KR101510828B1 - 식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열 ~ 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 군에서 선택되는 염기서열을 갖는, ibAGP1 프로모터와 SRD1 프로모터가 연결된 식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 식물체 전신 고 발현벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체의 전 조직에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 식물체 전신 고 발현 프로모터는 쌍자엽 식물의 전 조직에서 외래유전자의 고발현을 유도한다. 따라서 형질전환체 제작 시 항생제 혹은 제초제 저항성 유전자를 이용한 형질전환체 선발 및 의료, 산업용 유용 물질 생산 형질전환 식물체 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터{Chimeric promoter for directing strong universal expression in plants}

본 발명은 식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 쌍자엽 식물체의 뿌리를 포함한 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도하는 재조합 프로모터 염기서열, 상기 염기서열을 포함하는 쌍자엽 식물체 전신 고 발현 플라스미드 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 쌍자엽 식물체의 전 조직에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.

작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다.

이러한 작물분자육종 기술을 이용한 유전자변형 작물의 재배면적과 재배양이 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있으며, 2009년 현재 유전자 변형 작물의 재배 국가는 미국, 브라질, 아르헨티나, 인도, 중국 등을 비롯하여 총 25개국이 되었으며, 유전자 변형 작물의 재배면적 및 재배량이 지속적으로 증가하고 있는 실정이며, 실제로 2008년에 비해서 2009년에는 약 7%인 9백만 헥타아르의 재배 면적이 증가한 것으로 나타났다.

상업화된 유전자변형 신종자의 세계 시장 규모는 2002년 40억 달러에서 2010년 100억 달러(종자와 기술료 포함)로 전체 세계 종자 시장규모 300억 달러 대비 15% 수준이며 종류로는 대두, 옥수수, 면화, 유채가 주시장을 형성하고 있다. 유전자변형 작물의 향후 시장 규모에 대한 전망은 장기적으로 유전자변형 작물 시장이 바이오산업에서 가장 큰 영역을 차지할 것이라고 예측하면서 2020년 시장규모를 Astra- Zeneca 등 생명과학 기업들은 750억 달러, 일본의 미쓰비시 연구소는 1,375억 달러에 달할 것으로 전망하였다. 이와 함께 유전자 변형 가공식품도 2010년 1,360억 달러, 2020년에는 1,590억 달러의 거대 시장을 형성하여 21세기 최대의 바이오산업으로 부상할 것으로 예측하였다.

유전자변형 작물의 효과를 극대화하기 위해서는 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 가장 효과적으로 조절할 수 있어야하며 이를 위해 다양한 프로모터의 개발이 이루어져야 한다. 이에 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)의 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라고는 가능성이 제시되고(Hohn et al., 1982, Curr . Topics Microbiol . Immunol . 96: 193-236), 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀지고(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), 식물체내에서 강한 발현이 증명되었다(Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58). 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 항상성 (universal) 프로모터가 되었다.

이 후 아그로박테리움 유래 opine synthase 프로모터가 개발되었다 (Bevan et al., 1983, Nature 304: 184-187). 근래에는 형질전환 식물체 제작 시 식물 유래의 프로모터 사용에 대한 사회적인 요구가 지속적으로 있어왔으며, 이에 식물 유래 쌍자엽 식물용 항상성 프로모터 개발이 이루어져 왔다. 애기장대 ubiquitin 프로모터 (Callis et al., 1990, Journal of Biological Chemistry, 265: 12486-12493), 담배 식물의 NeIF-4A 프로모터 (Mandel et al., 1995, Plant Molecular Biology, 29: 995-1004), 애기장대 actin 프로모터 (An et al., 1996, Plant Journal, 10: 107-121), 담배식물 tCUP 프로모터 (Foster et al., 1999, Plant Molecular Biology, 41: 45-55; Wu et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265: 763-770; Malik et al., 2002, Theor Appl Genet, 105: 505-514) 등이 개발되어왔다.

하지만 식물 유래의 쌍자엽용 항상성 프로모터는 여전히 부족한 상황으로 쌍자엽용 항상성 프로모터의 개발에 대한 요구가 지속적으로 있어왔다. 본 발명자들에서 개발한 고구마 유래 ibAGP1 프로모터는 쌍자엽 식물의 지상부 조직에서 강한 활성을 보이는 항상성 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0604191 호(2006.07.25)이며, ibAGP1 유전자의 전분체 타겟팅 염기서열과 함께 사용할 경우 식물의 지상부 각 조직에서 CaMV35S 프로모터를 능가하는 활성을 보인다 (Kwak et al., 2007, Plant Cell Reports, 26: 1253-1262; 대한민국 등록특허 제10-0542053호 (2006.01.12)). 하지만 뿌리 조직에서는 그 활성이 매우 약하여 CaMV35S 프로모터에 훨씬 못 미치는 활성을 보이는 문제점이 있었다.

본 발명의 배경이 되는 기술로, 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-1259682호 (2013.05.02)에 미세조류 유래 베타카로틴 케톨레이제(ketolase) 유전자 및 이를 이용한 케토형 카로티노이드 생산과 동시에 베타카로틴 증산하는 형질전환 식물체 제조 방법에 대해 개시한 바가 있고, 대한민국 등록특허 제10-1260565호 (2013.05.06)에 고구마 유래 SRD1 유전자의 cDNA, 상기 cDNA을 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 생산한 뿌리작물 등의 형질전환 식물체에 대해 개시한 바 있다. 그러나, ibAGP1 프로모터를 포함하여 뿌리를 포함한 쌍자엽 식물의 전 조직에서 강한 발현을 유도하는 것에 대해 알려진 바는 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-0604191호 (2006.07.25) 대한민국 등록특허 제10-0542053호 (2006.01.12) 대한민국 등록특허 제10-1259682호 (2013.05.02) 대한민국 등록특허 제10-1260565호 (2013.05.06)

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 기 개발된 ibAGP1 프로모터의 뿌리 조직에서 활성을 증가시켜 쌍자엽 식물체의 뿌리를 포함한 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도하는 재조합 프로모터의 염기서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 의한 재조합 프로모터를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터 및 이에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 ~ 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 군에서 선택되는 하나의 염기서열을 갖는, ibAGP1 프로모터와 SRD1 프로모터가 연결된 식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터를 제공한다.

바람직하게, 상기 재조합 프로모터는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.

바람직하게, 상기 식물체는 쌍자엽 식물체인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 재조합 프로모터를 포함하는 형질전환용 발현벡터를 제공한다.

바람직하게, 상기 발현벡터는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 재조합 프로모터가 pBGWFS7.0에 도입된 형질전환용 발현벡터이다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 고구마 유래 ibAGP1 프로모터의 5' 말단 부위에 SRD1 프로모터를 융합시켜 재조합 프로모터를 제작하였으며 배추식물에 일시적 발현 및 애기장대 형질전환체에서 동일 프로모터의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 ~ 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 군에서 선택되는 하나의 염기서열을 갖는, ibAGP1 프로모터와 SRD1 프로모터가 연결된 식물체 전신 고 발현 재조합 프로모터를 제공한다.

본 발명에 있어, '프로모터(promoter)'란, 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 바람직하게 본 발명에 따른 프로모터는 전 조직에서 발현하는 재조합 프로모터이다. 따라서, 본 발명에 의한 상기 프로모터는 식물체 전 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도시킬 수 있다.

본 발명에 의한 재조합 프로모터는 상기 두 개의 프로모터의 4가지 조합을 이용할 수 있다 (도 1). ibAGP1 프로모터는 그 활성이 높으며 당 처리에 의해 프로모터 활성이 가장 높게 유도되는 전체 크기(1976 bp)의 프로모터와 전분체 타겟팅 염기서열 (TP)가 연결되어 있는 ibAGP1 프로모터를 이용한다. 한편, SRD1 프로모터는 3-kb 전체에 뿌리 특이 발현 조절 인자가 산재해 있을 것으로 추정되는 결손 프로모터 결과 (Noh et al., 2012, Transgenic Research, 21: 265-278)를 바탕으로 SRD1의 활성이 높게 나타나는 전체 크기(-2801~+209; 2801 bp SRD1 프로모터 + 209 bp 5' 비번역 부위)와 최소 크기(-321~+209; 321 bp SRD1 프로모터 + 209 bp 5' 비번역 부위), 그리고 ROOT MOTIF가 다량 산재되어 있는 부위(-2088 ~ -1543)를 선정하여 ibAGP1의 프로모터에 연결함으로써 새로운 재조합 프로모터 합성을 완성할 수 있다.

재조합 프로모터 제작 시에 ibAGP1 프로모터를 3' 방향에 그리고 SRD1 결손 프로모터들을 5' 방향에 위치하게 제작한다. 즉 4 가지의 종류가 다른 합성 프로모터 C1, C2, C3, C4를 제작할 수 있는데, C1은 SRD1 (-2801 ~ +209) + ibAGP1 (-1909 ~ +67) (서열번호 1), C2는 SRD1 (-321 ~ +209) + ibAGP1(-1909 ~ +67)(서열번호 2), C3는 SRD1(-2088 ~ -1543) + ibAGP1(-1909 ~ +67)(서열번호 3), C4는 SRD1(-2801 ~ +209) + ibAGP1[(-1909 ~ +67) + TP1](서열번호 4)의 프로모터들로 구성되어 있다 (도 1).

본 발명에 의한 상기 프로모터는 기존의 ibAGP1 프로모터의 뿌리 조직에서 약한 활성을 보완하여 쌍자엽 식물에서 뿌리를 포함한 모든 조직에서 목적 유전자의 강한 발현을 유도시킬 수 있다.

바람직하게, 상기 재조합 프로모터는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열을 갖으며, 더욱 바람직하게 서열번호 2의 염기서열을 갖는 재조합 프로모터(C2)이다. 상기 C2 프로모터는 기존의 ibAGP1 프로모터의 5' 말단 부위에 SRD1 프로모터의 일부분 (-321 ~ +209)을 연결시킨 것으로 발현유도 효율이 가장 우수하다.

본 발명의 식물체 전 조직 고 발현 재조합 프로모터는 상기 서열번호 1 ~ 서열번호 4의 염기서열뿐만 아니라 상기 염기서열의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서 전 조직 특이적 프로모터 활성을 나타내는 염기서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물체이고, 상기 쌍자엽 식물은 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채일 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 프로모터를 포함하는 형질전환용 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게 본 발명은 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 식물체의 전 조직 고 발현 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어, '발현 벡터'란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 전 조직 고 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

본 발명에 있어, '작동 가능하게 연결(operably linked)' 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 재조합 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 pBI101 벡터 및 pBGWFS7.0를 이용하여 C2::GUS 발현벡터를 제조하였다.

본 발명에 있어서, '목적 단백질'이란 본 발명의 프로모터에 의해 식물체의 전 조직에서 고 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질을 말하며, 바람직하게는 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 GUS가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBI101 또는 pBGWFS7.0에 본 발명의 애기장대 재조합 프로모터를 GUS 유전자의 상류부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터 C2::GUS를 제조하였다. 상기 외래 유전자는 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.

나아가 본 발명의 식물체 전 조직 고 발현 프로모터의 전사활성에 의하여 발현되는 목적 단백질 유전자의 예로는, 형질전환 대상 식물체가 유채, 들깨 및 참깨 등의 유지작물인 경우 지방산 생합성 및 조절 관련 유전자 등을 들 수 있고, 단백질의 생성 및 축적량이 다른 식물에 비해 상대적으로 높은 콩 및 알팔파 등의 두과식물인 경우 경제적으로 부가가치가 높은 항체 유전자 등을 들 수 있고, 사료작물로 대표적인 옥수수의 경우 돼지 설사병, 구제역 바이러스 등의 경구 백신(edible vaccine) 유전자 등을 들 수 있고, 뿌리로 장기간 보관, 유통되는 대부분의 작물의 경우 수확 후 저장성을 높이도록 각종 병 저항성에 관련된 유전자 등을 들 수 있으며, 그 외에도 토코페롤, 베타카로틴 등과 같이 특정 영양 성분을 작물의 뿌리에서 강화하려는 경우에는 관련 물질대사경로의 생합성 유전자 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되지 않고, 본 발명의 전 조직 고 발현 프로모터를 사용하여 조절될 수 있는 각종 목적 단백질을 코딩하는 유전자들이 포함될 수 있다.

그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 전 조직을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 전 조직에서 발현시킴으로써 식물체와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다. 또는, 식물체 내에서 생산된 목적 단백질을 당업계에 알려진 적절한 방법에 따라 추출하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물세포 및 식물체를 제공한다. 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 식물 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 식물 세포내로 도입하는 방법으로는, 제한 없이 당해 공지된 방법이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 염화칼슘(CaCl₂) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등과 같은 방법들이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 식물발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 전 조직에서 고발현시키는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 1) 서열번호 1 ~ 4의 염기서열 중 하나의 염기서열을 갖는 재조합 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및 2) 상기 형질전환된 식물체의 전 조직 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.

상술한 바와 같이 본 발명은 재조합 프로모터에 관한 것으로서 이는 쌍자엽 식물의 뿌리 조직을 포함한 전 조직에서 강한 발현을 유도한다. 그러므로 본 발명은 쌍자엽 식물의 전 조직에서 강한 발현을 유도할 때 효과적으로 이용될 수 있다. 특히, 형질전환 식물체 제작 시 제초제 혹은 항생제 합성 유전자 등의 선발 유전자의 강한 발현을 유도하거나, 의료 산업용 유용 물질 생산 형질전환체 제작에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 프로모터의 구조를 나타내는 도면.
도 2는 본 발명을 위한 일시적 발현 분석용 프로모터 클로닝에 이용한 pBI101 벡터 모식도.
도 3a는 본 발명에 의한 재조합 프로모터의 일시적 발현 분석 결과를 GUS 염색으로 나타내는 도면.
도 3b는 본 발명에 의한 재조합 프로모터의 일시적 발현 분석 결과를 뿌리 조직에서 GUS 단백질 정량 분석으로 나타내는 도면.
도 3c는 본 발명에 의한 재조합 프로모터의 일시적 발현 분석 결과를 잎 조직에서 GUS 단백질 정량 분석으로 나타내는 도면.
도 4는 본 발명에 의한 재조합 프로모터의 활성을 세포 단위별로 확인하기 위해 Agroinfiltration 방법을 이용하여 일시적으로 형질전환시키고 GUS 염색이 완료된 배추 식물체 뿌리 조직의 단면을 관찰한 결과를 보여주는 도면.
도 5는 본 발명을 위한 재조합 프로모터 애기장대 형질전환체 제작용 벡터 (pBGWFS7.0) 모식도.
도 6은 본 발명에 의한 재조합 프로모터의 애기장대 형질전환체에서 활성을 GUS 염색으로 나타낸 도면. 붉은 색 점선으로 된 원 내부는 뿌리 조직을 나타냄.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명에 의한 ibAGP1 + SRD1 재조합 프로모터 제작

ibAGP1 프로모터와 SRD1 프로모터를 재조합하여 뿌리를 포함한 전 조직에서 강하게 발현하는 프로모터를 개발하기 위하여 두 개의 프로모터의 4가지 조합을 이용하였다 (도 1).

ibAGP1 프로모터는 그 활성이 높으며 당 처리에 의해 프로모터 활성이 가장 높게 유도되는 전체 크기(1976 bp)의 프로모터와 전분체 타겟팅 염기서열 (TP)가 연결되어 있는 ibAGP1 프로모터를 이용하였다.

한편, SRD1 프로모터는 3-kb 전체에 뿌리 특이 발현 조절 인자가 산재해 있을 것으로 추정되는 결손 프로모터 결과 (Noh et al., 2012, Transgenic Research, 21: 265-278)를 바탕으로 SRD1의 활성이 높게 나타나는 전체 크기(-2801~+209; 2801 bp SRD1 프로모터 + 209 bp 5' 비번역 부위)와 최소 크기(-321~+209; 321 bp SRD1 프로모터 + 209 bp 5' 비번역 부위), 그리고 ROOT MOTIF가 다량 산재되어 있는 부위(-2088 ~ -1543)를 선정하여 ibAGP1의 프로모터에 연결함으로써 새로운 재조합 프로모터 합성을 완성하였다.

재조합 프로모터 제작 시에 ibAGP1 프로모터를 3' 방향에 그리고 SRD1 결손 프로모터들을 5' 방향에 위치하게 제작하였다. 즉 4 가지의 종류가 다른 합성 프로모터 C1, C2, C3, C4를 제작하였는데, C1은 SRD1(-2801 ~ +209) + ibAGP1(-1909 ~ +67)(서열번호 1), C2는 SRD1(-321 ~ +209) +ibAGP1(-1909 ~ +67)(서열번호 2), C3는 SRD1(-2088 ~ -1543) + ibAGP1(-1909 ~ +67)(서열번호 3), C4는 SRD1(-2801 ~ +209) + ibAGP1[(-1909 ~ +67) + TP1](서열번호 4)의 프로모터들로 구성되어 있었다 (도 1).

이상의 재조합 프로모터들의 벡터를 제작하기 위하여 두 개의 과정으로 클로닝을 실시하였다 (도 2). 먼저, ibAGP1 프로모터의 5'쪽 프라이머는 (서열번호 5) Xba I 제한효소 인식부위를 첨가시키고, 3'쪽 프라이머에 (ibAGP1은 서열번호 6. ibAGP1+TP1은 서열번호 7) Bam HI 제한효소 인식부위를 첨가시켜 PCR로 증폭시켰다. 이때 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 55℃-1분, 72℃-1분 30초를 30회 수행한 후 72℃에서 10분간 처리하였다. 이 PCR 산물을 pBI101 벡터에 삽입 시키고, Xba I 과 Bam HI을 처리하여 확인하였다.

5' 프라이머	5-GACTCTAGACTGATACTTTGGTGACT-3'	서열번호 5
3' 프라이머	5-TGCGGATCCTTTTAAGCCGCGCTACCA-3'	서열번호 6
3' 프라이머	5-TGCGGATCCCTGCGAATTCTGCGAATC-3'	서열번호 7

먼저 제작된 ibAGP1이 삽입된 pBI101 벡터에 각각의 SRD1 프로모터를 클로닝하기 위하여, SRD1 프로모터의 5'쪽 프라이머는 Sal I 제한효소 인식부위를 첨가시키고, 3'쪽 프라이머에 Xba I 제한효소 인식부위를 첨가시켜 PCR로 증폭시켰다 (표 2). C1 과 C4용 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 58℃-1분, 72℃-2분 30초를 30회 수행한 후 72℃에서 10분간 처리하였으며, C2와 C3용 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 58℃-1분, 72℃-1분을 30회 수행한 후 72℃에서 10분간 처리하였다. 이 PCR 산물을 각각 ibAGP1이 삽입된 pBI101 벡터에 삽입 시키고, Sal I 과 Xba I 을 처리하여 확인하였다. 삽입이 확인된 colony 들을 대상으로 플라스미드 DNA를 추출한 후 염기서열 분석을 통해 최종적으로 재조합 프로모터 제작을 완료하였다.

C1	5' 프라이머	5'-CATGTCGACGGCTGGTTTCTAAGACAT-3'	서열번호 8
	3' 프라이머	5'-GACTCTAGACCTTCTCCTCCCTGAAGAAATC-3'	서열번호 9
C2	5' 프라이머	5'-CATGTCGACGCTAATTAATCAAATACTCAT-3'	서열번호 10
	3' 프라이머	5'-GACTCTAGACCTTCTCCTCCCTGAAGAAATC-3'	서열번호 9
C3	5' 프라이머	5'-GACGTCGACATTATTTCATTGGCACG-3'	서열번호 11
	3' 프라이머	5'-GACTCTAGAGGTGCATTATTTTAAAGTTTAATGTGCT-3'	서열번호 12
C4	5' 프라이머	5'-CATGTCGACGGCTGGTTTCTAAGACAT-3'	서열번호 8
	3' 프라이머	5'-GACTCTAGACCTTCTCCTCCCTGAAGAAATC-3'	서열번호 9

실시예 2: 배추 식물에서 재조합 프로모터 일시적 발현 분석

제작된 4종의 재조합 프로모터(C1, C2, C3, C4) (도 1)를 대조구와 함께 agroinfiltration 실험을 실시하였다. Agroinfiltration 분석을 위하여 10일 동안 온실에서 키운 배추가 사용되었다. 각각의 프로모터가 삽입된 바이너리 벡터는 LBA4404에 각각 형질전환하고 잎과 뿌리 조직에 infiltration을 실시하였다. Agrobacterium 하나의 콜로니는 50 mg/L kanamycin과 25mg/L rifampicin이 포함된 3 mL YEP 액체배지에서 하루 동안 28℃에서 키웠다. 하루 동안 키운 배양액의 500 μL를 50 mL YEP 액체배지에서 OD₆₀₀ 값이 1.0이 되도록 키운 후 5000g, room temperature에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 여기에 50 mL infiltration buffer [10 mM MgCl₂ , 10 mM MES-KOH (pH5.7), 200 μM Acetosyringone]를 넣어 현탁 시킨 후 다시 원심분리하고 상층액을 버리고 다시 infiltration buffer를 OD₆₀₀ 값이 1.0이 되게 넣어 주었다. OD₆₀₀ 값이 1.0으로 맞춰진 배양액은 상온에서 2-4시간 동안 뒀다가 vaccum을 이용한 infiltration을 실시하였다. Agroinfiltration 실시 이틀 후 유식물을 각각 X-gluc이 첨가된 용액에 하룻밤 동안 반응시켜 발현된 GUS의 양상을 비교하고, 정량적 분석을 위해서는 자엽과 뿌리 조직을 각각 채취하여 GUS 추출용액에 담근 후 드릴과 플라스틱 막대를 이용하여 곱게 파쇄하였다. 이렇게 파쇄된 샘플에 MUG를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, MUG로부터 GUS에 의해 변환된 MU값을 정량적으로 환산하여 분석하였다.

분석 결과 ibAGP1 프로모터의 활성은 지상부에서는 35S 프로모터의 활성과 비슷한 수준이었다(도 3a 및 도 3c). 뿌리에서는 ibAGP1프로모터의 활성이 35S 프로모터보다 낮았다.(도 3a, 3b 및 3c) 그러나 재조합 프로모터의 활성은 뿌리에서는 35S 프로모터보다 높고 ibAGP1 프로모터보다 높아졌으며, 잎에서는 그 활성이 크게 감소되지 않았다 (도 3a ~ 도 3c). 그중에서도 특히, 재조합 프로모터 C2과 C3에 의해 뿌리에서 높아진 활성을 나타내었다. 이 결과는 뿌리에서 약한 ibAGP1 프로모터의 활성을 뿌리 특이적 활성을 나타내는 SRD1 프로모터가 보완함으로써 쌍자엽 형질전환체 개발에 유용한 전신 고발현 프로모터를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 3: 뿌리 조직에서 재조합 프로모터 활성 부위 확인

재조합 프로모터의 활성을 세포 단위별로 확인하기 위해 Agroinfiltration 방법을 이용하여 일시적으로 형질전환시키고 GUS 염색이 완료된 배추 식물체 뿌리 조직의 단면을 hand-section 하여 관찰하였다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 ibAGP1 프로모터는 뿌리 조직의 cortex 층에서만 GUS 염색이 관찰된 반면 재조합 프로모터 C2와 C3에 의해 형질전환된 뿌리들에서는 중심주 내부의 도관 조직 세포에서 강한 GUS 염색을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 기존의 ibAGP1 프로모터에서는 부족하던 뿌리 조직에서의 활성이 C2와 C3 재조합 프로모터에서는 첨가된 SRD1 프로모터 단편에 의해 뿌리의 도관 조직 내에서 강한 프로모터 활성을 보이고 있음을 시사한다. 따라서 C2와 C3 재조합 프로모터는 쌍자엽 식물의 형질전환체 개발에 유용한 전신 고발현 프로모터임을 보여주며, 이 중 뿌리와 잎 두 조직에서 모두 높은 활성을 보여주는 (도 3a 및 도 3b) C2 프로모터가 가장 적합한 재조합 프로모터임을 나타낸다.

실시예 4: 애기장대 형질전환용 벡터 제작

일시적 발현 분석에서 가장 적합한 전신 고발현 프로모터로 선정된 C2 프로모터의 활성을 형질전환 식물체에서 확인하기 위해, 애기장대 형질전환체를 제작하였다. 재조합 프로모터 C2와 ibAGP1 프로모터를 PCR로 증폭시킨 후 게이트웨이 벡터 pBGWFS7.0의 GFP-GUS 유전자의 5' 부위에 삽입시켰다 (도 5). PCR 조건은 상기 실시예 1에서 사용하였던 조건과 동일하였으며 프라이머 염기서열도 실시예 1에서 사용하였던 염기서열에서 제한효소 인식부위만 제외한 동일한 부위의 염기서열을 사용하였다. 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법(An, G. 1987, Methods in Enzymology)으로 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리아 (Agrobacteria)는 2일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 플로랄딥(floral dip) 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal)에 근거하여 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. columbia)의 개화 직전 암술머리에 접종하여 애기장대 식물체를 형질전환시켰다.

실시예 5: 형질전환된 애기장대의 조직 화학적 염색 분석

실시예 3에서 제조된 애기장대 형질전환체로부터 종자를 수확한 다음, PPT(phosphinothricin, 10 mg/L)을 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 형질전환 식물체를 선별하였다. 선별된 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하며 조사하였다. 유식물체의 전체 조직을 1 mM X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-glucuronidase), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담가 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 70% 에탄올을 첨가하여 2시간 동안 클로로필을 제거하는 과정을 3회 반복한 후, 100% 에탄올에 보관하면서 관찰하였다.

그 결과, 도 6과 같이 ibAGP1 프로모터는 유식물의 지상부 전 조직에서 강한 활성을 보이는 반면, 뿌리에서는 활성이 없어서 GUS 염색을 관찰할 수 없었던 반면 C2 프로모터는 뿌리를 포함한 지상부 전 조직에서 강한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2의 일시적 발현 분석에서도 뿌리 조직에서 C2 프로모터의 활성이 ibAGP1 프로모터의 활성에 비해 상승하였으나 형질전환체에서는 재조합 프로모터의 효과가 더 극명함을 보여준다. 이러한 결과는 형질전환체 제작 시에 C2 프로모터가 매우 효과적으로 사용할 수 있는 전신 고발현 프로모터임을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Chimeric promoter for directing strong universal expression in plants <130> P11-130923-03 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric promoter <400> 1 cgacggcccg ggctggtttc taagacattt tttggtttaa tccaaaccta attacaaata 60 ttcccaacaa gatcgaatga tctatggcta caaaccctat cccaacaaaa aactacattt 120 agtacatcaa attaagtggc atgattattt tattttgttc gacaaagtag catcaaataa 180 actacaaaaa aaactacatc attacaaaaa gactaattat caggcatcaa tgttagtata 240 tgggaggtgg tgggttcgag cctcagtgga ggcgttgctg tctctttgtt cttcagtagg 300 ttgagagagt aatttatgaa cagatactac actgtaatag agtcagtagc aatcaaaaaa 360 aaatttgttt taataatatc ctaatattat atttttctaa ccagtactat gctttcggct 420 ttccagaagg cagaagccta aaaaattcaa ttaagtttat aaactttaat ccacttgttt 480 gagtaattga gtatctttca gaacggttgt agatttaggt gggatgacaa atggtattcc 540 aaagttcaag atatttcttt ttagatttag gaatttgtag tcttttaagg ttagaggtta 600 cttaaaagga tgaacaaatt ttttatccca ttctatttct aggaagaatt tataatccgt 660 acgtgtgacg gctgccatta attatagtgc ccattcattt ttattgggaa aaagtactca 720 tccattattt cattggcacg gcaacccagt tttaaatatt ttataacaat aataacatat 780 ggaaccaaat tgtaaccttt atatcccaca gacccacaca ttacacatcc aataaaactt 840 gagccaaatt atatattagc gttactgagt actgactaaa atatattttt aaaatatact 900 aaaatattat taaaaaaata ttaaaatagt aaaattatat taaatagaaa atttaattta 960 atcaaagaat accaactaaa acgtataaaa tgagaaaata taggtatata atattgatga 1020 ttccttttga tttttttttt atgatccgaa aattctttgg ccataagaag agtaaatgaa 1080 caatttaaac taagaaaata agtaagttgc tcctatgtga ttaatatata aagtgagatt 1140 tgagctgttg atctatatta ttgaattaga tcaacgactc aaaatgaagg ataatttttt 1200 taaaaaatcg cttcctgtta atattaatgc tttaaaatta agcacattaa actttaaaat 1260 aatgcacctt tttttttaat actattgacc ttgttacatg tagtatctga agtccaacaa 1320 agtcaacatt gtccccactg aggctcaaac ccgtgacctc ccactaggga gaatcgcttc 1380 atgccgcttg accacaagtc ctttggtaaa aataatgcac cttaaagatg taaacttacg 1440 catcttcgat gaactgacca ctttgagctt gcaacttata cttttttgaa gataagcttg 1500 taacttatta taatggtcta ttaacattaa aaaaaaaaaa agtttcacaa tcaaattata 1560 atatttgtag ccaaatgaat ttaccgcggg tgtgactatt caggaattta aatacactaa 1620 agttggaggg gtagtacact caatacacta ttgctcatga cttttttctt cttttttttt 1680 tagattagct aatatattaa tcccaaatag aaacgtttac accaaagttc gaaaaaatgt 1740 tgtgtcattt cttacagtta gacacaaaaa taacattttt agctaagtta cagtaaactt 1800 gattggcaga ctgtttcaca aattgggagc ttggatcctt gaaggaactt actgctttct 1860 tagagtcatt aatggtttgg ccaaacatag aaaagattag ttgagcagtc ttgcacacta 1920 cttgagtaat catctccatt cttctactta ttgacaatat tctcttatga aaaaacacac 1980 ttgatcttat atcagttagg gatttgaccg gtttattaaa ggatagccta ccaactttgt 2040 tgaacgacat atcatcatat catgattcaa aagatgctct tttttattgt catatttgtg 2100 gcacaggatg agtacagttt cgcatacacc atgatcattt ttatcaaatc atactctata 2160 aaaccctgtc aaagaaaaga gaggaagaaa cgagaagaag aaactcatcc aagaaacaag 2220 aggaacatta ttgctcatga ttagatcgac ttgaacatgt actaatgcca atctcaaatt 2280 acctacatag gtgtgttaga caaatatttg ttaattagct gattgactta atggatttga 2340 ctagttgtta acattaattg attgtaggaa attgtttggt aaattagttg ttagttgata 2400 gttgattaca tgaaaattac tttctcaaaa agcttatcga aaaaactatt ttgaacagct 2460 ttttgaattt taacatttta taacaataag ttgttacaaa aagctaatta atcaaatact 2520 catatccatt gtttaaccat gtcaaacaac taataataat taaataattt gtttttaaaa 2580 tataagttaa atttaattga taagctaact atattaccaa acataccgta atattttctt 2640 aaccgcggta tgggctaaga tatgattgta tactattttt gttgcgagca tgattaatac 2700 agtaatacca tcatttaaaa gtggaaacca cattcgcagc tgtttccgaa agcaaacagc 2760 taacatttgc taggttctta cttatgcatt aatctgggtt ataaaatccc catttccatg 2820 ttggtgtgaa caaccaccta aacctagcgt cttcaacaat tctaccctac tatcatcccc 2880 caagacttcc ccgaccagta aataacccgc tttcctcttt cagtgatttc ttcatttgac 2940 tttgctatat atatatataa tctgatctgc tttcatcttt cagtgatttc ttcatttgga 3000 tttcttcagg actgatactt tggtgactgc attgtgtttg ggtcttgcca aatctattga 3060 gggaggggaa gaaagtagaa gtgtcaggga ttggtgtgtg gtggggtttc caaagtttcc 3120 ctcttttcct ttcttattct tagtttgctc gtcataagtg tcagggattg gtaaccaata 3180 gaaatctcat ctttaaccta tatgtatgtt ctagtatcat aattaagctc ttactcaaag 3240 gaatgttcca tttaggtcat ttttaatgtc tatcaattga tcatttcaag taaacaaaac 3300 tctggctcta atgctgggac tttggtttct ttattatgca gtcttatggg ataaaggttg 3360 gttatggtgg catcccgggg ccatcaatcg gaagagatgg agctcctgct ccaggagggg 3420 gttgctgcag ctgaaaatgg gacgtaattt cttttgagta aatgcttgtt tcattgttaa 3480 ttcgtgacta attgttcttt gtttttcaat tgttcaaaag cttacatgta tacgtggtgt 3540 ataatgtaat acaacagcca gcattaggat gtgaatagag gtttcaaatt aaactcaacc 3600 agaatcctgc ttatttcgag aattactacc attctcaaaa aataaataaa taaatcatga 3660 gatgtgttga tataaataaa taaatcatga gatgtgttga acgctcttca agtttttcac 3720 agttgtatga ataatgacga gcacatgata gttagagaac ttaggagcat tgaatctggt 3780 gcttgggctg atcgatttat ggcatgatgc agtgcattca ctgtatagcg tgtgattgca 3840 ggcattagat cttggtttat ggtctgcatt tcacgtgggg tgaccatttt gtgccgtttc 3900 cgtcagccac ttaaatggac caacatcccc tgaggaagac ctgcaaattc agacttagac 3960 acactaatta taggggcata tgatattatg attggataat ggctgatgaa attttcagcc 4020 gttaattcta aacaataaac agtatggcgg tctatgaatg ataacgatct ttaagctgaa 4080 gatgggcaaa acaatatgga tcgtctacta gtatttgtct ctttccctat cctgcttgtc 4140 tacaccacaa tactaaagac caaaacttga gtgactgaga gaaatatgca ttcattatcc 4200 gagtctgtat catgtaaatt ttatcttgta attttaacta ataaaaaatc aggagaaaat 4260 cagcctaaat tatttatagc tcataactta ctagttcaga ctaagaagac taataaaaca 4320 tccccgttac aaaattaaca ttttgactaa cttgtaacgt ttgcatggtc agaaacagga 4380 tacaccaact ttggttgtga tgatgatatc atatcataaa caaaccctcc aaaaagtcac 4440 ttgcaaggtg gcactttgcg acagaccacc atgcttaatt gctcataatc agctaaacta 4500 ttattattac tttataaaat attttcgccc catatcatat aatttggcca ataatatatc 4560 attttatctg tcttacttat tatttattaa ttacataaaa tgaaacggaa tgaataacat 4620 aaataatata aagatatact ccgtataagt aacggtgcaa aggagccgat tagatatttt 4680 cagtaatcac aagtcacatg tgatcatatc atgtgtattt ttcatataaa ataaaactag 4740 tataccccac cctgattttt gctctaaact tccaaatata cccttggtca cgcaaatgct 4800 agccgctggt ttggaagggc aaaccgtaaa tgttgacaaa ttctttggca attaggtaat 4860 aggtgtcacc tatttgaaca cttactataa aaggacgcct agtttctgtc caaatttcaa 4920 cagaatcact cgcttccaca cactccaaag tccgcagaga gctcagagtg gtagcgcggc 4980 gttaaa 4986 <210> 2 <211> 2494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric promoter <400> 2 gctaattaat caaatactca tatccattgt ttaaccatgt caaacaacta ataataatta 60 aataatttgt ttttaaaata taagttaaat ttaattgata agctaactat attaccaaac 120 ataccgtaat attttcttaa ccgcggtatg ggctaagata tgattgtata ctatttttgt 180 tgcgagcatg attaatacag taataccatc atttaaaagt ggaaaccaca ttcgcagctg 240 tttccgaaag caaacagcta acatttgcta ggttcttact tatgcattaa tctgggttat 300 aaaatcccca tttccatgtt ggtgtgaaca accacctaaa cctagcgtct tcaacaattc 360 taccctacta tcatccccca agacttcccc gaccagtaaa taacccgctt tcctctttca 420 gtgatttctt catttgactt tgctatatat atatataatc tgatctgctt tcatctttca 480 gtgatttctt catttggatt tcttcaggga ggagaaggac tgatactttg gtgactgcat 540 tgtgtttggg tcttgccaaa tctattgagg gaggggaaga aagtagaagt gtcagggatt 600 ggtgtgtggt ggggtttcca aagtttccct cttttccttt cttattctta gtttgctcgt 660 cataagtgtc agggattggt aaccaataga aatctcatct ttaacctata tgtatgttct 720 agtatcataa ttaagctctt actcaaagga atgttccatt taggtcattt ttaatgtcta 780 tcaattgatc atttcaagta aacaaaactc tggctctaat gctgggactt tggtttcttt 840 attatgcagt cttatgggat aaaggttggt tatggtggca tcccggggcc atcaatcgga 900 agagatggag ctcctgctcc aggagggggt tgctgcagct gaaaatggga cgtaatttct 960 tttgagtaaa tgcttgtttc attgttaatt cgtgactaat tgttctttgt ttttcaattg 1020 ttcaaaagct tacatgtata cgtggtgtat aatgtaatac aacagccagc attaggatgt 1080 gaatagaggt ttcaaattaa actcaaccag aatcctgctt atttcgagaa ttactaccat 1140 tctcaaaaaa taaataaata aatcatgaga tgtgttgata taaataaata aatcatgaga 1200 tgtgttgaac gctcttcaag tttttcacag ttgtatgaat aatgacgagc acatgatagt 1260 tagagaactt aggagcattg aatctggtgc ttgggctgat cgatttatgg catgatgcag 1320 tgcattcact gtatagcgtg tgattgcagg cattagatct tggtttatgg tctgcatttc 1380 acgtggggtg accattttgt gccgtttccg tcagccactt aaatggacca acatcccctg 1440 aggaagacct gcaaattcag acttagacac actaattata ggggcatatg atattatgat 1500 tggataatgg ctgatgaaat tttcagccgt taattctaaa caataaacag tatggcggtc 1560 tatgaatgat aacgatcttt aagctgaaga tgggcaaaac aatatggatc gtctactagt 1620 atttgtctct ttccctatcc tgcttgtcta caccacaata ctaaagacca aaacttgagt 1680 gactgagaga aatatgcatt cattatccga gtctgtatca tgtaaatttt atcttgtaat 1740 tttaactaat aaaaaatcag gagaaaatca gcctaaatta tttatagctc ataacttact 1800 agttcagact aagaagacta ataaaacatc cccgttacaa aattaacatt ttgactaact 1860 tgtaacgttt gcatggtcag aaacaggata caccaacttt ggttgtgatg atgatatcat 1920 atcataaaca aaccctccaa aaagtcactt gcaaggtggc actttgcgac agaccaccat 1980 gcttaattgc tcataatcag ctaaactatt attattactt tataaaatat tttcgcccca 2040 tatcatataa tttggccaat aatatatcat tttatctgtc ttacttatta tttattaatt 2100 acataaaatg aaacggaatg aataacataa ataatataaa gatatactcc gtataagtaa 2160 cggtgcaaag gagccgatta gatattttca gtaatcacaa gtcacatgtg atcatatcat 2220 gtgtattttt catataaaat aaaactagta taccccaccc tgatttttgc tctaaacttc 2280 caaatatacc cttggtcacg caaatgctag ccgctggttt ggaagggcaa accgtaaatg 2340 ttgacaaatt ctttggcaat taggtaatag gtgtcaccta tttgaacact tactataaaa 2400 ggacgcctag tttctgtcca aatttcaaca gaatcactcg cttccacaca ctccaaagtc 2460 cgcagagagc tcagagtggt agcgcggcgt taaa 2494 <210> 3 <211> 2521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 attatttcat tggcacggca acccagtttt aaatatttta taacaataat aacatatgga 60 accaaattgt aacctttata tcccacagac ccacacatta cacatccaat aaaacttgag 120 ccaaattata tattagcgtt actgagtact gactaaaata tatttttaaa atatactaaa 180 atattattaa aaaaatatta aaatagtaaa attatattaa atagaaaatt taatttaatc 240 aaagaatacc aactaaaacg tataaaatga gaaaatatag gtatataata ttgatgattc 300 cttttgattt tttttttatg atccgaaaat tctttggcca taagaagagt aaatgaacaa 360 tttaaactaa gaaaataagt aagttgctcc tatgtgatta atatataaag tgagatttga 420 gctgttgatc tatattattg aattagatca acgactcaaa atgaaggata atttttttaa 480 aaaatcgctt cctgttaata ttaatgcttt aaaattaagc acattaaact ttaaaataat 540 gcaccactga tactttggtg actgcattgt gtttgggtct 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gtttccgtca 1440 gccacttaaa tggaccaaca tcccctgagg aagacctgca aattcagact tagacacact 1500 aattataggg gcatatgata ttatgattgg ataatggctg atgaaatttt cagccgttaa 1560 ttctaaacaa taaacagtat ggcggtctat gaatgataac gatctttaag ctgaagatgg 1620 gcaaaacaat atggatcgtc tactagtatt tgtctctttc cctatcctgc ttgtctacac 1680 cacaatacta aagaccaaaa cttgagtgac tgagagaaat atgcattcat tatccgagtc 1740 tgtatcatgt aaattttatc ttgtaatttt aactaataaa aaatcaggag aaaatcagcc 1800 taaattattt atagctcata acttactagt tcagactaag aagactaata aaacatcccc 1860 gttacaaaat taacattttg actaacttgt aacgtttgca tggtcagaaa caggatacac 1920 caactttggt tgtgatgatg atatcatatc ataaacaaac cctccaaaaa gtcacttgca 1980 aggtggcact ttgcgacaga ccaccatgct taattgctca taatcagcta aactattatt 2040 attactttat aaaatatttt cgccccatat catataattt ggccaataat atatcatttt 2100 atctgtctta cttattattt attaattaca taaaatgaaa cggaatgaat aacataaata 2160 atataaagat atactccgta taagtaacgg tgcaaaggag ccgattagat attttcagta 2220 atcacaagtc acatgtgatc atatcatgtg tatttttcat ataaaataaa 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tgaccatttt gtgccgtttc 3900 cgtcagccac ttaaatggac caacatcccc tgaggaagac ctgcaaattc agacttagac 3960 acactaatta taggggcata tgatattatg attggataat ggctgatgaa attttcagcc 4020 gttaattcta aacaataaac agtatggcgg tctatgaatg ataacgatct ttaagctgaa 4080 gatgggcaaa acaatatgga tcgtctacta gtatttgtct ctttccctat cctgcttgtc 4140 tacaccacaa tactaaagac caaaacttga gtgactgaga gaaatatgca ttcattatcc 4200 gagtctgtat catgtaaatt ttatcttgta attttaacta ataaaaaatc aggagaaaat 4260 cagcctaaat tatttatagc tcataactta ctagttcaga ctaagaagac taataaaaca 4320 tccccgttac aaaattaaca ttttgactaa cttgtaacgt ttgcatggtc agaaacagga 4380 tacaccaact ttggttgtga tgatgatatc atatcataaa caaaccctcc aaaaagtcac 4440 ttgcaaggtg gcactttgcg acagaccacc atgcttaatt gctcataatc agctaaacta 4500 ttattattac tttataaaat attttcgccc catatcatat aatttggcca ataatatatc 4560 attttatctg tcttacttat tatttattaa ttacataaaa tgaaacggaa tgaataacat 4620 aaataatata aagatatact ccgtataagt aacggtgcaa aggagccgat tagatatttt 4680 cagtaatcac aagtcacatg tgatcatatc atgtgtattt 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primer <400> 8 catgtcgacg gctggtttct aagacat 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 gactctagac cttctcctcc ctgaagaaat c 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 catgtcgacg ctaattaatc aaatactcat 30 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gacgtcgaca ttatttcatt ggcacg 26 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 gactctagag gtgcattatt ttaaagttta atgtgct 37

Claims (6)

1. 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진, ibAGP1 프로모터 및 SRD1 프로모터가 연결된 쌍자엽 식물체의 전신 고 발현 재조합 프로모터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 프로모터를 포함하는 형질전환용 발현벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 재조합 프로모터가 pBGWFS7.0에 도입된 형질전환용 발현벡터.
6. 제4항 기재의 발현벡터에 의해 형질전환된 식물체.

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