KR101494436B1 - 오가피 열매 유래 신규 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항염 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

오가피 열매 유래 신규 화합물{Novel compound from the fruits of Acanthopanax sessiliflorus}

본 발명은 신규 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항염 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

염증반응(inflammation)은 비염(rhinitis), 기관지염(bronchitis), 간염(hepatitis), 관절염(arthritis) 등 다양한 질환의 원인이 되므로, 평생 염증 질환을 앓아보지 않은 사람이 없을 정도로 우리 건강과 밀접한 관련이 있다. 특히 평균수명의 연장으로 인구의 노령화로 그 문제가 심각한 퇴행성 질환의 경우, 그 병태생리가 염증·면역 반응과 밀접한 관계가 있다는 연구 보고들이 증가하면서 염증 반응의 기전 및 역할에 대한 관심이 급격히 증가하고 있다. 염증유발물질 중 하나인 NO(Nitric Oxide)는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며 세포살상과 살균작용 이외에도 다양한 생리활성을 나타내는데, 특히, 혈관 내피세포의 이완작용에 있어서 혈압의 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 유도형 산화질소 합성효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 발현을 유도하여 많은 양의 NO를 4 내지 6시간 동안 계속적으로 생성시키는데 이와 같이 생성된 과도한 양의 NO는 상기와 같은 질환들을 유발한다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높으며, 또한 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 사용될 수 있다.

한편, 오가피(Acanthopanax spp)는 두릅나무과에 속하는 다년생 활옆 관목으로, 학명의 Acantho는 가시가 있는 나무를, panax는 만병을 치료한다는 뜻으로, 높이가 2 ~ 3 m에 달하고 10월경에 결실이 되는 내한성 식물로서 우리나라 전역에 17종이 분포한다. 오가피는 생김새가 삼을 닮아 러시아 및 유럽에서는 가시오가피(siberian ginseng)이라고도 불린다. 오가피의 유효성분으로는 sesamin, savinin을 비롯하여 lignan 배당체인 acanthoside-A, B, C, D와 Chiisanoside, polyacetylene, β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, 비타민, 미네랄 등이 있으며, eleutherosides A, B, C, D, I, K, M 등이 풍부하여 좋은 약재로 주목받고 있다. 특히, 이들 중 eleutheroside B, E 등이 많은 연구가 이루어졌으며, 오가피 잎과 줄기에서 추출된 오가피 배당체는 기초대사의 생체기능을 보전하고 광범위하게 작용하는 성질이 있는 것으로 알려져 있다.

최근, 오가피 잎 유래의 sessiloside, chiisanoisde, saponin이 pancreatic lipase의 활성 저해 및 고지방 식이로 유도한 쥐 몸무게 증가를 억제하며, Adenosine diphosphate로 유도되는 혈소판 응고 억제효능이 있음이 보고되었다. 근래에 기능성 식품에 대한 관심 증가로 유익한 식품들이 다양하게 등장하고 있으며, 오가피에 관한 연구는 식품학적 측면에서보다는 약리학적 측면에서 먼저 시작되어 오가피 뿌리에서 분리된 lignan계 배당체의 생리활성을 중심으로 연구되어 왔다. 뿐만 아니라, 지금까지의 오가피에 관한 연구는 오가피의 잎, 줄기, 뿌리를 주재료로 하여 연구되어 왔다.

하지만, 오가피 열매는 식품으로 이용할 수 있으며 우리나라 전 지역에서 자생 및 재배하여 원료의 확보가 용이하지만, 기능성 식품으로서의 그 기능과 효능에 대한 연구는 미비한 실정이다.

또한, 최근에는 자연주의, 웰빙 추세에 따라 천연물을 활용한 약제에 대한 요구가 증가하고 있다. 이를 해결하기 위해 다양한 추출물 제조방법이 개발되고 이에 따라 천연물추출물을 활용한 기능성 식품, 약제 등의 개발이 이어지고 있다. 하지만 아직까지 뛰어난 염증성 질환 치료 효과를 가지며, 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적은 천연 약학적 조성물 또는 그 원료에 대한 개발은 미비한 상황이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 천연물 추출물을 포함하며 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적고, 뛰어난 항염 활성을 가지는 신규한 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 오가피 열매에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 오가피 열매 추출물을 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 오가피 열매 추출물은 오가피 열매를 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환이 피부염, 인후염, 편도염, 섬유근통, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

나아가, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 염증성 질환 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화합물 또는 그의 염이 오가피 열매에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환이 피부염, 인후염, 편도염, 섬유근통, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

나아가, 본 발명은 오가피 열매에 알코올을 가하여 추출물을 수득한 후 감압농축하는 단계; 감압농축한 추출물을 유기 용매를 통해 1차 분획물을 수득하는 단계; 상기 1차 분획물을 크로마토그래피를 통해 2차 분획물을 수득하는 단계; 및 상기 2차 분획물에서 하기 화학식 1의 화합물을 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 알코올이 C₁ ~ C₅ 알코올 중에서 선택되는 어느 하나 이상이고, 상기 유기 용매가 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 화합물 및 허용 가능한 그의 염을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 제조하게 되면, 일산화질소의 생성을 저해하여 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 대응할 수 있으며, 천연물추출물에서 유래하여 종래의 합성 화합물보다 부작용이 적고 염증성 질환 개선 효과가 뛰어난 건강기능식품의 제공이 가능하다.

도 1은 실험예 1에서 측정한 ¹H NMR 그래프이다.
도 2는 실험예 1에서 측정한 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 3은 실험예 1에서 측정한 HRFAB/MS 그래프이다.
도 4는 실험예 2에서 측정한 신규 화합물의 농도에 따른 세포독성활성 그래프이다.
도 5는 실험예 3에서 측정한 신규 화합물의 농도에 따른 일산화질소의 억제 활성 그래프이다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

본 발명의 "화학식 1로 표시되는 화합물"은 화학식 1로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 및/또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 확보가 용이한 오가피 열매의 기능성 식품으로서의 그 기능과 효능에 대한 연구 및 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적은 천연물추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료제에 대한 연구가 미비한 실정이었다.

본 발명은 오가피 열매 유래의 신규 화합물 또는 그의 염을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 확보가 용이한 오가피 열매 유래 신규 화합물의 항염 활성을 활용하여 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품을 제공할 수 있으며, 천연물 유래 성분인 신규 화합물을 이용하여 종래의 합성 약학적 조성물보다 부작용이 적고 염증성 질환 개선 효과가 뛰어난 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품을 제공할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및/또는 약제학적 허용 가능한 그의 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 상기 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 상기 화학식 1의 화합물을 유효 성분으로 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명은 동결건조되어 있고, 정맥 내, 근육 내 또는 피하 주사에 의해서와 같이 투여를 위한 약제학상 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있는 그러한 약제 또는 그의 염이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 기술된 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 고체로서 경구로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있거나, 용액, 현탄액 또는 에멀젼으로서 근육 내 또는 정맥 내로 투여될 수 있다. 바람직하게는 리포좀 현탁액으로서 흡액, 정맥 내 또는 근육 내로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 에어로졸로서 흡입에 의해 투여하기 적당한 약제학적 제제가 제공될 수 있다.

나아가, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 오가피 열매 추출물을 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 통상 1일당 0.01 내지 100 mg의 양을 1회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 상기 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 오가피 열매 추출물은 오가피 열매를 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 추출한 것일 수 있다. 상기 오가피 열매는 통상적으로 구매 가능하거나 재배된 것 등의 특별한 제한은 없다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물의 대상인 염증성 질환은 비염(rhinitis), 기관지염(bronchitis), 간염(hepatitis), 관절염(arthritis) 등 통상 다양한 질환이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면 부종, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 궤양성 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 다양한 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명의 건강기능성 식품은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함한다.

[화학식 1]

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염은 오가피 열매에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능성 식품은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.

상기 건강기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능성 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.

이때, 식품 또는 음료 중 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강기능성 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우, 건강 음료 조성물 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.1 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 건강기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 오가피 열매에 알코올을 가하여 추출물을 수득한 후 감압농축하는 단계; 감압농축한 추출물을 유기 용매를 통해 1차 분획물을 수득하는 단계; 상기 1차 분획물을 크로마토그래피를 통해 2차 분획물을 수득하는 단계; 및 상기 2차 분획물에서 하기 화학식 1의 화합물을 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

상기 오가피 열매에 알코올을 가하여 추출물을 수득한 후 감압농축하는 단계 중 오가피 열매는 통상적으로 구매 가능하거나 재배된 것 등의 특별한 제한은 없다.

또한, 상기 알코올은 통상적으로 천연물 추출에 사용되는 것이라면 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

나아가, 상기 추출물을 수득하는 방법으로는 통상적으로 천연물에서 추출물을 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 감압농축한 추출물을 유기 용매를 통해 1차 분획물을 수득하는 단계 중 유기 용매는 통상적으로 천연물 추출에 사용되는 유기 용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 1차 분획물을 크로마토그래피를 통해 2차 분획물을 수득하는 단계 중 크로마토그래피는 통상적으로 천연물 분리에 사용되는 크로마토그래피법이라면 특별히 제한하지 않는다.

상기 2차 분획물에서 하기 화학식 1의 화합물을 분리 정제하는 단계 중 분리정제 방법은 통상적으로 천연물 중 특정 성분을 분리 정제하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 신규 화합물 분리

실시예 1-1: 오가피 열매 추출물 제조

오가피 열매로는 강원도 정선군에서 재배된 것을 사용하였으며, 상기 오가피 열매 10 kg을 70% 에탄올 수용액에 침지시켜 상온으로 추출하였다. 이후 추출물을 여과하여 추출물을 분리한 다음, 상기 여과 후 남은 것을 70% 에탄올을 사용하여 동일한 방법으로 2회 더 추출공정을 수행하여 각각의 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물들을 모두 합쳐 감압 농축하여 오가피 열매 추출물을 얻었다.

실시예 1-2: 오가피 열매 분획물의 제조

실시예 1-1에서 제조한 오가피 열매 추출물을 에틸 아세테이트(3 L× 3)와 물(3 L)로 분배 추출하였고, 물층을 에틸 아세테이트(EtOAc, 3 L× 3)로 분배 추출하였다. 이후 다시 물층을 n-부탄올(2.5 L × 2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압 농축하여, 에틸 아세테이트 분획물(ASFE), n-부탄올 분획물(ASFB) 및 물 분획물을 얻었다.

실시예 1-3: 신규 화합물의 분리

실시예 1-2에서 제조한 에틸 아세테이트 분획물(ASFE) 100 g을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(SiO₂ c.c.)(Kieselgel 60 (70∼230 mesh)(Ø 12 × 25 cm, CHCl₃-MeOH 15:1(L:L) → 13:1(L:L) → 12:1(L:L) → 11:1(L:L) → 10:1(L:L) → 7:1(L:L) → 5:1(L:L) → 3:1(L:L) → 1:1(L:L), 각각 3 L씩)를 실시하였고, 각 분취액을 박층크로마토그래피(TLC; Thin Layer Chromatography)로 확인하여 14개의 분획물(ASFE-1 ~ ASFE-14)을 얻었다. 그 중 ASFE-8 분획(8.98 g)에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Ø 4 × 12 cm, CHCl₃-MeOH-H₂O=16:3:1(L:L:L) → 12:3:1(L:L:L), 각각 2.5L씩)를 실시하여 9개의 분획(ASFE-8-1 ~ ASFE-8-9)으로 나누었고, ASFE-8-4 분획(1.85 g)에 대해 옥타데실 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(ODS c.c.)(Lichroprep RP-18, 40∼63 ㎛, Merck, Germany)(Ø 4.5 × 11 cm, MeOH-H₂O=3:1(L:L))를 실시하여 21개의 분획물(ASFE-8-4-1 ~ ASFE-8-4-21)을 얻었으며, 이 중에서 화합물 1(ASFE-8-4-9, 13.5 ㎎, TLC(ODS F254S) Rf 0.40, MeOH-H₂O=5:1(L:L))을 분리하였다.

실험예 1. 신규 화합물의 구조 분석

상기 실시예 1-3에서 수득된 화합물 1에 대해 구조 분석을 하기 위하여 IR 스펙트럼으로 Perkin model 599B (Buckinghamshire, England)를 사용하여 측정하였고, NMR은 400 MHz FT-NMR 스펙트로미터(Varian Inova AS 400, Palo Alto, CA)를 사용하였고, NMR용 용매로는 피리딘-ds(Merck, Germany)의 시약을 사용하였다. HRFAB/MS는 JMS 700(JEOL, Japan)을 사용하여 측정함으로써 화합물의 구조 분석을 하였다. 상기에서 측정한 NMR 데이터 중 ¹H NMR는 하기 도 1에, ¹³C-NMR은 하기 도 2에 나타내었고, 상기에서 측정한 HRFAB/MS는 하기 도 3에 나타내었다. 상기 구조 분석을 통해 화합물 1의 하기 화학구조를 결정하였다.

화합물 1:

1) 물성: 흰색 분말 형태 (white powder)

2) HRFAB-MS m/z 647.3744 [M-H]-

3) ¹H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δ) 4.28 (dd, 4.4, 12.4, H-1β), 2.54 (dd, 2.4, 14.0, H-2α), 2.75 (m, H-2β), 1.68 (m, H-9α), 1.82 (m, H-11α), 1.77 (dd, 9.6, 10.8, H-18), 3.47 (ddd, 5.6, 10.8, 11.2, H-19), 2.25 (m, H-22α), 1.59 (m, H-22β), 1.08 (s, H-23a), 1.30 (s, H-24), 0.93 (s, H-25), 0.99 (s, H-26), 1.04 (s, H-27), 1.82 (s, H-29), 4.96 (brs, H-30a). 4.80 (brs, H-30b), 6.35 (d, 8.0, H-1'), 4.11 (dd, 8.0, 8.4, H-2'), 4.27 (dd, 8.4, 8.8, H-3'), 4.30 (dd, 8.8, 8.8, H-4'), 4.01 (m, H-5'), 4.43 (dd, 2.8, 12.0, H-6'α), 4.35 (dd, 4.8, 12.0, H-6'β), ¹³C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δ) 84.5 (C-1), 38.1 (C-2), 170.9 (C-3), 81.6 (C-4), 56.1 (C-5), 19.0 (C-6), 34.6 (C-7), 43.3 (C-8), 42.7 (C-9), 47.9 (C-10), 23.8 (C-11), 25.7 (C-12) 38.8 (C-13), 41.6 (C-14), 30.6 (C-15), 31.3 (C-16), 56.6 (C-17), 49.8 (C-18), 47.8 (C-19), 151.4 (C-20), 32.9 (C-21), 37.6 (C-22), 24.6 (C-23), 32.6 (C-24), 18.8 (C-25), 17.0 (C-26), 15.0 (C-27), 178.8 (C-28), 19.6 (C-29), 110.0 (C-30), 96.3 (C-1'), 74.5 (C-2'), 78.3 (C-3'), 71.2 (C-4'), 79.4 (C-5'), 62.4 (C-6').

3) 분석 결과

실시예 1-3에서 분리된 화합물 1에 대해 positive HRFAB-MS 측정 시 m/z 647.3744 [M-H]-가 관측됨에 따라 분자량은 648[M]+로 결정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 6.35 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1')에서 β-결합을 하고 있는 당의 아노머(anomer) 수소 시그널이 관측되었고, 두 쌍의 엑소메틸렌 올레핀 프로톤(exomethylene olefinic proton)[δ 4.93 (1H, br.s, H-23a), 4.79 (1H, br.s, H-29a), 4.75 (1H, br.s, H-23b), 4.70 (1H, br.s, H-29b)], 1개의 메틴(methine)[δ 3.47 (1H, ddd, J=9.6, 9.6, 4.4 Hz, H-19)], 5개의 터트-메틸기(tert-methyl group)[δ 1.77 (3H, s, H-30), 1.62 (3H, s, H-24), 1.06 (3H, s, H-26), 1.00 (3H, s, H-25), 0.66 (3H, s, H-27)]가 관측되었다. 또한, 산화 메틸렌(oxygenated methylene)[δ 4.41 (1H, dd, J=12.0, 2.0 Hz, H-6'a), 4.32 (1H, dd, J=12.0, 4.4 Hz, H-6'b)] 및 산화 메틴 시그널[δ 4.27 (2H, overlap, H-3', 4'), 4.11 (1H, dd, J=8.0, 8.0, H-2'), 4.00 (1H, m, H-5')]로부터 당 한 분자로부터 유래하는 산소가 치환된 프로톤 시그널(proton signal)이 관측되었다.

¹³C-NMR (DEPT) 스펙트럼에서 총 36개의 시그널이 관측됨에 따라, 트리테르펜(triterpene) 구조의 당 한 분자가 결합하여 있음을 확인하였다. 저자장 영역에서 2개의 카르복시기[δ 178.68 (C-3), 173.06 (C-28)] 및 2개의 이소프로페닐기[151.16 (C-4), 147.48 (C-20), 114.01 (C-29), 109.93 (C-23), 23.63 (C-24), 19.67 (C-30)]가 관측됨에 따라, 2개의 이소프로페닐기가 결합된 루판-트리레트펜(lupane-triterpene)의 골격을 확인하였다. 고자장 영역에서 5개의 메틴 카본(methine carbon), 10개의 메틸렌 카본(methylene carbon) 및 3개의 터트-메틸기(tert-methyl group)가 관측되었다. 당의 아노머 카본(anomer carbon)[δ 96.02 (C-1')]과 산화 메틴(oxygenated methine) 및 메틸렌 카본[δ 79.35 (C-5'), 78.45 (C-3'), 74.13 (C-2'), 71.05 (C-4'), 62.26 (C-6')]이 관측됨에 따라, 결합된 당은 글루코피라노오스(glucopyranose)로 확인되었다. 글루코피라노오스 및 각 이소프로페닐기의 결합 부위를 확인하기 위하여 gHMBC 스펙트럼을 토대로, 각각의 메틸 시그널[δ 1.77 (H-30), 1.62 (H-24)]이 메틴 카본[50.09 (C-5), 47.72 (C-19)]에 연결고리를 보여줌으로써 결합부위를 확인하였다. 당의 아노머 프로톤 시그널[δ 6.32, d, J=8.0 Hz (H-1')]이 카르보닐 카본[δ 173.06 (C-28)]에 연결됨에 따라, C-28번에 β-결합되었음을 확인하였고, 더욱이 아노머 카본[δ 96.02 (C-1')]이 고자장으로 약 5 ppm 정도 이동함을 확인할 수 있었다. 또한, 카르보닐 카본[δ 178.68 (C-3)]이 메틸렌 프로톤 시그널들과의 연결고리가 확인됨에 따라 트리테르펜의 A-링(A-ring)이 개환되어 있는 것을 확인하였다.

위 결과를 종합하여 구조 동정한 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 1은 세코-루판 트리테르펜(seco-lupane triterpene)인, (1R)-1,4-epoxy-3,4-seco-lup-20(30)-ene-3,28-dioic acid 3-O-β-D-glucopyranoside로 결정하였고, 아칸토세실리오사이드 D(acanthosessilioside D)로 명명하였으며, 신규 화합물임을 확인하였다.

실험예 2. 신규 화합물의 세포독성활성 측정

실시예 1-3에서 제조한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 세포독성활성을 측정하기 위하여, 세포 생존률을 측정하였다.

실시예 1-3에서 제조한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 희석하여 0 μM, 1.56 μM, 3.125 μM, 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM 농도의 시료용액을 각각 제조하였다. 이후 96-웰 플레이트(96-well plate)에 1× 105 셀/웰(cell/well)로 세포를 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양한 후 상기 여러 농도(0 μM, 1.56 μM, 3.125 μM, 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM)의 시료용액을 두 군으로 나누어 배지에 첨가하였다. 1시간 후, 한 군에만 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS) 1 ㎍/㎖를 첨가하였다. 24시간이 지난 후, MTT (Microculture Tetrazolium)시약을 넣고 4시간 동안 방치한 후 상등액을 제거하였다. 이후 상기 상등액이 제거된 침전물에 형성된 포르마잔(formazan)을 디메틸 설폭사이드(DMSO; Dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가하여 녹여 용액을 제조하였다. 30분 후 상기 용액을 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포의 생존률은 하기 수학식 1에 따라 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 그룹과 아무것도 처리하지 않은 대조군 그룹 내에 있는 생존세포의 비율로써 측정하였다. 측정된 세포 생존률은 하기 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인하는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존률과 비교하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 실험군의 세포 생존률이 감소하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 실시예 1-3에서 제조한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 세포독성 효과를 보이지 않는 것을 확인하였다.

실험예 3. 항염 활성 측정

RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 의 형태로서 측정하였다. RAW 264.7 세포를 상기 실험예 2와 같은 방법으로 배양한 후, 배양된 RAW 264.7 세포에 상기 실시예 1-3에서 제조한 화합물 1이 포함된 여러 농도(0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM)의 시료용액 첨가하였다. 이후 세포배양 상등액 100 ㎕ 및 Griess시약 100 ㎕를 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 일산화질소양은 하기 도 5에 나타내었다.

상기 Griess 시약은 1%(w/v) 설파닐아미드(sulfanilamide)에 5%(v/v) 인산(phosphoric acid) 및 0.1%(w/v) 나프틸에틸렌디아민-염화수소(naphtylethylenediamine-HCl)을 첨가한 시약이다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 상기 화학식 1로 표현되는 화합물의 농도가 증가함에 따라 일산화질소 억제능이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 본원 발명의 화합물 1인 상기 화학식 1로 표현되는 화합물은 일산화질소 억제활성을 가지는 것을 확인하였다. 특히, 11.9 μM의 낮은 농도를 사용하는 것만으로도 LPS에 의해 생성된 일산화질소 양의 50%를 억제하는 것을 확인하였다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 확인할 수 있듯이, 본원 발명의 신규 화합물인 상기 화학식 1로 표현되는 화합물은 세포독성을 가지지 않으며, 염증 유발인자인 일산화질소를 효과적으로 저해하는 활성을 가져 항염 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

[ 제조예 ]

제조예 1 : 약학적 조성물의 제조

본 발명의 실시예 1-3에서 제조한 상기 화학식 1로 표현되는 화합물(하기, "화합물 1"로 기재함)을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1-1. 산제의 제조

화합물 1 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2. 정제의 제조

화합물 1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3. 캡슐제의 제조

화합물 1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 1-4. 환의 제조

화합물 1 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제조예 1-5. 과립의 제조

화합물 1 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

제조예 2 : 건강기능성 식품의 제조.

제조예 2-1. 건강기능성 식품의 제조

화합물 1 3000 ㎎

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제조예 2-2. 건강 음료의 제조

화합물 1 3 g

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 오가피 열매 추출물을 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   

   

   [화학식 1]
4. 제3항에 있어서, 상기 오가피 열매 추출물은 오가피 열매를 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 추출한 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 염증성 질환이 피부염, 인후염, 편도염, 섬유근통, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 염증성 질환 개선용 건강기능성 식품:
   

   

   [화학식 1]
7. 제6항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 오가피 열매에서 유래된 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 건강기능성 식품.
8. 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환이 피부염, 인후염, 편도염, 섬유근통, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 건강기능성 식품.
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