KR101509139B1

KR101509139B1 - 히알루론산의 정제방법

Info

Publication number: KR101509139B1
Application number: KR20060116319A
Authority: KR
Inventors: 원특연; 이충; 서상현; 김봉수; 김진훈
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2006-11-23
Filing date: 2006-11-23
Publication date: 2015-04-08
Also published as: KR20080046821A; WO2008062998A1

Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 그 염 (이하, ‘히알루론산’이라 한다)의 정제 방법에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 미생물 발효에 의해 얻어진 히알루론산 함유 배양액에 대해 한외여과 공정을 수행하여 분자량이 작은 히알루론산 및 색소를 제거한 후, 활성탄 및 임의로 감마 알루미나를 첨가하여 단백질, 핵산 및 엔도톡신 등 불순물을 제거함을 특징으로 하여, 히알루론산을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

히알루론산의 정제방법 {Method for purifying hyaluronic acid}

본 발명은 미생물 발효에 의해 얻어진 히알루론산 함유 배양액에 대해 한외여과 공정을 수행하여 분자량이 작은 히알루론산 및 색소를 제거한 후, 활성탄 및 임의로 감마 알루미나를 첨가하여 단백질, 핵산 및 엔도톡신 등 불순물을 제거함을 특징으로 하여, 히알루론산을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 금속 이온 제거 단계를 포함함을 특징으로 하여 히알루론산 또는 그의 염을 정제하는 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 분자량 5만 내지 1,000만 달톤의 무색 투명한 고점도 선형 다당류이며, 반복단위인 글루쿠론산과 N-아세틸 글루코즈아민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있다. 히알루론산은 피부, 눈의 초자체, 관절액, 탯줄, 닭 벼슬 등에 널리 분포되어 있으며 스트렙토코커스 속 등의 박테리아에 의해 생성되기도 한다.

고분자량의 히알루론산은 윤활효과 및 세균 등의 침입에 대한 보호 효과가 있어 화장품 첨가제, 안과 수술시 눈 조직의 보호제, 퇴행성 관절염 치료제 등 광범위하게 사용된다.

이러한 히알루론산을 생산하는 방법으로는 위에서 언급한 생체조직으로부터 추출하는 방법과 미생물을 발효시켜 발효 산물로서 회수하는 방법이 있다.

닭 벼슬이나 탯줄 등의 생체조직으로부터 히알루론산을 정제하는 방법(미국 특허 제4,141,973호)은 생체 조직 내에 있는 콘드로이틴 설페이트와 글리코즈아미노 글리칸 등의 생체 고분자 불순물을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정이 필요하기 때문에 생산비용이 많이 들어 대량 생산에 부적합하다. 또한 동물유래의 병원성 물질들의 잔류가능성도 크다는 단점이 있다.

반면에 미생물을 이용한 히알루론산의 생산은 상대적으로 생산 비용이 적게 들고 고분자 히알루론산을 비교적 간단한 정제 과정을 거쳐 높은 수율로 얻을 수 있으며, 동물유래 병원성 물질의 잔류가능성이 낮다고 알려져 있다.

상업적, 특히 의료용으로 사용되기 위해서는 고순도의 히알루론산이 필요하며, 미생물을 이용한 히알루론산 생산의 정제 방법에 대해서는 다음과 같은 기술이 공지되어 있다.

미국특허 제4,517,295호는 스트렙토코커스 파이오젠 배양액을 트리클로로 아세트산으로 처리하여 균체를 응집하게 한 후 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 균체를 제거하고, 30,000Da 분자량 컷 오프(Cut off) 막을 이용하여 배지 유래 저분자량 오염 물질을 제거한 다음 유기용매를 이용한 침전 방법을 통하여 히알루론산을 정제하는 방법을 제시하고 있다. 여기에서는 고순도의 히알루론산을 얻기 위하여 침전물을 다시 녹인 후 CETAB(a mixed trimethylammonium bromide) 또는 CPC(Cetyl pyridium chloride) 등의 염으로 침전시키고 이 침전물을 녹인 후 무균 필터하는 방법을 제 시하고 있는데, 이렇게 얻어진 히알루론산은 단백질 함량이 0.3~0.03%, 핵산 함량이 A₂₆₀ = 0.314 로서 유럽약전 기준 단백질 0.1%이하의 기준을 만족시키지 못하고 있다.

미국특허 제4,782,046호에서는 스트렙토코커스 이퀴 배양액에 음이온 계면활성제인 라우릴 황산염을 0.01% 넣어 세포벽에 붙은 히알루론산을 분리시킨 후 비이온 계면활성제인 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드를 넣어 히알루론산을 침전시키고, 침전물을 2M 염화칼슘(CaCl₂) 용액에 녹인 후 균체를 원심분리 또는 여과하여 상등액을 얻는다. 이 상등액에 알코올을 가하여 히알루론산을 침전시킨 후 침전물을 회수한다. 이 침전물을 녹이고 알코올을 가하여 히알루론산을 침전시키고 침전물을 회수하는 과정을 적어도 3회 이상 더 실시하는 복잡한 정제 과정을 거친다.

미국특허 제4,784,990호에서는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 배양액을 3~4배의 3% 초산 완충액으로 희석한 후 규조토 0.5g/L 을 가하고 필터하여 균체를 제거한다. 상등액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 침전시키고 이 침전물을 용해시킨 후 다시 이소프로판올을 가하여 침전시키고, 침전물을 재용해시킨 후 활성탄을 1g/L 첨가하고 필터하여 활성탄을 제거한다. 상등액에 다시 이소프로판올을 첨가하여 침전시키고 침전물을 이소프로판올로 세척하고 건조시킨다. 의약품용으로 사용하기 위해서는 위 침전물을 녹인 후 CPC(Cetyl pyridium chloride)을 넣어 침전시키고, 이 침전물을 녹인 후 다시 이소프로판올로 침전시키고, 이 침전물을 녹인 후 CPC을 넣어 침전시키고 다시 침전물을 녹인 다음, 이 용액을 최종적으로 마그네슘 실리케이트(Magnesium silicate) 컬럼을 통과시켜 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후, 이소프로필 알코올로 침전시키고 에탄올로 침전물을 세척하는 복잡한 정제과정을 추가로 수행하는 방법을 언급하고 있다.

위에 언급한 방법들은 불순물 제거를 위하여 공통적으로 계면활성제인 사급암모늄염을 사용하고 있는데, 사급암모늄염을 사용할 경우에는 침전물의 재용해에 장시간이 소요되고, 이 과정에서 사급암모늄염으로 인한 계면활성제 폐수가 다량으로 발생하며, 특히 사급암모늄염이 최종 제품에 잔류할 가능성이 높은 단점이 존재한다.

따라서 이러한 단점을 보완하기 위하여 사급암모늄염을 사용하지 않고 다음과 같이 이온 교환 수지를 사용하는 공정이 개발되었다.

일본 공개특허 63-012293호에서는 히알루론산 함유 용액을 다이비닐벤젠 함량이 높은 마크로레티큘라 음이온 교환수지(Dianion HPA-25, HPA-75, IRA-900, IRA-904)로 처리하여 발열성 물질 및 단백질을 제거하는 방법을 제시하고 있다. 즉, 스트렙스코커스 주에피데미쿠스 배양액에 물을 첨가하여 희석한 후, 활성탄을 넣어 불순물을 흡착시키고 여과하여 활성탄을 제거한다. 상등액을 마크로레티큘라 음이온 교환수지가 충진되어 있는 컬럼에 통과시키고, 소금을 1M 농도로 첨가한 후 에탄올 등의 유기용매를 첨가하여 침전시키고 다시 에탄올로 세척한 다음 건조시킨다. 그러나 이 방법은 배양액 3L 당 고가인 음이온 교환수지를 2.5L 사용하므로 상업적 생산에 적용하기에는 경제적이지 못하다.

이에 따라 경제성 문제를 해결하면서 불순물 제거를 위하여 비교적 저가의 흡착제를 사용하는 공정이 개발되었는데, 구체적으로 다음과 같다.

대한민국 특허 공고 제10-0236766호에서는 히알루론산 생산균주 배양액에 에탄올을 가하여 히알루론산을 침전시키고 침전물을 65% 에탄올로 수회 세척하고 이 침전물을 녹인 후 활성탄을 가하여 불순물을 흡착시키고 필터하여 활성탄을 제거한다. 여기에 아연 알루미네이트 분말을 가하여 불순물을 흡착시키고 여과하여 아연 알루미네이트 분말을 제거하고 실리카 겔 칼럼을 통과시킨 후 0.2 ㎛ 필터로 여과한 다음 에탄올 침전시키고 에탄올로 수회 세척하여 히알루론산을 정제한다.

대한민국 등록특허 제0149793호에서는 배양액으로부터 회수된 히알루론산 함유 용액을 소수성 폴리머(폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스타이렌)로 처리한 후, 활성 알루미나를 가하여 불순물 및 저분자량 히알루론산을 선택적으로 제거하고, 유기용매로 침전시킨 후 히알루론산을 진공 건조시키는 것을 특징으로 하는 정제방법을 언급하고 있다.

불순물 제거 효율을 높이기 위하여 흡착제 처리 공정과 동시에 한외여과, 대전된 필터 여과 방법을 사용한 방법이 또한 개발되었다.

일본특허 제2731545호에서는 배양액을 물로 희석한 후, 원심분리하여 균체를 제거하고 한외여과하여 배지 성분을 제거하고 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 침전시킨 후 진공 건조시킨다. 이 침전물을 녹인 후, 히알루론산 함유액을 알루미나와 실리카겔로 순차적으로 처리하여 발열성 물질, 단백질, 핵산, 금속 불순물 등을 제거하고, 유기용매 침전을 통해 히알루론산을 정제하는 방법을 언급하고 있다.

또한, 일본 공개특허 제06-199656호에서는 히알루론산 함유액을 pH 6 내지 10으로 대전시킨 멤브레인 필터를 통과시켜 발열성 물질을 제거하고 에탄올 침전을 통해 히알루론산을 정제하는 방법을 언급하고 있다.

상기의 흡착제를 사용하는 공정의 경우 흡착제 처리의 전 단계로 에탄올 침전, 세척, 건조, 용해 공정을 거쳐야 하는데, 이로 인하여 공정의 소요 시간이 길어지며, 공정의 복잡성 또한 높아지게 된다.

앞에서 열거한 방법들은 처리과정이 복잡하여 대량 생산이 용이하지 않거나, 단백질, 발열성 물질, 핵산, 금속류 불순물 등을 완전히 제거하지 못하고 있다. 또한 CPC(Cetyl pyridium chloride) 등의 사급암모늄염을 사용할 경우에는 이 물질이 정제된 히알루론산에 잔류할 가능성이 있으며, 흡착제 처리의 경우에 전처리로 에탄올 침전 및 용해 공정을 요구한다. 따라서 간편하면서도 고순도의 히알루론산을 얻을 수 있는 정제방법의 필요성이 대두되었다.

이에 본 발명자들은 간편하여 공업적 대량생산이 용이하면서도 단백질, 핵산, 엔도톡신, 금속 이온 등의 불순물이 효과적으로 제거되어 고순도의 히알루론산을 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구하였으며, 그 결과 하기에 언급하는 바와 같은 방법에 의해 이러한 목적이 달성될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 미생물 발효에 의해 얻어지는 히알루론산 함유 배양액으로부터 간편하게 고순도의 히알루론산을 얻을 수 있는 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은

(a) 히알루론산 함유 배양액으로부터 균체를 제거하는 단계,

(b) 균체가 제거된 배양액을 한외여과하는 단계,

(c) 한외여과 잔류액에 활성탄 및 임의로 감마 알루미나를 첨가하여 흡착시킨 후 흡착제를 제거하는 단계, 및

(d) (c) 에서 얻어진 용액에 유기용매를 가하여 히알루론산을 침전시키고, 침전물을 유기용매로 세척한 후 건조시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여 히알루론산 또는 그의 염을 정제하는 방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 균체 제거 후 한외여과를 거친 다음 활성탄 및 임의로 감마 알루미나 처리를 순서대로 수행함을 특징으로 하여 보다 간편하게 고순도의 히알루론산을 얻는 방법을 제공하고 있다.

본 발명은 또한, 금속 이온 제거 단계를 포함함을 특징으로 하여 히알루론산 또는 그의 염을 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 히알루론산이 함유된 배양액은 히알루론산의 생산균주로서 공지된 균주, 예를 들어 스트렙토코커스 속의 균주, 바람직하게는, 스트렙토코커스 이퀴, 스트렙토코커스 주에피데미커스, 스트렙토코커스 파이오젠을 각 균주에 대해 공지된 배양 조건하에 배양하여 얻을 수 있다. 구체적인 균주의 종류 및 배양조건은 당업계에 공지되어 있다.

히알루론산이 함유된 배양액으로부터 균체를 제거하기 위해서는 당업계에 공 지된 임의의 방법, 예를 들어 원심분리, 유기산 침전, 여과(filtration) 등의 방법을 사용할 수 있고, 이중 여과는 필터 프레스(Filter press), 드럼 필터(Drum filter), 뎁스 필터(Depth filter), 막 필터(Membrane filter)를 사용하여 실시하며, 여과 보조제로는 규조토나 펄라이트를 사용한다. 바람직하게는 규조토를 여과 보조제로 사용하는 뎁스 필터(depth filter)를 사용하여 수행한다.

규조토는 규산(SiO₂)을 주성분으로 하는 다공성의 입자로 여과 보조제로서 주로 사용되는 물질이다. 히알루론산의 균체 제거에서 규조토를 여과 보조제로 사용하여 균체 제거를 실시하면 규조토 입자가 균체와 같이 쌓여서 여과막을 막는 것을 방지하여 여과 속도를 높이는 동시에 규조토가 가지는 다공질 구조에 균체가 걸러져서 균체 제거 효율이 높아진다. 그러나 사용되는 규조토의 양이 적으면 균체가 필터 구멍을 막아 여과 시간이 길어지고 규조토 양이 많으면 많은 여과 면적을 필요로 한다. 일반적으로 균체 제거에 사용하는 규조토의 양은 0.5~5%가 바람직하고, 히알루론산 농도는 0.5~20 g/L가 바람직하다.

본 발명의 선행기술에서는 통상 균체를 제거한 후 유기용매 처리 단계를 거치고 있으나 본 발명은 복잡하고 장시간이 소요되는 유기용매 처리를 거치지 않고 곧바로 한외여과(ultrafiltration)를 실시함을 특징으로 한다. 여기서, 한외여과란 일정한 크기의 구멍 크기를 갖는 막에 용액을 통과시키면 분자 크기가 작은 물질은 구멍을 통해 빠져나가고, 분자량이 큰 물질은 막 내에 남아 있게 되며, 이때 계속적으로 물을 공급하여 분자량이 작은 물질을 제거하는 방법을 말한다. 따라서 균체 제거 직후 한외여과를 수행하면 분자량이 작은 히알루론산 및 배지 유래의 불순물을 제거할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 한외여과막의 분자량 cut off는 5,000~300,000Da이며, 좀더 바람직하게는 10,000~100,000Da 범위이다. 300,000Da 을 초과하는 큰 cut off 막을 사용할 경우에는 히알루론산이 여과막 밖으로 빠져나가 수율이 낮아지며, 5,000Da 미만의 작은 cut off 막을 사용할 경우에는 여과 속도가 느려지고 불순물 중 분자량이 큰 물질이 제거되지 않아 불순물 제거 효율이 떨어지게 된다. 한외여과는 히알루론산 여과액의 전도도가 4 mS/cm 이하로 될 때까지 실시하는 것이 바람직하다.

한외여과 공정 후에는 활성탄 및 임의로 감마 알루미나를 통한 흡착제 처리를 실시한다. 감마 알루미나의 처리가 필수적인 것은 아니지만, 바람직하게는 활성탄과 감마 알루미나를 함께 첨가하여 처리한다(실시예 3 참조). 활성탄은 흡착 효과가 큰 탄소 입자로서 단백질, 핵산, 엔도톡신 등의 제거에 탁월한 능력이 있으며, 여기에 감마 알루미나를 첨가할 경우 활성탄 단독 처리로 제거되지 않는 잔류(residual) 단백질을 효과적으로 제거할 수 있다. 이는 실시예 3을 통해서도 확인할 수 있는 데, 활성탄이 감마 알루미나보다 흡착력이 뛰어나긴 하나 활성탄에 감마 알루미나를 첨가할 경우 흡착력이 크게 증가한다(표 3 참조). 활성탄의 처리량은 0.5~5%, 알루미나의 처리량은 0~3%가 바람직하다. 흡착제의 양이 많을 경우 오염 물질의 제거에는 효과적이나 비용이 많이 들고 일부 히알루론산이 흡착제에 흡착되어 수율이 낮아지는 문제가 있고, 흡착제 양이 적을 경우 오염 물질을 효과적으로 제거할 수 없다. 또한, 활성탄 처리시 히알루론산의 농도 0.5~20 g/L, pH 4.0~8.0, 온도 0~40℃의 조건이 바람직하다. 히알루론산의 농도가 낮으면 처리 효율이 떨어지고, 농도가 높으면 점도가 높아져 혼합이 어려워지기 때문이다.

한편, 흡착제 처리공정 중에 소금을 예를 들어 1M 정도의 농도로 용액에 첨가할 수 있다. 이와 같이 소금을 첨가하면 흡착제에 불순물이 잘 흡착되도록 작용하며, 에탄올 침전시 침전물의 형태(모양, 밀도)를 바람직하게 변화시킨다. 즉, 소금 농도가 낮은 상태에서 에탄올을 첨가하면 히알루론산 침전이 섬유상(Fiber)으로 생겨 건조 후 절단 공정 등의 균질화 공정이 추가로 필요하지만, 높은 소금 농도에서 에탄올을 첨가하면 히알루론산 침전이 입자(Particle) 모양으로 이루어져 침전 부피가 작고 제품이 균질해지는 효과가 있다.

이와 같이, 본 발명에 따라 바람직하게는 규조토를 이용하여 균체를 제거한 후 유기용매에 의한 침전과정 없이 한외여과를 실시한 다음 바람직하게는 활성탄에 감마 알루미나를 첨가하여 흡착시키는 순서로 히알루론산을 정제할 경우 한외여과 또는 흡착공정을 거치지 않거나 이들의 순서를 바꾸어 수행하는 경우에 비해 훨씬 고순도로 히알루론산을 정제할 수 있다. 예를 들어, 비교예 1, 2, 3 및 4와 표 1 및 표 2를 통해 알 수 있는 바와 같이, 한외여과 공정과 흡착공정을 함께 수행하는 기술적 구성뿐 아니라, 한외여과 공정을 먼저 수행한 후 흡착공정을 수행하는 순서를 취하는 것이 단백질, 엔도톡신, 핵산 등의 불순물 양을 감소시켜 고순도의 히알루론산을 얻는데 탁월한 효과를 발휘한다.

한편, 본 발명자들은 본 발명에 따른 연구를 수행하는 과정에서 정제된 히알루론산의 금속이온 함량을 감소시킴으로써 인체에 주사시, 특히 눈에 사용시 염증 반응을 방지할 수 있음을 확인하였다. 일반적으로 히알루론산을 의약품으로 사용하기 위해서는 NIF(Non-inflammatory activity), 즉 염증을 일으키지 않는 히알루론산을 사용하도록 되어 있으나, 유럽 약전에서 개시하고 있는 단백질, 핵산 및 엔도톡신의 기준을 만족하도록 정제하여도 염증반응을 일으킬 수 있음을 발견하였으며 그 원인이 금속 이온에 있음을 연구결과 확인할 수 있었다. 즉, 히알루론산은 수많은 음이온을 띠기 때문에 양이온을 띠는 금속 이온, 특히 알칼리 토금속 이온과 잘 결합하므로 정제 히알루론산도 높은 금속이온 함량을 가질 수 있다.

히알루론산에 포함된 금속이온 함량을 감소시키기 위해서는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있으며 바람직하게는 킬레이트제, 보다 바람직하게는 EDTA를 사용할 수 있다. 이러한 금속 이온 제거 단계는 어떤 정제 방법에서도 추가로 사용할 수 있으며 보다 바람직하게는 본 발명에 따른 정제 방법에서 사용할 수 있다. 또한, 금속 이온의 제거 단계는 상기 정제 과정 중 어느 단계에도 삽입될 수 있으나, 바람직하게는 활성탄 처리 후 공정액에 EDTA를 첨가함으로써 금속류 불순물을 쉽게 제거할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 비교예 5 및 표 4를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, EDTA를 처리하지 않을 경우 바륨, 칼슘, 마그네슘 등의 금속류 불순물이 상당량 검출되었으며, EDTA 처리를 통해 간단하고 효과적으로 금속류 불순물이 제거되었다. 이때, EDTA의 처리 농도는 0.01~10 mM로 하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명자들은 본 발명에 따른 정제공정에 따라 활성탄 및 임의로 감마 알루미나 처리를 거친 후 EDTA 처리를 수행할 경우 염증반응을 일으키지 않으며 의약용으로써 안전한 히알루론산을 얻을 수 있음을 발견하였다.

활성탄 처리 후 히알루론산의 회수를 위하여 유기용매를 투입하여 침전시키는 공정을 실시한다. 이때 유기 용매로는 당업계에서 사용되는 통상의 유기용매, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 아세톤, 이소프로필알코올 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이 사용된다. 추가적으로 불순물을 제거하고 건조를 용이하게 하기 위하여 침전 후 추가로 유기용매 세척과정을 수행할 수 있다. 유기용매로 침전된 히알루론산을 당업계에 알려진 통상의 건조방법, 예를 들어, 질소 또는 공기 퍼징, 동결 건조, 진공 건조 등의 방법으로 건조시켜 정제된 히알루론산을 백색 고체 상태로 얻는다. 본 발명자들은 최종적으로 얻어진 히알루론산 고체에 대하여 다음의 방법에 따라 의약품으로서의 사용 기준을 만족시키는지 여부를 측정하였다.

엔도톡신의 경우 히알루론산 나트륨 농도가 1 mg/mL이 되도록 녹이고 찰스 리버 엔도세이프의 LAL 시약을 사용하여 측정하였다. 유럽약전 기준은 0.05 IU/mg 이하이다. 단백질은 히알루론산 나트륨 농도가 10 mg/mL이 되도록 녹이고 로리법으로 정량하였다. 유럽약전 기준은 0.1% 이하이다. 또한 정제 중간단계에 있는 샘플의 단백질은 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 핵산의 측정은 히알루론산 0.10 g을 녹여 최종부피가 30.0 mL 이 되도록 한 후 260 nm에서 흡광도를 측정하였다. 유럽약전 기준은 0.5 이하이다. 금속류 불순물은 히알루론산 0.25 g에 해당하는 양을 질산 1 mL에 녹인 후 가열하고 정제수로 10.0 mL가 되게 한 후, 유럽약전 원자흡광광도법 II(atomic absorption spectrometry)에 따라 시험하였다(유럽약전 Sodium Hyaluronate 시험법 및 Bacterial Endotoxins 참조).

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 비교예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한 다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 예시로서 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 히알루론산의 배양액 제조

1.1. 종배양 배지 준비

20 g/L 포도당, 30 g/L 효모 추출물, 9 g/L 글루탐산 나트륨, 2 g/L의 소금, 2 g/L의 황산 마그네슘, 2 g/L의 인산제일수소 칼륨의 최종 농도가 되도록 배지를 준비하였다. 이때 포도당과 황산 마그네슘은 다른 플라스크에 녹여 멸균하고 식힌 후 다른 원료와 섞었다.

1.2. 종배양 1

단계 1.1에서 준비한 배지 50 mL에 스트렙토코커스 주에피데미커스(KCTC 0075BP)를 1 mL 양으로 접종하고, 35℃, 100rpm의 조건하에 진탕 배양기에서 약 24시간 배양하였다.

1.3. 종배양 2

단계 1.1에서 준비한 배지 950 mL에 종배양 1 배양액 50 mL를 접종하여 35℃, 100rpm의 조건하에 진탕 배양기에서 약 24시간 배양하였다.

1.4. 본배양 배지준비

70 g/L 포도당, 30 g/L 효모 추출물, 9 g/L 글루탐산 나트륨, 2 g/L 소금, 및 2 g/L 황산 마그네슘의 최종 농도가 되도록 배지를 준비하였다. 이때 포도당과 황산 마그네슘은 다른 플라스크에 녹여 멸균하고, 다른 원료는 15L 발효기에서 멸균하고 식힌 후 플라스크에서 준비한 원료와 섞었다.

1.5. 본배양

단계 1.4에서 준비한 배지 9L가 들어있는 15L 발효기에 종배양 2 배양액 1L를 접종하고, 35℃, 200rpm의 조건하에 포도당 농도가 1g/L 이하로 될 때까지 배양하였다. 배양시 배양액의 pH를 6.9 내지 7.3으로 유지하며, 통기량은 1VVM을 유지하였다.

실시예 2: 히알루론산의 정제

2.1. 균체 제거

실시예 1에서 수득된 히알루론산 배양액에 동부피의 정제수를 첨가하여 히알루론산 농도가 0.1~0.4% 범위에 들어오도록 희석한 후, 희석액 부피의 2% 규조토를 넣고 뎁스 필터(depth filter)로 여과하여 균체를 제거하고 히알루론산 상등액을 얻었다.

2.2. 한외여과

균체를 제거한 히알루론산 상등액을 분자량 cut off 크기가 30,000Da인 막을 이용하여 1/2 부피까지 농축시키고, 여기에 정제수를 가하여 일정한 부피를 유지시키면서 한외여과를 실시하여 히알루론산 용액의 전도도가 2mS/cm 일 때 한외여과를 중지하였다.

2.3. 흡착 공정

한외여과 잔류액에 활성탄 2%, 감마 알루미나 1%를 가한 후, 1M 농도가 되도록 염화나트륨을 첨가하고 약 5시간 동안 교반하여 단백질, 핵산, 엔도톡신 등의 불순물을 흡착시킨 후, 여과하여 흡착제를 제거하고 상등액을 취하였다.

2.4. EDTA 처리

흡착 공정 후의 상등액에 EDTA를 최종농도가 1mM 되도록 가한 후 10분 동안 교반하였다.

2.5. 에탄올 침전

히알루론산 상등액에 동부피의 95% 에탄올을 첨가해 히알루론산을 침전시켰다. 이 침전물을 회수한 후, 침전물을 80% 에탄올로 5 회 세척한 다음, 질소를 불어 넣어 건조시켰다.

비교예 1

한외여과 공정을 수행하지 않았다는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 수행하여 히알루론산을 정제하였다.

비교예 2

흡착 공정을 수행하지 않았다는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 수행하여 히알루론산을 정제하였다.

하기 표 1은 실시예 2와 비교예 1 및 2의 정제공정을 통해 수득된 히알루론산 분말을 물에 녹여서 단백질, 엔도톡신, 핵산 등의 불순물 함량을 측정한 결과를 비교하고 있다. 표 1의 결과로부터 한외여과 및 흡착공정을 둘 다 수행하는 것이 불순물 정제에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

비교예 3

한외여과 공정과 흡착공정을 실시예 2와 동일하게 진행하였으며, 에탄올 침전 및 이 후 공정은 실시하지 않았다.

비교예 4

한외여과 공정과 흡착공정의 순서를 바꾸어 정제하는 것을 제외하고는 비교예 3과 동일하게 히알루론산을 정제하였다.

하기 표 2는 비교예 3와 비교예 4의 정제공정을 통해 수득된 히알루론산에서 단백질, 엔도톡신, 핵산 등의 불순물 함량을 측정한 결과를 비교하고 있다. 표 2의 결과로부터 한외여과 공정을 먼저 수행하고 흡착공정을 수행하는 것이 불순물 함량을 줄이는 데 효과적임을 확인할 수 있다.

상기 표 1 및 표 2의 실험결과를 토대로, 단백질, 엔도톡신, 핵산 등의 불순물을 히알루론산 함유 배양액으로부터 제거하는데 한외여과 및 흡착공정의 조합이 매우 효과적이며, 특히 한외여과 공정을 먼저 수행한 후 흡착공정을 수행해야만 이들 불순물 함량을 유럽약전의 기준에 부합되게끔 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 흡착제 종류 및 흡착제 양에 따른 불순물 제거 효과

실시예 2와 동일하게 균체를 제거하고 한외여과공정 및 흡착공정을 실시하되, 흡착제 종류와 양을 하기 표에 나타낸 바와 같이 변화시켰다. 흡착제 제거 후 히알루론산 상등액에 존재하는 단백질, 엔도톡신 및 핵산 양을 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표 3의 결과를 통해 단백질, 엔도톡신, 핵산 등의 불순물 제거에는 활성탄이 감마 알루미나보다 우수하며, 활성탄의 농도가 0.5%일 때보다 3%일 때가 바람직하며, 활성탄과 감마 알루미나를 각각 사용하는 것보다 함께 사용하는 것이 보다 바람직함을 확인할 수 있다.

비교예 5: EDTA 처리에 따른 금속류 불순물 제거 효과

EDTA 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 실시하여 히알루론산을 정제하였다. 여기서, EDTA 처리 결과물과 EDTA 미처리 결과물의 금속이온류 불순물 농도를 측정하여 비교한 결과를 표 4에 나타내었으며, 이를 통해 EDTA 처리가 금속이온류 불순물 처리에 필수적임을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 정제방법은 임의의 미생물을 배양하여 얻어진 히알루론산 함유 배양액으로부터 히알루론산을 정제하는데 광범위하게 사용될 수 있다. 또한 정제 공정 중간 단계에서 복잡한 유기용매 침전 공정을 생략함으로써 단순하고 경제적인 방법으로 고순도의 히알루론산을 얻을 수 있게 해주며, 이렇게 얻어진 히알루 론산은 의약용으로 사용하기에 적합한 순도를 가지고 있다.

Claims

(a) 히알루론산 함유 배양액으로부터 균체를 제거하는 단계,

(b) 균체가 제거된 배양액을 한외여과하는 단계,

(c) 한외여과 잔류액에 활성탄을 0.5∼5%(w/v), 그리고 감마 알루미나를 0.25∼3%(w/v)의 양으로 첨가하여 흡착시킨 후, 활성탄 및 감마 알루미나를 제거하고, EDTA를 최종 농도 0.01∼10mM의 양으로 첨가하여 히알루론산 또는 그의 염에 포함된 금속이온을 제거하는 단계, 및

(d) (c) 에서 얻어진 용액에 유기용매를 가하여 히알루론산을 침전시키고, 침전물을 유기용매로 세척한 후 건조시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여 히알루론산 또는 그의 염을 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 규조토를 사용하여 균체를 제거하는 방법.
제2항에 있어서, 규조토를 0.5 내지 5%(w/v)의 양으로 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)의 한외여과에 사용하는 막의 분자량 컷 오프(cut off)가 5,000~300,000 Da인 방법.
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제1항에 있어서, 단계 (d)의 유기용매가 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이소프 로필 알코올 중에서 선택되는 방법.
제13항에 있어서, 유기용매가 에탄올인 방법.