 항체를 고정한다. 상기 나노섬유시트 상에 항체를 고정하는 과정은, 완충용액(Buffer solution)을 통해 상기 나노섬유시트 상에 코팅할 항체(antibody)의 농도(Concentration)를 희석(Dilution) 시키는 단계와, 상기 완충용액을 상기 나노섬유시트에 디스펜싱(dispensing)하는 단계와, 상기 나노섬유시트가 접착된 기판을 가습챔버 안에 넣어 인큐베이팅(Incubating)하는 단계와, 상기 기판을 세정 후 완충용액에서 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. After the surface modification as described above, the antibody is immobilized on the nanofiber sheet. The step of immobilizing the antibody on the nanofiber sheet comprises the steps of diluting the concentration of the antibody to be coated on the nanofiber sheet through a buffer solution, A step of dispensing the nanofibersheet onto the nanofiber sheet, incubating the nanofibrous sheet by immersing the nanofiber sheet in a humidification chamber, and incubating the substrate in a buffer solution after washing .

한편, 상기 나노섬유시트는 면역검사 공정 시 부서지는 것을 방지하기 위하여, 기판에 안정적으로 고정되도록 집적시켰으며, 이하에서는 상기 고분자층에 상기 나노섬유시트를 집적하는 방법에 대하여 살펴보기로 한다.Meanwhile, in order to prevent the nanofiber sheet from being broken during the immunoassay, the nanofiber sheet is integrated so as to be stably fixed on a substrate. Hereinafter, a method of integrating the nanofiber sheet on the polymer layer will be described.

상기 고분자층에 상기 나노섬유시트를 집적하는 방법은, 기판의 상면에 고분자층을 형성하는 단계와, 상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계와, 상기 고분자층의 상면에 상기 나노섬유시트를 접착하는 단계 및 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계를 포함한다. The method of integrating the nanofiber sheet on the polymer layer includes the steps of: forming a polymer layer on the upper surface of the substrate; precuring the polymer layer; Bonding the fiber sheet and main-curing the polymer layer and the nanofiber sheet so that they are fixed to each other.

여기서, 상기 고분자층은, 고분자용액과 경화제를 10 : 1의 중량비로 혼합하고, 상기 고분자용액과 상기 경화제가 혼합된 혼합액을 상기 기판의 상면에 15㎛ 내지 25㎛의 두께가 되도록 2500rpm 내지 3500rpm으로 40초 내지 80초 동안 스핀 코팅하여 제조한다. 이때, 상기 혼합액은 스핀 코팅하기 전 데시케이터 챔버 내에서 진공상태로 일정시간동안 보관하여 기포를 없애도록 하는 것이 바람직하다. Here, the polymer layer is formed by mixing a polymer solution and a curing agent at a weight ratio of 10: 1, mixing a mixture of the polymer solution and the curing agent on the upper surface of the substrate at 2500 rpm to 3500 rpm By spin coating for 40 seconds to 80 seconds. At this time, it is preferable that the mixed solution is stored in a vacuum state in a desiccator chamber for a predetermined time before spin coating to remove bubbles.

상기 고분자용액은 PDMS(Polydimethylsiloxane)용액, 폴리마이드(Polymide)용액 및 폴리카보네이트(Polycarbonate)용액 등 다양하게 적용 가능하며, 상기 경화제는 상기한 목적을 달성할 수 있다면 공지의 다양한 경화제를 적용할 수 있다. The polymer solution may be variously applied such as PDMS (Polydimethylsiloxane) solution, Polymide solution and Polycarbonate solution, and various known curing agents may be used as long as the curing agent can achieve the above object .

또한, 상기 기판은 실리콘기판(Silicon substrate)을 비롯하여, 폴리머기판(Polymer substrate), 유리기판(Glass substrate) 등 집적하고자하는 디바이스 기판 어느 것이든 다양하게 적용할 수 있다. The substrate may be a silicon substrate, a polymer substrate, a glass substrate, or any other device substrate to be integrated.

상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계는, 상기한 상태에서 상기 고분자층을 오븐에서 60℃ 내지 70℃도에서 5분 내지 30분 동안 경화하는 것이 바람직하다. In the pre-curing step of the polymer layer, it is preferable that the polymer layer is cured in an oven at 60 ° C to 70 ° C for 5 minutes to 30 minutes in the above-described state.

여기서, 상기 고분자층은, 프리 큐어링 시 경화정도에 따라 상기 나노섬유시트와의 접합성이 결정되는데, 경화시간을 5분으로 짧게 할 경우에는 고분자층이 용액상태로 존재하면서 나노섬유들이 침투해 들어가고, 반면 경화시간을 30분 이상했을 경우에는 나노섬유와의 접합력이 저하되어 나노섬유가 쉽게 분리되기 때문이다. 한편, 상기 고분자층의 프리 큐어링 시 경화시간은 5분 내지 30분으로 하여 실시하되, 9분 내지 11분 동안 실시하는 것이 최적의 실험적인 결과가 도출되었다. Here, the bonding property of the polymer layer to the nanofiber sheet is determined according to the degree of curing at the time of pre-curing. When the curing time is shortened to 5 minutes, the nanofibers penetrate into the polymer layer in a solution state On the other hand, when the curing time is more than 30 minutes, the bonding force with the nanofibers is lowered and the nanofibers are easily separated. On the other hand, the curing time of the polymer layer during pre-curing was 5 to 30 minutes, and the experiment was performed for 9 to 11 minutes.

상기 고분자층의 상면에 상기 나노섬유시트를 접착하는 단계는, 프리 큐어링으로(Pre-curing) 경화된 상기 고분자층의 상면에 전기방사로 제작된 상기 나노섬유시트를 전사하여 상기 고분자층에 접착하여 이루어진다.The step of adhering the nanofiber sheet to the upper surface of the polymer layer may include transferring the nanofiber sheet produced by electrospinning onto the surface of the polymer layer that has been pre-cured by curing, .

이렇게, 상기 고분자층에 상기 나노섬유시트가 접합된 후에는, 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 오븐에서 60℃ 내지 70℃에서 210분 내지 270분 동안, 또는 75℃ 내지 85℃에서 30분 내지 90분 동안 경화하는 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계를 거친다.After the nanofiber sheet is bonded to the polymer layer, the nanofiber sheet is heated in an oven at 60 to 70 DEG C for 210 to 270 minutes or at 75 to 85 DEG C for 30 to 90 minutes, Min to cure for a few minutes.

상기한 바와 같이, 상기한 나노섬유를 이용한 면역검사방법은, 전기방사(Electrospinning)을 통하여 쉽고 빠르고 저렴하게 제작할 수 있는 TiO2나노섬유시트를 이용하여 CRP(C-reactive protein)를 검출하는 면역검사로 적용하는 것으로서, 제조가 용이하고 비용을 저감시킬 수 있을 뿐만 아니라, LOD(Limit of detection)가 0.9 pg/ml (3SD)으로 성능면에서도 높은 감응비를 갖고 있으며, 빠르고 정확한 단백질(Protein)검출 및 진단을 수행할 수 있다. As described above, the immunoassay using the nanofibers is an immunoassay for detecting CRP (C-reactive protein) using a TiO2 nanofiber sheet that can be easily, quickly, and inexpensively manufactured through electrospinning (LOD) of 0.9 pg / ml (3SD), and it has a high sensitivity ratio in terms of performance. It can be used for fast and accurate protein detection and Diagnosis can be performed.

또한, 상기 나노섬유를 이용한 면역검사방법은, 나노튜브와 나노와이어 같이 일반 기판에 붙어서 제작된다는 것과 달리 시트형태로 제작되어 쉽게 다른 기판으로의 전이가 용이하고, 쉽게 집적할 수 있어 소자제작에 큰 도움이 될 뿐만 아니라 다양한 어플리케이션으로 적용할 수 있다.
Unlike nanotubes and nanowires which are attached to a common substrate, the immunoassay method using the nanofibers is easy to transfer to another substrate and can be easily integrated. It is not only helpful, but it can be applied to various applications.

1. TiO2 나노섬유 제작1. TiO2 nanofiber fabrication

먼저, TiO2 나노섬유제작을 위한 전구체 용액을 합성한다. 용액합성은 다음과 같다. 먼저, TTIP(Titanium tetraisopropoxide, 98%) 1.5g을 에탄올(Anhydrous ethanol, 99.5+%) 3ml/아세트산(acetic acid) 3ml속에 넣어 스터링(Stirring)하여 잘 섞은 뒤에, 3.64g 에탄올에 0.45g의 PVP(Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000)를 섞은 11wt%용액을 섞어 놓은 상기의 용액에 넣어 다시 잘 섞는다. First, a precursor solution for TiO2 nanofiber fabrication is synthesized. Solution synthesis is as follows. First, 1.5 g of TTIP (Titanium tetraisopropoxide, 98%) was put into 3 ml of ethanol (Anhydrous ethanol, 99.5 +%), 3 ml of acetic acid, and the mixture was stirred and mixed well. Then, 0.45 g of PVP Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000) in an 11 wt% solution, and mix well.

그런 다음 전기방사(Electrospinning)을 통하여 TiO2/PVP나노섬유를 만드는데, 세부 공정은 합성된 TiO2/PVP 전구체 용액을 실린지에 넣고 전기방사장치 내에 장착되어 있는 실린지펌프로 15kV (High DC-voltage)의 전기장 하에서 균일한 속도로 밀어주면서(Flow rate : 0.3 ml/h) 실린지 끝에 부착되어 있는 니들(Stainless steel needle)로 나노섬유를 뽑아내고, 기판(Ground substrate)에 나노섬유들이 증착되도록 하여 나노섬유층을 만든다. 이때, 기판은 Si 기판(2 cm x 2 cm)을 사용하였으며, 니들과 기판의 간격은 10cm로 하였다. 그 후 진공상태로(5 x 10^-5 torr) 500도에서 3시간 어닐링 공정을 통해 TiO2/PVP의 고분자층을 열분해(Pyrolysis)하여 아나타제(Anatase)결정성을 가지는 TiO2 나노섬유시트를 만든다.
Subsequently, TiO2 / PVP nanofibers are prepared by electrospinning. In detail, the synthesized TiO2 / PVP precursor solution is placed in a syringe and a 15 kV (High DC-voltage) The nanofibers were pulled out with a stainless steel needle attached to the end of the syringe while the nanofibers were being deposited on the ground substrate while pushing them at a uniform speed under an electric field (flow rate: 0.3 ml / h) Lt; / RTI > At this time, a Si substrate (2 cm x 2 cm) was used as a substrate, and a distance between the needle and the substrate was set to 10 cm. After that, the polymer layer of TiO2 / PVP is Pyrolysis by annealing at 500 ° C. for 3 hours under a vacuum condition (5 × 10 ^ -5 torr) to make a TiO2 nanofiber sheet having anatase crystallinity.

2. PDMS 필름(PDMS thin film) 제작2. Manufacture of PDMS film (PDMS thin film)

PDMS 폴리머(Prepolymer)용액과 경화제(Curing agent) 용액을 10:1 중량비율로 섞은 후에, 기포(Bubble)을 없애기 위해 데시케이터 챔버안의 진공상태에서 상기 섞은 용액을 1시간 놔둔다. 그 후 기판(Silicon substrate, Polymer substrate, glass substrate 등) 에 3000rpm 으로 60초 동안 스핀코팅 함으로써 두께가 약 20um인 PDMS필름 층을 만든다. After the PDMS polymer solution and the curing agent solution are mixed in a weight ratio of 10: 1, the mixed solution is left in the vacuum state in the desiccator chamber for one hour in order to eliminate bubbles. Then, a PDMS film layer having a thickness of about 20 μm is formed by spin coating on a substrate (silicon substrate, polymer substrate, glass substrate, etc.) at 3000 rpm for 60 seconds.

그런 다음, 형성된 PDMS층을 65도에서 10분동안 오븐에서 프리큐어링(Pre-curing)을 함으로써 살짝 경화시켜 졸(Sol) 상태를 겔(Gel) 상태로 만든 후, 제작된 TiO2 나노섬유시트를 그 위에 전사하여 PDMS층과 접합시킨 뒤, 65ㅀC에서 4시간 또는 80ㅀC에서 1시간 동안 PDMS를 완전히 경화시킨다. 도 2 및 도 3은 TiO2 나노섬유 표면과, TiO2 나노섬유시트가 PDMS층 위에 접합되어 고정되어 있는 단면 SEM이미지를 나타낸다.
Then, the formed PDMS layer was slightly cured by pre-curing in an oven at 65 ° C. for 10 minutes to convert the sol state to gel state, and then the prepared TiO 2 nanofiber sheet And the PDMS layer is completely cured at 65 ° C for 4 hours or at 80 ° C for 1 hour. Figs. 2 and 3 show a cross-sectional SEM image of a TiO2 nanofiber surface and a TiO2 nanofiber sheet bonded and fixed on the PDMS layer.

3. 표면 개질(Surface modification for immobilization of antibody and antigen on TiO2 nanofiber)3. Surface modification for immobilization of antibody and antigen on TiO2 nanofiber

제작된 TiO2 나노섬유에 CRP(C-reactive protein) 의 항체와 항원을 고정시키기 위한 표면 개질공정은(Surface modification)은 다음과 같다. 우선, 산소 플라즈마(Oxygen plasma)를 3분간 처리 한 뒤 에탄올에 10mM로 들어있는 GPDES((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane)에 TiO2 나노섬유를 담근 후 2시간 동안 놔둔다. Surface modifications of the prepared TiO2 nanofibers to immobilize antibodies and antigens of CRP (C-reactive protein) are as follows. First, oxygen plasma (Oxygen plasma) is treated for 3 minutes, then TiO2 nanofibers are immersed in GPDES (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxysilane in ethanol at 10 mM and left for 2 hours.

그 후 꺼내서, 에탄올로 세정한 뒤 GPDES 분자(Molecule) 들과 TiO2나노섬유간의 공유결합을 형성시키기 위하여 110도에서 1시간동안 베이킹(Baking)한 뒤, 에탄올 용액에 담가서 1분 동안 초음파처리(Sonication)를 실시하여 상기 TiO2나노섬유시트에 물리적으로 또는 바인딩(Binding)되지 않는 GPDES 분자(Molecule)들을 떼어낸 후 다시 에탄올로 세정한다. 그 다음, 질소(Nitrogen)로 블로잉(Blowing)하여 건조시킨 뒤에, 실온(Room temperature)에서 진공오븐에서 진공상태로 건조시킨다.
After baking, the substrate was baked at 110 ° C for 1 hour in order to form a covalent bond between the GPDES molecules and the TiO 2 nanofibers. Then, the substrate was immersed in an ethanol solution for 1 minute and sonicated ), GPDES molecules (Molecules) that are not physically or bound to the TiO2 nanofiber sheet are removed, and then washed again with ethanol. Then, it is dried by blowing with nitrogen and dried in a vacuum oven at room temperature.

4. 항체 고정화 (Immobilization of antibody on the surface)4. Immobilization of antibody on the surface

PBS 완충용액(buffer solution; pH 8.3) 을 통해 TiO2나노섬유위에 코팅할 항체의 농도(Concentration)를 희석(Dilution)시킨 뒤에 5㎕만큼 마이크로 피펫(Micro pipette)을 이용하여 TiO2 나노섬유 위에 떨어뜨려 디스펜싱(Dispensing)시킨다. 그 후, TiO2나노섬유 기판을 가습챔버(Humidified chamber)안에 넣어 37℃ 에서 4시간 동안 인큐베이팅(Incubating)한다. Dilute the concentration of the antibody to be coated on the TiO2 nanofibers through a PBS buffer solution (pH 8.3), and drop the TiO2 nanofiber onto the TiO2 nanofiber by 5 μl using a micropipette. Dispensing. Thereafter, the TiO 2 nanofiber substrate was placed in a humidified chamber and incubated at 37 ° C for 4 hours.

그런 다음, 시편을 0.1% BSA-PBS 완충액을 이용하여 세정한 뒤에 TiO2 나노섬유에서 항체가 고정되지 않는 영역을 blocking시키기 위해 1% BSA-PBS 완충액안에 넣어 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 그 후 바로 0.1 %BSA-PBS용액으로 2번 세정한다. 그 다음, 기판을 0.1% BSA-PBS 완충액에 담가 4℃ 에서 사용할 때까지 저장해 둔다.
The specimens are then washed with 0.1% BSA-PBS buffer and incubated for 1 hour at 37 ° C in 1% BSA-PBS buffer to block the areas where the antibody is not immobilized on the TiO2 nanofibers. Then rinse twice with 0.1% BSA-PBS solution. The substrate is then immersed in 0.1% BSA-PBS buffer and stored at 4 ° C until use.

5. 면역검사(Immunoassay)5. Immunoassay

CRP 항원(antigen)과 형광을 띄는 2차 항체(Secondary antibody labeled with HRP)가 들어있는 용액의 농도를 PBS (pH 7.4) 완충액 또는 CRP 무혈청(Free serum)용액을 이용하여 조절 한 뒤, 각기 다른 농도를 갖는 20㎕ 의 솔루션을 항체가 고정된 TiO2나노섬유 용액에 각각 떨어뜨려 디스펜싱 시킨 후, 37℃에서 20분간 인큐베이팅 시킨다. After the concentration of the solution containing the CRP antigen and the secondary antibody labeled with HRP was adjusted using PBS (pH 7.4) buffer or CRP free serum solution, 20 [mu] l of the solution is dispensed into the antibody-immobilized TiO2 nanofiber solution, followed by incubation at 37 [deg.] C for 20 minutes.

그 후 시편을 0.1% BSA-PBS 용액으로 플래이트 쉐이커(Plate shaker)위에서 120 rpm으로 2분간 2번 세정한다. 그 다음, 세척완충(Washing buffer)용액을 제거한 뒤, 100㎕ 의 화학발광(Chemiluminescent)기질을 CRP가 붙어있는 TiO2 나노섬유 위에 떨어뜨린 뒤, 1분간 쉐이킹하면서 인큐베이트 시킨다. 그 후 용액에서 90㎕ 만큼의 용액을 따와서 타겟기판(96-well opaque microplate)에 전이하여 상대적인 빛의 강도를 425nm 의 측정기(Luminometer)를 이용하여 측정한다.
The specimen is then rinsed twice with 0.1% BSA-PBS solution for 2 minutes at 120 rpm on a plate shaker. Then, after removing the washing buffer solution, 100 의 of the chemiluminescent substrate is dropped on the CRP-attached TiO 2 nanofiber, and incubated for 1 minute while shaking. Subsequently, 90 μl of the solution is transferred from the solution to a 96-well opaque microplate, and the relative light intensity is measured using a 425 nm Luminometer.

6. 결과(CRP spiked in serum: Calibration curve and LOD )6. Results (CRP spiked in serum: Calibration curve and LOD)

TiO2 나노섬유시트를 이용한 CRP검출에서 LOD 검출한계값(Detection limit)이 0.9 pg/ml (3SD)의 값을 얻을 수 있었으며, 이에 성능면에서도 높은 감응성을 갖고 있음을 알 수 있다(도 4 및 도 5참조).In the CRP detection using the TiO2 nanofiber sheet, the LOD detection limit was found to be 0.9 pg / ml (3SD), which indicates that it is highly sensitive in terms of performance (FIGS. 4 and 6) 5).

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. Accordingly, the true scope of the present invention should be determined by the technical idea of the appended claims.

11,12... 기판 20... 나노섬유시트
30... 고분자층11, 12 ... substrate 20 ... nano fiber sheet
30 ... polymer layer

Claims (10)

항원 항체 반응을 이용한 면역검사방법에 있어서,
전기방사를 통하여 제조된 나노섬유시트를 적용하여 면역검사를 수행하며,
상기 나노섬유시트는, TiO2(타이타늄 다이옥사이드) 나노섬유시트이고,
상기 TiO2 나노섬유시트는,
합성된 TiO2/PVP 전구체 용액을 실린지에 넣고 일정 전기장 하에서 균일한 속도로 밀어내어 TiO2/PVP 나노섬유를 뽑아내는 단계; 및
뽑아낸 상기 TiO2/PVP 나노섬유를 기판 상에 증착시키는 단계를 포함하며,
상기 나노섬유시트를 표면 개질하는 단계를 더 포함하고,
상기 표면 개질하는 방법은,
산소플라즈마(Oxygen plasma) 처리를 실시하는 단계와,
에탄올에 들어있는 GPDES((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane)에 상기 TiO2 나노섬유시트를 담그는 단계와,
상기 TiO2 나노섬유시트를 꺼내어 세정한 뒤 베이킹(Baking)하는 단계와,
베이킹 (Baking) 후 에탄올 용액에 담근 후 초음파처리(sonication)하는 단계와,
세정 후 건조하는 단계와,
진공상태에서 건조시키는 단계를 포함하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
In an immunoassay method using an antigen-antibody reaction,
The nanofiber sheet prepared by electrospinning is applied to perform immunoassay,
The nanofiber sheet is a TiO2 (titanium dioxide) nanofiber sheet,
The TiO2 nanofiber sheet is a sheet-
Adding the synthesized TiO2 / PVP precursor solution into a syringe and pushing it at a uniform rate under a constant electric field to extract TiO2 / PVP nanofibers; And
Depositing the extracted TiO2 / PVP nanofibers on a substrate,
Further comprising the step of surface-modifying the nanofiber sheet,
The method for surface modification comprises:
Performing an oxygen plasma process;
Immersing the TiO2 nanofiber sheet in GPDES ((3-glycidoxypropyl) methyldiethoxysilane) in ethanol,
Removing the TiO2 nanofiber sheet, cleaning and baking the sheet,
Baking, soaking in an ethanol solution, and sonication;
Washing and drying,
And drying the nanofibers in a vacuum state.
삭제delete 삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 TiO2 나노섬유시트는,
합성된 TiO2/PVP 전구체 용액을 실린지에 넣고 일정 전기장 하에서 균일한 속도로 밀어내어 TiO2/PVP 나노섬유를 뽑아내는 단계;
뽑아낸 상기 TiO2/PVP 나노섬유를 기판 상에 증착시키는 단계; 및
열분해 공정을 수행하는 단계를 포함하여 형성하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
The method according to claim 1,
The TiO2 nanofiber sheet is a sheet-
Adding the synthesized TiO2 / PVP precursor solution into a syringe and pushing it at a uniform rate under a constant electric field to extract TiO2 / PVP nanofibers;
Depositing the extracted TiO2 / PVP nanofibers on a substrate; And
And performing a thermal decomposition process on the nanofibers.
삭제delete 청구항 1에 있어서,
표면 개질 후 상기 나노섬유시트 상에 항체를 고정하는 항체고정단계를 더 포함하며,
상기 항체고정단계는,
완충용액을 통해 상기 나노섬유시트 상에 코팅할 항체의 농도를 희석시키는 단계와,
상기 완충용액을 상기 나노섬유시트에 디스펜싱(dispensing)하는 단계와,
상기 나노섬유시트가 접착된 기판을 가습챔버 안에 넣어 인큐베이팅(incubating)하는 단계와,
상기 기판을 세정 후 완충용액에서 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
The method according to claim 1,
Further comprising an antibody fixing step of fixing the antibody on the nanofiber sheet after surface modification,
The antibody immobilizing step comprises:
Diluting the concentration of the antibody to be coated on the nanofiber sheet through a buffer solution;
Dispensing the buffer solution to the nanofiber sheet;
Incubating the substrate to which the nanofiber sheet is adhered in a humidifying chamber,
And incubating the substrate in a buffer solution after washing the nanofibers.
청구항 1 또는 청구항 4 또는 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 나노섬유시트는 고분자층을 통하여 기판에 집적되며,
상기 고분자층에 상기 나노섬유시트를 집적하는 방법은,
기판의 상면에 고분자층을 형성하는 단계와,
상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계와,
상기 고분자층의 상면에 상기 나노섬유시트를 접착하는 단계와,
상기 고분자층과 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계를 포함하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
The method of claim 1, 4, or 6,
The nanofiber sheet is integrated on a substrate through a polymer layer,
The method of integrating the nanofiber sheet into the polymer layer comprises:
Forming a polymer layer on an upper surface of a substrate,
A step of pre-curing the polymer layer,
Bonding the nanofiber sheet to an upper surface of the polymer layer;
Curing the polymer layer and the nanofiber sheet so that the polymer layer and the nanofiber sheet are fixed to each other.
청구항 7에 있어서,
상기 고분자층은,
고분자용액과 경화제를 10 : 1의 중량비로 혼합하고, 상기 고분자용액과 상기 경화제가 혼합된 혼합액을 상기 기판의 상면에 5㎛ 내지 100㎛의 두께가 되도록 스핀 코팅하여 제조되는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
The method of claim 7,
Wherein the polymer layer
The polymer solution and the curing agent are mixed at a weight ratio of 10: 1, and a mixed solution obtained by mixing the polymer solution and the curing agent is spin-coated on the upper surface of the substrate to a thickness of 5 to 100 쨉 m. Way.
청구항 7에 있어서,
상기 고분자층을 프리 큐어링(Pre-curing)하는 단계는,
상기 고분자층을 60℃ 내지 70℃도에서 9분 내지 11분 동안 경화하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.
The method of claim 7,
The step of pre-curing the polymer layer comprises:
Wherein the polymer layer is cured at 60 DEG C to 70 DEG C for 9 to 11 minutes.
청구항 7에 있어서,
상기 고분자층과 상기 나노섬유시트가 서로 고정되도록 메인 큐어링(Main-curing)하는 단계는,
상기 고분자층과 상기 나노섬유시트를 60℃ 내지 70℃에서 210분 내지 270분 동안 경화하거나,
또는 상기 고분자층과 상기 나노섬유시트를 75℃ 내지 85℃에서 30분 내지 90분 동안 경화하는 나노섬유를 이용한 면역검사 방법.The method of claim 7,
The step of main-curing the polymer layer and the nanofiber sheet to be fixed to each other includes:
The polymer layer and the nanofiber sheet are cured at 60 ° C to 70 ° C for 210 minutes to 270 minutes,
Or the polymer layer and the nanofiber sheet are cured at 75 DEG C to 85 DEG C for 30 minutes to 90 minutes.

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