KR101695186B1 - 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하여 PTP-1B(Protein-tyrosine phosphatase 1B)의 활성화를 월등히 억제하고, 인슐린 분비를 촉진시킴으로써 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용한 약학 또는 식품으로 이용될 수 있는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것입니다.
Description
본 발명은 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 전 세계적으로 3번째로 위험한 질병으로 분리되며 우리나라 사망 원인 5위를 차지하고 있다.
당뇨병은 단일 질환이 아니라 고혈당증의 특징을 공유하는 대사성 질환이며, 당뇨병에서 고혈당증은 인슐린 분비, 인슐린 활성의 결함 또는 두 가지 모두에 의해 발생한다.
당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 자기 면역 공격에 의해 야기되는 췌장 베타 세포 파괴에 의한 인슐린 분비의 결핍의 특징을 가지고 있으며, 10% 정도를 차지한다. 제2형 당뇨병은 인슐린 활성에 대한 말단의 저항과 췌장 베타 세포에 의한 인슐린 분비에 대한 부적절한 보상적 반응으로 인해 일어나며 80~90% 정도를 차지한다.
당뇨병 치료를 위해 현재 많이 이용되고 있는 방법은 인슐린 요법과 경구혈당 강하제가 대표적이다.
혈당이 높으면 여러 가지 합병증이 생기기 때문에 혈당을 낮춰 합병증을 예방해야 한다. 당뇨병 치료의 제1원칙은 혈당을 정상으로 유지하는 것이며, 이를 위해 인슐린이 정상적인 역할을 수행할 것이 요구된다.
경구투여 당뇨약은 그 작용기전에 따라 인슐린 분비를 촉진시키는 것, 인슐린의 활성을 높이는 것, 몸에서 포도당을 덜 만들게 하는 것, 인슐린 생성량을 조절하고 당의 사용을 촉진하는 것 등으로 나눌 수 있다. 또 인슐린은 주로 주사제로 투여되는데, 최근 몸에 붙이는 인슐린에 대한 연구도 진행되고 있다.
한편, 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis)은 느타리버섯속의 아위느타리라고 불리는 아위 버섯의 한 종류로 기존의 아위버섯과는 다른 유전적 특성을 살려 대왕버섯이란 이름으로 특허등록을 가지고 있다. 식용버섯 가운데 대가 2~3㎝, 갓 지름이 10~15㎝으로 그 크기가 가장 큰 것으로 알려져 있으며, 유사 종류의 버섯에 비해 영양성분이 10~40배 이상 높다. 특히, 대왕버섯은 아미노산, 비타민, 미네랄 성분 등이 다량 함유되어 있다. 이 외에도 대왕버섯은 뇌의 신경전달물질인 아세콜린의 분해 효소 분비를 억제시키며, 아위버섯보다 10배 높은 18가지 아미노산을 함유하고 있어 어린이와 청소년의 성장발육에 매우 탁월하며, 다른 버섯에 비해 많은 무기질을 함유하고 있어 각종 성인병 예방에도 효과적으로 기능성 식품 및 기능성 약용 버섯으로서의 가치가 매우 우수하다
상기한 바와 같이 대왕버섯의 다양한 약리효과에 대해 알려져 있지만, 대왕버섯 분획물에 대한 연구는 여전히 미미한 상태이다.
Hypoglycemic effect of hot-water and ethanol extract of Pleurotus nebrodensis, 한국생물공학회, 2007 추계학술대회 및 국제심포지엄. pp.25-25, 2007.10.
본 발명에서는 항당뇨 효과를 갖는 새로운 약물을 개발하기 위해 대왕버섯 분획물을 이용하여 연구를 수행한 결과 대왕버섯 분획물이 우수한 항당뇨 효과가 있음을 확인인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명은 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하여 PTP-1B(Protein-tyrosine phosphatase 1B)의 활성화를 월등히 억제하고, 인슐린 분비를 촉진시켜 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용한 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 분획물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매 중 선택된 어느 하나 이상을 용매로 추출한 대왕버섯 추출물을 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 순차적으로 분획한 분획물인 것이 바람직하다.
상기 분획물은 대왕버섯 에탄올 추출물로부터 분리한 클로로포름 분획물인 것이 바람직하다.
상기 분획물은 대왕버섯 에탄올 추출물로부터 분리한 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 대왕버섯 분획물은 PTP-1B 활성을 억제하고, 인슐린 분비를 촉진킨다.
또한 본 발명은 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하여 PTP-1B(Protein-tyrosine phosphatase 1B)의 활성화를 월등히 억제하고, 인슐린 분비를 촉진시킴으로써 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용한 약학 또는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 α-글루코시다아제 억제능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 PTP-1B(Protein-tyrosine phosphatase 1B) 억제능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 세포(RIN-m5f) 생존력에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 세포(RIN-m5f)에서의 인슐린 분비량에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 PTP-1B(Protein-tyrosine phosphatase 1B) 억제능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 세포(RIN-m5f) 생존력에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 대왕버섯 분획물의 세포(RIN-m5f)에서의 인슐린 분비량에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 대왕버섯 추출물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 또한 상기 대왕버섯 추출물은 대왕버섯을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
상기 대왕버섯은 통상의 버섯 배양을 위해 사용되는 배지를 이용하여 배양될 수 있음은 물론이다.
구체적으로, 상기 대왕버섯은 면실피, 옥수수가루, 밀기울, 미강, 면실박, 콘컵, 사탕수수, 귤껍질분, 설탕, 대두박 및 석고 중 선택된 1종 이상의 성분을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게, 배지 총 부피에 대하여 면실피 30~50중량%, 옥수수가루 2~8중량%, 밀기울 5~15중량%, 미강 2~8중량%, 면실박 2~8중량%, 콘컵 10~26중량%, 사탕수수 5~15중량%, 귤껍질분 0.2~0.8중량%, 설탕 0.2~0.8중량%, 대두박 2~8중량% 및 석고 0.5~1.5중량%(v/v)를 포함하는 배지에서 배양하는 것이나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 대왕버섯은 22~25℃, 수분함량(RH) 60~65%, 산도(pH) 5.5~6.5의 조건에서 배양하는 것이 바람직하다
본 발명의 대왕버섯 분획물은 대왕버섯을 용매로 추출하여, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 대왕버섯 추출물을 얻은 후, 이를 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻을 수 있다.
이때, 대왕버섯 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 정의된 '추출물'은 적절한 용매를 이용하여 대왕버섯으로부터 추출한 것이며, 예를 들어 대왕버섯의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
상기 대왕버섯으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 용매로는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올 등을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 용매로는 에탄올(주정)을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 70%(v/v) 에탄올(주정)을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 추출 온도는 100℃ 이하인 것이 바람직하다. 또한 추출방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법이 사용될 수 있으며, 특히 열수추출법 또는 환류추출법을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
전술한 바와 같이 추출된 대왕버섯 추출물은 유기용매를 이용하여 비극성에서 극성으로 분획하여 각 용매 분획물을 얻을 수 있다.
상기 대왕버섯 분획물을 분획하기 위한 적절한 용매로는 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 특히 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물의 경우 다른 분획물에 비해 PTP-1B 활성 억제와 인슐린 분비 촉진에 의한 항당뇨 효과가 현저히 뛰어나기 때문에 본 발명의 대왕버섯의 분획물은 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 클로로포름 분획물인 것이다.
상기와 같이 유기용매를 이용하여 추출물을 얻은 이후에는 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무건조 또는 동결건조할 수도 있다.
또한 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 대왕버섯 분획물은 전술한 바와 같이 추출 및 분획된 분획물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수도 있다. 있다. 또한 상기 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획으로도 얻을 수 있다.
따라서 본 발명에서 사용되는 대왕버섯 분획물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대왕버섯 분획물은 PTP-1B 활성을 억제하고, 인슐린 분비를 촉진시키는 우수한 효과를 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 대왕버섯 분획물은 당뇨병의 예방, 개선, 치료를 위한 약학 및 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 대왕버섯 분획물은 약학 조성물 총 중량에 대하여 0.01~95중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1~80중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.01중량% 미만일 경우에는 복용의 효율성이 떨어질 수 있으며, 95중량%를 초과할 경우에는 제형화에 어려움이 있을 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 피부외용제의 형태로 제공되는 것이 가장 바람직할 수 있다. 구체적으로, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제 또는 에어로졸제 등의 피부외용제의 형태로 사용될 수 있다.
또한 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경구제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 가질 수 있다. 예컨대, 해당 부위에 국부적으로 사용되는 피부외용제인 경우에는 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다. 해당 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 성분들은 유효성분, 즉 대왕버섯 분획물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한 본 발명은 대왕버섯 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 대왕버섯 분획물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다.
상기 대왕버섯 분획물이 식품 첨가제로 사용할 경우, 대왕버섯 분획물을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 대왕버섯 분획물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있음은 물론이며, 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~95중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1~80중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.01중량% 미만일 경우에는 복용의 효율성이 떨어질 수 있으며, 95중량%를 초과할 경우에는 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.
구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 대왕버섯 분획물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 대왕버섯 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10중량%, 바람직하게는 0.01~0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우, 본 발명의 식품 조성물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 장기간 복용이 가능하다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1. 대왕버섯 분획물 제조
건조한 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 50g을 환류추출장치를 이용하여 70%(w/w) 에탄올로 80℃에서 2회 반복 추출하여 대왕버섯 추출물 24.11g(수율 48.22%)을 얻었다. 이렇게 얻은 대왕버섯 추출물 중 15g을 물 150mL에 녹인 다음 클로로포름(chloroform, CHCl3) 층을 분리하는 과정을 3회 반복하였다. 얻어진 클로로포름 층을 합하여 감압 농축하여 분말형태의 대왕버섯 클로로포름 분획물 0.17g(수율 1.13%)을 얻었다. 남은 물층에 에틸아세테이트(ethyl acetate, CH3COOC2H5) 및 물(H2O)을 순차적으로 가하여 상기와 동일한 방법으로 분획하였으며, 감압 농축 후 동결건조하여 분말형태의 대왕버섯 에틸아세테이트 분획물 1.19g(수율 7.93%) 및 물 분획물 12.23g(수율 81.53%)을 얻었다.
실시예 2. a-글루코시다아제(α-glucosidase) 억제
α-글루코시다아제는 체내에서 당 분해를 유도하는 효소로 이당류를 단당류로 분해하여 혈당이 증가하는데 가장 직접적으로 기여하는 효소이므로, 대왕버섯 분획물의 항당뇨 기능을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
먼저, α-글루코시다아제 저해활성은 니트로페놀 분석법을 응용하여 측정하였다. 0.3U/ml 효모 유래 α-글루코시다아제 효소액 50μl, 10mM p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드 100μl, 상기 실시예 1에서 제조한 대왕버섯 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분확물 2, 10, 50㎍/ml 및 0.2M 포스페이트 완충액(pH 7.0) 50μl와 혼합하여 37℃에서 20분간 배양시킨 후 0.1M Na2CO3 100μl를 가하여 반응을 정지시키고 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 아카보즈(acarbos, 10mM)를 사용하였다. 효소활성의 억제율은 다음 식에 의하여 산출하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
α-글루코시다아제 저해활성(%)={1-(시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)}×100
도 1에 도시한 바와 같이, 대왕버섯 클로로포름 분획물 및 대왕버섯 에틸아세테이트 분획물 처리군은 α-글루코시다아제 효소 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 단백질 티로신 탈인산가수분해효소(protein-tyrosine phosphatase 1B, PTP-1B) 억제
인슐린이 그 수용체와 결합하면 IRS-1(Insulin receptor substrate-1), PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 경로를 통해 당 대사와 글리코겐 합성을 유도하게된다. 이때 인슐린과 인슐린 수용체의 결합을 방해하는 효소가 PTP-1B이며, PTP-1B의 활성화를 억제하면 인슐린의 작용을 유도하게 된다. 따라서, 본 실시예에서는 대왕버섯 분획물의 PTP-1B 억제를 통한 항당뇨 기능을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
PTP1B 효소 활성은 기질인 파라-니트로페닐 포스페이트(p-NPP)를 사용하여 측정하였다. 50mM 구연산염 완충액(pH 6.0), 0.1M NaCl, 1mM EDTA 및 1mM DTT가 포함된 완충용액에 20mM p-NPP, PTP1B(0.05㎍) 그리고 상기 실시예 1에서 제조한 대왕버섯 에탄올 추출물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물을 각각 0.8, 4㎍/ml의 농도로 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 10N NaOH 10μl를 첨가하여 반응을 종결하였다. 이때 대조군으로 구아바 잎 추출물(4㎍/ml)을 사용하였다. p-니트로페놀은 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율(%)은 완충용액에 효소와 기질만 넣고 반응시켜 측정한 값을 100%로 하고 효소만 넣어 측정한 값을 0%로 하여 계산한 후 이에 대한 비율로 나타내었다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유효성분인 대왕버섯 분획물의 경우 대왕버섯 에탄올 추출물과 대비하여 농도의존적으로 PTP-1B 효소를 더욱 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 대왕버섯 클로로포름 분획물의 경우 4㎍/ml의 농도에서 다른 분획물들과 대비하여 2배 이상의 향상된 PTP-1B 효소 억제능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 4㎍/ml의 농도에서 구아바 잎 추출물을 처리한 대조군과 비교하여 대왕버섯 클로로포름 분획물, 에틸아세에이트 분획물 처리군에서의 PTP-1B 효소 억제능이 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 세포 생존률
상기 실시예 1에서 제조한 대왕버섯 분획물의 세포 생존력을 분석하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 사용하여 실험을 수행하였다.
Rin-m5F(rat insulinoma β-cell) 세포는 ATCC에서 구매하였으며, 10% 소 태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 RIN-m5F 세포를 24-웰 플레이트에 3×105cell/well의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양기에 배양한 후, 상기 실시예 1에서 제조한 대왕버섯 추출물과 그의 분획물들을 각각 4, 20, 100㎍/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 MTT 완충액을 사용하여 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대왕버섯 에탄올 추출물과 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물은 100㎍/ml 농도까지 세포가 생존하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 인슐린 분비능
상기 실시예 4의 세포생존율 실험결과 대왕버섯 분획물의 경우 전 농도에서 세포 생존율이 우수하게 나타났으며, 따라서 세포 생존율이 우수하게 나타난 중간 농도값(4, 20㎍/ml)을 취하여 인슐린 분비능을 시험하였다.
먼저, Rin-m5F(rat insulinoma β-cell) 세포에 웰당 3.0×105개로 6-wellplate에 분주하여 완전배지에서 3일간 배양한 후, RPMI 배지의 글루코오즈를 씻어내기 위해, Krebs-Ringer bicarbonate(KRB) 완충제를 소량 넣어 세척하였다. 이후 KRB 완충제를 넣고 37℃에서 40분 동안 배양한 후 완충제를 제거하고 정상대조군(Vehicle), 당뇨대조군(Glucose 16.7mM), KCL 25mM 및 상기 실시예 1에서 제조한 대왕버섯 추출물과 분획물(4, 20㎍/ml)을 각각 넣고 1시간 배양하였다. 그 다음 상층액을 취하여 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 모아 -20℃에서 보관하였다. 상기 세포에서 분비된 인슐린의 양을 insulin RIA kit로 측정하고, 각 웰의 세포 단백질의 농도를 측정하여 각 단위 그램 단백질 당 인슐린 분비량을 계산하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유효성분인 대왕버섯 클로로포름 분획물 처리군은 4㎍/ml와 20㎍/ml의 농도에서 모두 인슐린 분비량이 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다. 특히, 20㎍/ml의 농도에서는 대왕버섯 클로로포름 분획물 처리군의 경우 대왕버섯 에탄올 추출물 처리군과 대비하여 1.5배 이상 향상된 인슐린 분비량을 보임을 확인할 수 있었으며, 이같은 결과로부터 본 발명의 유효성분인 대왕버섯 클로로포름 분획물이 당뇨병의 예방, 개선, 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것임을 예측할 수 있었다.
제제예 1. 약학 제제의 제조
산제 제조
대왕버섯 클로로포름 분획물 20㎎, 유당 100㎎ 및 탈트 10㎎을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
정제 제조
대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 10㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
캡슐제 제조
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물물 10㎎, 결정성 셀룰로오스 3㎎, 락토오스 14.8㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.2㎎을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
주사제 제조
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 10㎎, 만니톨 180㎎, 주사용 멸균 증류수 2,974㎎ 및 Na2HPO4· 2H2O 26㎎으로 제조하였다.
액제 제조
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 20㎎, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 더 가하여 전체 100mL로 조절한 후 갈색병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예 2. 식품 제제의 제조
건강식품 제조
대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 100㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70g, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2g, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10g, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50g, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎ 및 염화마그네슘 24.8㎎을 혼합한 다음, 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다. 이때, 상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
건강음료 제조
통상의 건강음료 제조방법에 따라 대왕버섯 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 100㎎, 비타민 C 15g, 비타민 E(분말) 100g, 젖산철 19.75g, 산화아연 3.5g, 니코틴산아미드 3.5g, 비타민 A 0.2g, 비타민 B1 0.25g, 비타민 B2 0.3g 및 정량의 물을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다. 이때, 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (7)
- 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 에탄올 추출물로부터 클로로포름으로 분획한 클로로포름 분획물; 또는 대왕버섯 에탄올 추출물로부터 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차 분획한 에틸아세테이트 분획물;을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 에탄올 추출물은 에탄올 70%(v/v) 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 클로로포름 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 약학 조성물 총 중량에 대하여 0.01~95중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 클로로포름 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 PTP-1B 활성을 억제하고, 인슐린 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 대왕버섯(Pleurotus nebrodensis) 에탄올 추출물로부터 클로로포름으로 분획한 클로로포름 분획물; 또는 대왕버섯 에탄올 추출물로부터 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차 분획한 에틸아세테이트 분획물;을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
KR20050078860A (ko) * | 2004-02-03 | 2005-08-08 | 학교법인 영광학원 | 각종 버섯의 자실체 또는 균사체로부터 얻은 추출물들을함유한 기능성 소주 및 그 제조방법 |
KR20100112205A (ko) * | 2001-04-27 | 2010-10-18 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 면역강화제 |
KR20150119560A (ko) * | 2014-04-15 | 2015-10-26 | 대한민국(농촌진흥청장) | 노랑느타리버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 |
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2016
- 2016-02-05 KR KR1020160014989A patent/KR101695186B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Byoung-rai Lee 외 2명, "Hypoglycemic effect of hot-water and ethanol extract of Pleurotus nebrodensis", 2007 한국생물공학회 추계학술대회 및 국제심포지엄 초록집, 제25면, 2007년 발행* * |
Hypoglycemic effect of hot-water and ethanol extract of Pleurotus nebrodensis, 한국생물공학회, 2007 추계학술대회 및 국제심포지엄. pp.25-25, 2007.10. |
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