JP2007271609A - Biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオセンサーに関する。特に、臨床診断用途に使用できる高感度で、分析操作が容易なバイオセンサーに関する。 The present invention relates to a biosensor. In particular, the present invention relates to a biosensor that can be used for clinical diagnosis and has high sensitivity and easy analytical operation.
今日、遺伝子解析や臨床診断などの目的でDNAチップや免疫検査薬等のバイオセンサーが様々な研究機関や医療機関において使用されている。
現行のDNAチップは、被検体を蛍光色素で標識して用いる必要があるため、分析操作が煩雑であり、今後臨床検査用等に広く普及させるためには更なる分析操作の簡素化が必要である。また、DNAプローブの代わりにタンパク質をチップ上にスポットしたタンパク質チップも盛んに研究されているが、タンパク質は蛍光色素等で標識すると変性するものが多く、標識が不要なタンパク質チップが求められている。
Today, biosensors such as DNA chips and immunoassays are used in various research institutes and medical institutions for purposes such as gene analysis and clinical diagnosis.
The current DNA chip requires the analyte to be labeled with a fluorescent dye, so the analytical operation is complicated, and further simplification of the analytical operation is necessary for widespread use in clinical tests and the like in the future. is there. In addition, protein chips in which proteins are spotted on chips instead of DNA probes have been actively studied, but proteins are often denatured when labeled with fluorescent dyes, and protein chips that do not require labeling are required. .
一方、抗原抗体反応を利用した免疫試薬としては、ラテックス比濁法、化学発光法イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ等が挙げられるが、ラテックス比濁法は検出感度が低く、ラジオイムノアッセイでは放射性物質を用いるため危険性があるといった問題があるため、化学発光法イムノアッセイが主流となっている。
しかし、化学発光法も発光物質等での標識が不可欠であり、試薬コストが高く、分析操作も煩雑であるといった問題がある。また、極微量の発光を測定するために、高価な検出機を使用する必要があり、一般的に装置コストが高い。
On the other hand, immunoreagents using antigen-antibody reaction include latex turbidimetry, chemiluminescence immunoassay, radioimmunoassay, etc. Latex turbidimetry has low detection sensitivity, and radioimmunoassay uses radioactive substances. Chemiluminescence immunoassays have become the mainstream because of the problem of the nature.
However, in the chemiluminescence method, labeling with a luminescent substance or the like is indispensable, and there are problems that the reagent cost is high and the analysis operation is complicated. Further, in order to measure a very small amount of light emission, it is necessary to use an expensive detector, and the apparatus cost is generally high.
被検体の標識が不要であり、小型かつ安価な装置にて測定できるバイオセンサーとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが盛んに研究されている。本センサーは、チップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。一般的には、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に抗体等を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に抗体等を固定化したものである。 A surface plasmon resonance (SPR) sensor has been actively studied as a biosensor that does not require labeling of an object and can be measured with a small and inexpensive apparatus. This sensor detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the chip's metal film by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. Generally, it consists of a transparent substrate (for example, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group that can immobilize antibodies, etc., on the metal surface. It has become.
しかし、表面プラズモンセンサーは、化学発光法レベルの高感度検出を未だ達成できておらず、その原因の一つとして、ターゲット物質をトラップする抗体等の集積密度が小さいことが挙げられる。合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編物、不織布などの多孔質材料の表面及び内部に抗体等を固定化して集積密度を高める方法が検討されているが、孔径が小さい等の理由から内部に被検体物質が拡散せず、有効な集積密度の向上は達成できていない（例えば、特許文献1参照）。
即ち、本発明の目的は、表面プラズモンセンサーでは対応できない微量成分の検出を可能とする検出感度の高いバイオセンサーを提供することである。 That is, an object of the present invention is to provide a biosensor with high detection sensitivity that enables detection of trace components that cannot be handled by a surface plasmon sensor.
本発明のバイオセンサー(S)は、水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化されたか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）が固定化されたことを特徴とする。
また、本発明のターゲット物質(Y)の検出方法は、上記バイオセンサー（S）に、ターゲット物質(Y)を含有する被検体(A)を接触させて、被検体(A)中に含まれるターゲット物質(Y)と特異的結合物質（X）を結合させ、バイオセンサー（S）と被検体(A)を接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルのピーク波長を比較することにより、ターゲット物質(Y)を検出することを特徴とする。
The biosensor (S) of the present invention has a photonic crystal (C) composed of a periodic structure (N) composed of a solid substance (M) insoluble in an aqueous medium as a main constituent element, and the periodic structure (N The specific binding substance (X) is immobilized on the surface of), or the specific binding substance (X) is immobilized on the surface of the structural unit (L) of the periodic structure (N). .
Further, the target substance (Y) detection method of the present invention is contained in the specimen (A) by bringing the specimen (A) containing the target substance (Y) into contact with the biosensor (S). Obtained by irradiating photonic crystal (C) with electromagnetic wave of specific wavelength before and after contacting target substance (Y) and specific binding substance (X) and bringing biosensor (S) into contact with analyte (A) The target material (Y) is detected by comparing the peak wavelengths of the reflected spectra.
本発明のバイオセンサー（S）は、表面プラズモンセンサーと同様に被検体の標識が不要であり、小型かつ安価な装置にて測定できるという機能を有し、かつ、表面プラズモンセンサーよりも優れた検出感度を発揮する。特異的結合物質の高集積化やフォトニック結晶を利用した新しいセンシング原理によって、表面プラズモンセンサーでは対応できない微量成分の検出を可能とするバイオセンサーである。 Like the surface plasmon sensor, the biosensor (S) of the present invention does not require the labeling of the analyte, has a function that can be measured with a small and inexpensive device, and has a detection superior to the surface plasmon sensor. Demonstrate sensitivity. It is a biosensor that enables detection of trace components that cannot be handled by a surface plasmon sensor due to high integration of specific binding substances and a new sensing principle using photonic crystals.
本発明において水性媒体に不溶である固体物質（M）としては、有機化合物(M1)、無機化合物(M2)又は有機無機複合物(M3)等のいずれも使用することができる。ここで水性媒体とは、水又は水を主成分とする0.01〜10重量部の酸、アルカリ、中和塩又は0.01〜50重量部有機溶剤との混合媒体を意味する。酸、アルカリ、中和塩としては、抗原抗体反応やDNAのハイブリダイゼーションに使用されている緩衝液に使用されているものが挙げられ、具体的には、塩酸、硫酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等である。有機溶剤としては、抗原抗体反応やDNAのハイブリダイゼーション、DNA等の洗浄等に使用されているものが挙げられ、具体的には、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール等である。
固体物質（M）の屈折率としては、バイオセンサー（S）の検出感度向上等の観点から、1.3〜3.0であることが好ましく、更に好ましくは1.33〜2.5、より好ましくは1.35〜2.0特に好ましくは1.4〜2.0、極めて好ましくは1.45〜2.0である。屈折率がこの範囲内であれば、検出される反射スペクトルのピークがシャープなものとなり、バイオセンサー（S）の検出感度が更に良好なものとなる。
In the present invention, as the solid substance (M) that is insoluble in the aqueous medium, any of an organic compound (M1), an inorganic compound (M2), an organic-inorganic composite (M3), and the like can be used. Here, the aqueous medium means water or a mixed medium of 0.01 to 10 parts by weight of acid, alkali, neutralized salt or 0.01 to 50 parts by weight of an organic solvent containing water as a main component. Examples of the acid, alkali, and neutralized salt include those used in buffer solutions used for antigen-antibody reaction and DNA hybridization. Specifically, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, sodium hydroxide, Potassium hydroxide, sodium borate, sodium acetate, sodium phosphate, sodium carbonate and the like. Examples of the organic solvent include those used for antigen-antibody reaction, DNA hybridization, DNA washing, and the like, specifically, lower alcohols such as ethanol, propanol, and isopropanol.
The refractive index of the solid substance (M) is preferably 1.3 to 3.0, more preferably 1.33 to 2.5, more preferably 1.35 to 2.0, particularly preferably from the viewpoint of improving the detection sensitivity of the biosensor (S). 1.4-2.0, very preferably 1.45-2.0. If the refractive index is within this range, the peak of the detected reflection spectrum is sharp, and the detection sensitivity of the biosensor (S) is further improved.
加えて、固体物質（M）は波長100〜1000cm-1の電磁波を吸収しないことが好ましく、さらに好ましくは波長300〜900 cm-1、より好ましくは波長300〜800 cm-1、特に好ましくは波長400〜800 cm-1の電磁波を吸収しないことである。後述する理由からフォトニック結晶（C）に照射する電磁波の特定波長は、100〜1000cm-1ぐらいであることが好ましく、物質（M）がこの特定波長の電磁波の吸収がなければ、反射スペクトルのピーク強度向上やノイズの低減等が可能で、バイオセンサー（S）の検出感度、定量精度等が更に良好なものとなる。 In addition, a solid material (M) is preferably not absorb the electromagnetic radiation of wavelength 100～1000Cm -1, more preferably a wavelength 300 to 900 cm -1, and more preferably a wavelength 300 to 800 cm -1, particularly preferably a wavelength It does not absorb electromagnetic waves of 400-800 cm- 1 . For the reason described later, the specific wavelength of the electromagnetic wave applied to the photonic crystal (C) is preferably about 100 to 1000 cm −1, and if the substance (M) does not absorb the electromagnetic wave of this specific wavelength, The peak intensity can be improved, noise can be reduced, and the detection sensitivity and quantitative accuracy of the biosensor (S) can be further improved.
有機化合物(M1)としては、開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマー、ビニル重合系ポリマーなどの合成ポリマー、多糖類（セルロース、アミロース、アミロペクチン、キトサン、キチン、アラミド繊維など）、脂質（リン脂質、糖脂質、コレステロールなど）、各種ポリペプチド（コラーゲンなど）などの天然ポリマー等が挙げられる。
開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマーなどの非ビニル重合系ポリマーとしては、ウレタン樹脂、ウレア樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエーテル樹脂等が挙げられる。
ビニル重合系ポリマーは、ビニル基を有するモノマーを構成単位とするポリマーであり、
シアノ基含有ビニルモノマー、（メタ）アクリレート（アクリル樹脂）、カルボキシル基含有ビニルモノマー、芳香族ビニル炭化水素、脂肪族ビニル炭化水素、脂環式ビニル炭化水素、（メタ）アクリルアミド、ビニルスルホン酸、炭ビニルエーテル、ビニルケトン、架橋性モノマー、フッ素系モノマー等を構成単位として使用することができる。具体的には、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ソーダ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどのホモポリマー、又は、これらの構成単位を共重合したコポリマーが挙げられる。
Organic compounds (M1) include ring-opening polymer, polyaddition polymer, polycondensation polymer, vinyl polymerization polymer and other synthetic polymers, polysaccharides (cellulose, amylose, amylopectin, chitosan, chitin, aramid fiber, etc.) , Natural polymers such as lipids (phospholipids, glycolipids, cholesterol, etc.) and various polypeptides (collagen etc.).
Non-vinyl polymerization polymers such as ring-opening polymerization polymers, polyaddition polymers, and polycondensation polymers include urethane resins, urea resins, polyamide resins, polyimide resins, epoxy resins, silicone resins, polyester resins, polyether resins, etc. Is mentioned.
The vinyl polymerization polymer is a polymer having a monomer having a vinyl group as a structural unit,
Cyano group-containing vinyl monomer, (meth) acrylate (acrylic resin), carboxyl group-containing vinyl monomer, aromatic vinyl hydrocarbon, aliphatic vinyl hydrocarbon, alicyclic vinyl hydrocarbon, (meth) acrylamide, vinyl sulfonic acid, charcoal Vinyl ether, vinyl ketone, a crosslinkable monomer, a fluorine-based monomer, or the like can be used as a structural unit. Specifically, homopolymers such as polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, polymethacrylic acid, polyacrylic acid, polyacrylic acid soda, polystyrene, polyethylene, polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, or structural units thereof. A copolymer obtained by copolymerizing
その他、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド樹脂等に感光性を付与した感光性樹脂も使用することができる。光重合型のオリゴマー、光重合型モノマー、光重合開始剤および光増感剤からなる。光重合型のオリゴマーとしては、例えばエポキシアクリレート、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエーテルアクリレート、ポリオールアクリレート、アルキドアクリレート等が使用可能である。光重合型モノマーとしては、例えば単官能アクリレート、２官能アクリレート、３官能アクリレート、４官能アクリレート等のアクリルモノマーが使用可能である。光重合開始剤としては、例えばベンゾイン系、アセトフェノン系、パーオキサイド系、チオキサンソン系等の種々の光重合開始剤が使用可能である。光増感剤としては、例えばアミン系、キノン系等の種々の光増感剤が使用可能である。 In addition, a photosensitive resin obtained by imparting photosensitivity to an acrylic resin, an epoxy resin, a polyimide resin, or the like can also be used. It consists of a photopolymerization type oligomer, a photopolymerization type monomer, a photopolymerization initiator and a photosensitizer. As the photopolymerization type oligomer, for example, epoxy acrylate, urethane acrylate, polyester acrylate, polyether acrylate, polyol acrylate, alkyd acrylate and the like can be used. As the photopolymerizable monomer, for example, acrylic monomers such as monofunctional acrylate, bifunctional acrylate, trifunctional acrylate, and tetrafunctional acrylate can be used. As the photopolymerization initiator, various photopolymerization initiators such as benzoin, acetophenone, peroxide, and thioxanthone can be used. As a photosensitizer, various photosensitizers, such as an amine type and a quinone type, can be used, for example.
無機化合物(M2)としては、天然物、天然物の変性物及び合成物（精製物を含む）のいずれも使用することができるが、生産ロットのブレ防止等の観点から、合成物であることが好ましい。例えば、金属化合物や有機物を前駆体とする炭化物等が挙げられる。
金属化合物としては、元素の周期率表において、１族〜１６族の金属酸化物（酸化チタン、酸化ケイ素（シリカ）、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化クロム、酸化マンガン、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化バナジウム、酸化スズ、酸化鉄（磁性酸化鉄を含む）及び酸化インジウム等）、金属水酸化物（水酸化アルミニウム、水酸化金、水酸化マグネシウム等）、金属硫化物（硫化銅、硫化ナトリウム、硫化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化ニッケル及び硫化白金等）、金属ハロゲン化物（フッ化カルシウム、フッ化スズ及びフッ化カリウム等）、金属炭化物（炭化カルシウム、炭化チタン、炭化鉄及び炭化ナトリウム等）、金属窒化物（窒化アルミニウム、窒化クロム、チッ化ケイ素、窒化ゲルマニウム及び窒化コバルト等）、炭酸金属塩（炭酸カルシウム（軽質炭酸カルシウム）、炭酸水素カルシウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸鉄等）、硫酸金属塩（硫酸アルミニウム、硫酸コバルト、硫酸水素ナトリウム、硫酸銅、硫酸ニッケル及び硫酸バリウム等）及びその他の金属塩（チタン酸塩（チタン酸バリウム、チタン酸マグネシウム、チタン酸カリウム等）、ホウ酸塩（ホウ酸アルミニウム、ホウ酸亜鉛等）、燐酸塩（リン酸カルシウム、燐酸ナトリウム、燐酸マグネシウム等）、アルミン酸塩（アルミン酸イットリウム（YAG）等）及び硝酸塩（硝酸ナトリウム、硝酸鉄、硝酸鉛等）など又はこれらの固溶体（チタン酸ジルコン酸ランタン鉛等）などが挙げられる。
As the inorganic compound (M2), any of natural products, modified products of natural products, and synthetic products (including purified products) can be used. Is preferred. For example, a carbide having a metal compound or an organic substance as a precursor can be used.
Examples of the metal compound include group 1 to group 16 metal oxides (titanium oxide, silicon oxide (silica), zinc oxide, aluminum oxide, chromium oxide, manganese oxide, molybdenum oxide, tungsten oxide, oxidation in the periodic table of elements. Vanadium, tin oxide, iron oxide (including magnetic iron oxide) and indium oxide), metal hydroxide (aluminum hydroxide, gold hydroxide, magnesium hydroxide, etc.), metal sulfide (copper sulfide, sodium sulfide, sulfide) Cadmium, zinc sulfide, lead sulfide, nickel sulfide and platinum sulfide), metal halides (calcium fluoride, tin fluoride, potassium fluoride, etc.), metal carbides (calcium carbide, titanium carbide, iron carbide, sodium carbide, etc.) , Metal nitride (aluminum nitride, chromium nitride, silicon nitride, germanium nitride, cobalt nitride, etc. , Metal carbonates (calcium carbonate (light calcium carbonate), calcium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, iron carbonate, etc.), metal sulfates (aluminum sulfate, cobalt sulfate, sodium hydrogen sulfate, copper sulfate, nickel sulfate, barium sulfate, etc.) And other metal salts (titanates (barium titanate, magnesium titanate, potassium titanate, etc.), borates (aluminum borate, zinc borate, etc.), phosphates (calcium phosphate, sodium phosphate, magnesium phosphate, etc.) And aluminates (yttrium aluminate (YAG), etc.) and nitrates (sodium nitrate, iron nitrate, lead nitrate, etc.) or solid solutions thereof (lead lanthanum zirconate titanate, etc.).
有機物を前躯体とする炭化物としては、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、グラファイト、活性炭、竹炭、木炭及びフラーレン等が挙げられる。
有機無機複合物(M3)としては、有機化合物（M1）及び無機化合物（M2）を各々粉砕又は溶融して混合したものやシランカップリング剤等を介して有機化合物（M1）と無機化合物（M2）を化学結合したもの等を使用することができる。
Examples of the carbide having an organic substance as a precursor include carbon black, carbon nanotube, graphite, activated carbon, bamboo charcoal, charcoal, and fullerene.
As the organic-inorganic composite (M3), the organic compound (M1) and the inorganic compound (M2) are mixed with each other by pulverizing or melting the organic compound (M1) and the inorganic compound (M2). ) Can be used.
バイオセンサー（S）の検出感度向上等の観点から、固体物質（M）の屈折率が1.45以上2.0以下であり、波長400〜800ｃｍ-1の電磁波を吸収しないものであることが特に好ましく、有機化合物(M1)としては、合成ポリマー、無機化合物(M2)としては、金属化合物が好ましく、特に好ましくは合成ポリマーである。合成ポリマーとしては、ビニル重合系ポリマーが好ましく、特に好ましくは、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリシクロオレフィンを主成分とするポリマーである。また、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソシアナト基、エポキシ基などの官能基をポリマー骨格中に導入してもよく、スチレンやメチルメタクリレートと、メタクリル酸やヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等とを共重合することによりこれら官能基をポリマー中に導入することができる。金属化合物としては、金属酸化物が好ましく、特に好ましくは、酸化チタン、ジルコニア、シリカである。 From the viewpoint of improving the detection sensitivity of the biosensor (S), it is particularly preferable that the solid substance (M) has a refractive index of 1.45 or more and 2.0 or less and does not absorb electromagnetic waves having a wavelength of 400 to 800 cm−1. The compound (M1) is preferably a synthetic polymer, and the inorganic compound (M2) is preferably a metal compound, and particularly preferably a synthetic polymer. As the synthetic polymer, a vinyl polymerization polymer is preferable, and a polymer mainly containing polystyrene, polymethyl methacrylate, or polycycloolefin is particularly preferable. In addition, functional groups such as hydroxyl groups, thiol groups, carboxyl groups, amino groups, aldehyde groups, isocyanato groups, and epoxy groups may be introduced into the polymer skeleton, such as styrene, methyl methacrylate, methacrylic acid, hydroxyethyl methacrylate, glycidyl. These functional groups can be introduced into the polymer by copolymerizing with methacrylate or the like. As the metal compound, a metal oxide is preferable, and titanium oxide, zirconia, and silica are particularly preferable.
本発明において周期構造体（N）は、一定の規則性、即ち、周期性を有する構造体であって、その周期構造としては、結晶性無機固体と同様の結晶構造等が挙げられ、具体的には、六方最密充填構造、立方最密充填構造、体心立方充填構造、ログパイル構造（図1）、ダイヤモンド構造等である。
これらの周期構造のうち、周期構造体（N）の微細化や生産性向上等の観点から、六方最密充填構造、立方最密充填構造が好ましい。
In the present invention, the periodic structure (N) is a structure having a certain regularity, that is, a periodicity, and examples of the periodic structure include a crystal structure similar to a crystalline inorganic solid. These include hexagonal close-packed structure, cubic close-packed structure, body-centered cubic packed structure, log pile structure (Fig. 1), and diamond structure.
Among these periodic structures, the hexagonal close-packed structure and the cubic close-packed structure are preferable from the viewpoints of miniaturization of the periodic structure (N) and productivity improvement.
構成単位（L）とは固体物質（M）からなる一定の形態を有するものであって、その形態としては、粒子状、繊維状、板状、針状、柱状等が挙げられる。これらの形態のうち、バイオセンサー（S）の生産性向上等の観点から粒子状であることが好ましい。構成単位（L）が粒子状であれば、後述する集積方法により周期構造体（N）を作製することができるため、生産性が向上し、安価なバイオセンサー（S）を提供することが可能となる。ここで粒子状とは、均一な周期構造体（N）を作製するために、不定形の粒子を含まない真球状（真球状粒子（P））であることが好ましい。
構成単位(L)のサイズとしては、繊維状、針状、柱状の場合は、短径が100〜1000nm、長径が0.5〜100μmであることが好ましく、板状の場合は、短径と長径は同一であってもよく、各々0.1〜100μmであることが好ましい。
The structural unit (L) has a certain form made of the solid substance (M), and examples of the form include a particulate form, a fiber form, a plate form, a needle form, and a column form. Of these forms, particles are preferable from the viewpoint of improving the productivity of the biosensor (S). If the structural unit (L) is in the form of particles, the periodic structure (N) can be produced by the integration method described later, so that productivity can be improved and an inexpensive biosensor (S) can be provided. It becomes. Here, in order to produce a uniform periodic structure (N), the particle form is preferably a true sphere (true sphere particle (P)) that does not contain irregular particles.
As the size of the structural unit (L), in the case of a fiber, needle or column, the minor axis is preferably 100 to 1000 nm and the major axis is preferably 0.5 to 100 μm. They may be the same and are each preferably 0.1 to 100 μm.
真球状粒子（P）は、数平均粒子径が100〜1000nmであることが好ましく、更に好ましくは150〜800nm、特に好ましくは200〜700nmである。平均粒子径がこの範囲内であると、検出装置として小型かつ安価なものを使用することができるし、検出感度も大幅に向上する。
また、真球状粒子（P）の粒度分布はシャープなものであることが好ましく、具体的には変動係数が10％以下であることが好ましく、7％以下が更に好ましく、5％以下が特に好ましい。粒度分布がこの範囲内であると、更に精度の高いバイオセンサー（S）を作製することが可能となる。ここで変動係数とは、標準偏差を平均値で除した値の百分率を意味する。不定形の粒子であったり、粒度分布がブロードであったりすると周期構造中に粒子が集積されていない欠陥が存在する等、バイオセンサー（S）に適した周期構造体（N）を作製することができない。
The spherical particles (P) preferably have a number average particle diameter of 100 to 1000 nm, more preferably 150 to 800 nm, and particularly preferably 200 to 700 nm. When the average particle diameter is within this range, a small and inexpensive detection device can be used, and the detection sensitivity is greatly improved.
The particle size distribution of the true spherical particles (P) is preferably sharp, and specifically, the coefficient of variation is preferably 10% or less, more preferably 7% or less, and particularly preferably 5% or less. . When the particle size distribution is within this range, it is possible to produce a biosensor (S) with higher accuracy. Here, the variation coefficient means a percentage of a value obtained by dividing the standard deviation by the average value. Producing periodic structures (N) suitable for biosensors (S), such as irregular particles or broad particle size distributions, where there is a defect in which particles are not accumulated in the periodic structure. I can't.
真球状粒子（P）の組成としては、前述の如く、スチレン、メチルメタクリレートを主要成分とするポリマーや金属酸化物が好ましく、これらの組成からなる真球状粒子（P）は、公知の方法により合成することができる。例えば、スチレンを主要成分とする場合、乳化重合法、懸濁重合法、ソープフリー乳化重合法等が挙げられ、シリカの場合、ゾルゲル法等が挙げられる。これらの組成からなり、上記の好ましい平均粒子径及び粒度分布を有する真球状粒子（P）は数多く市販されており、それらの市販品を使用することもできる。 As described above, the composition of the spherical particles (P) is preferably a polymer or metal oxide mainly composed of styrene or methyl methacrylate. The spherical particles (P) having these compositions are synthesized by a known method. can do. For example, when styrene is the main component, an emulsion polymerization method, a suspension polymerization method, a soap-free emulsion polymerization method, and the like can be mentioned. In the case of silica, a sol-gel method and the like can be mentioned. Many true spherical particles (P) having these compositions and having the above-mentioned preferred average particle size and particle size distribution are commercially available, and those commercially available products can also be used.
周期構造体（N）の作製方法としては、マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位（L）を1個ずつ集積する方法や構成単位（L）として真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法が挙げられる。
前者の方法としては、構成単位（L）、具体的には、公知の微細加工技術（リソグラフィー及びエッチング、レーザー加工等）により作製した金属化合物や合成ポリマーからなる柱状体や板状体を電子顕微鏡等で確認しながら1個ずつ集積していく方法が挙げられる。 この方法によれば、後述するフォトニックバンドギャップを容易に得ることができるログパイル構造を作製することができる。具体的には、図2で示すような周期構造体（N）（フォトニック結晶（C））が得られる。
As a method for producing the periodic structure (N), a spherical unit (P) is used as a structural unit (L) or a method of accumulating the structural unit (L) one by one using a micromanipulator, Examples of the method include accumulation by gravity, centrifugal force, capillary force, liquid crosslinking force, and the like.
As the former method, a structural unit (L), specifically, a columnar body or a plate-like body made of a metal compound or a synthetic polymer produced by a known fine processing technique (lithography and etching, laser processing, etc.) is used for an electron microscope. A method of accumulating them one by one while confirming with etc. is mentioned. According to this method, a log pile structure capable of easily obtaining a photonic band gap described later can be produced. Specifically, a periodic structure (N) (photonic crystal (C)) as shown in FIG. 2 is obtained.
一方、後者の方法は、電子顕微鏡等で確認しながら集積する必要がなく、集積ドライビングフォースを適切に選択すれば、極めて容易に大量生産することができるため前者の方法よりも好ましい。後者の方法によれば、周期構造体（N）の周期構造は六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造となる。後述のように、ある特定形状のテンプレートを使用する場合には、選択的に立方最密充填構造が得られる。
これら六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造を総称してオパール構造という。
このオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、後述の方法において、逆オパール構造を作製することができる。逆オパール構造とは、オパール構造体の間隙に固体物質（M）の前駆体などを充填した後、オパール構造体を取り除くことにより形成される構造であり、オパール構造体をちょうど逆にした構造である。
ここで立方最密充填構造及び六方最密充填構造とは、いずれも最密充填構造であって、充填率は74体積％である。
立方最密充填構造は、面心立方格子構造とも呼ばれ、正四角形の単位格子の各頂点および各面の中心に粒子が位置し、最稠密面をABCABCABCの順に重ねた構造となっている。
六方最密充填構造は、単位格子を正六角柱で表し、この正六角柱の上面および底面の各角および中心と、六角柱の内部で高さ 1/2 のところに 3 つの粒子が存在する。底面の中心に位置する原子は、底面の角の 6 粒子および上下の各3粒子（計 12 粒子）と接しており、最稠密面をABABABの順に重ねた構造となっている。
また、バルク状の固体物質（M）をレーザーにより直接加工する方法も周期構造体（N）の作製方法として挙げることができる。具体的な方法としては、感光性レジストに短パルスレーザーを照射することによりレーザーを照射した部分のみを選択的に硬化させて周期構造を得る方法（特開2004-126312に記載の方法）などが挙げられる。
On the other hand, the latter method is preferable to the former method because it is not necessary to perform accumulation while confirming with an electron microscope or the like, and mass production can be performed very easily if the accumulation driving force is appropriately selected. According to the latter method, the periodic structure (N) has a hexagonal close-packed structure and / or a cubic close-packed structure. As will be described later, when a template having a specific shape is used, a cubic close-packed structure is selectively obtained.
These hexagonal close-packed structures and / or cubic close-packed structures are collectively referred to as opal structures.
Using the periodic structure (N) composed of this opal structure as a template, an inverse opal structure can be produced by the method described later. The inverted opal structure is a structure formed by filling the gap between the opal structures with a solid material (M) precursor and then removing the opal structure, and the opal structure is just reversed. is there.
Here, the cubic close-packed structure and the hexagonal close-packed structure are both close-packed structures, and the filling rate is 74% by volume.
The cubic close-packed structure is also called a face-centered cubic lattice structure, and has a structure in which particles are positioned at the vertices of the regular tetragonal unit cell and the center of each surface, and the close-packed surfaces are stacked in the order ABCCABBC.
In the hexagonal close-packed structure, the unit cell is represented by a regular hexagonal column, and there are three particles at each corner and center of the top and bottom surfaces of this regular hexagonal column and at a height of 1/2 inside the hexagonal column. The atom located in the center of the bottom is in contact with the 6 particles at the corner of the bottom and 3 particles above and below (12 particles in total), and has the structure in which the most dense surfaces are stacked in the order of ABABAB.
In addition, a method of directly processing a bulk solid material (M) with a laser can be cited as a method for producing the periodic structure (N). As a specific method, there is a method of obtaining a periodic structure by selectively curing only a portion irradiated with a laser by irradiating a photosensitive resist with a short pulse laser (a method described in JP-A-2004-126312). Can be mentioned.
真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法では、何らかのテンプレート基板(Q)が必要である。テンプレートの機能を有する基板(Q)としては、真球状微粒子（P）を規則的に集積できる基板であれば種々の基板を使用することができ、凹凸のない平面基板、穴が形成された基板、溝が形成された基板、チューブ状の基板等を使用することができる。これら基板の形状や大きさにより、得られる周期構造体（N）の形状や大きさが決定されるため、精度良く穴や溝、チューブ等のサイズが揃った基板が必要であり、穴が形成された基板、溝が形成された基板、チューブ状の基板等を使用することが好ましい。これらの基板(Q)を使用すれば、極めて欠陥の少なく規則性の高い周期構造体（N）を作製することができ、バイオセンサー（S）の感度が更に良好なものとなる。
基板(Q)を構成する材料としては、シリコンやシリカ、酸化チタン等の無機化合物からなるものやアクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド樹脂や感光性樹脂などの合成ポリマー等からなるものを使用することができる。
A template substrate (Q) is required in the method of using true spherical particles (P) and accumulating them by gravity, centrifugal force, capillary force, liquid bridging force or the like. As the substrate (Q) having a template function, various substrates can be used as long as they can regularly accumulate spherical fine particles (P). A substrate having a groove, a tube-like substrate, or the like can be used. Since the shape and size of the periodic structure (N) obtained are determined by the shape and size of these substrates, a substrate with a uniform size of holes, grooves, tubes, etc. is required and holes are formed. It is preferable to use a substrate having a groove, a substrate having a groove, a tube-like substrate, or the like. If these substrates (Q) are used, a periodic structure (N) having very few defects and high regularity can be produced, and the sensitivity of the biosensor (S) can be further improved.
As a material constituting the substrate (Q), it is possible to use a material made of an inorganic compound such as silicon, silica, titanium oxide or a material made of a synthetic polymer such as an acrylic resin, an epoxy resin, a polyimide resin or a photosensitive resin. it can.
穴が形成された基板としては、図3のような基板が挙げられる。図3に示す穴の形状は基板表面に対して正確に54.7°の角度をなす逆ピラミッド型であり、このような極めて精度良くサイズの揃った穴を有する基板は、光や電子線を使用したリソグラフィー及びエッチング等の公知の微細加工技術により作製することができる。
例えば、図3に示す逆ピラミッド型基板は、電子線リソグラフィーと異方性エッチングにより作製することができる。具体的には、シリコン基板状に塗布したレジスト膜を電子線によりパターンニング（電子線リソグラフィー）した後、水酸化カリウム水溶液にて100面を選択的に溶解（異方性エッチング）することにより作製できる。逆ピラミッド型の穴を形成した基板を使用して、ピラミッドの先端部より順に真球状粒子（P）を集積すれば、立方最密充填構造のみからなる周期構造を作製することもできる。但し、立方最密充填構造と六方最密充填構造はいずれも最密充填構造であり、どちらの構造であっても又は両者の混合した構造であっても、フォトニックバンドギャップの効果等が変化することはない。
この方法を使用すれば、逆ピラミッド型の穴だけでなく、断面がV字型のアスペクト比が高い溝も精度良く作製することができるし、同様の微細加工技術を利用して、円柱型、柱状型の穴等も作製することができる。
An example of the substrate in which the hole is formed is a substrate as shown in FIG. The shape of the hole shown in Fig. 3 is an inverted pyramid that makes an accurate angle of 54.7 ° to the substrate surface. The substrate with such a hole with a uniform size uses light or an electron beam. It can be produced by a known fine processing technique such as lithography and etching.
For example, the inverted pyramid type substrate shown in FIG. 3 can be manufactured by electron beam lithography and anisotropic etching. Specifically, a resist film coated on a silicon substrate is patterned by electron beam (electron beam lithography), and then 100 surfaces are selectively dissolved (anisotropic etching) with an aqueous potassium hydroxide solution. it can. If the spherical particles (P) are accumulated in order from the tip of the pyramid using a substrate in which an inverted pyramid hole is formed, a periodic structure consisting only of a cubic close-packed structure can be produced. However, the cubic close-packed structure and the hexagonal close-packed structure are both close-packed structures, and the effect of the photonic band gap, etc., changes regardless of which structure is used or a mixture of both. Never do.
If this method is used, not only inverted pyramid type holes, but also V-shaped cross-sections with high aspect ratio grooves can be accurately produced. Columnar holes and the like can also be produced.
その他、無機化合物等からなる平面基板に電子線リソグラフィー等により作製したレジスト膜のパターン自体を基板(Q)とすることもできるし、微細加工技術により金型基板を作製し、これを熱軟化点以上に加熱した熱可塑性樹脂等に押しつけパターンを転写する方法（ナノインプリント法）により作製した樹脂製の基板も使用することができる。
1つの穴の大きさ（μm）としては、直径が1〜1000であることが好ましく、更に好ましくは5〜500、特に好ましくは10〜100であり、大きさがこの範囲内であれば、短径と長径が存在してもよい。
In addition, the resist film pattern itself produced by electron beam lithography or the like on a flat substrate made of an inorganic compound or the like can be used as the substrate (Q), or a mold substrate can be produced by microfabrication technology, and the heat softening point can be obtained. A resin substrate produced by a method (nanoimprint method) of transferring a pressing pattern to a thermoplastic resin or the like heated as described above can also be used.
As for the size (μm) of one hole, the diameter is preferably 1 to 1000, more preferably 5 to 500, and particularly preferably 10 to 100. There may be a diameter and a major axis.
溝が形成された基板としては、図4のような基板が挙げられ、同様の微細加工技術により作製することができる。ここで溝とは穴よりもアスペクト比（長径/短径、短径とは基板表面の断面の直径）が高い線状のものを意味し、具体的には、アスペクト比が10倍以上のものである（アスペクト比が10倍未満のものを穴とする）。
溝の断面の形状としては、四角形や図4のようなＶ字型等が挙げられる。
1つの溝の大きさ（μm）としては、短径が1〜1000、長径が10〜50000であることが好ましく、更に好ましくは短径が5〜500、長径が50〜20000、特に好ましくは短径が10〜100、長径が100〜10000である。
これらの溝としては、溝の両端が切り出されているもの、即ち、基板の端部に溝の両端が存在するものや片端だけが切り出されているもの、又は両端とも切り出されていないものを使用することができる。
Examples of the substrate on which the groove is formed include a substrate as shown in FIG. 4 and can be manufactured by the same fine processing technique. Here, the groove means a linear shape having a higher aspect ratio (major axis / minor axis, where the minor axis is the diameter of the cross section of the substrate surface) than the hole. Specifically, the aspect ratio is 10 times or more. (A hole whose aspect ratio is less than 10 times is used as a hole).
Examples of the cross-sectional shape of the groove include a quadrangle and a V-shape as shown in FIG.
As the size (μm) of one groove, the minor axis is preferably 1 to 1000 and the major axis is preferably 10 to 50,000, more preferably the minor axis is 5 to 500, and the major axis is 50 to 20000, particularly preferably short. The diameter is 10-100 and the major axis is 100-10000.
As these grooves, those in which both ends of the groove are cut out, that is, those in which both ends of the groove are present at the end of the substrate, those in which only one end is cut out, or those in which both ends are not cut out are used. can do.
チューブ状の基板としては、市販されているキャピラリーチューブ（石英キャピラッリーチューブ（モリテックス社製、TCI社製など））やマイクロチューブ（フッ素樹脂マイクロチューブなど（テックジャム社製））等を使用することができる。 As the tube-shaped substrate, a commercially available capillary tube (quartz capillary tube (MORITEX, TCI, etc.)) or microtube (fluororesin microtube (TEC JAM)), etc. are used. be able to.
これらの基板（Q）に真球状粒子（P）を重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては公知の方法等を使用することができる。
重力による真球状粒子の集積方法は、自然沈降法とも呼ばれ、基板（Q）に真球状粒子のスラリーを滴下し、重力を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。ここで集積ドライビングフォースとは、真球状粒子（P）を基板（Q）に集積させるために働かせる力を意味する。
液架橋力による真球状粒子の集積方法（液架橋力法）は、基板（Q）に真球状粒子のスラリーを滴下し、溶媒の蒸発によって発生する液架橋力を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。
As a method for accumulating the spherical particles (P) on these substrates (Q) by gravity, centrifugal force, capillary force, liquid bridging force, etc., known methods can be used.
The method for accumulating true spherical particles by gravity is also called a natural sedimentation method, and is a method in which a slurry of true spherical particles is dropped on a substrate (Q) and the true spherical particles are accumulated using gravity as an accumulation driving force. Here, the accumulated driving force means a force that acts to accumulate the spherical particles (P) on the substrate (Q).
The method for collecting spherical particles by liquid crosslinking force (liquid crosslinking force method) is to drop slurry of spherical particles onto the substrate (Q) and use the liquid crosslinking force generated by evaporation of the solvent to collect the spherical particles using the integrated driving force. It is a method of accumulation.
遠心力を使用した集積方法は、集積ドライビングフォースとして遠心力を使用することにより、周期構造体（N）の生産効率を高め、更に従来の方法では作製することが困難である均一性の高い周期構造単位の小さな周期構造体（N）を作製することが可能な方法である。例えば、遠心力を10Ｇ加えると、集積速度が10倍となる。また、5000Ｇ程度の強い遠心力を加えると、粒子径が300nm程度の小さな粒子も容易に集積することが可能であり、バイオセンサー（S）に適した周期構造単位の小さな周期構造体（N）を作製することができる。 The integration method using centrifugal force increases the production efficiency of the periodic structure (N) by using centrifugal force as the integrated driving force, and furthermore, a highly uniform cycle that is difficult to produce by conventional methods. This is a method capable of producing a periodic structure (N) having a small structural unit. For example, when a centrifugal force of 10 G is applied, the accumulation speed becomes 10 times. In addition, when a strong centrifugal force of about 5000 G is applied, small particles with a particle size of about 300 nm can be easily accumulated, and a periodic structure (N) with a small periodic structure unit suitable for a biosensor (S). Can be produced.
遠心力とは、遠心力中心から外へと向かう方向の慣性力であり、次式で与えられる。
F = ｍｒω２
ここで、ｍは真球状粒子（P）の質量、ｒは遠心場の中心から真球状粒子（P）までの距離、ωは角速度（回転数×2π）である。ｒは、正確には遠心場の中心（遠心機の中心）から真球状粒子（P）までの距離であるが、粒子は常に移動するので、便宜上遠心機の中心から基板（Q）までの距離として扱う。
使用する遠心力の強さとしては、粒子径や粒子の比重により好ましい強さは異なるが、生産速度向上の観点からは強い方がよい。但し、規則性の高い均一な真球状粒子（P）の集積体を作製するためには、遠心力の強さだけでなく、処理時間、粒子スラリーの濃度、溶媒の蒸発速度等のパラメーターを最適化する必要がある。
Centrifugal force is an inertial force in the direction from the center of centrifugal force to the outside, and is given by the following equation.
F = mrω 2
Here, m is the mass of the true spherical particle (P), r is the distance from the center of the centrifugal field to the true spherical particle (P), and ω is the angular velocity (number of revolutions × 2π). To be precise, r is the distance from the center of the centrifuge field (centrifugal center) to the spherical particle (P), but since the particles always move, the distance from the center of the centrifuge to the substrate (Q) for convenience. Treat as.
The strength of the centrifugal force to be used varies depending on the particle diameter and the specific gravity of the particles, but it is better from the viewpoint of improving the production speed. However, in order to produce a highly regular and uniform aggregate of spherical particles (P), not only the strength of the centrifugal force but also parameters such as processing time, particle slurry concentration, and solvent evaporation rate are optimal. It is necessary to make it.
例えば、真球状粒子（P）として数平均粒子径が500nmのポリスチレン粒子、基板（Q）として直径が10μｍの正方形の穴径を有し、深さが12μｍの図3に示す逆ピラミッド型の穴が形成された基板を使用した場合のこれらパラメーターの好ましい範囲は、生産効率及び得られる周期構造体（N）の均一性等の観点から以下の通りである。
遠心力の強さとしては、10〜10000Ｇであることが好ましく、更に好ましくは100〜8000Ｇ、特に好ましくは500〜5000Ｇである。
処理時間としては、遠心力の強さによっても異なるが、5〜3600分であることが好ましく、更に好ましくは10〜1000分、特に好ましくは15〜120分である。
真球状粒子スラリーの濃度としては、粒子スラリーの量によっても異なるが、0.01〜20重量%であることが好ましく、更に好ましくは0.02〜15重量%、特に好ましくは0.05〜10重量%である。真球状粒子スラリーの調製方法としては、真球状粒子を水等に界面活性剤や超音波分散機を使用して分散することにより調整できるが、水中にて原料モノマー等からソープフリー乳化重合等により真球状粒子を合成して、そのまま真球状粒子スラリーとして用いることが好ましい。
溶媒の蒸発は、前述のように、集積処理中に行わないことが好ましい。
For example, a polystyrene particle having a number average particle diameter of 500 nm as a true spherical particle (P), a square hole diameter of 10 μm in diameter as a substrate (Q), and an inverted pyramid type hole having a depth of 12 μm as shown in FIG. The preferable range of these parameters when using the substrate on which is formed is as follows from the viewpoints of production efficiency, uniformity of the obtained periodic structure (N), and the like.
The strength of the centrifugal force is preferably 10 to 10,000 G, more preferably 100 to 8000 G, and particularly preferably 500 to 5000 G.
The treatment time varies depending on the strength of the centrifugal force, but is preferably 5 to 3600 minutes, more preferably 10 to 1000 minutes, and particularly preferably 15 to 120 minutes.
The concentration of the true spherical particle slurry varies depending on the amount of the particle slurry, but is preferably 0.01 to 20% by weight, more preferably 0.02 to 15% by weight, and particularly preferably 0.05 to 10% by weight. The method for preparing the true spherical particle slurry can be adjusted by dispersing the true spherical particles in water or the like using a surfactant or an ultrasonic disperser. It is preferable to synthesize spherical particles and use them as they are as spherical particle slurry.
The evaporation of the solvent is preferably not performed during the accumulation process as described above.
具体的な製造方法としては、基板（Q）に形成した穴又は溝に、真球状粒子（P）のスラリーを充填し、基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えて穴又は溝に真球状粒子（P）を集積する方法である。
真球状粒子（P）をそのまま使用するのではなく、溶媒に分散したスラリーとして使用するのは、粒子に機動性を持たせるためである。溶媒がない場合又は溶媒が蒸発してなくなった場合、粒子間や粒子と基板間において直ちに固着が起こり、粒子の機動性が無くなるため、均一性の高い周期構造体（N）を作製することができない。
As a specific manufacturing method, holes or grooves formed in the substrate (Q) are filled with slurry of true spherical particles (P), and centrifugal force is applied perpendicularly to the surface of the substrate (Q) to form holes or grooves. In this method, spherical particles (P) are accumulated in the grooves.
The reason why the spherical particles (P) are not used as they are but as a slurry dispersed in a solvent is to give the particles mobility. When there is no solvent or when the solvent ceases to evaporate, fixing occurs immediately between particles or between the particle and the substrate, and the mobility of the particles is lost, so that a highly uniform periodic structure (N) can be produced. Can not.
ここで溶媒とは、真球状粒子（P）を溶解せず、分散させることができるものであれば販発明の構成上特に限定されず、水やアルコール、アセトンやトルエンなどの有機溶剤等を使用することができる。クリーンプロセス等の観点から、溶媒として水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒を使用することが好ましい。
粒子のブラウン運動は規則的な集積を促進するため、遠心力の強度を定期的に増減させる、温度を高くする、何らかの振動を与える等に粒子に更に機動性を付与する方法は、均一性の高い周期構造体（N）を作製する方法として有効である。
基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えるとは、真球状粒子（P）が 基板（Q）の表面、穴や溝が形成された基板であれば、穴や溝の底部に対して垂直な力によって集積されることを意味する。具体的な方法としては、遠心力の増加に伴って基板（Q）を設置した遠心管の角度が変化する、所謂、スイングローター型の遠心機を使用する方法や遠心力が強い場合であって、遠心力がかかる方向に対して垂直に基板（Q）を設置することができる遠心機を使用する方法等が挙げられる。後者の方法において、遠心力が強い場合とは大凡500Ｇ以上の遠心力を加える場合を意味する。遠心力が大きくなると重力の影響が無視できるからである。
Here, the solvent is not particularly limited in terms of the structure of the sales invention as long as it can dissolve and disperse the spherical particles (P), and water, alcohol, organic solvents such as acetone and toluene are used. can do. From the viewpoint of a clean process or the like, it is preferable to use water, a lower alcohol or a mixed solvent thereof as a solvent.
Since the Brownian motion of the particles promotes regular accumulation, the method of adding more mobility to the particles such as periodically increasing / decreasing the strength of the centrifugal force, increasing the temperature, applying some vibration, etc. This is an effective method for producing a high periodic structure (N).
Applying centrifugal force perpendicular to the surface of the substrate (Q) means that if the spherical particles (P) are on the surface of the substrate (Q), a substrate with holes or grooves formed on the bottom of the holes or grooves It means that it is accumulated by a force perpendicular to it. Specific methods include a method using a so-called swing rotor type centrifuge in which the angle of the centrifuge tube on which the substrate (Q) is installed changes as the centrifugal force increases, or when the centrifugal force is strong. And a method of using a centrifuge capable of installing the substrate (Q) perpendicular to the direction in which the centrifugal force is applied. In the latter method, the case where the centrifugal force is strong means a case where a centrifugal force of about 500 G or more is applied. This is because the influence of gravity can be ignored when the centrifugal force increases.
これらの方法に使用できる遠心機としては、市販されている多くの遠心機を使用することができる。例えば、冷却高速遠心機H2600、H923，H2000B、小型卓上遠心機H11NA、H19FMR（コクサン社製）、高速冷却遠心機GRX250、SRX201（トミー精工社製）などを使用することができる。使用できるローター（遠心管）としては、前者の方法の場合は、RF109Ｌ、RF127（H19FMR用）やSH1（H2600用）などが使用でき、後者の方法の場合は、DWH1（H2600用）などが使用できる。 As a centrifuge that can be used in these methods, many commercially available centrifuges can be used. For example, cooling high-speed centrifuges H2600, H923, H2000B, small table centrifuges H11NA, H19FMR (manufactured by Kokusan), high-speed cooling centrifuges GRX250, SRX201 (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.) and the like can be used. As the rotor (centrifuge tube) that can be used, RF109L, RF127 (for H19FMR) and SH1 (for H2600) can be used in the former method, and DWH1 (for H2600) is used in the latter method. it can.
遠心力を基板（Q）の表面に対して垂直ではなく平行にかける方法によっても周期構造体（N）を作製することができる。
この方法は、基板（Q）に形成した溝に必要により上部カバーを設置し、遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに液量調整部を設け、溝に真球状粒子（P）のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えて、必要により液量調整部を調整しながら、溝に真球状粒子（P）を集積する方法である。この方法に使用する装置の概念図を図5に示す。なお、遠心中心から基板（Q）までの距離が短い場合や基板（Q）が大きい場合等には、基板（Q）に形成される溝は遠心場の外側に位置する溝の片端から遠心中心に引いた線上に溝を形成することが好ましい。
The periodic structure (N) can also be produced by a method in which centrifugal force is applied in parallel to the surface of the substrate (Q) instead of perpendicularly.
In this method, if necessary, an upper cover is installed in the groove formed in the substrate (Q), and a liquid amount adjusting unit is provided on one end of the groove located outside the centrifugal field or on the upper cover just above one end, and the groove is spherical. After filling the slurry of particles (P), apply centrifugal force in the direction parallel to the surface of the substrate (Q), and adjust the liquid volume adjustment part as necessary, while adding spherical particles (P) to the grooves. It is a method of accumulation. A conceptual diagram of an apparatus used in this method is shown in FIG. When the distance from the centrifuge center to the substrate (Q) is short or when the substrate (Q) is large, the groove formed on the substrate (Q) is from one end of the groove located outside the centrifuge field to the centrifuge center. It is preferable to form a groove on the line drawn in (1).
上部カバーとは、真球状粒子（P）のスラリーの排出を防止する目的で基板（Q）に形成した溝又は基板（Q）全面の上部に設置されるカバーであり、排出のおそれがある場合には設置することが好ましい。
遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに設置した液量調整部とは、溶媒のみを排出し真球状粒子（P）を透過させないフィルターや弁等であって、溶媒の排出速度を任意に調整できることが好ましい。真球状粒子（P）が集積された後において、閉じていた弁を開き溶媒を排出してもよいし、フィルターや適当に開いた弁を使用して真球状粒子（P）の集積過程において溶媒を排出してもよい。但し、フォトニック結晶の均一性向上等の観点から、真球状粒子（P）の集積が完了するまで、溶媒を完全に排出しないことが好ましい。
溝に真球状粒子（P）のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えるとは、基板に形成した遠心場の外側に位置する溝の片端断面に対して垂直に遠心力をかけることを意味する。従って、真球状粒子（P）は遠心場外側に位置する溝の片端より順に集積されることになる。
The top cover is a cover that is installed on the top of the groove or the entire surface of the substrate (Q) for the purpose of preventing the discharge of slurry of spherical particles (P) or when there is a risk of discharge Is preferably installed.
The liquid volume adjusting unit installed on one end of the groove located outside the centrifuge field or on the upper cover just above one end is a filter or valve that discharges only the solvent and does not allow the spherical particles (P) to permeate. It is preferable that the discharge speed of the can be adjusted arbitrarily. After the spherical particles (P) are accumulated, the closed valve may be opened to discharge the solvent, or the filter may be used to open the solvent during the accumulation process of the spherical particles (P). May be discharged. However, from the viewpoint of improving the uniformity of the photonic crystal, it is preferable that the solvent is not completely discharged until the accumulation of the spherical particles (P) is completed.
Applying centrifugal force in a direction parallel to the surface of the substrate (Q) after filling the groove with a spherical particle (P) slurry is a cross section at one end of the groove located outside the centrifugal field formed on the substrate This means that centrifugal force is applied perpendicular to Accordingly, the spherical particles (P) are accumulated in order from one end of the groove located outside the centrifugal field.
前述の方法において、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えた状態で、真球状粒子（P）のスラリーを遠心場の内側の片端から充填することにより3次元フォトニック結晶（C）を製造することもできる。この方法によれば生産効率が更に高くなり、連続的な製造方法として極めて有効である。
この方法に使用する装置の概念図を図6に示す。遠心中心に真球状粒子（P）のスラリーを滴下し一時的に溜めておくための凹部（WP）があり、その周囲に基板（Q）を設置する。基板装着部（QS）は凹部の壁が除去されており、基板（Q）に形成された溝の底部とWPの底部が同じ高さとなるように設計及び設置することが好ましい。本発明の構成上、基板装着部（QS）の数に制限はなく、多数も受けることにより、更に生産性が向上する。
上部カバーを設置する場合には、遠心中心に真球状粒子（P）スラリーの供給部（WI）を設けておき、ここから遠心中心にスラリーを滴下することができる。
In the method described above, three-dimensional photonics are obtained by filling a slurry of true spherical particles (P) from one end inside the centrifugal field with centrifugal force applied in a direction parallel to the surface of the substrate (Q). Crystal (C) can also be produced. According to this method, the production efficiency is further increased and it is extremely effective as a continuous production method.
A conceptual diagram of an apparatus used in this method is shown in FIG. There is a recess (WP) for dripping a slurry of true spherical particles (P) in the center of the centrifuge and temporarily storing it, and a substrate (Q) is placed around it. The substrate mounting portion (QS) is preferably designed and installed such that the wall of the recess is removed, and the bottom of the groove formed in the substrate (Q) and the bottom of the WP are the same height. In the configuration of the present invention, the number of substrate mounting portions (QS) is not limited, and the productivity is further improved by receiving a large number.
In the case of installing the upper cover, a spherical particle (P) slurry supply unit (WI) is provided at the centrifugal center, and the slurry can be dropped onto the centrifugal center from here.
遠心力を基板（Q）の表面に対して平行にかける方法に使用できる遠心機としては、市販されているスピンコーター等を使用することができる。例えば、1Hシリーズ（ミカサ社製）、ACTシリーズ、ASSシリーズ（アクティブ社製）、K359シリーズ（共和理研社製）等が挙げられる。
スピンコーターの回転数としては、回転半径等によって好ましい回転数が異なるが、前述の強さの遠心力が加わるように調整することが好ましい。
A commercially available spin coater or the like can be used as a centrifuge that can be used in a method of applying a centrifugal force parallel to the surface of the substrate (Q). For example, 1H series (manufactured by Mikasa), ACT series, ASS series (manufactured by Active), K359 series (manufactured by Kyowa Riken) and the like can be mentioned.
As the rotation speed of the spin coater, a preferable rotation speed varies depending on the rotation radius or the like, but it is preferable to adjust so that the above-described strong centrifugal force is applied.
毛細管力を使用した集積方法としては、細い管の中の溶媒が管の中を上昇する現象（毛細管現象）を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。
溶媒が上昇する高さは、溶媒の表面張力、管の濡れ易さ、溶媒の密度等によって決まり、次式により計算することができる。
h= 2Tcosθ/pgr
ここでTは表面張力(N/m)、θは接触角、pは溶媒の密度(kg/m3)、gは重力加速度(m/s2)
、rは管の半径(m)である。
溶媒中に分散されている真球状粒子（P）は溶媒の上昇により一緒に上昇し、管の上から順に集積されていく。真球状粒子（P）の集積は、溶媒が蒸発することにより発生する液架橋力によって最終的に行われるが、通常の液架橋力とは異なり力がほぼ垂直方向のみに働く。溶媒の蒸発が管の上から順に起こるため、通常の液架橋力のように四方八方に力が働くものではないため、通常の液架橋力を使用した方法よりも均一性の高い周期構造体（N）を作製することが可能な方法である。
An accumulation method using capillary force is a method of accumulating true spherical particles using a phenomenon (capillary phenomenon) in which a solvent in a thin tube ascends in the tube as an accumulation driving force.
The height at which the solvent rises depends on the surface tension of the solvent, the ease of wetting of the tube, the density of the solvent, and the like, and can be calculated by the following equation.
h = 2Tcosθ / pgr
Where T is the surface tension (N / m), θ is the contact angle, p is the density of the solvent (kg / m 3 ), and g is the acceleration of gravity (m / s2)
, R is the radius (m) of the tube.
The spherical particles (P) dispersed in the solvent rise together with the rise of the solvent and accumulate in order from the top of the tube. Accumulation of the true spherical particles (P) is finally performed by the liquid crosslinking force generated by the evaporation of the solvent, but the force works only in the vertical direction unlike the normal liquid crosslinking force. Since the evaporation of the solvent occurs in order from the top of the tube, the force does not work in all directions like the normal liquid bridging force. Therefore, the periodic structure with higher uniformity than the method using the normal liquid bridging force ( N) is a possible method.
この方法に使用できる基板（Q）としては、チューブ状の基板を使用することが好ましく、前述のように、市販されているキャピラリーチューブ（石英キャピラッリーチューブ（モリテックス社製、TCI社製など））やマイクロチューブ（フッ素樹脂マイクロチューブなど（テックジャム社製））等を使用することができる。
具体的な方法としては、チューブ状の基板を真球状粒子（P）のスラリーに片端を浸漬するだけであるが、浸漬していない上部の片端から吸引する方法や、異なる種類の真球状粒子（P）のスラリーに順次浸漬してストライブ状に集積された周期構造体（N）のアレイを作製する方法など、生産効率の向上等を目的とした改良方法を幾つか挙げることができる。また、管表面の親疎水性を調整する等集積の条件を最適化することにより、更に均一性の高い周期構造体（N）を作製することができる。
As the substrate (Q) that can be used in this method, a tube-shaped substrate is preferably used. As described above, a commercially available capillary tube (quartz capillary tube (manufactured by Moritex, TCI, etc.)) ), Microtubes (fluorine resin microtubes and the like (manufactured by Tech Jam)) and the like can be used.
As a specific method, only one end of a tube-shaped substrate is immersed in a slurry of true spherical particles (P), but a method of sucking from one end of the upper portion not immersed, or different types of true spherical particles ( There can be mentioned several improved methods for the purpose of improving production efficiency, such as a method of producing an array of periodic structures (N) that are sequentially immersed in the slurry of P) and accumulated in a stripe shape. Furthermore, by optimizing the accumulation conditions such as adjusting the hydrophilicity / hydrophobicity of the tube surface, it is possible to produce a periodic structure (N) with higher uniformity.
真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては、前述のように、公知の方法を使用することができるが、生産性を更に高め、かつ、バイオセンサー（S）に適した欠陥のない周期構造体（N）を作製する等の観点から、集積ドライビングフォースとして、遠心力、毛細管力を使用することが好ましい。
上記の方法により作製したオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、逆オパール構造の周期構造体（N）を作製することができる。構成単位（L）としてポリスチレン微粒子を使用したオパール構造の周期構造体（N）を鋳型として、シリカを固体物質（M）とする逆オパール構造の周期構造体（N）を作製する方法を以下に説明する。
前述の方法を使用して作製したポリスチレン微粒子を使用したオパール構造体の間隙に固体物質（M）の前駆体であるエタノール、テトラエトキシシラン、少量の水から作成されたシリカゾルを充填し、エタノール及び水を乾燥除去した後、ポリスチレン微粒子を除去することによりシリカからなる逆オパール構造体を作製することができる。ポリスチレン微粒子の除去方法としては、400〜500℃程度に加熱してポリスチレン微粒子を熱分解してガス化する方法やトルエンやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を使用して溶解除去する方法が挙げられる。
一方、構成単位（L）としてシリカ微粒子を使用したオパール構造の周期構造体（N）を鋳型として、ポリスチレンを固体物質（M）とする逆オパール構造の周期構造体（N）を作製することもできる。シリカ微粒子を使用したオパール構造体の間隙に固体物質（M）の原料であるスチレンモノマー及び重合開始剤を充填し、加熱することによりスチレンを重合しポリマー化した後、シリカ微粒子を除去することによりポリスチレンからなる逆オパール構造体を作製することができる。シリカ微粒子の除去方法としては、フッ酸に浸漬してシリカ微粒子を溶解除去する方法が挙げられる。
他にも種々のオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、前述と同様の方法にて、チタニアやジルコニアの無機化合物、ポリオレフィン等の有機化合物を構成材料（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N）を作製することができる。
逆オパール構造からなる周期構造体（N）は、ターゲット物資（Y）が特異的結合物質（X）に結合することにより発生する反射スペクトルピークのシフトの幅が、オパール構造よりも数倍から数十倍程度大きく、従って、逆オパール構造体のフォトニック結晶をバイオセンサー（S）として使用するほうが検出感度の観点からは好ましい。但し、オパール構造体の作製は極めて容易であることから低コストで作製できるため、使用者のニーズに応じて使い分けることが好ましい。
As described above, known methods can be used as a method of using spherical particles (P) and collecting them by gravity, centrifugal force, capillary force, liquid crosslinking force, etc., but the productivity is further improved. From the standpoint of producing a defect-free periodic structure (N) suitable for the biosensor (S), it is preferable to use centrifugal force or capillary force as the integrated driving force.
A periodic structure (N) having an inverse opal structure can be produced using the periodic structure (N) having an opal structure produced by the above method as a template. The following is a method for producing a periodic structure (N) with an inverted opal structure using silica as a solid substance (M) using a periodic structure (N) with an opal structure using polystyrene fine particles as a structural unit (L) as a template. explain.
The gap between the opal structures using polystyrene fine particles prepared using the above-described method is filled with a solid substance (M) precursor ethanol, tetraethoxysilane, silica sol made from a small amount of water, ethanol and After removing water by drying, the inverse opal structure made of silica can be produced by removing the polystyrene fine particles. Examples of the method for removing the polystyrene fine particles include a method of pyrolyzing the polystyrene fine particles by heating to about 400 to 500 ° C. and a method of dissolving and removing them using an organic solvent such as toluene and dimethyl sulfoxide.
On the other hand, a periodic structure (N) having an inverted opal structure in which polystyrene is used as a solid substance (M) by using a periodic structure (N) having an opal structure using silica fine particles as a structural unit (L) as a template may be prepared. it can. By filling the gap between the opal structures using silica fine particles with the styrene monomer and polymerization initiator, which are raw materials of the solid substance (M), and polymerizing the styrene by heating, and then removing the silica fine particles An inverse opal structure made of polystyrene can be produced. Examples of the method for removing the silica fine particles include a method in which the silica fine particles are dissolved and removed by immersion in hydrofluoric acid.
In addition, using the periodic structure (N) composed of various opal structures as a template, using the same method as described above, an inverted opal structure using an inorganic compound such as titania or zirconia, or an organic compound such as polyolefin as the constituent material (M) A periodic structure (N) made of can be produced.
In the periodic structure (N) composed of the inverse opal structure, the width of the reflection spectrum peak shift generated when the target material (Y) binds to the specific binding substance (X) is several times to several times that of the opal structure. From the viewpoint of detection sensitivity, it is preferable to use a photonic crystal having an inverse opal structure as the biosensor (S). However, since the production of the opal structure is extremely easy and can be produced at low cost, it is preferable to use the opal structure according to the needs of the user.
本発明においてフォトニック結晶（C）とは、特定の電磁波の波長と同程度の周期的な屈折率変化を内部にもつ構造体を意味し、3次元的な屈折率分布をもつ3次元フォトニック結晶である。このような構造では、半導体において原子核の周期ポテンシャルによって電子(電子波)がブラッグ反射を受けバンドギャップが形成されるのと同様に、周期的な屈折率分布によって対応する波長の電磁波がブラッグ反射を受け、電磁波に対するバンドギャップ(フォトニックバンドギャップ)が形成されるという特長がある。
具体的には、フォトニック結晶（C）は周期構造体（N）とその構造体の間に存在する物質からなる。その構造体の間に存在する物質とは、気体、液体、固体のいずれも使用することができるが、屈折率が1.0〜1.4の気体又は液体であることが好ましく、具体的には、空気、窒素、希ガス、水性媒体等である。
In the present invention, the photonic crystal (C) means a structure having a periodic refractive index change equivalent to the wavelength of a specific electromagnetic wave, and a three-dimensional photonic crystal having a three-dimensional refractive index distribution. It is a crystal. In such a structure, similarly to the case where electrons (electron waves) are subjected to Bragg reflection due to the periodic potential of the nucleus in a semiconductor and a band gap is formed, electromagnetic waves of the corresponding wavelength are Bragg reflected due to the periodic refractive index distribution. It has a feature that a band gap (photonic band gap) against electromagnetic waves is formed.
Specifically, the photonic crystal (C) is composed of a periodic structure (N) and a substance existing between the structures. The substance existing between the structures can be any of gas, liquid and solid, but is preferably a gas or liquid having a refractive index of 1.0 to 1.4, specifically, air, Nitrogen, noble gas, aqueous medium and the like.
フォトニック結晶（C）は、基板（Q）に集積された状態でバイオセンサー（S）として使用することもできるし、基板を除去してフォトニック結晶（C）のみからバイオセンサー（S）を構成したり、基板を除去した後で別の基板にフォトニック結晶（C）を設置してバイオセンサー（S）に組み込むこともできる。
基板（Q）から取り出す場合には、例えば、周期構造体（N）がオパール構造である場合、粒子同士を固定化することが好ましい。粒子同士を固定化する方法としては、熱有着する方法が一般的であり、真球状微粒子（P）が有機化合物からなる場合だけでなく、無機化合物からなる場合にも適用することができる。例えば、真球状微粒子（P）がポリスチレンからなる場合には、90℃付近にて1〜5分程度熱処理することにより固定化することができ、シリカの場合も500℃付近にて1〜5分程度熱処理することにより固定化することができる。その他の方法としては、真球状微粒子（P）に反応性官能基を導入し、その官能基と反応する基を有する架橋剤を加えて化学的に結合する方法が挙げられる。これらの方法により、フォトニック結晶（C）を取り出す場合には、特異的結合物質（X）の変性を防止するため、周期構造体（N）（フォトニック結晶）を作製した後に（X）を固定化することが好ましい。
The photonic crystal (C) can be used as a biosensor (S) while being integrated on the substrate (Q), or the substrate can be removed and the biosensor (S) can be removed from the photonic crystal (C) alone. The photonic crystal (C) can be installed on another substrate after the substrate is removed or incorporated into the biosensor (S).
When taking out from a board | substrate (Q), when a periodic structure (N) is an opal structure, it is preferable to fix | immobilize particles. As a method for immobilizing particles, a method of thermally adhering is generally used, and the method can be applied not only when the spherical particles (P) are made of an organic compound but also when it is made of an inorganic compound. For example, when the spherical particles (P) are made of polystyrene, they can be fixed by heat treatment at about 90 ° C. for about 1 to 5 minutes, and in the case of silica at about 500 ° C. for 1 to 5 minutes. It can be fixed by heat treatment to some extent. Examples of other methods include a method in which a reactive functional group is introduced into the spherical fine particles (P), and a cross-linking agent having a group that reacts with the functional group is added to chemically bond the reactive functional group. When taking out the photonic crystal (C) by these methods, in order to prevent denaturation of the specific binding substance (X), after preparing the periodic structure (N) (photonic crystal), (X) It is preferable to fix.
基板（Q）から取り出さずに使用する場合には、粒子同士はヴァンデルワールス力或いは静電的引力等により物理的に吸着しているので、必ずしも固定化は必要ではない。
基板（Q）から取り出す具体的な方法としては、上記の方法により固定化した3次元フォトニック結晶を粘着テープ等を表面に付着させて物理的に取り出す方法や基板（Q）を酸やアルカリ、有機溶剤等を使用して除去する方法等が挙げられる。
生産効率等の観点から、テンプレート基板に集積された状態でバイオセンサー（S）として使用できることが好ましく、テンプレート基板はテンプレートとしての役割だけでなく、バイオセンサー（S）の主要構成要素であるフォトニック結晶（C）の固定部品としての機能を有することが好ましい。
When the particles are used without being taken out from the substrate (Q), the particles are physically adsorbed by van der Waals force or electrostatic attraction, and thus immobilization is not necessarily required.
As a specific method of removing from the substrate (Q), a method of physically removing the 3D photonic crystal fixed by the above method by attaching an adhesive tape or the like to the surface, or removing the substrate (Q) from acid or alkali, For example, a method of removing the organic solvent using an organic solvent can be used.
From the viewpoint of production efficiency and the like, it is preferable that it can be used as a biosensor (S) in a state of being integrated on a template substrate. It preferably has a function as a fixed part of the crystal (C).
本発明において、特異的結合物質（X）は被検体(A)中に含まれるターゲット物質と特異的に結合する物質であれば制限なく使用でき、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチド若しくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
ここで被検体(A)としては、血液（血清、血漿）、尿、大便、喀痰、髄液等が挙げられる。
被検体(A)中に含まれる特異的結合物質（X）と特異的に結合するターゲット物質とは、特異的結合物質（X）と同様のものであって、例えば（X）が抗体の場合、ターゲット物質は、その抗体が認識する抗原であり、例えば（X）が糖鎖の場合、ターゲット物質は、レクチン、例えば（X）が遺伝子の場合、ターゲット物質は、相補的な遺伝子である。
In the present invention, the specific binding substance (X) can be used without limitation as long as it is a substance that specifically binds to the target substance contained in the analyte (A). For example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, small molecules Examples include organic compounds, non-immune proteins, immunoglobulin-binding proteins, sugar-binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, or polypeptides or oligopeptides having ligand-binding ability.
Here, examples of the subject (A) include blood (serum, plasma), urine, stool, sputum, and cerebrospinal fluid.
The target substance that specifically binds to the specific binding substance (X) contained in the analyte (A) is the same as the specific binding substance (X), for example, when (X) is an antibody The target substance is an antigen recognized by the antibody. For example, when (X) is a sugar chain, the target substance is a lectin, for example, when (X) is a gene, the target substance is a complementary gene.
免疫蛋白質としては、抗原、抗体やハプテンを例示することができる。抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、腫瘍マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター等が挙げられる。薬剤としては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例えば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールなどが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げられる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。 Examples of immune proteins include antigens, antibodies and haptens. As the antibody, an antibody against the following antigen can be used, and examples of the antigen include drugs, low molecular hormones, tumor markers, viruses, high molecular hormones, cytokines, various growth factors and the like. Examples of the drug include theophylline, phenytoin, valproic acid and the like. Examples of the low molecular hormone include thyroxine, estrogen, and estradiol. Examples of tumor markers include CEA, AFP, and CA19-9. Examples of viruses include HIV, HCV, HBV and the like. Examples of the polymer hormone include thyroid stimulating hormone, insulin and the like. Examples of cytokines include IL-1, IL-2, and IL-6. Examples of various growth factors include EGF, PDGF, and the like. These antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, and may be F (ab ') 2, Fab', Fab which are degradation products of antibodies.
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、ターゲット物質がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、ターゲット物質がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等をターゲット物質とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
As an enzyme, an oxidoreductase, a hydrolase, an isomerase, a desorption enzyme, a synthetic enzyme, etc. can be used. Specifically, glucose oxidase can be used if the target substance is glucose, and cholesterol oxidase can be used if the target substance is cholesterol. In addition, when targeting pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc., target substances that are metabolized from them, such as acetylcholinesterase, Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
核酸としては、ターゲットとする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡの化学合成は、市販の合成装置を用いて行うことができるし、市販されているＤＮＡプローブをそのまま使用することもできる。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
As the nucleic acid, those that hybridize complementarily with the target nucleic acid can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA. Chemical synthesis of DNA (including cDNA) and RNA can be performed using a commercially available synthesizer, or a commercially available DNA probe can be used as it is.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins. Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
特異的結合物質（X）は、周期構造体（N）の表面に固定化されており、（X）が表面に固定化された構成単位（L）を使用して周期構造体（N）を構成してもよいし、周期構造体（N）を作製した後に（X）を表面に固定化してもよい。
特異的結合物質（X）を固定化する方法としては、化学的に結合する方法、物理吸着による方法など公知の方法が使用できる。
The specific binding substance (X) is immobilized on the surface of the periodic structure (N), and the structural unit (L) with (X) immobilized on the surface is used to bind the periodic structure (N). It may be configured, or (X) may be immobilized on the surface after producing the periodic structure (N).
As a method for immobilizing the specific binding substance (X), a known method such as a chemical binding method or a physical adsorption method can be used.
特異的結合物質（X）が免疫蛋白質や酵素等の蛋白質である場合、化学的に結合する方法としては、周期構造体（N）又は構成単位（L）にアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基を導入し、特異的結合物質（X）のアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基をグルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル、ｏ−フェニレンビスマレイミドなどで架橋する方法が使用できる（例えば、米国特許第４２８０９９２号、米国特許第３６５２７６１号に記載されている。）。
他にも、周期構造体（N）又は構成単位（L）にカルボキシル基を導入し、カルボジイミドを介して特異的結合物質（X）のアミノ基と結合する方法が挙げられる。構成単位（L）として、カルボキシル基を表面に有するポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P）（平均粒子系300nm・商品名K1-030・モリテックス社製）を使用する場合について具体的に説明する。まず、K1-030のスラリーにカルボジイミドを加え、室温で約１時間反応させた後、未反応のカルボジイミドを十分に洗浄除去する。次に、AFP抗体等の蛋白質を加え、約２時間反応させた後、未反応の蛋白質を洗浄除去することにより、蛋白質を化学的に結合した真球状粒子（P）を得ることができる。ここで洗浄除去の方法としては、遠心分離機を使用して粒子を沈降させ、上澄み液のみを除去して、更に超純水等を加えて同様の操作を繰り返す方法が挙げられる。
When the specific binding substance (X) is a protein such as an immunity protein or an enzyme, the chemical binding method includes functional groups such as amino groups and sulfhydryl groups on the periodic structure (N) or the structural unit (L). And functional groups such as amino group and sulfhydryl group of the specific binding substance (X) are cross-linked with glutaraldehyde, succinaldehyde, m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester, o-phenylenebismaleimide, etc. Can be used (for example, as described in US Pat. No. 4,280,992, US Pat. No. 3,657,761).
In addition, a method in which a carboxyl group is introduced into the periodic structure (N) or the structural unit (L) and bonded to the amino group of the specific binding substance (X) through carbodiimide can be mentioned. As a structural unit (L), a specific explanation will be given for the case of using spherical particles (P) (average particle size 300 nm, trade name K1-030, manufactured by Moritex Co., Ltd.) whose main component is polystyrene having carboxyl groups on the surface. To do. First, carbodiimide is added to the slurry of K1-030 and reacted at room temperature for about 1 hour, and then unreacted carbodiimide is sufficiently washed away. Next, after adding a protein such as an AFP antibody and reacting for about 2 hours, the unreacted protein is washed and removed, thereby obtaining spherical particles (P) chemically bound to the protein. Here, as a method for washing and removing, there is a method in which particles are settled using a centrifuge, only the supernatant liquid is removed, and ultrapure water or the like is further added to repeat the same operation.
物理吸着による方法としては、例えば、固体物質（M）がポリスチレンの場合、特異的結合物質（X）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に担体を適当時間浸漬する方法が使用できる（例えば、バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年に記載されている。）。
特異的結合物質（X）が核酸である場合、物理的に結合する方法としては、周期構造体（N）又は構成単位（L）に正電荷を付与し、電気的引力により結合するものである。この方法は、DNA が負電荷を有していることを利用するものであり、ポリリジンを表面にコートする方法やアミノシランを周期構造体（N）又は構成単位（L）に反応させアミノ基を導入する方法など、公知の方法を使用することができる。
数十程度の塩基からなる、いわゆるオリゴDNA と呼ばれる短いDNA 鎖の固定には、化学的に結合する方法が好ましい。最も知られている方法は、前述のように周期構造体（N）又は構成単位（L）にアミノ基を導入し、DNA 断片鎖の末端にもアミノ基を導入して、グルタルアルデヒドのような架橋剤により固定する方法である。
As a method by physical adsorption, for example, when the solid substance (M) is polystyrene, the carbonic acid buffer solution (pH 9.0) containing 0.001 to 0.04% (W / V) of the specific binding substance (X) is used. A method of immersing the carrier for an appropriate time can be used (for example, described in BioSim Biophys Actor, 251, 427, 1971).
When the specific binding substance (X) is a nucleic acid, the physical binding method is to impart a positive charge to the periodic structure (N) or the structural unit (L) and bind by electrical attraction. . This method makes use of the fact that DNA has a negative charge, such as coating polylysine on the surface or reacting aminosilane with a periodic structure (N) or structural unit (L) to introduce amino groups. A known method such as a method for performing can be used.
In order to fix a short DNA strand composed of several tens of bases, so-called oligo DNA, a chemical binding method is preferable. The most known method is to introduce an amino group into the periodic structure (N) or the structural unit (L) as described above, and to introduce an amino group into the end of the DNA fragment chain, such as glutaraldehyde. This is a method of fixing with a crosslinking agent.
本発明のバイオセンサー（S）は、フォトニック結晶（C）を必須構成要素とするものであり、このフォトニック結晶（C）がセンシングを司る部位である。
本バイオセンサー（S）は、特異的結合物質（X）が被検体中のターゲット物質と特異的に結合し、その結合によりフォトニック結晶（C）に生じる変化を観測してターゲット物質を検出・定量するものである。
具体的な検出方法としては、バイオセンサー（S）の主要構成素子であるフォトニック結晶（C）部位と被検体物質とを接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルの波長を比較することにより、被検体物質中に含まれる特異的結合物質（X）と特異的に結合するターゲット物質を検出する方法であり、フォトニック結晶のフォトニックバンドギャップを利用した検出方法である。この検出方法によれば、フォトニック結晶の表面における極くわずかなターゲット物質（Y）の結合による表面状態変化も感知することが可能である。特異的結合物質（X）と特異的に結合したターゲット物質がフォトニック結晶（C）の表面に付着することによりフォトニック結晶（C）の表面状態が変化し、フォトニックバンドギャップに由来する反射スペクトルの波長が高波長側若しくは低波長側にシフトする。このシフトにより、ターゲット物質を検出し、シフト量により、ターゲット物質の存在量を定量することができる。
The biosensor (S) of the present invention has a photonic crystal (C) as an essential component, and this photonic crystal (C) is a site that controls sensing.
In this biosensor (S), the specific binding substance (X) specifically binds to the target substance in the specimen, and the target substance is detected by observing the change that occurs in the photonic crystal (C) due to the binding. It is to be quantified.
Specifically, the photonic crystal (C) is irradiated with an electromagnetic wave of a specific wavelength before and after the photonic crystal (C) site, which is the main component of the biosensor (S), is contacted with the analyte. In this method, the target substance that specifically binds to the specific binding substance (X) contained in the analyte is detected by comparing the wavelengths of the reflection spectra obtained in this way. The photonic band of the photonic crystal This is a detection method using a gap. According to this detection method, it is possible to sense a change in the surface state due to a very small amount of binding of the target substance (Y) on the surface of the photonic crystal. Reflection originating from the photonic band gap due to the surface state of the photonic crystal (C) being changed by the target substance that specifically binds to the specific binding substance (X) adhering to the surface of the photonic crystal (C). The wavelength of the spectrum shifts to the high wavelength side or the low wavelength side. The target material can be detected by this shift, and the abundance of the target material can be quantified by the shift amount.
ここでフォトニックバンドギャップとは、前述の通り、電磁波に対するバンドギャップであり、電磁波の絶縁帯域を意味する。そのギャップに対応する波長の電磁波は結晶の内部に透過できず完全に反射されることになる。従って、フォトニックバンドギャップに対応する波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射すると反射スペクトルのピークが検出される。この反射スペクトルのピークは、フォトニックバンドギャップに由来するものであり、フォトニックバンドギャップはフォトニック結晶の表面状態変化に敏感に反応するため、被検体物質と接触させる前後において、この反射スペクトルのピーク波長を比較することによりターゲット物質を検出することができる。 Here, as described above, the photonic band gap is a band gap with respect to an electromagnetic wave, and means an insulating band of the electromagnetic wave. The electromagnetic wave having a wavelength corresponding to the gap cannot be transmitted into the crystal and is completely reflected. Therefore, when the photonic crystal (C) is irradiated with an electromagnetic wave having a wavelength corresponding to the photonic band gap, the peak of the reflection spectrum is detected. The peak of this reflection spectrum is derived from the photonic band gap, and the photonic band gap reacts sensitively to changes in the surface state of the photonic crystal. The target substance can be detected by comparing the peak wavelengths.
特定波長の電磁波としては、γ線、X線、紫外線、可視光線、赤外線、ミリ波、マイクロ波等が挙げられる。
これらのうち、X線、紫外線、可視光線、赤外線を使用することが好ましく、更に好ましくは、波長100〜1000nmの紫外線、可視光線、赤外線であり、特に好ましくは、波長300〜750nmの紫外線、可視光線である。この特定波長の電磁波を使用すれば、検出感度が良好なものとなり、また、汎用的で安価な検出装置を使用することができる。
反射スペクトルの検出装置としては、汎用の分光光度計等を使用することができる。例えば、顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）、分光測光装置PMA-11（浜松ホトニクス社製）、マルチスペクトロフォトメーターATRAS-25、FTIR-IRT-3000（日本分光社製）、紫外可視近赤外分光光度計UV-3600（島津社製）、反射測定装置MCPD-3000（大塚電子社製）などが挙げられる。
Examples of the electromagnetic wave having a specific wavelength include γ rays, X rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, millimeter waves, and microwaves.
Among these, it is preferable to use X-rays, ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays, more preferably ultraviolet rays having a wavelength of 100 to 1000 nm, visible rays, and infrared rays, and particularly preferably ultraviolet rays having a wavelength of 300 to 750 nm, visible rays. Light rays. If electromagnetic waves of this specific wavelength are used, the detection sensitivity will be good, and a general-purpose and inexpensive detection device can be used.
A general-purpose spectrophotometer or the like can be used as the reflection spectrum detection device. For example, microscopic UV-visible spectrophotometer MSV-350 (manufactured by JASCO), spectrophotometer PMA-11 (manufactured by Hamamatsu Photonics), multi spectrophotometer ATRAS-25, FTIR-IRT-3000 (manufactured by JASCO) UV-visible near-infrared spectrophotometer UV-3600 (manufactured by Shimadzu Corporation), reflection measuring device MCPD-3000 (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.) and the like.
特定の波長の電磁波を周期構造体に照射して得られる反射スペクトルの波長は、主にフォトニック結晶（C）の周期サイズに対応し、例えば、平均粒子径200〜300nmの真球状粒子（P）から構成されるオパール構造の周期構造体（N）からなるフォトニック結晶（C）の場合には、200〜500nm付近に反射スペクトルが現れる。 The wavelength of the reflection spectrum obtained by irradiating the periodic structure with electromagnetic waves of a specific wavelength mainly corresponds to the periodic size of the photonic crystal (C), for example, a spherical particle (P In the case of a photonic crystal (C) composed of a periodic structure (N) having an opal structure composed of), a reflection spectrum appears in the vicinity of 200 to 500 nm.
特異的結合物質（X）に、被検体（A）中に含まれるターゲット物質（Y）を特異的に結合させる方法としては、種々の調整を行った被検体をバイオセンサー（S）の主要構成素子であるフォトニック結晶（C）に接触させることにより行う。フォトニック結晶（C）の表面に特異的結合物質（X）が固定化されているため、被検体物質中に含まれるターゲット物質の反応がフォトニック結晶（C）の表面にて起こる。
被検体（A）をフォトニック結晶（C）に接触させる方法としては、被検体（A）をフォトニック結晶（C）の表面に滴下する方法、フォトニック結晶（C）が固定化された基板の溝やチューブに、被検体（A）を圧入する方法、被検体（A）の希釈液等にフォトニック結晶（C）を浸漬する方法などが挙げられる。
接触の条件、即ち、反応時の温度、時間等の条件は、公知の条件を適用することができ、例えば、免疫蛋白質の場合、室温〜３７℃で1〜６０分反応させる。
未結合のターゲット物質（Y）や被検体（A）中のその他のタンパク質などをフォトニック結晶（C）中から取り除くため、被検体（A）の接触後、水性媒体等により洗浄することもでき、バイオセンサー（S）の検出感度向上の観点からは、洗浄操作を行うことが好ましい。
また、被検体（A）中のターゲット物質（Y）以外のタンパク質が特異的結合物質（X）や周期構造体（N）に非特異的に吸着する場合もあるため、牛血清アルブミン（BSA）等の親水性の高いタンパク質を周期構造体（N）に吸着させる等の公知の非特異的吸着防止法を採用することもできる。
As a method of specifically binding the target substance (Y) contained in the specimen (A) to the specific binding substance (X), the specimen with various adjustments is used as the main component of the biosensor (S). The contact is made with a photonic crystal (C) as an element. Since the specific binding substance (X) is immobilized on the surface of the photonic crystal (C), the reaction of the target substance contained in the analyte substance occurs on the surface of the photonic crystal (C).
As a method of bringing the subject (A) into contact with the photonic crystal (C), a method of dropping the subject (A) on the surface of the photonic crystal (C), a substrate on which the photonic crystal (C) is immobilized For example, a method of press-fitting the subject (A) into the groove or tube, a method of immersing the photonic crystal (C) in a diluted solution of the subject (A), and the like.
Known conditions can be applied as contact conditions, that is, conditions such as temperature and time during the reaction. For example, in the case of an immunoprotein, the reaction is performed at room temperature to 37 ° C. for 1 to 60 minutes.
Unbound target substance (Y) and other proteins in the specimen (A) are removed from the photonic crystal (C), so after contact with the specimen (A), it can be washed with an aqueous medium. From the viewpoint of improving the detection sensitivity of the biosensor (S), it is preferable to perform a washing operation.
In addition, proteins other than the target substance (Y) in the analyte (A) may adsorb nonspecifically to the specific binding substance (X) or periodic structure (N), so bovine serum albumin (BSA) It is also possible to employ a known non-specific adsorption preventing method such as adsorption of a highly hydrophilic protein such as the periodic structure (N).
バイオセンサー（S）は、主要構成素子であるフォトニック結晶（C）のみから構成することもできるが、取り扱いやすいようにフォトニック結晶（C）を固定化したチップや、或いは被検体物質を効率的に接触させるための溝や流路等を設けたチップとすることが好ましい。 The biosensor (S) can be composed of only the main component, photonic crystal (C), but it is efficient to use a chip with a fixed photonic crystal (C) for easy handling, or the analyte. It is preferable to use a chip provided with a groove, a flow path, and the like for contact with each other.
[実施例]
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部、％は重量％を意味する。
[Example]
EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples without departing from the gist of the present invention. Unless otherwise specified, “part” means “part by weight” and “%” means “% by weight”.
＜基板（Q）の作製＞
（1）穴を形成した基板（基板（Q-1））
外観；図3参照
穴の形状；逆ピラミッド型
穴のサイズ；一辺；10μmの正方形（断面）、深さ；12μm、ピラミッドの角度；54°、穴の数；100個
基板（Q）の大きさ；一辺1cmの正方形
作製方法；
一辺1cmのシリコン基板（基板（Q））を1000℃で1.5時間、大気中で加熱することにより酸化膜を形成した後、ピラニア液（硫酸と30%過酸化水素水を体積比1：9で混合したもの）にて洗浄して有機物を完全に除去した。
乾燥後、スピンコーターによりレジストを塗布し、約400nmの膜厚のレジスト膜をシリコン基板上に形成した（180℃で3分間プリベーク）。レジストはαメチルスチレン-αクロロアクリレート共重合体（ZEP520（ポジ型レジスト）、日本ゼオン社製）を使用した。
このレジスト膜に電子線描画装置にて上記の穴のサイズ等に対応するようにパターンを描画した後、現像液（ZEP-RD、日本ゼオン社製）に浸漬してマスクパターンを作製した。
BHF（フッ化アンモニウムとフッ酸を体積比1：9で混合したもの）に数分間浸漬して酸化膜のみを取り除いた後、水酸化カリウム（30％）とイソプロピルアルコール（12％）からなる水溶液に1時間浸漬して、異方性エッチングを行った。最後に、酸化膜をBHFにて取り除き、基板（Q-1）を得た。
（2）溝を形成した基板（基板（Q-2））
外観；図4参照
溝の断面形状；Ｖ字型
溝のサイズ；幅；10μm、長さ；1000μm、深さ；12μm、溝の数；100個
基板の大きさ；1cm×0.1cmの長方形
その他；溝は短い方の辺と平行な方向に形成し、基板の両端部に溝の両端が位置する。
作製方法；
上記の溝のサイズ等に対応するようにパターンを作製して、基板（Q-1）と同様にして基板（Q-2）を作製した。
（3）チューブ状の基板（基板（Q-3））
以下の内径、長さを有する石英製キャピラリーチューブ（TSP030150、ポリミクロ社製）を使用した。
内径；30μm （外径；150μm）
長さ；3cm
（4）溝を形成した基板（基板（Q-4））
外観；図4及び図6参照
溝の断面形状；Ｖ字型
溝のサイズ；幅；10μm、長さ；1000μm、深さ；12μm、溝の数；100個
基板の大きさ；扇型、内円半径0.7cm、外円半径1.1cm、面積2.1cm2（溝の数；300個）
その他；基板の両端部に溝の両端が位置する
溝は遠心場の外側に位置する溝の片端から遠心中心に引いた線上に溝を形成。
（上記条件を満たす位置に基板（Q-4）を設置する）
作製方法；
上記の溝のサイズ等に対応するようにパターンを作製して、基板（Q-1）と同様にして基板（Q-4）を作製した。
（5）チューブ状の基板（基板（Q-5））
以下の内径、長さを有する石英製キャピラリーチューブ（TSP030150、ポリミクロ社製）を使用した。
内径；5μm （外径；150μm）
長さ；3cm
（6）平面状の基板（基板（Q-6））
一辺24mm×24mm、厚さ0.2mmの凹凸のないガラス製カバーガラス（マツナミ社製）を使用した。
（7）チューブ状の基板（基板（Q-7））
厚さ（内径）0.1mm、幅（内径）1mm、長さ30mmのガラス製キャピラリーチューブを使用した。
<Production of substrate (Q)>
(1) Substrate with holes (substrate (Q-1))
Appearance; see Fig. 3 Hole shape; inverted pyramid type Hole size; one side; 10μm square (cross section), depth: 12μm, pyramid angle; 54 °, number of holes; 100
Substrate (Q) size: 1cm square
After forming an oxide film by heating a silicon substrate (substrate (Q)) with a side of 1 cm at 1000 ° C for 1.5 hours in the atmosphere, piranha solution (sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide water at a volume ratio of 1: 9) The organic matter was completely removed by washing with a mixture.
After drying, a resist was applied by a spin coater to form a resist film having a thickness of about 400 nm on a silicon substrate (prebaked at 180 ° C. for 3 minutes). As the resist, α-methylstyrene-α-chloroacrylate copolymer (ZEP520 (positive resist), manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) was used.
A pattern was drawn on the resist film with an electron beam drawing apparatus so as to correspond to the size of the hole and the like, and then immersed in a developer (ZEP-RD, manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) to prepare a mask pattern.
An aqueous solution consisting of potassium hydroxide (30%) and isopropyl alcohol (12%) after being immersed in BHF (a mixture of ammonium fluoride and hydrofluoric acid at a volume ratio of 1: 9) for several minutes to remove only the oxide film. For 1 hour to perform anisotropic etching. Finally, the oxide film was removed with BHF to obtain a substrate (Q-1).
(2) Substrate with groove (substrate (Q-2))
Appearance; see Fig. 4 Cross-sectional shape of groove; V-shaped groove size; width: 10 µm, length: 1000 µm, depth: 12 µm, number of grooves: 100
Size of substrate: 1 cm × 0.1 cm rectangle Others: The groove is formed in a direction parallel to the shorter side, and both ends of the groove are located at both ends of the substrate.
Production method;
A pattern was produced so as to correspond to the size of the groove and the like, and a substrate (Q-2) was produced in the same manner as the substrate (Q-1).
(3) Tubular substrate (substrate (Q-3))
A quartz capillary tube (TSP030150, manufactured by Polymicro) having the following inner diameter and length was used.
Inner diameter: 30μm (Outer diameter: 150μm)
Length: 3cm
(4) Substrate with groove (substrate (Q-4))
Appearance; see Fig. 4 and Fig. 6 Cross-sectional shape of groove; V-shaped groove size; width: 10 µm, length: 1000 µm, depth: 12 µm, number of grooves: 100
Substrate size: Fan-shaped, inner circle radius 0.7 cm, outer circle radius 1.1 cm, area 2.1 cm 2 (number of grooves: 300)
Other: Both ends of the groove are located at both ends of the substrate
The groove forms a groove on a line drawn from one end of the groove located outside the centrifugal field to the centrifugal center.
(Install the board (Q-4) at a position that satisfies the above conditions)
Production method;
A pattern was produced so as to correspond to the size of the groove and the like, and a substrate (Q-4) was produced in the same manner as the substrate (Q-1).
(5) Tubular substrate (substrate (Q-5))
A quartz capillary tube (TSP030150, manufactured by Polymicro) having the following inner diameter and length was used.
Inner diameter: 5μm (Outer diameter: 150μm)
Length: 3cm
(6) Planar substrate (Substrate (Q-6))
A glass cover glass (manufactured by Matsunami Co., Ltd.) having a side of 24 mm × 24 mm and a thickness of 0.2 mm and having no irregularities was used.
(7) Tubular substrate (substrate (Q-7))
A glass capillary tube having a thickness (inner diameter) of 0.1 mm, a width (inner diameter) of 1 mm, and a length of 30 mm was used.
＜構成単位（L）への特異的結合物質（X）の固定化＞
（1）AFP抗体固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-1）
構成単位（L）；ポリスチレン真球状微粒子（P-1）
（数平均粒子径320nm、標準偏差3.0%、屈折率1.59）
特異的結合物質（X）；AFP抗体
作製方法；
数平均粒子径320nm、標準偏差3.0%、粒子濃度4重量%のカルボキシル基のついたポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のAFP抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介してAFP抗体を真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応のAFP抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
<Immobilization of specific binding substance (X) to structural unit (L)>
(1) AFP antibody-immobilized polystyrene spherical particles (LX-1)
Structural unit (L): Polystyrene spherical particles (P-1)
(Number average particle size 320nm, standard deviation 3.0%, refractive index 1.59)
Specific binding substance (X); AFP antibody production method;
0.2 μl in 250 μl of water slurry (W030CA, manufactured by Moritex) of spherical particles (P-1) mainly composed of polystyrene with a carboxyl group with a number average particle size of 320 nm, standard deviation of 3.0% and particle concentration of 4% by weight. 100 μl of 1% by weight 1-ethyl-3dimethylaminopropylcarbodiimide aqueous solution is added and allowed to react at room temperature for 1 hour. Thoroughly wash away unreacted 1-ethyl-3dimethylaminopropylcarbodiimide with phosphate buffer, add 100 μl of phosphate buffer containing 0.2% by weight of AFP antibody, and react at room temperature for 2 hours. The AFP antibody was immobilized on the surface of the spherical particles (P-1) via carbodiimide. Unreacted AFP antibody was sufficiently washed and removed with a phosphate buffer, and then the particle concentration was adjusted to 0.1% by weight with a phosphate buffer.
（2）CEA抗体固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-2）
構成単位（L）；（P-1）
特異的結合物質（X）；CEA抗体
作製方法；
真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のCEA抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介してCEA抗体を真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応のCEA抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
(2) CEA antibody-immobilized polystyrene spherical particles (LX-2)
Structural unit (L); (P-1)
Specific binding substance (X); CEA antibody production method;
To 250 μl of an aqueous slurry of true spherical particles (P-1) (W030CA, manufactured by Moritex), 100 μl of 0.2 wt% 1-ethyl-3dimethylaminopropylcarbodiimide aqueous solution is added and allowed to react at room temperature for 1 hour. Thoroughly wash away unreacted 1-ethyl-3dimethylaminopropylcarbodiimide with phosphate buffer, add 100 μl of phosphate buffer containing 0.2% by weight of CEA antibody, and react at room temperature for 2 hours. The CEA antibody was immobilized on the surface of the spherical particles (P-1) via carbodiimide. Unreacted CEA antibody was sufficiently washed away with a phosphate buffer, and then the particle concentration was adjusted to 0.1% by weight with a phosphate buffer.
（3）AFP抗体固定化シリカ真球状粒子（LX-3）
構成単位（L）；シリカ真球状微粒子（P-2）
（数平均粒子径500nm、標準偏差4.0%、屈折率1.46）
特異的結合物質（X）；AFP抗体
作製方法；
数平均粒子径500nm、標準偏差4.1%、粒子濃度2重量%のシリカ真球状粒子（P-2）の水スラリー（標準粒子8050、モリテックス社製）にエタノールを加えながら室温、30mmHgの減圧条件下にて脱水して水分含量0.3重量%、粒子濃度4重量%のエタノールスラリーとし、このエタノールスラリー250μlに、0.5重量%のアミノプロピルトリエトキシシランのエタノール溶液100μlを加え、室温で2時間反応させる。未反応のアミノプロピルトリエトキシシランをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のグルタルアルデヒド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応のグルタルアルデヒドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のAFP抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりグルタルアルデヒドを介してAFP抗体を真球状粒子（P-2）の表面に固定化した。未反応のAFP抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
(3) AFP antibody-immobilized silica spherical particles (LX-3)
Structural unit (L): Silica spherical particles (P-2)
(Number average particle diameter 500nm, standard deviation 4.0%, refractive index 1.46)
Specific binding substance (X); AFP antibody production method;
While adding ethanol to an aqueous slurry of silica spherical particles (P-2) with a number average particle size of 500 nm, standard deviation of 4.1% and particle concentration of 2% by weight (standard particle 8050, manufactured by Moritex), room temperature at 30 mmHg under reduced pressure To give an ethanol slurry having a water content of 0.3 wt% and a particle concentration of 4 wt%. To 250 μl of this ethanol slurry, 100 μl of an ethanol solution of 0.5 wt% aminopropyltriethoxysilane is added and reacted at room temperature for 2 hours. Unreacted aminopropyltriethoxysilane is sufficiently washed and removed with a phosphate buffer, and then 100 μl of 0.2 wt% aqueous glutaraldehyde solution is added and reacted at room temperature for 1 hour. After thoroughly washing and removing unreacted glutaraldehyde with phosphate buffer, add 100 μl of phosphate buffer containing 0.2% by weight of AFP antibody and react at room temperature for 2 hours to react with AFP via glutaraldehyde. The antibody was immobilized on the surface of true spherical particles (P-2). Unreacted AFP antibody was sufficiently washed and removed with a phosphate buffer, and then the particle concentration was adjusted to 0.1% by weight with a phosphate buffer.
（4）DNA固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-4）
構成単位（L）；（P-1）
特異的結合物質（X）；一本鎖DNA（3’末端をチオール基で修飾）（宝バイオ社製）
塩基配列（CAAgCATgACTTCgACTTCATCgTCACCgg）
作製方法；
真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%のグルタルアルデヒド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応のグルタルアルデヒドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%の一本鎖DNA（3’末端をチオール基で修飾）を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介して一本鎖DNAを真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応の一本鎖DNAをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
(4) DNA-immobilized polystyrene true spherical particles (LX-4)
Structural unit (L); (P-1)
Specific binding substance (X); single-stranded DNA (3 'end modified with thiol group) (manufactured by Takara Bio Inc.)
Base sequence (CAAgCATgACTTCgACTTCATCgTCACCgg)
Production method;
100 μl of a 0.2 wt% aqueous solution of glutaraldehyde is added to 250 μl of an aqueous slurry of spherical particles (P-1) (W030CA, manufactured by Moritex Corporation), and reacted at room temperature for 1 hour. Unreacted glutaraldehyde is thoroughly washed and removed with phosphate buffer, then 100 μl of phosphate buffer containing 0.2% by weight of single-stranded DNA (modified at the 3 'end with a thiol group) is added at room temperature. By reacting for 2 hours, single-stranded DNA was immobilized on the surface of the spherical particles (P-1) via carbodiimide. Unreacted single-stranded DNA was sufficiently washed and removed with a phosphate buffer, and then the particle concentration was adjusted to 0.1% by weight with a phosphate buffer.
＜被検体（A）の調整＞
（1）ターゲット物質（Y）が免疫蛋白質の場合
ボランティア3名（被検者ｂ1、ｂ2、ｂ3）から採集した血液をそれぞれ遠心分離機にて10000rpmで15分間遠心処理して上澄みの血漿を採取し、これを被検体（A-b1）、（A-b2）、（A-b3）とした。
（2）ターゲット物質（Y）が核酸の場合
LX-4の表面に存在する一本鎖DNAと相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA（塩基配列（gTTCgTACTgAAgCTgAAgTAgCAgTggCC））を20.0ng/mlと、該一本鎖DNAと塩基配列が異なる一本鎖DNAが100種類をそれぞれ10〜100ng/mlの濃度で含有するリン酸緩衝液を調整し、これを被検体（A-4）とした。
<Adjustment of subject (A)>
(1) When the target substance (Y) is an immunity protein Blood collected from three volunteers (subjects b1, b2, b3) is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes in a centrifuge, and the supernatant plasma is collected. These were designated as specimens (A-b1), (A-b2), and (A-b3).
(2) When the target substance (Y) is a nucleic acid
A single-stranded DNA (base sequence (gTTCgTACTgAAgCTgAAgTAgCAgTggCC)) that has a complementary base sequence to the single-stranded DNA present on the surface of LX-4 is 20.0 ng / ml. A phosphate buffer solution containing 100 kinds of strand DNAs at a concentration of 10 to 100 ng / ml was prepared, and this was used as a specimen (A-4).
＜実施例1＞
基板（Q-2）に、（LX-1）のスラリー0.01gを滴下し、遠心機（H30R、コクサン社製）を使って、4000Gにて90分間、基板（Q-2）の表面に対して垂直に遠心力を加えて（LX-1）を集積した。遠心機には、基板（Q-2）の表面に対して垂直に遠心力が加わるように、スイングローター（RF121）に図7に示す遠心管を設置した。
遠心集積後、基板（Q-2）を遠心管から取り外し、余分なスラリーをリン酸緩衝液で洗浄しながら除去し、フォトニック結晶（C-1）（周期構造体（N-1）の隙間をリン酸緩衝液で満たしたもの）を得た。周期構造体（N-1）の周期構造は、立方最密充填構造と六方最密充填構造の両方が混合したオパール構造で、大きさは幅10μm、長さ1000μm、深さ12μmあった。以下、周期構造は表１及び２に記載した。
フォトニック結晶（C-1）が集積された基板（Q-1）上に、親水性スライドガラス（極東製薬工業社製）を設置してバイオセンサー（S-1）とした。
<Example 1>
Add 0.01 g of (LX-1) slurry to the substrate (Q-2) and use a centrifuge (H30R, manufactured by Kokusan) for 90 minutes at 4000G against the surface of the substrate (Q-2). (LX-1) was accumulated by applying a centrifugal force vertically. In the centrifuge, the centrifuge tube shown in FIG. 7 was installed on the swing rotor (RF121) so that a centrifugal force was applied perpendicularly to the surface of the substrate (Q-2).
After centrifugation, the substrate (Q-2) is removed from the centrifuge tube, and the excess slurry is removed while washing with phosphate buffer to remove the photonic crystal (C-1) (gap in the periodic structure (N-1)) Was filled with a phosphate buffer). The periodic structure (N-1) had an opal structure in which both a cubic close-packed structure and a hexagonal close-packed structure were mixed, and the size was 10 μm wide, 1000 μm long, and 12 μm deep. Hereinafter, the periodic structures are shown in Tables 1 and 2.
A hydrophilic slide glass (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) was installed on the substrate (Q-1) on which the photonic crystal (C-1) was integrated to obtain a biosensor (S-1).
＜実施例2＞
基板（Q-2）に、（LX-2）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-2）及びバイオセンサー（S-2）を得た。
<Example 2>
A slurry of (LX-2) was dropped onto the substrate (Q-2), and a photonic crystal (C-2) and a biosensor (S-2) were obtained in the same manner as in Example 1.
＜実施例3＞
基板（Q-2）に、（LX-3）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-3）及びバイオセンサー（S-3）を得た。
<Example 3>
A slurry of (LX-3) was dropped onto the substrate (Q-2), and a photonic crystal (C-3) and a biosensor (S-3) were obtained in the same manner as in Example 1.
＜実施例4＞
基板（Q-2）に、（LX-4）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-4）及びバイオセンサー（S-4）を得た。
<Example 4>
A slurry of (LX-4) was dropped onto the substrate (Q-2), and a photonic crystal (C-4) and a biosensor (S-4) were obtained in the same manner as in Example 1.
＜実施例5＞
基板（Q-2）の代わりに基板（Q-1）を使用して、（LX-1）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-5）を得た。フォトニック結晶（C-1）が基板（Q-1）に集積された状態でバイオセンサー（S-5）とした。
<Example 5>
Using the substrate (Q-1) instead of the substrate (Q-2), the slurry of (LX-1) was dropped, and the photonic crystal (C-5) was obtained in the same manner as in Example 1. . The biosensor (S-5) was formed with the photonic crystal (C-1) integrated on the substrate (Q-1).
＜実施例6＞
基板（Q-3）の片端を、真球状粒子(P-1)（構成単位（L））の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したものに2cm浸漬して、30時間静置することにより毛細管力を利用して真球状粒子(P-1)を集積した。
集積後、基板（Q-3）を真球状粒子(P-1)のスラリーから取り外し、90℃にて3分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、周期構造体（N-6）得た。得られた周期構造体（N-6）の大きさは、直径30μm、長さ3mmであった。
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に周期構造体（N）が集積された基板（Q-3）に注入し反応させて、周期構造体（N-6）の表面に特異的結合物質（X）としてAFP抗体を固定化した。
周期構造体（N-6）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-6）を得た。
フォトニック結晶（C-6）が基板（Q-3）に集積された状態でバイオセンサー（S-6）とした。
<Example 6>
One end of the substrate (Q-3) is immersed 2cm in a 10-fold dilution of water slurry (W030CA, manufactured by Moritex) of spherical particles (P-1) (constituent unit (L)) with ultrapure water. Then, by standing for 30 hours, spherical particles (P-1) were accumulated using capillary force.
After accumulation, the substrate (Q-3) is removed from the slurry of true spherical particles (P-1) and fixed between the particles by heat treatment at 90 ° C for 3 minutes to obtain a periodic structure (N-6) It was. The obtained periodic structure (N-6) had a diameter of 30 μm and a length of 3 mm.
In the same manner as in the production of (LX-1), 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide and AFP antibody were injected into the substrate (Q-3) on which the periodic structure (N) was accumulated in this order and reacted. Thus, an AFP antibody was immobilized as a specific binding substance (X) on the surface of the periodic structure (N-6).
A photonic crystal (C-6) was obtained by filling a gap between the periodic structures (N-6) with a phosphate buffer.
The biosensor (S-6) was formed with the photonic crystal (C-6) integrated on the substrate (Q-3).
＜実施例7＞
真球状粒子(P-1)（構成単位（L））の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したものの代わりに、数平均粒子径300nm、標準偏差1.3%、粒子濃度1重量%のポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を使用する以外は、実施例6と同様にして周期構造体（N-7）を得た。得られた周期構造体（N-6）の大きさは、直径30μm、長さ3mmであった。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液5μlを基板（Q-3）内に注入してAFP抗体を周期構造体（N-6）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-7）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-7）を得た。
フォトニック結晶（C-7）が基板（Q-3）に集積された状態でバイオセンサー（S-7）とした。
<Example 7>
Instead of the spherical slurry (P-1) (constituent unit (L)) water slurry (W030CA, manufactured by Moritex Corp.) diluted 10-fold with ultrapure water, the number average particle size is 300nm and the standard deviation is 1.3%. A periodic structure (N--) was used in the same manner as in Example 6 except that a water slurry (3300A, manufactured by Moritex Corporation) of spherical particles (P-3) mainly composed of polystyrene having a particle concentration of 1% by weight was used. 7) got. The obtained periodic structure (N-6) had a diameter of 30 μm and a length of 3 mm.
5 μl of AFP antibody-containing phosphate buffer at a concentration of 1 mg / ml was injected into the substrate (Q-3) to physically immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-6). Excess AFP antibody was washed away with a phosphate buffer, and the gap between the periodic structures (N-7) was filled with a phosphate buffer to obtain a photonic crystal (C-7).
The biosensor (S-7) was formed with the photonic crystal (C-7) integrated on the substrate (Q-3).
＜実施例8＞
基板（Q-4）に液量調整弁を設けた上部カバーを設置し、スピンコーター（1H360S、ミカサ社製）を使って1500Gの遠心力を加えた後、真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したもの0.1gを上部カバーのスラリー供給部からスピンコーターの中心の液溜に0.01g/分の速度で滴下してポリスチレン粒子を集積した。集積処理中において液量調整弁を開き、ポリスチレン粒子が完全に集積した後に溶媒が排出されるように設定した（図6参照）。
スラリーの供給終了10分後にスピンコーターを停止した後、上部カバーを外し、90℃にて3分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、周期構造体（N-8）得た。得られた周期構造体（N-8）の大きさは、幅10μm、長さ900μm、深さ12μmであった。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液3μlを基板（Q-4）内に注入してAFP抗体を周期構造体（N-8）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-8）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-8）を得た。
フォトニック結晶（C-8）が基板（Q-4）に集積された状態でバイオセンサー（S-8）とした。
<Example 8>
Install a top cover with a liquid level control valve on the substrate (Q-4), apply 1500G centrifugal force using a spin coater (1H360S, manufactured by Mikasa), and then add the spherical particles (P-3) 0.1 g of water slurry (3300A, manufactured by Moritex Corp.) diluted 10-fold with ultrapure water is dropped at a rate of 0.01 g / min from the slurry supply part of the top cover to the liquid reservoir at the center of the spin coater. Accumulated particles. During the accumulation process, the liquid amount adjustment valve was opened, and the solvent was discharged after the polystyrene particles were completely accumulated (see FIG. 6).
The spin coater was stopped 10 minutes after the completion of the slurry supply, and then the upper cover was removed, and heat treatment was performed at 90 ° C. for 3 minutes to immobilize the particles to obtain a periodic structure (N-8). The obtained periodic structure (N-8) had a width of 10 μm, a length of 900 μm, and a depth of 12 μm.
3 μl of AFP antibody-containing phosphate buffer at a concentration of 1 mg / ml was injected into the substrate (Q-4) to physically immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-8). Excess AFP antibody was washed away with a phosphate buffer, and the gap between the periodic structures (N-8) was filled with a phosphate buffer to obtain a photonic crystal (C-8).
The biosensor (S-8) was formed with the photonic crystal (C-8) integrated on the substrate (Q-4).
＜実施例9＞
基板（Q-4）の代わりに基板（Q-5）を使用する以外は実施例7と同様にして、フォトニック結晶（C-9）及びバイオセンサー（S-9）を得た。
得られた周期構造体（N-9）の大きさは、直径5μm、長さ5mmであった。
<Example 9>
A photonic crystal (C-9) and a biosensor (S-9) were obtained in the same manner as in Example 7 except that the substrate (Q-5) was used instead of the substrate (Q-4).
The obtained periodic structure (N-9) had a diameter of 5 μm and a length of 5 mm.
＜実施例10＞
固体物質（M）として光硬化性樹脂（ネガティブ・フォトレジストＳＵ−８、μリソグラフィーケミカル社製）を使用し、特開2004-126312に記載の方法に準拠してバルク状の固体物質（M）を直接加工することにより周期構造体（N-10）を作製した。
マルチビーム干渉パターンの記録に使用される三次元ホログラフィック記録装置として、レーザ光源から発生したフェムト秒レーザパルスのレーザビームを複数光束に分割する回折ビームスプリッタ（ＤＢＳ（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ ｂｅａｍ ｓｐｌｉｔｔｅｒ））を設置し、その回折ビームスプリッタ通過後のレーザビームの光路上に焦点距離が１７５ｍｍの色消しレンズと顕微鏡の対物レンズを設置し、色消しレンズと対物レンズの間に４光束を選択するためのアパーチャを設置した。
これらの光学機器を用い、まずレーザー光源で発生したフェムト秒レーザパルスビームを回折ビームスプリッタにより複数光束に分割し、回折ビームスプリッタの後方に配置された色消しレンズでそれら複数光束を平行方向に集光し、さらにその後方に設置されたアパーチャにより3次元干渉パターンを得るための４光束の選択を行った後、顕微鏡の対物レンズで４光束レーザビームを集光し、ＳＵ−８薄膜にそれらレーザビームを集光させ、４光束を干渉露光させた。
４光束のレーザパルスビームにより、ＳＵ−８薄膜中で４回対称（正方形）干渉パターンを形成した。露光には再生増幅器付のＴｉサファイア発振器（Ｔｓｕｎａｍｉ ＆ Ｓｐｉｔｆｉｒｅ， Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）で得られるフェムト秒レーザパルスを使用した。このレーザパルスの繰返し周波数は１ｋＨｚでありパルス幅は１５０ｆｓであって波長が８００ｎｍであった。また、フェムト秒レーザパルスの回折ビームスプリッタ（ＤＢＳ）の手前でのレーザパワーは２１０ｍＷであったが、ＳＵ−８薄膜の位置では３分の露光時間で１．７ｍＷであった。
光硬化性樹脂薄膜（ＳＵ−８薄膜）は、スピンコーターを使用して、ガラス基板上に５μｍの厚さで均一に形成した。その薄膜に対し露光前に事前焼付けを行い、レーザパルスビームを照射後、事後焼付けして光励起架橋反応を強化し、引き続いて現像を行うことにより非架橋領域を取り除き1辺20μm、厚さ5μm、構造周期が0.5μmの周期構造体（N-10）を得た（図1）。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液3μlを周期構造体（N-10）部に滴下してAFP抗体を表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-8）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-10）を得た。
フォトニック結晶（C-10）が光硬化生樹脂薄膜を作製する際に使用したガラス基板上に集積された状態でバイオセンサー（S-10）とした。
<Example 10>
Using a photocurable resin (negative photoresist SU-8, manufactured by μ Lithography Chemical Co., Ltd.) as the solid material (M), a bulk solid material (M) according to the method described in JP-A-2004-126312 The periodic structure (N-10) was fabricated by directly processing
As a three-dimensional holographic recording device used for recording multi-beam interference patterns, a diffraction beam splitter (DBS (diffractive beam splitter)) that splits a laser beam of a femtosecond laser pulse generated from a laser light source into a plurality of light beams is installed. An achromatic lens with a focal length of 175 mm and an objective lens of the microscope are installed on the optical path of the laser beam after passing through the diffraction beam splitter, and an aperture for selecting four light beams is installed between the achromatic lens and the objective lens. did.
Using these optical instruments, first, a femtosecond laser pulse beam generated by a laser light source is divided into a plurality of light beams by a diffraction beam splitter, and these light beams are collected in a parallel direction by an achromatic lens disposed behind the diffraction beam splitter. After selecting four light beams to obtain a three-dimensional interference pattern with an aperture disposed behind the light beam, the four light beam laser beam is condensed by an objective lens of a microscope, and the laser is applied to the SU-8 thin film. The beam was condensed and four beams were subjected to interference exposure.
A four-fold symmetrical (square) interference pattern was formed in the SU-8 thin film by using four laser beam beams. For the exposure, a femtosecond laser pulse obtained with a Ti sapphire oscillator with a regenerative amplifier (Tsunami & Spiritfire, Spectra Physics) was used. The repetition frequency of this laser pulse was 1 kHz, the pulse width was 150 fs, and the wavelength was 800 nm. The laser power before the diffraction beam splitter (DBS) of the femtosecond laser pulse was 210 mW, but at the position of the SU-8 thin film, it was 1.7 mW with an exposure time of 3 minutes.
The photocurable resin thin film (SU-8 thin film) was uniformly formed with a thickness of 5 μm on a glass substrate using a spin coater. Pre-baking to the thin film before exposure, after irradiating with a laser pulse beam, post-baking to enhance the photo-excited cross-linking reaction, followed by development to remove the non-cross-linked area 20μm per side, thickness 5μm, A periodic structure (N-10) with a structural period of 0.5 μm was obtained (Fig. 1).
3 μl of AFP antibody-containing phosphate buffer at a concentration of 1 mg / ml was dropped onto the periodic structure (N-10) part to physically immobilize the AFP antibody on the surface. Excess AFP antibody was washed away with a phosphate buffer, and the gap between the periodic structures (N-8) was filled with a phosphate buffer to obtain a photonic crystal (C-10).
A biosensor (S-10) was formed in a state where the photonic crystal (C-10) was integrated on the glass substrate used when the photocured raw resin thin film was produced.
＜実施例11＞
基板（Q-6）上に、一辺5mm×5mmの穴を開けた厚み1mmのシリコンゴムを設置し、シリコンゴムの穴の中に真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を濃縮して固形分濃度を10重量%としたものを25μL滴下し、室温で乾燥させることにより（P-3）を集積した(液架橋力による集積)。
90℃にて10分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、一辺5mm×5mm、厚み0.5mmのオパール構造からなる周期構造体（N-11）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-11）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-11）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-11）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-11）を得た。
フォトニック結晶（N-11）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-11）とした。
<Example 11>
On the substrate (Q-6), a 1mm thick silicon rubber with a 5mm x 5mm side hole was placed, and a spherical slurry (P-3) water slurry (3300A, Moritex Corp.) in the silicon rubber hole. The product (P-3) was accumulated by concentrating 25 μL of the product having a solid content concentration of 10% by weight and drying at room temperature (accumulation by liquid crosslinking force).
The particles were fixed by heat treatment at 90 ° C. for 10 minutes to obtain a periodic structure (N-11) composed of an opal structure having a side of 5 mm × 5 mm and a thickness of 0.5 mm.
The periodic structure (N-11) was immersed in a phosphate buffer containing AFP antibody at a concentration of 1 mg / ml to physically immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-11). Excess AFP antibody is washed away with phosphate buffer, and the space between periodic structures (N-11) is filled with phosphate buffer to provide a photonic crystal (C-11) with a side of 5mm x 5mm and a thickness of 0.4mm. Got.
A photonic crystal (N-11) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-11).
＜実施例12＞
周期構造体（N-11）の間隙に、シリカゾル（エタノール5ml、テトラエトキシシラン5ml、35％塩酸水溶液0.5ml、イオン水0.5mlを配合し、10時間室温にて攪拌して作成）を充填し、乾燥させた。乾燥して形成するシリカの厚みが、周期構造体（N-11）の厚みの80％になるまで、この充填・乾燥の操作を繰り返した。
シリカを充填した周期構造体（N-11）を基板（Q-6）と共に、500℃の電気炉にて2時間加熱処理して（P-3）を除去することにより、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-12）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-12）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-12）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-12）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-12）を得た。
フォトニック結晶（N-12）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-12）とした。
<Example 12>
Silica sol (mixed with 5 ml of ethanol, 5 ml of tetraethoxysilane, 0.5 ml of 35% hydrochloric acid aqueous solution and 0.5 ml of ionic water, and stirred for 10 hours at room temperature) is filled in the gap between the periodic structures (N-11). , Dried. This filling / drying operation was repeated until the thickness of the silica formed by drying reached 80% of the thickness of the periodic structure (N-11).
The periodic structure (N-11) filled with silica is heated together with the substrate (Q-6) in an electric furnace at 500 ° C. for 2 hours, and (P-3) is removed. A periodic structure (N-12) having an inverse opal structure with a thickness of 0.4 mm was obtained.
The periodic structure (N-12) was immersed in a phosphate buffer containing AFP antibody at a concentration of 1 mg / ml to physically immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-12). Excess AFP antibody is washed away with phosphate buffer, and the gap between periodic structures (N-12) is filled with phosphate buffer to allow photonic crystals (C-12) with a side of 5mm x 5mm and a thickness of 0.4mm Got.
A photonic crystal (N-12) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-12).
＜実施例13＞
基板（Q-6）上に、一辺5mm×5mmの穴を開けた厚み1mmのシリコンゴムを設置し、シリコンゴムの穴の中にシリカからなる真球状微粒子（P-4）の水スラリー（粒径300nm、Cv3％、固形分濃度10重量％）を70μL滴下し、室温で乾燥させることにより（P-4）を集積した。
200℃にて30分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのオパール構造からなる周期構造体（N-13）を得た。
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に反応させて、周期構造体（N-13）の表面にAFP抗体を固定化した後、リン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-13）を得た。
フォトニック結晶（N-13）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-13）とした。
<Example 13>
On the substrate (Q-6), a 1 mm thick silicon rubber with a 5 mm x 5 mm side hole is placed, and a water slurry (particles of spherical particles (P-4) made of silica is placed in the silicon rubber hole. (P-4) was accumulated by dropping 70 μL of a particle having a diameter of 300 nm, Cv 3%, and a solid concentration of 10% by weight, and drying at room temperature.
The particles were fixed by heat treatment at 200 ° C. for 30 minutes to obtain a periodic structure (N-13) composed of an opal structure having a side of 5 mm × 5 mm and a thickness of 0.4 mm.
In the same manner as in the preparation of (LX-1), 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide and AFP antibody were reacted in this order to immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-13) Thereafter, a photonic crystal (C-13) having a side of 5 mm × 5 mm and a thickness of 0.4 mm was obtained by filling with a phosphate buffer.
A photonic crystal (N-13) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-13).
＜実施例14＞
周期構造体（N-13）の上部に基板（Q-6）をもう一枚のせて粘着テープにて基板（Q-6）と周期構造体（N-13）とを完全に密着させて、その間隙にスチレンモノマー及びアゾビスイソブチロニトリルを充填した。60℃、窒素雰囲気下にて20時間重合を行いポリスチレンを充填した周期構造体（N-14）を得た。これをフッ酸水溶液に2日間浸漬して、（P-4）及び基板(Q-6)を溶解除去して、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-14）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-14）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-14）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-14）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-14）を得た。
フォトニック結晶（N-14）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-14）とした。
<Example 14>
Place another substrate (Q-6) on top of the periodic structure (N-13) and attach the substrate (Q-6) and periodic structure (N-13) completely with adhesive tape. The gap was filled with styrene monomer and azobisisobutyronitrile. Polymerization was performed at 60 ° C. in a nitrogen atmosphere for 20 hours to obtain a periodic structure (N-14) filled with polystyrene. This is immersed in a hydrofluoric acid aqueous solution for 2 days, and (P-4) and the substrate (Q-6) are dissolved and removed to form a periodic structure (N- 14)
The periodic structure (N-14) was immersed in a phosphate buffer containing AFP antibody at a concentration of 1 mg / ml to physically immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-14). Excess AFP antibody is washed away with phosphate buffer, and the gap between periodic structures (N-14) is filled with phosphate buffer to allow photonic crystals (C-14) with a side of 5mm x 5mm and a thickness of 0.4mm Got.
A photonic crystal (N-14) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-14).
＜実施例15＞
基板（Q-7）の片端から2cmを、真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）に2日間浸漬することにより、浸漬していない片端に厚み0.3mm、幅1mm、長さ5mmのオパール構造からなる周期構造体（N-15B）（90℃で10分間の熱処理を行った）を得た。
以降の操作は実施例12と同様にして、厚み0.3mm、幅1mm、長さ5mmのシリカを固体物質（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N-15）、及びフォトニック結晶（C-15）を得た。
フォトニック結晶（N-15）が基板（Q-7）内にある状態でバイオセンサー（S-15）とした。
<Example 15>
2cm from one end of the substrate (Q-7) is immersed in an aqueous slurry of spherical particles (P-3) (3300A, manufactured by Moritex Corp.) for 2 days. As a result, a periodic structure (N-15B) composed of an opal structure having a length of 5 mm (heat treated at 90 ° C. for 10 minutes) was obtained.
Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 12, and a periodic structure (N-15) having a reverse opal structure in which silica having a thickness of 0.3 mm, a width of 1 mm, and a length of 5 mm was used as a solid substance (M), and a photonic crystal (C-15) was obtained.
A biosensor (S-15) was formed with the photonic crystal (N-15) in the substrate (Q-7).
＜実施例16＞
シリカゾルに代えて、チタニアゾル（作成方法は同じ）を使用する以外は、実施例12と同様にして、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのチタニアを固体物質（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N-16）、及びフォトニック結晶（C-16）を得た。
フォトニック結晶（N-16）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-16）とした。
<Example 16>
Instead of silica sol, except for using titania sol (the production method is the same), in the same manner as in Example 12, a cycle comprising an inverted opal structure in which titania having a side of 5 mm × 5 mm and a thickness of 0.4 mm is a solid substance (M) A structure (N-16) and a photonic crystal (C-16) were obtained.
A photonic crystal (N-16) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-16).
＜実施例17＞
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に反応させて、周期構造体（N-15）の表面にAFP抗体を固定化した以外は、実施例12と同様にして周期構造体（N-15X）、及びフォトニック結晶（C-17）を得た。
フォトニック結晶（C-17）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-17）とした。
<Example 17>
In the same manner as in the production of (LX-1), 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide and AFP antibody were reacted in this order to immobilize the AFP antibody on the surface of the periodic structure (N-15). Except for this, the periodic structure (N-15X) and photonic crystal (C-17) were obtained in the same manner as in Example 12.
A photonic crystal (C-17) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-17).
＜実施例18＞
液架橋力による集積の代わりに、遠心力による集積とする以外は実施例11と同様にして周期構造体（N-18B）を得た。
以降の操作は実施例12と同様にして、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-18）、及びフォトニック結晶（C-18）を得た。
フォトニック結晶（N-18）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-18）とした。
<Example 18>
A periodic structure (N-18B) was obtained in the same manner as in Example 11 except that accumulation by centrifugal force was used instead of accumulation by liquid crosslinking force.
Subsequent operations were carried out in the same manner as in Example 12 to obtain a periodic structure (N-18) having a reverse opal structure having a side of 5 mm × 5 mm and a thickness of 0.4 mm, and a photonic crystal (C-18).
A photonic crystal (N-18) was placed on the substrate (Q-6) to form a biosensor (S-18).
表１〜３に作成したバイオセンサー（S-1）〜（S-18）の一覧表を示した。 Tables 1 to 3 show a list of biosensors (S-1) to (S-18) created.
＜実施例19＞
被検体（A-b1〜3）100μlに、AFP抗体濃度を50.0ng/mlに調整したリン酸緩衝液（AFP抗原リン酸緩衝液）100μlを添加混合して試験サンプルAFPb1、AFPb2、AFPb3を作製した。
顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）を使用して、バイオセンサー（S-1）の1本のフォトニック結晶（C-1）における反射スペクトル（RS）を測定した（ブランク測定）。RSのピークは波長710.0nmに観測された。ここで1本のフォトニック結晶（C-1）とは、基板（Q-2）に形成された溝1個に集積された周期構造体(N-1)から構成されるフォトニック結晶（C-1）を意味し、以下の全ての処理及び測定は、この1本のフォトニック結晶（C-1）について行う（以下、フォトニック結晶（C-1）と称する）。
フォトニック結晶（C-1）の片端から、マイクロシリンジを使用して、試験サンプルAFPb1を1μl注入し、固定化したAFP抗体と試験サンプルAFPb1中のAFP抗原（ターゲット物質（Y））とを反応させた。ここで試験サンプルAFPb1はフォトニック結晶（C-1）の中を通過して、もう一方の片端より排出される。試験サンプルAFPb1の注入終了後、リン酸緩衝液5μlを注入して、AFP抗原以外の未反応の蛋白質等を洗浄除去した後、リン酸緩衝液を再び充填した。
ブランク測定と同様にRSを測定した。RSのピークは、波長714.0 nmに観測された。同様の操作を試験サンプルAFPb2、AFPb3についても行ない（ブランクのRSのピークはいずれも波長710.0nmに観測された）、それぞれ波長713.8、713.7nmにRSのピークが観測された。ここで使用したバイオセンサー（S1）は同一のものであって、同一基板（Q）上の異なるフォトニック結晶（C-1）を使用して測定を行った。
検量線を作製して、各試験サンプル中におけるAFP抗原濃度を決定した結果、試験サンプルAFPb1が25.5ng/ml、試験サンプルAFPb2が25.2ng/ml、試験サンプルAFPb3が25.1ng/mlであった。
AFP抗原リン酸緩衝液の濃度を減少させて、前述と同様の条件にて、検出下限濃度を決定した。検出下限濃度は、RSピークのシフト量（ターゲット物質（Y）との反応後のRSピーク波長から、ブランク測定のRSピーク波長を引いた値）が観測不可能になる濃度、具体的にはシフト量が0.1nmとなる濃度とした。
バイオセンサー（S-1）の検出下限濃度（ng/ml）は0.05であった。
<Example 19>
Test samples AFPb1, AFPb2, and AFPb3 are prepared by adding 100 μl of phosphate buffer (AFP antigen phosphate buffer) adjusted to 50.0 ng / ml to 100 μl of the subject (A-b1-3). did.
Using a micro-UV-visible spectrophotometer MSV-350 (manufactured by JASCO), the reflection spectrum (RS) of one photonic crystal (C-1) of the biosensor (S-1) was measured (blank) Measurement). The RS peak was observed at a wavelength of 710.0 nm. Here, one photonic crystal (C-1) is a photonic crystal (C-1) composed of a periodic structure (N-1) integrated in one groove formed in the substrate (Q-2). -1), and all the following processes and measurements are performed on this single photonic crystal (C-1) (hereinafter referred to as photonic crystal (C-1)).
Using a microsyringe, 1 μl of test sample AFPb1 is injected from one end of photonic crystal (C-1), and the immobilized AFP antibody reacts with AFP antigen (target substance (Y)) in test sample AFPb1. I let you. Here, the test sample AFPb1 passes through the photonic crystal (C-1) and is discharged from the other end. After the injection of the test sample AFPb1, 5 μl of a phosphate buffer was injected to wash away unreacted proteins other than the AFP antigen, and then the phosphate buffer was filled again.
RS was measured in the same manner as the blank measurement. The RS peak was observed at a wavelength of 714.0 nm. The same operation was performed for test samples AFPb2 and AFPb3 (both blank RS peaks were observed at a wavelength of 710.0 nm), and RS peaks were observed at wavelengths of 713.8 and 713.7 nm, respectively. The biosensor (S1) used here was the same, and measurements were performed using different photonic crystals (C-1) on the same substrate (Q).
As a result of preparing a calibration curve and determining the AFP antigen concentration in each test sample, the test sample AFPb1 was 25.5 ng / ml, the test sample AFPb2 was 25.2 ng / ml, and the test sample AFPb3 was 25.1 ng / ml.
The concentration of the AFP antigen phosphate buffer was decreased, and the lower detection limit concentration was determined under the same conditions as described above. The detection lower limit concentration is the concentration at which the RS peak shift amount (the value obtained by subtracting the RS peak wavelength of the blank measurement from the RS peak wavelength after reaction with the target substance (Y)) cannot be observed. The concentration was such that the amount was 0.1 nm.
The detection lower limit concentration (ng / ml) of the biosensor (S-1) was 0.05.
＜実施例20＞
被検体（A-b1〜3）10μlに、CEA抗体濃度を50ng/mlに調整したリン酸緩衝液（CEA抗原リン酸緩衝液）10μlを添加混合して試験サンプルCEAb1、CEAb2、CEAb3を作製した。
バイオセンサー（S-2）を使用し、実施例19と同様にして、試験サンプルCEAb1、CEAb2、CEAb3中のCEA濃度の定量を行った。それぞれ、波長709.6、709.3、709.2nmにRSのピークが観測された（ブランクのRSスペクトルピークは、いずれも波長705.9 nmに観測された）。
検量線を作製して、各試験サンプル中におけるCEA抗原濃度を決定した結果、試験サンプルCEAb1が25.3ng/ml、試験サンプルCEAb2が25.1ng/ml、試験サンプルCEAb3が25.1ng/mlであった。
実施例19と同様にして、検出下限濃度の測定を行った。
<Example 20>
Test samples CEAb1, CEAb2, and CEAb3 were prepared by adding 10 μl of phosphate buffer (CEA antigen phosphate buffer) adjusted to a CEA antibody concentration of 50 ng / ml to 10 μl of the subject (A-b1-3). .
Using the biosensor (S-2), the CEA concentration in the test samples CEAb1, CEAb2, and CEAb3 was quantified in the same manner as in Example 19. RS peaks were observed at wavelengths of 709.6, 709.3, and 709.2 nm, respectively (all blank RS spectrum peaks were observed at a wavelength of 705.9 nm).
As a result of preparing a calibration curve and determining the CEA antigen concentration in each test sample, the test sample CEAb1 was 25.3 ng / ml, the test sample CEAb2 was 25.1 ng / ml, and the test sample CEAb3 was 25.1 ng / ml.
In the same manner as in Example 19, the detection lower limit concentration was measured.
＜実施例21＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-3）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 21>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-3).
＜実施例22＞
バイオセンサー（S-4）を使用し、実施例19と同様にして、被検体（A-4）の定量を行った。波長720.0nmにRSのピークが観測された（ブランクのRSスペクトルピークは、波長718.5 nmに観測された）。
検量線を作製して、被検体（A-4）中における相補的DNAの濃度を決定した結果、20.0ng/mlであり、予め調整した濃度と一致した。
実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 22>
Using the biosensor (S-4), the analyte (A-4) was quantified in the same manner as in Example 19. An RS peak was observed at a wavelength of 720.0 nm (a blank RS spectrum peak was observed at a wavelength of 718.5 nm).
A calibration curve was prepared and the concentration of complementary DNA in the subject (A-4) was determined. As a result, it was 20.0 ng / ml, which coincided with the concentration adjusted in advance.
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19.
＜実施例23＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-5）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、実施例19の1本のフォトニック結晶は、基板（Q-1）に形成された穴1個に集積された周期構造体(N-5)から構成されるフォトニック結晶（C-5）を意味する。また、抗原抗体反応等は、試料サンプルをフォトニック結晶（C-5）表面に直接滴下することにより行なった。
<Example 23>
The lower detection limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-5).
One photonic crystal of Example 19 is a photonic crystal (C-5 composed of a periodic structure (N-5) integrated in one hole formed in the substrate (Q-1). ). The antigen-antibody reaction and the like were performed by directly dropping a sample sample on the surface of the photonic crystal (C-5).
＜実施例24＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-6）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 24>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-6).
＜実施例25＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-7）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 25>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-7).
＜実施例26＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-8）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 26>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-8).
＜実施例27＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-9）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 27>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-9).
＜実施例28＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-10）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、抗原抗体反応等は、試料サンプルをフォトニック結晶（C-10）表面に直接滴下することにより行った。
<Example 28>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 19 except that the biosensor was a biosensor (S-10).
The antigen-antibody reaction and the like were performed by directly dropping a sample sample on the surface of the photonic crystal (C-10).
＜実施例29＞
試験サンプル100μlを、バイオセンサー（S-11）のフォトニック結晶部（C-11）に滴下(或いはフォトニック結晶を試験サンプルに浸漬)する以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、実施例19の1本のフォトニック結晶は、基板（Q-6）に形成されたフォトニック結晶（C-11）を意味する。
<Example 29>
100 μl of the test sample was dropped to the photonic crystal part (C-11) of the biosensor (S-11) (or the photonic crystal was immersed in the test sample), and the detection lower limit concentration was adjusted in the same manner as in Example 19. Measurements were made.
One photonic crystal of Example 19 means a photonic crystal (C-11) formed on the substrate (Q-6).
＜実施例30＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-12）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 30>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-12).
＜実施例31＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-13）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 31>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-13).
＜実施例32＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-14）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 32>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-14).
＜実例33＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-15）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 33>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-15).
＜実施例34＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-16）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 34>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-16).
＜実施例35＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-17）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 35>
The lower detection limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-17).
＜実施例36＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-18）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
<Example 36>
The detection lower limit concentration was measured in the same manner as in Example 29 except that the biosensor was a biosensor (S-18).
＜比較例1＞
表面プラズモンセンサーを使用して、試験サンプルAFPb1〜AFPb3の測定を行った。
表面プラズモンセンサーとしてはビアコアX（ビアコア社製）、センサーチップとしてCM5（ビアコア社製）を使用した。構成単位（L-1）の作製の場合と同様にして、CM5の表面にAFP抗体を固定化した。具体的には、1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドでカルボキシル基を活性化した後、AFP抗体を含有するリン酸緩衝液を加えて室温で2時間反応させることにより固定化した。
ビアコアXによれば、洗浄処理や試料サンプルの供給、表面プラズモンシグナルの観測等は、全て自動で行われる。ビアコアセンサーグラムは、センサーチップ表面の質量変化（縦軸）と質量の時間変化（横軸）を測定データーとして表示し、質量変化量が平衡になった時点の質量変化量からターゲット物質の定量を行うものである。
試料サンプルは、1分間に20μlの速度で5分間供給し、合計100μl必要であった。
まず、実施例のバイオセンサーと同一のAFP抗原量を供給して検出感度を比較するために、試料サンプルAFPb1〜AFPb3をリン酸緩衝液にて100倍に希釈して供給した。その結果、明確な質量変化が観測されず（センサーグラムが作製できない）、測定不可能であった。
次に、試料サンプルAFPb1〜AFPb3を100μlそれぞれ供給し、同様に測定を行ったところ、質量変化が観測され、その平衡点から試験サンプルAFPb1、AFPb2、AFPb3いずれも25ng/mlという定量結果が得られた。
実施例の場合と同様に、AFP抗原リン酸緩衝液の濃度を増減させて、前述と同様の条件にて、検出下限濃度（ng/ml）を決定した。
<Comparative Example 1>
Test samples AFPb1 to AFPb3 were measured using a surface plasmon sensor.
Biacore X (Biacore) was used as the surface plasmon sensor, and CM5 (Biacore) was used as the sensor chip. The AFP antibody was immobilized on the surface of CM5 in the same manner as in the production of the structural unit (L-1). Specifically, after activating the carboxyl group with 1-ethyl-3dimethylaminopropylcarbodiimide, a phosphate buffer containing an AFP antibody was added and immobilized at room temperature for 2 hours.
According to Biacore X, cleaning processing, sample sample supply, surface plasmon signal observation, etc. are all performed automatically. The Biacore sensorgram displays the change in mass (vertical axis) and temporal change in mass (horizontal axis) on the sensor chip surface as measurement data, and quantifies the target substance from the mass change when the mass change is in equilibrium. Is what you do.
Sample samples were delivered for 5 minutes at a rate of 20 μl per minute, requiring a total of 100 μl.
First, in order to supply the same amount of AFP antigen as in the biosensor of Example and compare detection sensitivity, sample samples AFPb1 to AFPb3 were diluted 100 times with a phosphate buffer and supplied. As a result, no clear mass change was observed (a sensorgram could not be prepared), and measurement was impossible.
Next, when 100 μl each of sample samples AFPb1 to AFPb3 was supplied and measured in the same manner, a change in mass was observed, and from the equilibrium point, a quantitative result of 25 ng / ml was obtained for all test samples AFPb1, AFPb2, and AFPb3. It was.
As in the case of the example, the concentration of AFP antigen phosphate buffer was increased or decreased, and the lower detection limit concentration (ng / ml) was determined under the same conditions as described above.
表４〜７に作成したバイオセンサー（S-1）〜（S-18）、比較例の表面プラズモンセンサーを使用した場合の検出評価結果を示した。
バイオセンサー（S-1）〜（S-10）は、検出部であるフォトニック結晶が極めて微細であるため、必要な試験サンプル量はいずれも1μlと極微量であり、かつ、検出下限濃度は5ng/ml以下であった。比較例の表面プラズモンセンサーよりも、ターゲット物質（Y）絶対量あたりの検出感度で数十倍高く、試験サンプル量を100μlとして表面プラズモンセンサーで測定した場合においても、検出感度は2〜10倍も優れていた。
バイオセンサー（S-11）〜（S-18）の検出感度も、表面プラズモンセンサーよりも高く、特に逆オパール構造の周期構造体からなるフォトニック結晶を有するバイオセンサーは検出感度が高かった。
Tables 4 to 7 show detection evaluation results when the biosensors (S-1) to (S-18) and the surface plasmon sensor of the comparative example were used.
Biosensors (S-1) to (S-10) have extremely fine photonic crystals, which are the detection parts. Therefore, the required test sample volume is as small as 1 μl, and the detection lower limit concentration is It was less than 5 ng / ml. Compared with the surface plasmon sensor of the comparative example, the detection sensitivity per target substance (Y) absolute amount is several tens of times higher, and even when the test sample volume is 100 μl and measured with the surface plasmon sensor, the detection sensitivity is 2 to 10 times higher It was excellent.
The detection sensitivity of the biosensors (S-11) to (S-18) was also higher than that of the surface plasmon sensor, and in particular, the biosensor having a photonic crystal composed of a periodic structure with an inverted opal structure had high detection sensitivity.
本発明のバイオセンサーは、新たなセンシング原理を取入れた極めて検出感度の高いバイオセンサーとして様々な用途に使用することができる。特に、蛋白質解析、遺伝子解析等の研究用途や、腫瘍検査、ウイルス検査等の臨床検査用途に好適である。 The biosensor of the present invention can be used in various applications as a biosensor with extremely high detection sensitivity that incorporates a new sensing principle. It is particularly suitable for research use such as protein analysis and gene analysis, and clinical test use such as tumor test and virus test.
Ｑ：基板（テンプレート）
Ｃ：上部カバー
ＳＱ：スピンコーター基板
ＤＩ：溝部
ＰＩＮ：固定用ビス
ＶＡ：液量調整部（調整弁）
ＱＳ：基板装着部
ＷＩ：粒子スラリー供給部
ＷＰ：粒子スラリー溜
ＣＷ：溶媒蒸発防止カバー
ＯＲ：オーリング
Q: Substrate (template)
C: Upper cover SQ: Spin coater substrate DI: Groove PIN: Fixing screw VA: Liquid amount adjusting unit (regulating valve)
QS: substrate mounting part WI: particle slurry supply part WP: particle slurry reservoir CW: solvent evaporation prevention cover OR: O-ring
Claims (7)
A photonic crystal (C) composed of a periodic structure (N) composed of a solid substance (M) that is insoluble in an aqueous medium is used as a main component, and a specific binding substance (X ) Or a specific binding substance (X) is immobilized on the surface of the structural unit (L) of the periodic structure (N), and the target substance (Y ) Containing the analyte (A), the target substance (Y) and the specific binding substance (X) contained in the analyte (A) are bound, and the biosensor (S) and the analyte (A The target material is characterized by detecting the target material (Y) by comparing the peak wavelength of the reflection spectrum obtained by irradiating the photonic crystal (C) with an electromagnetic wave of a specific wavelength before and after contacting (Y) detection method.
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