KR101488364B1 - Tr관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템이다. 보다 상세하게는 광생물반응기를 과초산으로 멸균시키고 정제수로 세척한 후, 멸균된 배양액으로 광생물반응기를 채우고, 박테리아에 오염된 미세조류 배양물을 PBR 상부에 부착된 트리이오다이드 수지(TR)관에 통과시켜 얻은 무균 배양물을 광생물반응기내에서 배양액에 접종시켜 미세조류를 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템 이다.
본 발명은 박테리아에 오염된 미세조류가 TR관을 통과하면서 유입되는 외부공기의 박테리아도 같이 멸균되므로 접종시 또는 배양시 생길 수 있는 2차오염의 우려가 없다.

Description

TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템 {Axenic Seeding System of Microalgae Using Triiodide Resin Tube}

본 발명은 트리이오다이드 수지 (triiodide resin)를 이용한 TR관을 만들어 광생물반응기 상부에 부착하고 이를 이용하여 미세조류가 포함된 배양액과 순수한 액체 및 공기를 통과시킨다. 또한 도처에 기생하는 박테리아의 유입을 선택적으로 차단하고 사멸하는 selective channel의 구성과, 이를 이용한 무균접종 시스템의 확립에 관한 것이다.

본 발명은 TR관은 배양 과정에서 미세조류의 접종 시 일시적인 외부환경의 노출에 의해서 일어날 수 있는 박테리아의 오염을 원천적으로 차단하고 공기, 배양액 및 미세조류만을 폐쇄형 광생물반응기(closed photobioreactor, PBR)에 선택적으로 통과시키는 TR관을 이용한 미세조류의 무균접종 시스템에 관한 것이다.

미세조류를 이용한 바이오디젤의 안정적인 대량 생산을 위한 방안의 하나로써 폐쇄형 광생물반응기(photobioreactor, PBR)를 이용한 배양 시스템의 사용은 미세조류의 세포성장에 최적의 운전 조건과 안정적인 제어를 통해서 바이오매스 농도를 최대로 증가시키려는데 그 목적이 있다. 즉 PBR에서 생산된 바이오매스를 세포내 지질 축적을 유도할 수 있도록 안정적으로 배양하여 지질생산성(脂質生産性, g/m²/yr)이 최대가 되도록 배양을 수행하는 시스템이다. 광생물반응기(photobioreactor, PBR)는 높은 효율로 미세조류를 배양할 수 있고 배양 중 외부환경의 직접적인 접촉이 차단되어 있어 open pond보다 외래 박테리아균에 의한 오염 확률이 낮으나, 외부환경에 노출된 옥내/외배양에서 접종 시 일어날 수 있는 일시적인 외부환경의 노출로 인한 박테리아에 의한 오염가능성을 배제할 수 없다.

본 발명에서 이용하는 트리이오다이드 음이온 교환 수지의 미생물에 대한 살균력과 수처리 능력 및 안정성에 관한 많은 연구가 진행되어 왔으나, 미세조류의 안전한 무균접종을 광생물반응기 밖에서 외부노출 형태로 하기 위한 방법으로 사용되어 지는 것은 본원 발명이 최초이다.

광생물반응기는 외부환경의 직접적인 접촉이 차단되어 있으나, 옥내/외배양에서 균종의 접종 시 일어날 수 있는 일시적인 외부환경의 노출로 인한 박테리아에 의한 오염가능성을 배제할 수 없다. 따라서 옥내/외배양에서 오염된 미세조류로부터 또는 외부 환경에서 존재하는 박테리아를 멸균시키고 무균의 미세조류만 선택적으로 TR관을 통과시켜 광생물반응기 내에 접종시킬 수 있어야 한다.

본 발명은 광생물반응기(PBR)를 과초산(peracetic acid)으로 멸균시키고 정제수로 세척하고, PBR 상부에 설치된 개방형 트리이오다이드 수지관(opened TR관)에 박테리아가 오염된 미세조류 배양물을 통과시켜 얻은 무균 배양물을 광생물반응기 내에서 배양액에 접종하여 미세조류를 배양하는 단계로 구성된다. 따라서 본 발명은 광생물반응기용 공기 및 미세조류의 무균 배양물이 PBR에 공급되므로서 TR관을 이용한 미세조류의 무균접종 시스템을 제공한다.

본 발명의 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템은 트리이오다이드 수지의 선택적인 박테리아 균주의 사멸기능으로 인해 무균시스템으로 배양기 안쪽과 바깥쪽을 연결해 주는 통로로서 추가 배양액과 기타 액체성분이 외부에서부터 개방형 TR관을 통해 오염에 대한 위험 없이 공급할 수 있게 한다.

본 발명은 미세조류의 접종 시 외부환경의 일시적인 노출로 인해 생길 수 있는 박테리아의 오염을 원천적으로 차단하고 무균적으로 공기, 배양액 및 미세조류를 개방형 TR관을 거쳐 광생물반응기에 제공할 수 있다. 또한 배양액의 멸균에 열적 또는 화학적방법을 사용하지 않으므로 에너지 소모가 적은 무균 연속공정 시스템을 제공할 수 있다.

도 1은 박테리아 사멸을 증명하는 실험 결과이다.
도 2는 처리 전 현미경 사진 (from preculture)이다.
도 3은 처리 후 현미경 사진 (from photobioreactor)이다.
도 4는 광생물반응기 안에서의 미세조류의 성장 곡선이다.
도 5는 본 발명의 장치(1; 배양액, 2; 무균배양물, 10; 광생물반응기, 11; pH센서, 13; Outlet, 14; NaOH주입구, 15; HCl주입구, 20; 개방형TR관)이다.

본 발명에서 사용한 TR관은 직경의 크기와 길이 및 모듈형식의 연결 방법의 조절로 높은 Feed rate 와 충분한 1회 처리 용량을 설정할 수 있고 배양기 상부에 channel형식으로 설치되어서 미세조류의 접종 시 필요한 통로로 활용되어지며 Biomass의 수확 시 필요한 배양기 내의 Air balance의 통로로 다양하게 이용되어 질수 있다.

본 발명은 광생물반응기를 과초산으로 멸균시키고 정제수로 세척하는 단계를 거친 후, PBR 상부에 설치된 개방형 트리이오다이드 수지관(opened TR관)에 박테리아가 오염된 미세조류 배양물을 통과시켜 얻은 무균 배양물을 광생물반응기 내에서 배양액에 접종하여 미세조류를 배양하는 단계로 구성된다. 따라서 본 발명은 광생물반응기용 미세조류의 무균 배양물이 PBR에 공급되므로서 TR관을 이용한 미세조류의 무균접종 시스템을 제공한다.

<실시예 1>; 배양액과 오염된 배양물의 살균

직경이 약 2cm인 원통형 트리이오다이드 수지가 담긴 TR관에 트리이오다이드가 코팅된 glass bead보다 다공 사이즈가 작은 철망을 깔아 수지(TR)의 유출을 막으면서 트리이오다이드 수지를 8cm 높이로 쌓아 올린다. 그리고 TR관을 광생물반응기 상부에 설치한다. 박테리아에 오염된 배양물(N. gaditana preculture)을 개방형 TR관(트리이오다이드 수지)을 통과시켜 광생물반응기 내부의 배양액에 접종시킨다.

트리이오다이드 수지의 박테리아에 대한 높은 접착성과 살균성으로 인해 반응기 내부에는 미세조류를 제외한 미생물은 발견되지 않았고 단일 균주상태로 배양이 가능하였다. 접종전의 샘플과(오염된 preculture) TR관을 통하여 접종 후 반응기 안에서 샘플을 채취하여 그 안에 있는 박테리아 개체수를 TYG, LB 한천 배지에 도말하여 비교(도 1)하였다. 처리전에는 TYG한천배지에서 15,000 CFU/ml이었던 균수가 처리후에는 무균으로 나타났다. 또한 LB한천배지에서 12,000 CFU/ml이었던 균수가 처리후에는 무균으로 나타났다. 이것은 이오딘(iodine)의 음극성과 살균성의 특성에 의해서 미세조류는 선택적으로 통과하여 자랐고 박테리아는 거의 통과하지 못하였고, 통과한 것이라도 거의 100% 사멸되었다.

<실시예 2>; 미세조류의 배양

광생물반응기(도 5)에서 배지(F/2 medium)에 균주는 나노클로로프시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana)를 접종하였다.F/2 배지는 8.83 x 10^-4 M NaNO_{3 ,} 3.63 x 10^-5 M NaH₂PO_{4 ,} 1.07 x 10^-4 M Na₂SiO_{3 ,} 1 x 10^-5 M FeCl_{3 ,} 1 x 10^-5 M Na₂ EDTA, 4 x 10^-8 M CuSO_{4 ,} 3 x 10^-8 M Na₂MoO_{4 ,} 8 x 10^-8 M ZnSO_{4 ,} 5 x 10^-8 M CoCl_{2 ,} 9 x 10^-7 M MnCl_{2 ,} 1 x 10^-10 M Vitamin B_12, 2 x 10^-9 M Biotin, 3 x 10^-7 M Thiamine로 구성되어 진다. 재료 및 장비 중 미세조류 배양에는 2 L 평판형광생물반응기, LED 광원, 2 % 이산화탄소, PTFE air filter (0.45 μm, Corning, 미국)로 구성되어지며, UV VIS spectrometer (shimadzu, Japan)을 사용하여 트리이오다이드 수지를 이용해 접종한 N. gaditana의 성장은 680 nm 파장 대에서 흡광도를 통하여서 관찰(도 4)되었다. 액상에서의 미세조류의 박테리아의 오염도는 직접적인 현미경 관찰(도 2, 3)을 통해서 조사하였고 그 결과를 도 1, 2, 3, 4와 같이 나타냈다.

<시험예>; 박테리아 사멸

박테리아에 오염된 미세조류 배양물(Preculture)이 트리이오다이드 수지를 통과하기 전과 통과한 후의 박테리아 개체수를 비교하였다. Preculture가 트리이오다이드 수지를 통과한 후의 샘플은 광생물반응기에서 직접 샘플을 채취하여 배양기 내부는 박테리아가 없는 무균상태라는 것을 함께 증명하였다. 미세조류는 박테리아에 비해 한천 배지에서의 성장이 느려 박테리아의 콜로니가 보이기 전까지 콜로니를 형성하지 못한다. 이번 실험에서 사용된 두 가지 종류의 한천 배지 (LB, TYG) 모두에서 트리이오다이드 수지를 사용하여 접종했을 때 박테리아는 완전 사멸되었고 이로써 TR관을 통해 오염된 접종균체를 통과시켜도 박테리아는 외부에서 배양기 안으로 TR관을 통해 유입될 수 없음을 증명(도 1, 2, 3, 4)하였다.

발명은 개방형 TR관을 통해 박테리아에 오염된 미세조류를 선별하고 박테리아를 100 % 완전 멸균하고 외부공기 중에 존재하는 박테리아의 배양기 안쪽 유입을 원척적으로 차단하고 또한 멸균하여 접종시 또는 배양시 2차오염의 우려가 없으므로 옥외/내 배양시 배양에 대한 편의성을 최대한 제공하고 무균배양에 대한 특별한 지식이나 기술이 없이도 무균배양을 일반인이 쉽게 실현하는데 그 이용 가능성이 크다.

Claims (4)

1. 광생물반응기(PBR)를 과초산으로 멸균시키고 정제수로 세척한 후, 멸균된 배양액으로 광생물반응기를 채우고, 박테리아에 오염된 미세조류 배양물을 PBR 상부에 부착된 트리이오다이드 수지(TR)관에 통과시켜 얻은 무균 배양물을 광생물반응기내에서 배양액에 접종시켜 미세조류를 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템
2. 제 1항에 있어서, 박테리아에 오염된 미세조류는 개방형 트리이오다이드 수지(opened TR)관을 통해 멸균되는 것을 특징으로 하는 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템
3. 제 1항에 있어서, TR관은 원통형으로 구성되는 것을 특징으로 하는 TR관을 이용한 미세조류의 무균 접종 시스템
4. 삭제

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