KR101493065B1 - 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서 - Google Patents

후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 후각 수용체를 포함하는 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 암 진단을 위한 물질과 결합하는 후각 수용체를 이용하여 암 진단 물질과 후각 수용체의 결합에 의한 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정함으로써 암을 진단할 수 있는 후각 수용체를 포함하는 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에 관한 것이다.
본 발명에 따른 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터를 포함하는 암센서는 후각 수용체 단백질을 이용하여 후각물질의 신호 전달 기작과 유사하게 민감도 및 선택도가 우수하여 실시간으로 fM 범위까지 고특이적으로 암 특이 물질을 검출할 수 있다.

Description

후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서{CANCER SENSOR BASED ON OLFACTORY RECEPTOR AND FIELD EFFECT TRANSISTOR}
본 발명은 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 특정 암에 의하여 발생되는 암 진단 물질과 특이적으로 결합하는 후각 수용체를 이용하여, 상기 암 진단 물질과 후각 수용체의 결합에 의한 컨덕턴스 변화를 측정함으로써 암을 진단할 수 있는 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에 관한 것이다.
종래 암 센서들은 암 진단의 선택도를 높이기 위하여 항체(antibody) 및 압타머(aptamer)와 같은 생체분자를 사용하였다. 화학 물질 바이오 마커가 진단에 사용되지 않은 가장 중요한 이유는 화학물질을 선택적으로 선별하는 적합한 생체 분자를 찾기 어렵기 때문이다. 이러한 관점에서, 390여 종류의 인간 후각 수용체(human olfactory receptor, hORs)는 화학 바이오 마커를 검출하기 위한 후보가 될 수 있다. 인간의 코는 선택적으로 수천 가지의 휘발성 화합물을 구별할 수 있으며, 이 능력은 후각 감각뉴런으로 표현되는 인간 후각 수용체의 높은 선택도에서 비롯된 것이다.
최근에 인간의 오감(시각, 촉각, 청각, 후각, 미각)을 모사하는 인공감각기관에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 다른 감각기관에 비해 후각을 모사하려는 연구는 덜 진척되어 있으며, 최근에야 인간 후각의 기본적 메커니즘이 규명되기 시작하고 이를 이용한 생체전자코(bioelectronic nose) 연구가 진행되고 있다. 특히 2004년 미국 리처드 액설 및 린다 벅은 후각 인지 메커니즘을 규명하여 노벨상을 수상하였다.
최근에 단일벽탄소나노튜브(SWNTs,single-walled carbon nanotubes)전계 효과트랜지스터(FETs,field-effect transistors) 및 인간 후각 수용체를 이용한 고민감성 바이오센서에 대한 광범위한 연구가 진행되고 있다. 이러한 예로서 종래 대장균에서 발현된 후각 수용체를 SWNT-FETs 소자에 흡착시키는 방법으로 고정화시켜 이를 생체전자코로 이용한 사례가 보고되어 있었다.
또한, 전계효과 트랜지스터(field effect transistor, FETs)를 이용한 암 진단용 센서로 혈관형성인자를 감지하는 대한민국 등록특허 10-1140049호가 공지되어 있었으나, 후각 수용체를 이용하여 암 진단이 가능한 센서로는 알려진 바가 없었다.
대한민국 등록특허 10-1140049호
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 새로운 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 위하여,
기판;
상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극(source electrodes), 드레인 전극(drain electrodes); 및
상기 소스 전극의 표면, 상기 드레인 전극에 고정된 암 진단용 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클(nanovesicle); 을 포함하는 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 제공한다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 암 진단용 후각 수용체 단백질은 OR1J2 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에서는 상기 후각 수용체 단백질과 시료 내의 후각 물질이 결합하여 cAMP 경로를 통해 나노베지클 내로 양이온이 유입되어 전류 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.
도 1(a)에 상기 후각 수용체, G 단백질, 아데닐산 사이클레이즈(adenylyl cyclase) 및 이온채널을 포함하는 인공 후각 세포를 도시하였다. 상기 후각 수용체 단백질에 의한 신호의 전달은 크게 cyclic adenosine monophosphate(cAMP) 경로와 ionsitol triphosphate(IP3)경로로 나누어 진다. cAMP 경로는 우선 리간드와 반응을 일으키면, adenylate cyclase (adenylyl cyclase, AC) 효소를 활성화한다. 활성화된 adenylate cyclase (adenylyl cyclase, AC) 효소는 ATP(adenosine triphosphate)를 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 로 바꾸어 준다. 그 다음 cAMP는 cyclic-nucleotide-gated (CNG) 채널을 활성화 시켜 세포 내로 Ca2 +과 Na+을 들어오게 한다. 이렇게 양이온이 유입되면 섬모 막(ciliary membrane)의 감극을 유발하고 엑손(exon)의 포텐셜(potential) 변화를 이끌어 낸다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 나노베지클은 Gαolf 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 암 진단용 후각 수용체 단백질은 G 단백질 연결 수용체(GPCR)의 한 종류로, 7개의 막 통과 도메인 모티브(transmembrane domain motifs)를 가지며, 지질 이중막의 표면, 또는 내부 또는 표면과 내부에 걸쳐 존재할 수 있다. G 단백질 연결 수용체는 세포 내 기능이나 질병에 관련하여 매우 중요한 역할을 한다. G 단백질 연결 수용체는 리간드와 결합했을 때, G 단백질의 세 소단위 Gα, Gβ, Gγ 중 Gα 와 Gβγ 구성요소의 분리를 유도하여, 궁극적으로 효소와 이온채널반응기를 조절한다.
본 발명에 있어서, 상기 후각 수용체 단백질은 상기 나노베지클 내에 포함되고, 구체적으로 상기 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클은
i)후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질 전환하는 단계;
ii)상기 동물 세포를 화합물로 처리하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클을 분비하도록 하는 단계; 및
iii)상기 분비된 나노베지클을 원심 분리에 의하여 동물 세포로부터 분리하는 단계;에 의하여 제조된다.
본 발명에 있어서, 상기 형질 전환된 동물 세포로부터 나노베지클을 분비하도록 하기 위해 사이토칼라신 비(cytochalasin B)를 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 나노베지클은 세포 수송 단백질 RTP 1S(receptor-transporting protein 1S)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 수용체 수송 단백질은 일종의 샤페론(chaperone)과 같이 작용하여 후각 수용체 단백질을 보조한다. 따라서, 수용체 수송 단백질의 공동발현으로 후각 수용체 단백질 발현 수준은 증가한다. 본 발명의 일 실시예에서, 후각 수용체와 함께 Gαolf 및 RTP1S의 공동발현은 세포와 나노베지클의 후각 신호의 증폭에 도움을 주는 것으로 나타났다. 상기 세포 수송 단백질 RTP 1S(receptor-transporting protein 1S)는 상기 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로 동물 세포를 형질 전환시 상기 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자와 동시에 형질 전환됨으로써 발현되는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 암은 상기 인간 후각 수용체 OR1J2 단백질과 특이적으로 결합하는 헵타날(heptanal)을 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 암은 특이적으로 헵타날을 생성하는 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 센서 제작을 위한 기판은 일반적으로 전계 효과 트랜지스터를 제작하기 위해 사용되는 기판을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 실리콘, 유리, 석영, 금속, 플라스틱 및 산화물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 소스 전극 및 드레인 전극은 백금, 금, 크롬, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐 및 티타늄으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 암 센서에 있어서, 상기 소스 전극 및 드레인 전극 표면은 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 및 나노볼로 이루어진 그룹에서 선택되는 전도성 고분자 재료로 표면 개질되고, 상기 나노베지클은 상기 전도성 고분자 재료 에 부착되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 단일벽 나노탄소튜브는 상기 PDL(poly-D-lysine)으로 코팅될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서와 시료를 접촉시키는 단계 ; 및
상기 시료내의 헵타날과 상기 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서의 인간 후각 수용체 OR1J2 단백질과의 결합에 의한 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정하는 단계; 를 포함하는 본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 이용하는 암 진단방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 센서와 시료를 접촉시키는 단계에서 시료는 액상 또는 기상으로 나노베지클 기반의 전계효과 트랜지스터와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에서는 앞서 살펴본 바와 같이 후각 수용체 단백질과 시료 내의 후각 물질이 결합하여 나노베지클 내로 양이온이 유입되어 전류 변화를 일으키므로, 전계 효과 트랜지스터 를 이용하여 이에 따른 컨덕턴스(conductance) 변화를 측정함으로써 암을 진단할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서는 특정암에서 생성되는 물질과 결합하는 후각 수용체 단백질을 이용하여 후각 물질의 신호 전달 기작과 유사하게 민감도 및 선택도가 우수하여 실시간으로 fM(femto-molar)범위까지 고특이적으로 암 특이 물질을 검출할 수 있다.
도 1은 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터(SWNT-FETs) 상에 나노베지클의 고정화에 의하여 제조된 본 발명에 의한 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서에서 세포 및 나노베지클로부터 후각 신호 발생에 따른 암 진단 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 암 진단에 유용한 수용체를 확인하기 위하여 인간 후각 수용체 라이브러리를 스크리닝한 결과를 나타낸다.
도 3은 웨스턴 블롯(western blot)에 의하여 세포 및 나노베지클 내에서의 형질 전환 단백질을 검출한 결과를 나타낸다.
도 4는 세포 및 나노베지클 내에서 헵타날(heptanal)과의 반응에 의한 컨덕턴스(conductance) 변화를 실시간으로 측정한 데이터를 나타낸다.
도 5는 아무 처리도 되지 않은 단일벽탄소나노튜브, PDL(poly-D-lysine) 코팅된 단일벽탄소나노튜브, 나노베지클이 고정화된 단일벽탄소나노튜브의 전류-전압 관계를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 사용하여 헵타날 검출시 민감도 및 선택도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서를 사용하여 인간 혈장 내에 헵타날 검출 실험 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 암 진단을 위한 후각 수용체 단백질 스크리닝
30가지의 후각 수용체 단백질 샘플을 준비하고, 10mM Fura-2/AM(Invitrogen, USA)를 포함하는 링거용액 (Ringer's solution, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM glucose, 및 10 mM HEPES (pH 7.4))에서 세포를 배양함으로써 칼슘 이온 민감 형광 염료, 즉, 형광 칼슘 지시제로서 Fura-2를 로딩하고, 암진단을 위한 지표 물질로서 100μM의 헵타날(heptanal)를 투입하고, 세포 내부로의 Ca2+ 이온의 유입 반응의 크기를 측정하였다.
후각 수용체 단백질이 헵타날과 반응할 경우 세포 내로 Ca2 + 이온이 유입되게 되고, 세포 내로 유입된 Ca2 + 이온이 Fura-2 와 결합하는 경우 Fura-2 의 발광 파장을 380 nm 에서 340 nm 로 변화되게 된다. 따라서, 세포 내부로의 Ca2 + 이온의 유입은 340/380 nm 에서의 파장의 비로 계산하였다.
30가지의 후각 수용체 단백질에 대한 실험 결과를 도 2(a)에 나타내었다. 도 2에서 OR1J2 단백질이 헵타날과 특이적으로 결합하는 수용체임을 확인할 수 있다.
< 실험예 1> 후각 수용체 단백질의 특이성 시험
상기 실시예 1에서 선택된 후각 수용체 단백질 OR1J2 이 헵타날(heptanal)에 대한 선택성이 있는지 여부를 확인하기 위하여 후각 수용체 단백질 OR1J2 를 헵타날 및 헵타날과 유사한 구조를 가진 헥사날(hexanal), 옥타날(octanal) 및 노날(nonanal)과 반응시키고 세포 내부로의 Ca2 + 이온의 유입 반응의 크기를 측정한 결과를 도 2(b)에 나타내었다.
도 2(b)에서 후각 수용체 단백질 OR1J2 이 헵타날을 첨가한 경우, Ca2 + 이 급격하게 유입되었으나, 헵타날과 유사한 구조를 가진 헥사날, 옥타날, 노나날을 첨가한 경우 변화가 거의 없어 본 발명에 의한 후각 수용체 단백질 OR1J2 이 헵타날에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있다.
< 실시예 2> 형질 전환 세포 및 나노베지클의 제작
동물 세포로 포유류 세포인 HEK-293 세포를 사용하였으며, 상기 실시예 1에서 스크리닝된 후각 수용체 OR1J2 및 Gαolf , RTP1S 유전자를 동시에 형질전환하였다.
인간 배아 신장(HEK-293, human embryonic kidney) 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco, USA) 및 1% PS(penicillin-streptomycin, Gibco, USA)를 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, WelGENE, South Korea)에서 37˚C, 5% CO2 의 조건으로 배양하였다.
Neon Transfection System (Invitrogen, USA)을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 세포를 거두고, 1.0 x 107 세포 mL- 1 로 재현탁하였다. 그 후, 세포 용액 100㎕을 단백질을 세포막 표면으로 유도하는 임포트 시퀀스(import sequence)인 Rho-tag 융합된 OR1J2 후각 수용체 유전자를 코딩하는 pcDNA3 플라스미드 5㎍과 혼합하였다. 이후 각각 Gαolf 및 RTP1S 유전자를 인코팅하는 1㎍ 및 0.5㎍ pcDNA3 플라스미드를 각각 추가적으로 혼합하였다. 혼합 과정 후, 전기 펄스(1100 V, 3회, 그리고 10 milli-sec)를 처리하고, 세포를 48시간 동안 배양하였다.
이와 같이 OR1J2 및 Gαolf , RTP1S 유전자로 동시에 형질 전환된 세포로부터 나노베지클을 제조 분리하였다. 상기 형질전환된 세포를 사이토칼라신 비(cytochalasin B)(Sigma, USA) 10 mg 이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 에서 25분간 교반하면서 배양하였다. 제조된 나노베지클은 에펜 도르프 튜브(Eppendorf tubes)에서 500g, 10분 동안 원심분리기로 세포로부터 분리하였으며, 15,000g, 30분 동안 원심분리기하여 수집되었다. 나노베지클을 dPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline; Gibco, USA)에서 총 단백질 농도의 1000ng mL- 1 로 재현탁하였다.
< 실험예 2> 형질 전환 단백질 발현 확인
< 실험예 2-1> Gα olf 단백질 발현 확인
상기 실시예 2에서 제조된 형질전환된 세포 및 세포로부터 분리된 나노베지클에서 형질전환시킨 단백질이 발현되고 있음을 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 사용하여 확인하였다.
먼저 Gαolf 의 발현 여부를 확인하기 위해 상기 실시예 2에서 제조된 형질전환된 세포, 상기 형질전환된 세포로부터 분리된 나노베지클을 준비하고, 준비된 시료를 초음파처리(2초 간격으로 총 5분)에 의해 용해하고, 15000g, 30분 동안 원심분리하여 상청액(supernatant)과 침전물(pellet)을 분리하였다. 상청액을 동결 건조하고, 단백질 농도를 높이기 위해 재현탁하였다. 1mg mL-1 총 단백질 밀도를 가지는 상청액 및 침전물을 사용하였다.
준비된 단백질 샘플을 SDS (sodium dodecyl sulfate)- 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동으로 분리하였고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane, PDFV; Bio-Rad, USA)에 0.15A, 60분의 조건으로 이동시켰다. 상기 막을 5 wt% skim milk 와 0.1 vol% Tween-20 을 녹인 PBS에서 2시간 동안 배양하고, 1:1000으로 희석된 1차 항체(primary antibody) 내에서 2시간 동안 배양하였다. 항-Rho 토끼 항체(GenScript, USA) 및 항 Gαolf 염소 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1차 항체로 사용하였다. 상기 막은 1:1000으로 희석된 2차 항체 용액 내에서 2시간 동안 배양되었다. 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)와 결합된 항-토끼 IgG(Amersham-Pharmacia Biotech, UK) 및 항-염소 IgG(Millipore, USA)를 2차 항체로 사용하였다. 형광신호를 향상된 화학 발광 검출 키트 (Amersham Pharmacia Biotech, UK)로 측정하고, 그 결과를 도 3(a)에 나타내었다. 도 3(a)에서 세포 및 세로포부터 배출된 나노베지클 내에 Gαolf 단백질이 존재하고 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2-2> 후각 수용체 단백질의 발현 확인
형질전환시킨 후각 수용체 단백질 OR1J2 의 발현 여부 및 RTP1S 에 의하여 후각 수용체 단백질 OR1J2 의 발현이 어떠한 영향을 주는지를 알아보기 위하여 OR1J2와 RTP1S 로 형질전환된 세포, 형질전환되지 않은 세포 및 상기 OR1J2와 RTP1S 로 형질전환된 세포, 형질전환되지 않은 세포로부터 각각 분리된 나노베지클의 4가지 시료에 대해서 상기 실험예에서와 같은 웨스턴 블롯(western blot) 방법을 사용하여 후각 수용체 단백질 OR1J2의 발현을 확인하고 그 결과를 도 3(b)에 나타내었다.
도 3(b)에서 후각 수용체 단백질이 RTP1S 로 형질전환된 세포, RTP1S 로 형질전환되지 않은 세포 및 상기 OR1J2 와 RTP1S 로 RTP1S 로 형질전환된 세포, 형질전환되지 않은 세포로부터 각각 분리된 나노베지클의 4가지 시료 모두에서 발현되며, 특히 RTP1S 와 같이 형질전환된 lane 2와 4의 경우 lane 1, 3에 비해 검출되는 OR1J2가 많아서 후각 수용체 단백질 OR1J2의 발현 수준이 RTP1S 와 공동 발현에 의해 증가되는 것을 알 수 있다.
< 실험예 3> 칼슘 이온 전달 실험
OR1J2와 RTP1S 로 형질전환된 세포, 형질전환되지 않은 세포 및 상기 OR1J2와 RTP1S 로 형질전환된 세포, 형질전환되지 않은 세포로부터 각각 분리된 나노베지클의 4가지 시료에 대해서 상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 칼슘 이온 전달 실험을 실시하였다.
10mM Fura-2/AM(Invitrogen, USA)를 포함하는 링거용액 (Ringer? solution, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM glucose, 및 10 mM HEPES (pH 7.4))에서 세포를 배양함으로써, 후각 수용체 발현 세포 및 나노베지클에 칼슘 이온 민감 형광 염료, 형광 칼슘 지시제로서 Fura-2를 로딩하였다.
Fura-2 함유 용액을 순수 링거용액에 첨가한 후, 형광 강도를 GENios Pro microplate reader (Tecan, Germany)를 이용하여 측정하였다. 분광형광광도계(spectrofluorophotometer; Tecan, Switzerland) 장비를 이용하여, 340nm 및 380nm를 교대로 이중 자극(excitation)을 주고, 510nm에서 발광되는 형광을 측정하였다. 나노베지클 내 칼슘 신호를 측정하기 위하여, 나노베지클에 로딩된 Fura-2를 0.1mg mL-1 PDL(poly-D-lysine)로 미리 코팅된 96-well 플레이트(Nunc, Germany) 내에 고정하고, 나노베지클로부터 형광신호를 측정하였다.
1mM의 헵타날(heptanal)을 주입시 시간에 따른 Ca2 + 이온의 유입을 후각 수용체 OR1J2와 RTP1S로 형질전환된 세포 및 형질전화되지 않은 세포 및 이들로부터 분리된 나노베지클 내에서 확인하고 그 결과를 도 4(a) 및 도 4(b)에 나타내었다. 도 4(a) 및 도 4(b)를 참조하면, Gαolf, OR1J2 및 RTP1S로 형질 전화된 세포 및 나노베지클은 그렇지 않은 나노베지클에 비하여 Ca2 +의 전달 신호가 높다는 것을 확인할 수 있다. 또한, Ca2 + 이온 유입 반응의 증가는 나노베지클에서도 이루어지며, 이로부터 나노베지클을 바이오센서 시스템 내 효율적으로 적용할 수 있음을 확인하였다.
Gαolf, RTP1S로 형질 전환된 후각 수용체 OR1J2 세포 및 형질 전환되지 않은 후각 수용체 OR1J2 세포에 대해서 주입되는 헵타날의 농도에 따른 Ca2 + 이온의 유입을 확인하고 그 결과를 도 4(c) 에 나타내었다.
후각 수용체 OR1J2 및 Gαolf, RTP1S이 공동 발현되는 세포, 및 후각 수용체만 발현되는 세포에서의 최대 유효 농도(EC50, half maximal effective concentration)가 각각 48.6 및 103.7μM을 나타냈다. 형광신호는 후각 수용체 OR1J2 및 Gαolf, RTP1S를 가지는 세포에서 그렇지 않은 세포에 비하여 더욱 낮은 농도에서 더욱 민감하고 큰 변화를 나타내어 후각 수용체 OR1J2 와 함께 Gαolf, RTP1S이 공동 발현됨에 따라, 후각 신호가 보다 효율적으로 발생 되는 것을 알 수 있다.
< 실시예 3> 나노베지클 기반 단일벽탄소나노튜브 - 전계효과트랜지스터 제작
< 실시예 3-1> 전계효과트랜지스터 제작
본 발명에 따른 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터(SWNT-FETs)의 모식도를 도 1(d)에 도시하였다. 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터를 통상적인 전계효과트랜지스터의 제작 방법으로 제작하고, 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터를 상기 실시예 2에서 제조된 나노베지클로 기능화하였다.
우선, 무극성 말단기를 가지는 OTS (octadecyltrichlorosilane, 옥타데실트리클로로실란)를 SiO2 (1000 Å) 웨이퍼(wafer) 상에 포토리소그래피(photolithography) 방법을 이용하여 이용하여 패터닝하였다. OTS가 패터닝된 웨이퍼를 단일벽탄소나노튜브(single-walled carbon nanotubes (SWNTs)) 현탁액(suspension)(0.05 mg mL-1 디클로로벤젠)에 약 10초 동안 담가두었다. 상기 과정 동안, 단일벽탄소나노튜브 네트워크는 노출된 SiO2 웨이퍼 상에 자가조립 되었다. Ti(10nm)/Au(20nm) 전극을 포토리소그래피(photolithography) 방법을 이용하여 증착하였고, 용액과의 접촉을 차단하기 위하여 단열 포토레지스트(insulating photoresist, DNR)로 커버하였다. 소스 및 드레인 전극(drain electrode) 사이의 거리는 15㎛이었다.
< 실시예 3-2 > 나노베지클 고정화
상기와 같이 제조된 전계효과트랜지스터에 나노베지클을 dPBS 용액 내에서 고정하였다. 나노베지클은 동물 세포로부터 유래된 것이기 때문에, 이들의 막은 세포 막과 같이 음전하를 가진다. 따라서, PDL (poly-D-lysine)로 미리 코팅된 트랜지스터 위에 전하간 상호작용을 통해 쉽게 고정화될 수 있다.
단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터 채널을 0.1mg/ml poly D-lysine으로 먼저 PDL 코팅시키고, 상기 PDL이 코팅된 채널에 나노베지클 현탁액(suspension)의 액적을 2시간 동안 적하하여 나노베지클을 고정화하였다. 제조된 단일벽 탄소나노튜브 채널을 dPBS로 2회 내지 3회 세척하였다. 그리고 dPBS 용액을 N2 가스를 주입하여 서서히 건조시켰다.
아무 처리도 되지 않은 단일벽탄소나노튜브, PDL 코팅된 단일벽탄소나노튜브, 나노베지클이 고정화된 단일벽탄소나노튜브 각각에 대해 전류-전압의 관계 및 저항을 측정하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5(a)는 드레인-소스 전극의 전압 대 드레인-소스 전극의 전류를 나타낸 것이며, 도 5(b)는 드레인-소스 전극의 전류 대 백 게이트 전압을 나타낸 것이다. 도 5(a)를 참조하면, 상기 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터는 선형의 전류-전압 관계를 가지는 것으로 나타났다. 도 5(a)에서 단일벽탄소나노튜브, PDL 코팅된 단일벽탄소나노튜브, 나노베지클이 고정화된 단일벽탄소나노튜브의 저항은 각각 3.36 ×105, 1.21 ×106, 및 1.90 ×106 Ω 로 나타났다. 저항의 증가는 기판의 표면상에 무엇인가 부착되었다는 것을 의미한다. 단일벽탄소나노튜브의 저항은 PDL 코팅 및 나노베지클 고정화에 의하여 증가되었다. 도 5(b)을 참조하면 드레인-소스 전극의 전류는 게이트 전압의 증가와 함께 감소되었다.
< 실험예 4> 원자간력 현미경측정
상기 실시예 3에서 제조된 나노베지클이 고정화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터의 채널에 부착된 나노베지클을 원자간력 현미경(AFM, atomic force microscopy; MFP-3D, Asylum Research, USA)으로 관찰하고 그 결과를 도 6 에 나타내었다. AFM 시스템을 이용하여 대기조건(ambient conditions) 및 간헐적 모드(intermittent mode)에서 AFM 이미지를 측정하였다.
도 6(a)에서 세포로부터 분리된 100 내지 200nm의 나노베지클이 구 형태를 이루며 단일벽탄소나노튜브의 네트워크와 함께 단일벽탄소나노튜브 채널상에 고정화된 것을 알 수 있다.
< 실험예 5> 신호 전달 확인
< 실험예 5-1> 헵타날에 의한 신호 측정
상기 실시예 3에서 제조된 나노베지클이 기능화된 전계효과트랜지스터를 이용하여 Ca2 + 이온 유입을 Keithley 2636A sourcemeter (Keithley, USA) 및 probe station (MS tech, South Korea)을 이용하여 전기적으로 측정하였다.
소스 및 드레인 전극 사이에 0.1 V DC를 적용하고, 게이트 전압(gate voltage)을 접지하였다. Ca2 + (140 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2)을 포함하는 49.5㎕ PBS 을 상기에서 제작된 나노베지클 기반의 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터에 두고, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 1M의 헵타날을 각각 혼합하고, 이를 Ca2 +를 포함하는 dPBS 및 링거 용액에 1:10으로 순차적으로 희석하여 준비한 샘플을 0.5㎕ 주입하였다. 이후에, 소스 및 드레인 전극 사이의 전류 변화를 측정하였다.
도 6(b)에 헵타날 주입후 컨덕턴스(conductance) 변화를 실시간으로 측정한 데이터를 나타내었다. 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터는 10fM 의 헵타날을 첨가한 후 컨덕턴스의 감소를 보여주며, 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터의 반응강도는 picomolar 범위에서 헵타날의 농도가 증가함에 따라 증가하였다.
또한, 후각수용체 단백질 및 Gαolf, RTP1S로 형질전환된 세포로부터 분리된 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터의 반응강도는 8.88 ×10-14 M 인데 비해, 후각수용체 단백질로만 형질전환 된 세포로부터 분리된 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터의 반응 강도는 3.73 ×10-13 M 이었으므로, 후각수용체 단백질 및 Gαolf, RTP1S로 형질전환된 세포로부터 분리된 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터의 반응강도가 증가하는 것을 알 수 있다.
< 실험예 5-2> 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브 - 전계효과트랜지스터의 선택도 확인
상기 실시예 3에서 제조된 나노베지클이 기능화된 전계효과트랜지스터의 헵타날에 대한 선택도를 확인하기 위해 디메틸설폭사이드(DMSO)에 1M의 헥사날, 헵타날, 옥타날, 노나날(Sigma, USA)을 각각 혼합하고, 이를 Ca2 +를 포함하는 dPBS 및 링거 용액에 1:10으로 순차적으로 희석하여 0.5㎕ 주입하였다. 이후에, 소스 및 드레인 전극 사이의 전류 변화를 측정하였다.
도 6(d)를 참조하면, 1nM의 헥사날, 옥타날 및 노나날은 컨덕턴스에 아무런 영향을 미치지 않은 반면, 10fM 헵타날의 첨가는 컨덕턴스(conductance)가 급격히 감소하는 변화를 나타내어 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 나노베지클로 기능화된 단일벽탄소나노튜브-전계효과트랜지스터가 헵타날에 대해 높은 선택도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 6>인간 혈장으로부터 헵타날 감지
상기 실시예 3에서 제조된 나노베지클이 기능화된 전계효과트랜지스터가 인간 혈장에 포함된 헵타날을 감지하는지 여부를 건강한 사람의 혈장 샘플을 대상으로 확인하였다.
인간 혈장 내에 많은 화합물이 포함되어 있으며, 상기 화합물은 단일벽 탄소나노튜브 및 나노베지클에 영향을 미칠 수 있다. 혈장에 의한 비특이적인 영향을 확인하기 위해, 혈장을 다른 비율의 버퍼 용액에 희석시키고 본 발명에 따른 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클이 고정화된 트랜지스터에 주입하였다.
도 7(a)를 참조하면, 1:107 희석된 혈장 샘플이 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클이 고정화된 트랜지스터의 컨덕턴스에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 즉, 건강한 환자의 혈장을 채취하여 실험한 결과, 후각 나노베지클 기반 암센서의 컨덕턴스(conductance)에 영향을 미치지 않았다.
후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클이 고정화된 트랜지스터가 혈장 내 다른 분자로부터 헵타날을 얼마나 잘 구별해내는지 확인하기 위하여, 혈장 샘플 내에 다양한 농도의 헵타날을 첨가하고 반응의 크기를 관찰하였다.
도 7(b)는 헵타날이 다양한 농도로 첨가된 혈장 샘플로 처리된 것에 따른 컨덕턴스 변화를 실시간으로 측정한 데이터이다. 100fM의 헵타날이 첨가된 혈장 샘플로 처리한 경우, 후각 나노베지클 기반 암 센서는 검출 가능한 정도로 감소된 반면, 후각 수용체를 포함하지 않은 후각 나노베지클 기반 암 센서는 아무런 영향을 받지 않았다.
표준용액(standard solution)을 사용한 경우보다 혈장을 사용하여 실험한 경우, 실제 혈장 내 다양한 화합물이 영향을 미치는 것임에도 불구하고, 민감도는 덜 감소하는 것으로 나타났다.
즉, 건강한 사람의 혈장 샘플을 1:107로 희석하고, 다양한 농도의 헵타날을 첨가한 후, 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클이 고정화된 트랜지스터는 희석된 혈장 샘플 내에서 100fM의 헵타날을 인식할 수 있었다. 이는 혈장 샘플을 1:107로 희석하고, 혈장 샘플이 100fM의 이상의 헵타날을 포함하는 경우, 본 발명에 따른 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클이 고정화된 트랜지스터 시스템에 의하여 암 진단이 가능하다는 것을 의미한다.
상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어진다. 또한, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 기판;
    상기 기판 상에 서로 이격되어 형성된 소스 전극 및 드레인 전극; 및
    상기 소스 전극, 상기 드레인 전극에 고정되고 암 진단용 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노베지클; 을 포함하는 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암 진단용 후각 수용체 단백질은 OR1J2 인 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노베지클은 Gαolf 단백질을 더 포함하는 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노베지클은 세포 수송 단백질 RTP1S 를 더 포함하는 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 후각 수용체 단백질 OR1J2 과 특이적으로 결합하는 헵타날을 생성시키는 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 폐암 또는 유방암인 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 소스 전극 및 드레인 전극 표면은 나노튜브, 나노와이어, 나노로드, 나노리본, 나노필름 및 나노볼로 이루어진 그룹에서 선택되는 전도성 고분자 재료로 표면 개질되고, 상기 나노베지클은 상기 전도성 고분자 재료에 고정되는 것인 후각 수용체 및 전계 효과 트랜지스터 기반 암 센서.
  8. 삭제
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