KR100604191B1 - 고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열 및 이를포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1) 프로모터 염기서열 중 식물체에서 당 유도성 발현을 유도하는 염기서열(서열번호 1), 상기 염기서열을 포함하는 식물체 당 유도성 발현 플라스미드 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 당 유도성 발현 프로모터는 당을 처리하였을 때 그 활성이 8 내지 11배 증가되므로, 이는 보편적으로 쓰이는 CaMV35S 프로모터에 비해 12 내지 15배 증가한 활성이다. 따라서, 본 발명에 의한 프로모터는 식물체내에서 비교적 많은 양의 당이 축적되는 저장기관에서 유용 의료, 산업용 단백질을 대량 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
프로모터, ADP-글루코즈 인산화 효소, 고구마, 당, 저장기관, 당 유도성

Description

고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열 및 이를 포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터{DNA nucleotide sequence for directing sucrose-inducible high level expression in plant and plasmid vector using the same}
도 1은 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위의 염기서열을 나타내는 도면.
도 2a는 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 형질전환용 바이너리 벡터(이하, 'pSPagp1-101'이라 함)를 나타내는 모식도.
도 2b는 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 일시적 발현 분석용 벡터(이하, 'pSPagp1-221'이라 함)를 나타내는 모식도.
도 3은 본 발명에 의한 pSPagp1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 애기장대 식물체를 조직 화학적인 방법으로 GUS를 염색시켜 관찰한 조직별 발현 양상을 나타내는 도면.
도 4는 본 발명에 의한 pSPagp1-101 벡터를 이용하여 형질전환시킨 애기장대 식물체에 당 처리를 한 후 GUS를 정량적인 방법으로 분석하여 본 발명에 의한 프로모터의 당 유도성을 확인한 도면.
도 5는 본 발명에 의한 pSPagp1-221 벡터를 이용하여 당근의 저장뿌리에서 일시적 발현을 분석한 결과를 나타내는 도면.
본 발명은 고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열, 이를 포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1) 프로모터 염기서열 중 식물체에서 당 유도성 발현을 유도하는 염기서열, 상기 염기서열을 포함하는 식물체 당 유도성 발현 플라스미드 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 외래 유전자를 식물체내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다.
이러한 작물분자육종은 기술의 효과를 극대화시키려면 1) 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하며, 2) 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하며, 3) 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터의 개발이 선행되어져야 한다.
이에 국외에서는 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모 터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)의 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라고는 가능성이 제시되고(Hohn et al., 1982, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 193-236), 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀지고(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), 식물체내에서 강한 발현이 증명되었다(Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58). 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 보편적인(universal) 프로모터가 되었다.
한편, CaMV 35S 이후 식물체내에서 생리적(biotic) 혹은 비생리적인(abiotic) 조건하에서 활성이 증가되는 유도성 프로모터에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다.
이 중, 당 처리에 의해 그 활성이 증가되는 당 유도성 프로모터에 관한 연구도 활발하게 진행되고 있는데, 이러한 당 유도성 프로모터는 식물체에서 당으로부터 합성되는 전분의 축적량이 비교적 많은 저장기관 특히 저장뿌리 조직에서 유용 의료, 산업용 단백질(예, Interferon, growth hormone, Lactoferrin, Phytase 등)이 대량으로 생산되는 것을 유도할 수 있는 장점이 있다.
이러한, 당 유도성 프로모터에 대한 연구는 주로 저장기관에 축적되는 저장 단백질 유전자들 혹은 전분합성에 관련되는 유전자들을 중심으로 이루어져 왔다.
그 예로서 감자 괴경의 저장 단백질인 파타틴을 코딩하는 유전자의 프로모터의 활성이 당에 의해 증대됨이 확인되었으며(Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8, 23-31; Wenzler et al., 1989a, Plant Mol. Biol. 12, 41-50; Wenzler et al., 1989b, Plant Mol. Biol. 13, 347-354), 이 프로모터의 당 유도성에는 -344 부위의 특정 염기서열(B 서열)이 필요하다고 밝혀져 있다(Grierson et al., 1994, Plant J, 5, 815-826).
또한, 두가지의 감자 당합성 효소(Sucrose synthase) 유전자들 (Sus3 과 Sus4) 중 Sus4의 발현이 당 유도성으로 확인되었으며(Salanoubat and Belliard, 1989, GENE 84, 181-185), Sus4 유전자의 프로모터 염기서열 중 -1500 내지 -267 염기서열과 3' 비번역 부위, 그리고 1612-bp 리더인트론(leader intron)도 당 유도성 활성에 필수적이라고 보고되었다(Fu et al., 1995, Plant Cell 7, 1387-1394).
그리고, 옥수수 전분분지효소 I(starch-branching enzyme I, SBE1) 유전자의 프로모터가 당에 반응하여 활성이 증가됨이 확인되었으며, 이러한 당 유도성에는 -314 내지 -145 부위가 필수적이라고 밝혀졌다(Kim and Guiltinan, 1999, Plant Physiology 121, 225-236).
고구마 β-아밀레이제 유전자의 프로모터의 활성이 당에 의해 유도되는 것이 확인되었으며, 이 당 유도성 활성에는 -901 내지 -820 부위가 필수적이며, 이 중에서도 TGGACGG 염기서열이 조절인자로 작용한다고 밝혀졌다(Maeo et al., 2001, Plant Mol. Biol. 46, 627-637).
한편, 식물체 내의 전분 합성에 관련되어 그 함량을 조절하는 결정적 효소인 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자 프로모터들이 토마토와 애기장대에서 당 유도성으로 보고되었으며(Siedlecka et al., 2003, Planta 217, 184-192; Li et al., 2002, Plant Science 162, 239-244), 이들 중 애기장대 프로모터는 일반적으로 단 백질 탈인산화 효소 I과 2A(phosphatase I and 2A)의 억제제(inhibitor)인 오카다산(okadaic acid)에 의해 그 활성이 감소한다고 보고되었다.
한편, 고구마 유래 2가지 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자들(ibAGP1 과 ibAGP2) 중 ibAGP1(종전에는 ibAGP-sTL1으로 명명됨)이 당에 의해 그 발현이 증가함을 확인된 바 있으며(Bae and Liu, 1997, Molecular Genetics and Genomics 154, 179-185), 두 유전자의 전장 유전자 염기서열이 비교 분석되었으며 각각 유전자의 전사 개시 부위가 확인되어 있다(Noh et al., in press, GENE). 그러나, 아직까지 식물체에서 고효율로 당 유도성을 나타내는 프로모터의 염기서열이 밝혀진 바는 없다.
따라서, 보다 고효율로 저렴하게 식물체내로 유용한 외래 단백질을 대량 생산할 수 있는 일 방법으로 당 유도성 발현 프로모터에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다.
본 발명은 상기 문제점 및 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1)에서 유래된 식물체의 고효율 당 유도성 프로모터 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 당 유도성 프로모터 및 상기 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체 형질전환용 고효율 당 유도성 발현 플라스미드 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 저장기관, 특히 저장뿌리 조직에서 유용 물질을 대량으로 생산하고자 하는 경우, 상기 고효율 당 유도성 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 저장조직(저장뿌리 조직)에서 고효율로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1)의 프로모터 중 당 유도성 발현 프로모터를 클로닝하여서, 동일 유전자의 5' 비번역 부위를 포함시켜 식물체 형질 전환용 발현 벡터 및 일시적 발현용 벡터를 제작하였으며 동일 벡터들의 발현을 실험을 통해 확인한 바 조직특이성 및 당 유도성이 뛰어난 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 분리된 당 유도성 프로모터 부위 및 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1)의 5' 비번역 부위 DNA 염기서열을 제공한다.
상기 프로모터 염기서열은 서열번호 1의 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소(ibAGP1)의 전사개시 부위로부터 -1 내지 -1908에서 유래된 것을 특징으로 한다(도 1 참조). 본 발명에 의한 상기 프로모터는 식물체내에서 당에 반응하여 강한 활성이 유도될 수 있다.
또한, 상기 비번역 부위는 서열번호 1의 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소(ibAGP1)의 전사개시 부위로부터 +1 내지 +68에서 유래된 것을 특징으로 한다(도 1 참조). 상기 본 발명에 의한 비번역 부위는 식물체내에 도입된 유전자의 번역 효율을 높임으로써 목적 외래 유전자의 발현을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1)의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체의 형질전환용 고효율 당 유도성 발현 벡터(pSPagp1-101) 및 일시적 발현용 벡터(pSPagp1-221)를 제공한다.
상기 식물체 당 유도성 발현벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체내에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 형질전환용 바이너리 벡터이고, 일시적 발현용 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 벡터이다.
또한, 상기 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 벡터들에서, 본 발명에 의한 프로모터 및 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자(ibAGP1)의 5' 비번역 부위는 pBI101 및 pBI221 벡터에 함유된 외래 유전자의 앞에 위치한다. 본 발명에서는 GUS 리포터 유전자가 함유된 벡터(pBI101과 pBI221)에 본 발명에 의한 프로모터 및 5’비번역 부위를 삽입한 pSPagp1-101과 pSPagp1-221(도 2a와 도 2b 참조)를 제조하였으나, 상기 GUS 리포터 유전자는 외래 유전자의 한 예로서 다른 유용한 목적의 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명은 상기 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 고효율 발현 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 일시적 발현용 벡터에 의해 일시적으로 형질전환된 저장뿌리를 제공한다.
상기 식물체 당 유도성 발현 바이너리 벡터는 아그로박테리움을 이용하는 방법, 혹은 유전자 총을 이용한 방법 등으로 식물체를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에서는 그 예로서 플로랄딥(floral dip) 방법(Clough 와 Bent, 1998, Plant J.) 을 이용하여 애기장대에 형질전환시켰다. 또한, 상기 식물체 당 유도성 일시적 발현 벡터는 유전자 총을 이용하여 식물체 저장뿌리를 일시적으로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에 의한 일시적 발현 벡터는 저장뿌리 작물의 종류에 상관없이 형질전환시킬 수 있으며, 작물의 예로서 당근 등을 들 수 있다.
또한 상기 외래 유전자는 식물체내에서 많은 양의 전분을 축적하기 때문에 비교적 당 함량이 높은 저장기관에서 대량 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 식물체 당 유도성 고효율 발현 벡터들에서 상기 프로모터 및 고구마 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자의 5' 비번역 부위의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 프로모터 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 ADP-글루코즈 인산화 효소 유전자 (ibAGP1)의 프로모터 중 당 유도성 발현 프로모터 부위 및 그 유전자의 5' 비번역 부위에 관한 것으로써, 이는 식물체내에서 당 유도성 발현을 유도하며 특히 많은 양의 전분을 축적하기 위해 당 함량이 높은 저장뿌리에서는 높은 정도의 발현을 유도한다. 그러므로 본 발명은 식물의 저장뿌리에서 유용 의료, 산업용 단백질(예, Interferon, growth hormone, Lactoferrin, Phytase 등)을 대량으로 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자( ibAGP1 )의 당 유도성 발현 프로모터의 클로닝
고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자(ibAGP1)의 프로모터는 고구마(Ipomoea batatas cv Yulmi) ADP-글루코즈 인산화 유전자(ibAGP1)(Noh et al., GENE, in press)의 5' 영역 염기서열을 결정하여 확인하였다.
이렇게 확인된 1,908 bp 프로모터 염기서열을 GenBank에 등록하였다(Accession no. AY694185)(도 1 참조). 상기 도 1은 본 발명에 의한 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 고구마 유래 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위 염기서열을 나타내는 도면이다. 도 1에서 단백질 합성 개시 코돈 'ATG'는 밀줄친 굵은 글씨체로, 전사개시 부위인 염기 'A'는 '+1'로 표시하였다.
실시예 2: 식물체 당 유도성 발현 벡터 및 일시적 발현 벡터의 제작
실시예 1에서 클로닝된 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자(ibAGP1)의 당 유도성 발현 프로모터와 68 bp 5' 비번역 부위(염기서열 1, 도 1 참조)를 pBI101과 pBI221 벡터(Clonetech)에 삽입하여 식물체 당 유도성 발현 벡터 및 일시적 발현 벡터를 각각 제작하였다.
먼저, 식물체 당 유도성 발현 벡터의 제작에 대해 구체적으로 살펴보면, 상 기 염기서열 1의 클로닝된 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자(ibAGP1)의 당 유도성 발현 프로모터와 68 bp 5' 비번역 부위를 표 1에 나타나 있는 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭시켜서, SalI과 BamHI으로 절단한 다음 pBI101의 SalI, BamHI 위치에 삽입하여 pSPagp1-101으로 명명하였다(도 2a 참조). 이때 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 55℃-1분, 72℃-1분 30초를 30회 수행한 후 72℃에서 10분간 처리하였다.
5' 프라이머 5‘-CGAGTCGACACTGATACTTTGGTGACT-3' 서열번호 2
3’프라이머 5‘-TGCGGATCCTTTTAAGCCGCGCTACCA-3' 서열번호 3
도 2a에서 GUS는 베타-글루쿠로니다제 II(β-glucuronidase II)를 코딩하는 카나마이신(kanamycin) 저항성 마커 유전자이고, Nos-pro와 Nos-ter는 NPTII의 식물체 발현 프로모터와 터미네이터이다. 그리고 GUS 리포터 유전자는 삽입된 프로모터와 Nos(Nopalin synthase) 터미네이터(Nos-ter)에 의해 식물체에서 발현된다.
한편, 식물체 당 유도성 일시적 발현 벡터의 제작은, 상기 염기서열 1의 클로닝된 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자(ibAGP1)의 당 유도성 발현 프로모터와 68 bp 5' 비번역 부위를 표 2에 나타나 있는 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭시켜서, SphI과 BamHI으로 절단한 다음 pBI221의 SphI, BamHI 위치에 삽입하여 pSPagp1-221으로 명명하였다(도 2b 참조). 이때 PCR은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃-1분, 58℃-1분, 72℃-2분을 30회 수행한 후 72℃에서 5분간 처리하였다.
5' 프라이머 5‘-CGCGCATGCACTGATACTTTGGTGACT-3' 서열번호 4
3' 프라이머 5‘-TGCGGATCCTTTTAAGCCGCGCTACCA-3' 서열번호 5
실시예 3 : 제작된 pSPagp1-101 벡터를 이용한 애기장대 형질전환
실시예 2에서 제작된 pSPagp1-101 벡터를 아크로박테리움(Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법(An, G. 1987, Methods in Enzymology)으로 도입하였다.
형질전환된 아그로박테리아(Agrobacteria)는 2일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 플로랄딥(floral dip) 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal)에 근거하여 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. columbia)의 개화직전 암술머리에 접종하여 애기장대 식물체를 형질전환시켰다.
실시예 4 : 형질전환된 애기장대의 조직 화학적 염색 및 효소학적 분석
실시예 3에서 제조된 애기장대 형질전환체로부터 종자를 수확한 다음, 카나마이신(kanamycin, 30 mg/L)을 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 형질전환 식물체를 선별하였다.
선별된 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법 및 효소학적 방법을 이용하여 조사하였다. 각 형질전환 식물체의 전 조직을 염색하기 위하여, 식물체의 각 조직은 1mM G-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담구어 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 100% 에탄올을 부가함으로써 조직에 존재하는 클로로필을 제거했다.
그 결과, 도 3 에서 나타난 것처럼 pSPagp1-101로 형질전환된 애기장대의 잎과 체관조직, 꽃대의 줄기, 뿌리 정단 부위에서 강하게 GUS의 활성이 확인되었으며, 꽃가루에서는 약한 GUS 활성을 확인하였다.
실시예 5: 본 발명에 의한 당 유도성 발현 프로모터( ibAGP1 프로모터)의 당 유도성 확인
ibAGP1 프로모터의 당 유도성 확인하기 위해, 상기 형질전환 애기장대에 당(sucrose) 농도를 조절한 후 GUS의 활성을 정량적으로 조사하였으며, 이 때 Jefferson et al.,(EMBO J. 6: 3901-3907, 1987) 방법을 사용하였다.
구체적으로는 형질전환 애기장대의 종자를 0.5%, 3%, 6% 당을 함유하는 MS 배지에 파종한 후 14일간 배양한 후, 어린 식물체들을 수거하여 50mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium lauroylsarcosine, 그리고 10 mM β-mercaptoethanol을 함유하는 용액에서 마쇄한 다음, 12,000 x g에서 원심분리하여 상등액을 취했다.
획득된 상등액은 1mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 반응시킨 다음, 0.2M Na2CO3를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광계(fluorometer)를 이용하여 365 nm와 455 nm 파장에서 값을 측정한 다음, 측정된 값은 MUG 표준용액을 이용하여 만든 표준 곡선과 비교함으로써 GUS 활 성을 계산하여 도 4 에 나타내었다.
도 4 에서 보여지는 GUS 활성도는 각 당 처리별로 얻어진 12개 형질전환체 (T2 식물체)를 분석하여 얻어진 값이다. pBI101 벡터는 프로모터가 없는 벡터이며 CaMV35S 프로모터는 pBI121(Clonetech, USA) 벡터를 사용하여 실험하였다. 그 결과 고구마 ibAGP1 유전자 프로모터는 3% 당에 의해 GUS 활성이 8배, 6% 당에 의해 11배 정도 활성이 증가함을 확인할 수 있었다. 한편, 보편적으로 쓰이는 CaMV35S 프로모터에 비해서는 12 내지 15배 증가된 활성을 확인하였다.
실시예 6: 당근 저장뿌리 조직에서 당 유도성 발현 프로모터( ibAGP1 프로모터)의 활성 확인
ibAGP1 프로모터의 활성을 식물의 저장뿌리 조직에서 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제작된 pSPagp1-221 벡터로 당근의 저장뿌리에서 일시적 발현 분석을 실시하였다. 이를 위하여, 비대 성장 중인 직경 2 cm 이하 당근의 저장뿌리를 채취하여 세척한 다음, 저장뿌리의 단면을 약 5mm 두께로 절단하여 습도가 충분히 유지되는 상태로 페트리 디쉬에 넣어 4℃에서 4-5시간 방치한다.
Sanford 등(1993, Meth Enzymol 217:485-509)의 방법에 따라 직경 1.0 μm의 골드입자에 DNA를 섞어서 코팅하고 DNA 농도 1.0 μg, 헬륨가스 압력 1,350 PSi, 당근과의 거리를 6 cm로 조절하여 밤바딩(bombarding)하였다.
밤바딩한 후 25℃, 암 상태에서 24시간 동안 방치한 후 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법으로 확인하였다. 당근의 절단된 저장뿌리 조직을 염색하기 위하 여, DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 X-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide) 1 mM, 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 그리고 0.1 % Triton X-100을 함유하는 용액에 담구어 37℃에서 24시간 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 70% 에탄올에 24시간, 그리고 100% 에탄올을 매일 갈아주면서 수일간 방치하여 조직에 존재하는 색소를 제거하였다.
그 결과, 도 5 에서 보는 것처럼 pSPagp1-221은 당근 저장뿌리 전 조직에서 강한 활성을, 특히 저장뿌리의 직경이 커질수록(식물체내 당 함량이 높아질수록) 강한 활성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 종합해 본 결과, 본 발명에 의한 프로모터는 식물체내에서 당 함량이 높은 저장기관 조직에서 매우 강한 활성을 나타냄을 알 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 당 유도성 발현 프로모터와 동일 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 프로모터를 pBI101과 pBI221에 삽입시켜서 바이너리 식물체 발현 벡터와 일시적 발현에 의한 분석용 벡터를 제조하였으며, 애기장대 형질전환체에서 조직별 활성을 조사하였으며, 3% 와 6% 당 처리에 의해 본 발명에 의한 프로모터의 활성이 8배 내지 12배 증가함을 보였다. 한편, 일시적 발현 분석에 의해 동일 프로모터가 당근 저장뿌리에서 매우 강하게 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 프로모터는 형질전환 저장뿌리 조직에서 유용 단백질을 대량으로 생산하고자 할 때, 혹은 형질전환체를 이용한 저장뿌리 조직의 대사 조절 및 기능성 물질 생산 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 전사 개시 부위로부터 -1 내지 -1,908 부위의 염기서열을 갖는 식물체 당 유도성 발현 프로모터.
  2. 서열번호 1의 전사 개시 부위로부터 +1 내지 +68 부위의 염기서열을 갖는 식물체 당 유도성 발현에 유용한 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위.
  3. 서열번호 1의 전사 개시 부위로부터 -1 내지 -1,908 부위의 염기서열을 갖는 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 서열번호 1의 전사개시 부위로부터 +1 내지 +68 부위의 염기서열을 갖는 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체 당 유도성 형질전환용 바이너리 벡터.
  4. 서열번호 1의 전사 개시 부위로부터 -1 내지 -1,908 부위의 염기서열을 갖는 식물체 당 유도성 발현 프로모터 및 서열번호 1의 전사개시 부위로부터 +1 내지 +68 부위의 염기서열을 갖는 고구마 ADP-글루코즈 인산화 유전자의 5' 비번역 부위를 포함하는 식물체 당 유도성 일시적 발현 분석용 벡터.
  5. 제3항 기재의 식물체 당 유도성 형질전환용 바이너리 벡터를 포함하는 대장 균.
  6. 제4항 기재의 식물체 당 유도성 일시적 발현 분석용 벡터를 포함하는 대장균.
  7. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 PCR용 프라이머.
  8. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 PCR용 프라이머.
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