KR101482663B1 - 신규한 다당류 분해활성을 갖는 셀룰로파가 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다당류 분해 활성을 갖는 신규한 셀룰로파가(Cellulophaga sp .) 속 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 남해 지역의 해수, 갯벌, 해안가에서 시료를 채취하여 미생물을 분리한 후, 카르복시메칠셀룰로오즈(CMC)를 분해할 수 있는 미생물을 선별하고, 16S rRNA 분석을 통해 상기 미생물이 셀룰로파가 속 신규한 균주임을 확인한 다음, 상기 균주 및 이의 배양 상층액이 다양한 다당류의 분해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
Description
본 발명은 다당류 분해 활성을 갖는 신규한 셀룰로파가(Cellulophaga sp .) 속 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해수, 갯벌, 해안가에서 분리한 다양한 다당류 분해 활성을 갖는 신규한 셀룰로파가 속 균주에 관한 것이다.
바이오연료(biofuel)는 재생 가능하고 환경 친화적이다. 왜냐하면, 바이오연료는 이산화탄소 고정에 의한 광합성으로 생성되는 바이오매스(biomass)로 부터 생산되기 때문이다. 특히 점점 줄어드는 화학 연료 공급에 대한 우려, 및 깨끗한 재생가능 에너지에 대한 요구로 인해 바이오연료에 대한 필요성은 증가하는 추세이다.
현재 두 개의 바이오연료인 바이오알코올(바이오에탄올)과 바이오디젤이 각각 가솔린 및 디젤의 대안이 되는 연료로 제안되고 있으며 또한 사용되고 있다. 이들은 대기중 이산화탄소 방출 감소 및 지구 온난화에 긍정적인 효과를 줄 뿐만 아니라, 기존의 자동차의 시스템을 변화시키지 않고 사용될 수 있다. 바이오연료의 일례로는 목초, 건초 및 스위치그래스(switchgrss)와 같은 셀룰로오스 자원을 이용하여 바이오에탄올을 생산하고 있다. 최근에, 바이오에탄올의 매년 전세계 생산은 대략 10억 갤론으로 평가되고 있다. 이들 대부분은 기존의 정립된 시스템의 전분 및 당으로부터 생산되고 있다. 현재의 기술은 자연 상태에서 가장 풍부한 탄소원인 육상 식물로부터 유래된 다당류를 이용하여 바이오연료를 생산하는 것에 제한되고 있다. 특히, 육상 식물은 그 종류에 따라 차이는 있지만 자라는데 시간이 걸리고 기후 조건의 변화에 쉽게 반응한다. 따라서, 육상 식물로부터 유래된 다당류를 바이오연료를 생산에 상용하는 것은 한계가 있다.
수생에서 서식하는 해조류는 포자에 의한 무성 생식 방법과 배우자에 의한 유성 생식 방법을 통하여 증식한다. 이들은 적절한 조건이 갖추어지면 육상 식물에 비해 더 빠른 속도로 증식할 수 있다. 또한, 이들은 지구의 70% 이상을 차지하는 바다 속에서 서식하고 있어 그 공급 가능성도 크다. 따라서, 빠른 속도로 증식할 수 있고 육상 식물에 비해 넓은 재배 면적을 갖는 해조류로부터 유래된 세포 외 다당류는 육상 식물로부터 유래된 다당류에 비해 바이오연료를 생산하는데 더 높은 효율을 제공할 수 있을 것이다.
셀롤로스란 β-(1, 4)-결합의 D-포도당 유닛으로 구성된 다당류를 말한다. 이는 식물 세포벽에서 주요한 구성요소이자 지구상에 존재하는 가장 풍부한 탄소원이기도 하다. 미생물에 의해 셀룰로스를 분해한다는 것은 지구 탄소 재활용에 있어 중요한 사안이다. 셀룰로스 분해 미생물들은 엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제, 베타-글루코시다아제, 및 보조적 효소들을 생산함으로써 셀룰로스의 β-1,4-글룰코시드 결합을 시너지 효과를 일으키며 포도당으로 효과적으로 분해한다. 이들 효소들은 종종 탄수화물 결합 도메인(carborhydrate binding domain; CBD)라고 칭해지는 부속적 모듈을 포함한다. CBD의 주 역할은 셀룰라아제의 촉매적 도메인을 좀 더 근접하게 셀룰로스 표면으로 이송함으로써 효과적 가수분해를 일으키는 데에 있다.
현재, 셀룰라아제가 동물 사료, 섬유, 폐기물 처리 및 양조 산업에서 광범위하게 사용되고 있다(Beguin, 1983; Mandels, 1985). 또한, 셀룰로스 바이오매스를 셀룰라아제에 의해 분해함으로써 얻어지는 포도당을 이용한 발효를 통한 에탄올 및 부탄올과 같은 생물연료는 점차적으로 매력적인 지속적이자 대안적 에너지원으로 간주되고 있다. 따라서, 셀룰라아제를 이용한 효과적 셀룰로스 분해가 셀롤로스 바이오매스의 사용에 있어 중요한 이슈가 되는 것이다. 퇴비 토양, 부패 식물재료, 하수도 찌꺼기, 반추류의 분변 및 극심한 환경 등과 같은 다양한 소스에서 곰팡이 및 세균에 의해 생성된 셀룰로스 분해 효소 다량을 분리하여 특성화했다(Blumer-Schuette et al., 2008; Doi, 2008; Maki et al., 2009; Viikari et al., 2007). 그러나, 해양 세균에서 얻어지는 셀룰로스 분해 시스템에 대해서는 상대적으로 연구된 수가 적은 편이다(Ekborg et al., 2007; Fu et al., 2010; Gao et al., 2010; Hirasawa et al., 2006; Ryu et al., 2001; Shanmughapriya et al., 2010; Taylor et al., 2006; Yin et al., 2010; Zeng et al., 2006). 최근 들어, Saccharophagus degradans 2-20T 및 Teredinibacter turnerae T7902T 에 대해 보고된바 있다(Taylor et al., 2006; Yang et al., 2009). S. degradans 2-20T 및 T.turnerae T7902T 은 다중 엔도글루카나아제 및 엑소글루카나아제와 함께 기타 해조류(marine algae and plants)의 다당류 분해 시스템을 보유한다. 따라서, 해양 세균류가 신규한 셀룰로스 바이오매스 분해 시스템을 위해 풍부한 소스가 될 것으로 보인다.
이에, 본 발명자들은 해조류 및 식물 유래 다당류를 분해할 수 있는 신규 미생물을 선별하기 위하여, 다양한 시료를 채취하여 미생물을 분리한 후, 카로복시메칠 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose; CMC)를 분해할 수 있는 미생물을 선별하고, 16S rRNA 분석을 통해 셀룰로파가(Cellulophaga) 속에 속하는 신규한 미생물임을 확인한 다음, 상기 신규한 미생물이 다양한 다당류 효과적으로 분해할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다당류 분해 활성을 가지는 신규한 균주, 상기 균주를 이용한 다당류 분해용 조성물 및 상기 균주를 이용한 다당류 분해하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가 속 균주 및 이의 배양 상층액을 포함하는 다당류 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가 속 균주 및 이의 배양 상층액을 다당류에 접촉시키는 단계를 포함하는 다당류 분해 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 바이오매스로부터 다당류를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 다당류에 제 1항 또는 제 2항의 균주, 또는 이의 배양 상층액을 접촉시켜 단당류를 생성시키는 단계; 및
3) 단계 2)의 단당류를 미생물에 의해 발효시키는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 다당류 분해 활성을 가지는 신규한 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 균주에 관한 것으로, 남해 지역의 해수, 갯벌, 해안가에서 시료를 채취하여 미생물을 분리한 후, 카르복시메칠셀룰로오즈(CMC)를 분해할 수 있는 미생물을 선별하고, 16S rRNA 분석을 통해 상기 미생물이 셀룰로파가 속 신규한 균주임을 확인한 다음, 상기 균주 및 이의 배양 상층액이 다양한 다당류의 분해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
도 1은 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 PDB-1 및 PDB-2의 16S rRNA의 계통도 분석을 나타낸 도이다. 16S rRNA 유전자에 따른 인접한 계통도가 기타 다른 관련된 분류군들 사이에서 PDB-1 및 PDB-2의 위치를 보여준다. 분기점(branching point)에서 붓스트랩 값(bootstrap values)(1000 복제의 퍼센트로 표현됨) > 50 % 이 나타낸다. Bacteroides fragilis ATCC 25285T(GenBank accession number, X83935)를 외군비교(outgroup)로 사용했다. Scale bar, 0.01 substitutions per nucleotide position.
도 2는 셀룰로파가 속 PDB-1 및 PDB-2의 세포 외 셀룰라아제에 대한 CMC-SDA-PAGE 분석 및 자이코그래피를 나타낸 도이다;
좌측 패널에는 60% 및 70 % 황산암모늄(ammonium sulfate)에서 침전된 단백질의 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색된 0.1 % CMC를 통한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다; 및
우측 패널은 침전 단백질의 셀룰라아제 활성 염색에 대한 자이모그램(zymography)을 나타낸다.
Lanes: M: 분자무게 마커 단밸질
60은 60% 황산암모늄에서의 PDB-1 및 PDB-2의 침전된 세포 외 단백질;
70은 70% 황산암모늄에서의 PDB-1 및 PDB-2의 침전된 세포 외 단백질; 및
화살표는 N-말단 시퀀싱 수행을 수행한 35 kDa 단백질을 나타낸다.
도 3은 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 갈락탄(Galactan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액 상에 포함된 다당류인 저온 용해성 아가로스(Agarose)와 카라기난(Carrageenan)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 4는 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 글루칸(Glucan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액 상에 포함된 다당류인 전분(Starch), CMC, 라미나린(Laminarin), 풀루란(Pullulan)로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 5는 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 자일란과 다른 다당류들에 대한 분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 자일란(xylan), 알긴산(Alginate), 콜로이드 키틴(Chitin), 펙틴(Pectin)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 6은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 갈락탄(Galactan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-2의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 저온 용해성 아가로스(Agarose)와 카라기난(Carrageenan)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 7은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 글루칸(Glucan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 전분(Starch), CMC, 라미나린(Laminarin), 풀루란(Pullulan)로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 8은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 자일란과 다른 다당류들에 대한 분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 자일란(xylan), 알긴산(Alginate), 콜로이드 키틴(Chitin), 펙틴(Pectin)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 2는 셀룰로파가 속 PDB-1 및 PDB-2의 세포 외 셀룰라아제에 대한 CMC-SDA-PAGE 분석 및 자이코그래피를 나타낸 도이다;
좌측 패널에는 60% 및 70 % 황산암모늄(ammonium sulfate)에서 침전된 단백질의 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색된 0.1 % CMC를 통한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다; 및
우측 패널은 침전 단백질의 셀룰라아제 활성 염색에 대한 자이모그램(zymography)을 나타낸다.
Lanes: M: 분자무게 마커 단밸질
60은 60% 황산암모늄에서의 PDB-1 및 PDB-2의 침전된 세포 외 단백질;
70은 70% 황산암모늄에서의 PDB-1 및 PDB-2의 침전된 세포 외 단백질; 및
화살표는 N-말단 시퀀싱 수행을 수행한 35 kDa 단백질을 나타낸다.
도 3은 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 갈락탄(Galactan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액 상에 포함된 다당류인 저온 용해성 아가로스(Agarose)와 카라기난(Carrageenan)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 4는 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 글루칸(Glucan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액 상에 포함된 다당류인 전분(Starch), CMC, 라미나린(Laminarin), 풀루란(Pullulan)로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 5는 셀룰로파가 속 PDB-1의 분비 단백질의 자일란과 다른 다당류들에 대한 분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 자일란(xylan), 알긴산(Alginate), 콜로이드 키틴(Chitin), 펙틴(Pectin)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 6은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 갈락탄(Galactan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-2의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 저온 용해성 아가로스(Agarose)와 카라기난(Carrageenan)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 7은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 글루칸(Glucan)분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 전분(Starch), CMC, 라미나린(Laminarin), 풀루란(Pullulan)로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
도 8은 셀룰로파가 속 PDB-2의 분비 단백질의 자일란과 다른 다당류들에 대한 분해능을 나타낸 도이다. x축은 배양액 상에 포함된 단당류 및 다당류를 나타낸 것이며, y축은 1 mL의 PDB-1의 분비 단백질을 포함하는 배양액 첨가 시 반응액상에 포함된 다당류인 자일란(xylan), 알긴산(Alginate), 콜로이드 키틴(Chitin), 펙틴(Pectin)으로부터 시간당 유리되는 환원당의 양을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC11940BP Cellulophaga sp. PDB-1로 기탁된 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC11941BP Cellulophaga sp. PDB-2로 기탁된 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 균주를 제공한다.
상기 다당류는 아가로즈, 카라기난, 전분, 풀루난, 카르복시메칠셀룰로오즈(carboxylmethylcellulose; CMC), 자일란, 라미나린, 키틴 및 펙틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 다당류를 분해하는 미생물을 분리하기 위하여, 남해지역의 해수, 갯벌 및 해안가에서 시료를 채취하여 미생물을 분리한 후, 카르복시메칠 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulosel; CMC)를 분해할 수 있는 미생물을 선별하였다.
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 상기 선별된 미생물을 동정하기 위하여, 16S rRNA 유전자의 시퀀싱과 계통발생학적 분석을 수행한 결과, 이들 미생물들이 서열번호: 1 및 서열번호 2로 나타낸 바와 같이 C. lytica ATCC 23178T 및 C. fucicola NN015860T 에 일관된 클러스터를 형성하는 Cellulophaga(셀롤로파가) 속을 포함하는 클레이드(clade)의 분류에 해당함을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 상기 선별된 미생물의 셀롤로스 분해활성을 확인하기 위하여 CMC로 SDS-PAGE에 대한 자이모그램 분석을 수행한 결과, 상기 미생물은 셀룰로스 분해 효소를 가지는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 PDB-1의 35 kDa 단백질의 N-말단 시퀀싱을 수행한 결과, 35 kDa 단백질의 N-말단 시퀀스는 기타 공지된 셀룰로스 분해 효소와 매칭되지 않는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 PDB-1의 분비 단백질의 분해 활성 분석하기 위하여 PDB-1의 분비 단백질의 셀룰로스 분해 활성을 확인한 결과, PDB-1의 분비 단백질은 CMC를 잘 가수분해하는 반면, 결정체 기질(substrate)는 효과적으로 가수분해할 수 없었다. 이를 통해 이들 효소가 셀룰로스의 비결정질 부위의 β-1,4 결합에 더욱 활성을 보임을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 셀룰로파가 PDB-1 및 PDB-2의 다당류 분해 활성 확인하기 위하여, 다당류를 포함하는 최소 배지 배양액 하에서 배양 후, 세포 외로 분비된 단백질의 다당류 분해능력을 확인한 결과, PDB-1 및 PDB-2는 아가로즈, 카라기난, 전분, 풀루란, CMC, 자일란, 라미나린, 키틴, 펙틴과 같은 다양한 다당류의 분해시스템을 갖고 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8 참조).
따라서, 상기 다양한 다당류에 대한 분해 활성을 가진 신규한 미생물을 셀룰로파가 속으로 동정하고, Cellulophaga sp. PDB-1 및 Cellulophaga sp. PDB-2으로 명명하였으며 2011년 05월 24일에 한국생명공학연구원(KRIBB) 생물자원관리본부(KBRC) 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.(기탁번호: KCTC11940BP 및 KCTC11941BP).
또한, 본 발명은 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액을 포함하는 다당류 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 PDB-1의 분비 단백질의 분해 활성 분석하기 위하여 PDB-1의 분비 단백질의 셀룰로스 분해 활성을 확인한 결과, PDB-1의 분비 단백질은 CMC를 잘 가수분해하는 반면, 결정체 기질(substrate)은 효과적으로 가수분해할 수 없었다. 이를 통해 이들 효소가 셀룰로스의 비결정질 부위의 β-1,4 결합에 더욱 활성을 보임을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명의 한가지 실시태양에서 본 발명자들은 셀룰로파가 PDB-1 및 PDB-2의 다당류 분해 활성 확인하기 위하여, 다당류를 포함하는 최소 배지 배양액 하에서 배양 후, 세포 외로 분비된 단백질의 다당류 분해능력을 확인한 결과, PDB-1 및PDB-2는 아가로즈, 카라기난, 전분, 풀루란, CMC, 자일란, 라미나린, 키틴, 펙틴과 같은 다양한 다당류의 분해시스템을 갖고 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8 참조).
따라서, 본 발명의 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액은 다양한 다당류에 대한 분해 활성을 가지므로 다당류 분해용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액을 포함하는 다당류에 접촉시키는 단계를 포함하는 다당류 분해 방법을 제공한다.
상기 다당류를 접촉시키는 단계는 다당류와 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액을 55℃-85℃, 바람직하게는 65℃에서, pH 5.0 내지 5.5 또는 7.5 내지 8.0에서 10-30분 동안 접촉시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액은 다양한 다당류에 대한 분해 활성을 가지므로 다당류에 접촉시키는 단계를 포함하는 다당류 분해 방법으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 바이오매스로부터 다당류를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 다당류에 제 1항 또는 제 2항의 균주, 또는 이의 배양 상층액을 접촉시켜 단당류를 생성시키는 단계; 및
3) 단계 2)의 단당류를 미생물에 의해 발효시키는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조방법을 제공한다.
상기 바이오매스는 다당류를 포함하는 볏짚, 보릿짚, 고구마 줄기, 유채줄기, 카사바 줄기의 농업 부산물, 폐지, 플러프의 고체 쓰레기, 간벌목, 폐목재, 가공 부산물의 목재, 담조류, 해조류의 수상 식물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 다당류는 아가로즈, 카라기난, 전분, 풀루난, 카르복시메칠셀룰로오즈, 자일란, 라미나린, 키틴 및 펙틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 미생물은 사카로마이세스 세레비시애, 사르시나 벤트리큘리, 클루이베로마이세스 프라질리스, 자이고모모나스 모빌리스, 클루이베로마이세스 막시아너스 IMB3, 브레타노마이세스 쿠스테르시이, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 바이예링키, 클로스트리디움 아우란티부틸리쿰 및 클로스트리디움 테타노모르퓸으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 PDB-1 및 PDB-2, 또는 이의 배양 상층액은 다양한 다당류에 대한 분해 활성을 가지므로 이러한 분해를 통해 생성된 다당류 분해 생성물에 바이오 연료를 생산할 수 있는 미생물을 반응시켜 효과적으로 바이오에탄올을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 미생물의 분리
셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 미생물을 분리하기 위해, 대한민국 거제도 남해 모래 해안에서 dilution plating 방법을 이용하여 Marine Agar 2216(MA; Difco, 미국)에서 성장하는 미생물을 분리하였다.
분리한 미생물 중 셀룰라아제를 생산하는 미생물을 선별하기 위하여, 카르복시메칠 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulosel; CMC)를 분해할 수 있는 미생물을 선별하였다.
구체적으로 상기 분리한 미생물은 CMC 한천배지(1.0%의 카르복시메틸 셀룰로스(Sigma, 미국)와 MA)상으로 찍어서 도말하는 방법으로 옮겨진 후, 3일 동안 25℃에서 배양한 후, 상기 플레이트들을 0.1% 콩고 레드(congo red) 용액으로 15분 동안 염색한 후, 1M NaCl으로 세척(Beguin, 1983)한 결과, 큰 헤일로(halos)를 나타내는 CMC 분해 활성(degrading activity)을 가진 두 종류의 균주를 선별하였다.
<
실시예
2> 미생물의 동정
상기 <실시예 1>에서 선별된 미생물을 분류하기 위해, Yoon et al.에 기재된 방법에 따라, 분리된 박테리아에 대해 염색체 DNA 추출 및 정제를 수행하고, 이와 함께 RNase T1 102의 변형을 RNase A와 조합하여 사용함으로써 RNA에 의한 오염을 최소화했다(Yoon et al., 1996). 상기 언급한 두 개의 유니버셜 프라이머(universal primers)를 사용하여 16S rRNA 유전자 증폭을 수행한 후(Yoon et al., 1998), Yoon et al.에 기재된 방법에 따라, 증폭된 16S rRNA 유전자의 시퀀싱과 계통발생학적 분석을 수행했다(Yoon et al., 2003).
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 PDB-1 및 PDB-2의 16S rRNA에 대한 계통발생학적 분석에 따라, 이들 미생물들이 서열번호: 1 및 서열번호 2로 나타낸 바와 같이 C lytica ATCC 23178T 및 C. fucicola NN015860T 에 일관된 클러스터를 형성하는 Cellulophaga(셀롤로파가) 속을 포함하는 클레이드(clade)의 분류에 해당함을 확인하였다. 또한, 스트레인(strain) PDB-2는 스트레인 PDB-1, C. fucicola NN015860T , 및 C. lytica ATCC 23178T, 각각에 대해 16S rRNA 유전자 상동성 99.0, 98.5, 및 97.6%를 가지며, 다만 기타 다른 Cellulophaga 속에 대해서는 92.2 내지 93.6% 값을 갖는 것을 확인한 후(도 1), Cellulophaga sp. PDB-1 및 Cellulophaga sp. PDB-2으로 명명하였으며 2011년 05월 24일에 한국생명공학연구원(KRIBB) 생물자원관리본부(KBRC) 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.(기탁번호: KCTC11940BP 및 KCTC11941BP).
<
실시예
3> 미생물의
셀롤로스
(
cellulose
) 분해 활성 확인
상기 <실시예 2>에 선별한 미생물의 셀롤로스 분해활성을 확인하기 위하여, 0.2% CMC의 MA 배지 내에서 30℃에서 이틀간 배양된 PDB-1 및 PDB-2의 세포외 단백질에 대해 4℃에서 염석(salting out)을 수행하였다. 대부분의 활성 셀룰라아제 분획물은 포화 황산 암모늄 50 내지 70% 범위 사이에서 침전되었고, 자이모그래피(zymography technique) 용법을 이용하여 탈염 분획물을 분석하였다.
구체적으로, 0.1 % CMC의 SDS-PAGE 젤을 제조한 후, 70 V 전기영동 한 다음, 리폴딩(refolding) 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 및 1% Triton-X100)에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 새로운 리폴딩 버퍼로 바꿨다. 1 시간 동안 추가로 인큐베이션을 한 뒤, 상기 젤을 150 mM NaCl으로 20 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 하룻밤 동안 유지시킨 다음, 0.1% 콩고 레드(Congo Red)로 염색했다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 CMC로 SDS-PAGE에 대한 자이모그램 분석을 수행한 결과, 각 세균의 다양한 분자량 및 유사한 소거 밴드(clear band)를 지니는 셀룰로스 분해 효소를 가지는 것을 확인하였고, 또한, 이들은 유사한 셀룰로스 분해 시스템을 가지고 있는 것을 확인하였다(도 2).
<
실시예
4> 미생물 유래 단백질의 활성 분석
<4-1>
N-말단 시퀀싱(
sequencing
)
PDB-1의 35 kDa 단백질의 N-말단 시퀀싱을 수행했다. 70% 포화 황산암모늄(ammonium sulfate) 내의 PDB-1의 세포외 단백질의 침전 분획물을 SDS-PAGE 분석한 후, 이를 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane; PVDF) 상으로 전자이동(electrotransferred)시킨 후, 35 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 시퀀싱을 Automatic Protein Sequencer(Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였다.
그 결과, 상기 단백질의 N-말단 시퀀스는 NTAQTVV임을 확인하였다. 최근 들어, C. algicola DSM 14237의 게놈 시퀀스가 보고되었고, 네 개의 ORF에 대해 셀룰라아제(GenBank 등록번호. ADV51156, ADV50035, 및 ADV 47383) 및 글루코시드 가수분해 계열 5(GenBank 등록번호. ADV50845)로 주석이 달린 바가 있다. 그러나 35 kDa 단백질의 N-말단 시퀀스는 기타 공지된 셀룰로스 분해 효소는 물론, C. algicola DSM 14237 셀룰라아제와 매칭되지는 않았다. 따라서, Cellulophaga 속 PDB-1은 신규한 셀룰로스 분해 시스템을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
<4-2>
PDB
-1의 분비 단백질의 분해 활성 분석
PDB-1의 분비 단백질의 셀룰로스 분해 활성을 알아보기 위해, 450 μL의 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 20 μm의 마이크로크리스탈린 셀룰로스 및 아비셀 PH-101, 셀룰로스 섬유를 이용하여 0.5% 농도로 pH 5.0의 25 mM citrate 완충용액과 pH 7.0의 10 mM phosphate 완충용액에 현탁하였다. 각 반응용액에 50 μg의 PDB-1의 분비 단백질을 첨가한 후, 30℃에서 1시간 동안 반응을 진행하였다. 100℃로 가열하여 효소를 실활 한 후, 방출된 환원당을 파라-하이드록시벤조산 히드라자이드 (p-hydroxybenzoic acid hydrazide; pHBH) 분석법을 이용하여 415 nm에서 흡광도변화를 통해 측정하였다 (Moretti and Thorson, 2008).
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, PDB-1의 분비 단백질은 CMC를 잘 가수분해하는 반면, 결정체 기질(substrate)는 효과적으로 가수분해할 수 없었다. 이를 통해 이들 효소가 셀룰로스의 비결정질 부위의 β-1,4 결합에 더욱 활성을 보임을 확인하였다. 또한, pH 5.0 및 pH 7.0에서의 특정 활성도는 유사함을 확인하였다. 따라서, PDB-1의 셀룰로스 분해 시스템은 산성 및 중성 pH에서 활동적이다. 해양환경은 일반적으로 약 알칼리성 조건이기 때문에 해양 환경에서 얻어진 대부분의 특징화된 셀룰라아제가 중성 및 약 알칼리 조건에서 최대 활성을 보이고, 산성 조건에서는 활성이 감소된다는 사실을 고려할 때, PDB-1의 셀룰로스 시스템이 pH 5.0 하에서 CMC를 잘 가수분해할 수 있다는 것은 흥미로운 사실이다. 또한, 총 세포외 단백질과 50 ~ 70%의 포화 황산암모늄에서의 침전 단백질이 유사한 특정 활성을 보였다. 따라서, PDB-1의 셀룰로스 분해 시스템은 산성 조건하에서도 활성을 유지했다. 이러한 특성은 산성 조건 하에서 전 처리된 셀룰로스 재료의 분해와 같은 생명공학적 적용에서 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
<
실시예
5>
셀룰로파가
PDB
-1의 다당류 분해 활성 확인
셀룰로파가 PDB-1의 다당류 분해 능력을 측정하기 위하여 아래의 배지를 이용하여 셀룰로파가 PDB-1을 배양하였다. 각 배지는 0.2%의 탄소원에 인공 해수(Artificial sea water: NaCl 23.6 g/L, KCl 0.64 g/L, MgCl26H2O 4.53 g/L, MgSO4H2O 5.94 g/L, CaCl2H2O 1.3g/L)에 효모 추출물(Yeast Extract) 1.0 g/L, 염화 암모늄(NH4Cl) 0.5 g/L, 트리즈마 염(Trizma Base) 6.05 g/L을 첨가 한 후, 염산을 이용하여 pH 7.4로 적정하였다. 사용된 단당류는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), N-아세틸글루코사(N-acetylglucosamine, NAG), 자일로스(xylose)를 이용하였으며, 다당류로는 저온 용해성 아가로스(Agarose, Lonza), 알긴산(Alginate, Wako), 카라기난(Carrageenan, Sigma), 카르복시메틸셀룰로스(Carboxymethylcellulose, Sigma), 콜로이드 키틴(Colloidal chitin, Sigma), 라미나린(Laminarin, Sigma), 펙틴(Pectin from apple peel, Sigma), 풀루란(Pullulan, Sigma), 전분(Soluble starch, Difco), 자일란(Birchwood xylan, Sigma)을 이용하였으며 단당류 및 다당류가 첨가되지 않은 배지를 포함하여 배양하였다. 콜로이드 키틴은 농축 염산을 이용하여 종래의 방법으로 제조하였다. 종균 배양의 탄소원으로서는 0.1 %의 Bacto-Trypton(Difco)를 이용하였다.
구체적으로, 균주를 3 mL 종균 배양(seed culture)한 후, 30 mL 종균 배양한 다음, 단당류 및 다당류를 포함하는 50 mL 배지를 main culture에서 30℃에서 배양하였다. 그런 다음, 원심분리를 통해 세포를 제거한 후, 배지 용액을 동결하여 보관하였다. 세포 밖으로 분비된 단백질의 양을 Lowey 방법으로 측정하였다. 분비 단백질의 활성 측정을 위해 반응에 이용된 다당류는 배지에 탄소원으로 이용된 다당류와 동일하였으며 저장액의 농도는 0.5%였다. 다당류 저장액과 배지를 혼합한 후, 30℃에서 24시간 동안 400 rpm으로 반응시켰다. 각 반응액을 1/10으로 희석한 후, 0.5M 염산 녹인 2 %(w/v) pHBH 와 2M NaOH의 1:1 혼합액 120 μL에 희석액 40 μL 섞은 후, 100℃에서 7분간 가열하였다. 그런 다음 마이크로플레이트(microplate) 분석을 이용하여 415 nm 흡광도를 측정하였다(Moretti and Thorson, 2008).
그 결과, 도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 셀룰로파가 PDB-1은 갈락탄, 글루칸, 자일란 및 다른 다당류에 대한 유의적인 다당류 분해 활성을 가지는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 5).
<
실시예
6>
셀룰로파가
PDB
-2의 다당류 분해 활성 확인
셀룰로파가 PDB-2의 다당류 분해 능력을 측정하기 위하여 아래의 배지를 이용하여 셀룰로파가 PDB-2를 배양하였다. 각 배지는 0.2% 의 탄소원에 인공 해수(Artificial sea water: NaCl 23.6 g/L, KCl 0.64 g/L, MgCl26H2O 4.53 g/L, MgSO4H2O 5.94 g/L, CaCl2H2O 1.3g/L)에 효모 추출물(Yeast Extract) 1.0 g/L, 염화 암모늄(NH4Cl) 0.5 g/L, 트리즈마 염(Trizma Base) 6.05 g/L을 첨가 한 후, 염산을 이용하여 pH 7.4로 적정하였다. 사용된 단당류는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine, NAG), 자일로스(xylose)를 이용하였으며, 다당류로는 저온 용해성 아가로스(Agarose, Lonza), 알긴산(Alginate, Wako), 카라기난(Carrageenan, Sigma), 카르복시메틸셀룰로스(Carboxymethylcellulose, Sigma), 콜로이드 키틴(Colloidal chitin, Sigma), 라미나린(Laminarin, Sigma), 펙틴(Pectin from apple peel, Sigma), 풀루란(Pullulan, Sigma), 전분(Soluble starch, Difco), 자일란(Birchwood xylan, Sigma)을 이용하였으며 단당류 및 다당류가 첨가되지 않은 배지를 포함하여 배양하였다. 콜로이드 키틴은 농축 염산을 이용하여 종래의 방법으로 제조하였다. 종균 배양의 탄소원으로서는 0.1 %의 Bacto-Trypton(Difco)를 이용하였다.
구체적으로, 균주를 3 mL 종균 배양(seed culture)한 후, 30 mL 종균 배양한 다음, 단당류 및 다당류를 포함하는 50 mL 배지를 main culture에서 30℃에서 배양하였다. 그런 다음, 원심분리를 통해 세포를 제거한 후, 배지 용액을 동결하여 보관하였다. 세포 밖으로 분비된 단백질의 양을 Lowey 방법으로 측정하였다. 분비 단백질의 활성 측정을 위해 반응에 이용된 다당류는 배지에 탄소원으로 이용된 다당류와 동일하였으며 저장액의 농도는 0.5% 였다. 다당류 저장액과 배지를 혼합한 후, 30℃에서 24시간 동안 400 rpm으로 반응시켰다. 각 반응액을 1/10으로 희석한 후, 0.5M 염산 녹인 2 % (w/v) pHBH 와 2M NaOH의 1:1 혼합액 120 μL에 희석액 40 μL 섞은 후, 100℃에서 7분간 가열하였다. 그런 다음 마이크로플레이트 분석을 이용하여 415 nm 흡광도를 측정하였다(Moretti and Thorson, 2008).
그 결과, 도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 셀룰로파가 PDB-2는 갈락탄, 글루칸, 자일란 및 다른 다당류에 대한 유의적인 다당류 분해 활성을 가지는 것을 확인하였다(도 6 내지 도 8).
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.
<120> RAB6KIFL/KIF20A EPITOPE PEPTIDE AND VACCINES CONTAINING THE SAME
<130> 11fpi-04-06
<150> US61/197,106
<151> 2008-10-22
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3471
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (497)..(3166)
<400> 1
tttttcccct taagacaaag caagcaccct aaaccagtta ccctgtgcac tcctgttaag 60
attgttgcta aggaaggaca ggagttggct gctgaagcct caagatttcc tttaggctct 120
taggtaagaa atgtctaagg ttcaaggaaa aaggttaagt tggaagaatc ccaggcaaaa 180
taagtgcgaa tccacgacag ttggtaaccc ggacccacat tagaactcag aggtcaagca 240
gaagcgaacg actggaattc cagtcaggcc cgcccccttt ccttacgcgg attggtagct 300
gcaggcttcc ctatctgatt ggccgaacga acgcagcgcg taatttaaaa tattgtatct 360
gtaacaaagc tgcacctcgt gggcggagtt gtgctctgcg gctgcgaaag tccagcttcg 420
gcgactaggt gtgagtaagc cagtatccca ggaggagcaa gtggcacgtc ttcggaccta 480
ggctgcccct gccgtc atg tcg caa ggg atc ctt tct ccg cca gcg ggc 529
Met Ser Gln Gly Ile Leu Ser Pro Pro Ala Gly
1 5 10
ttg ctg tcc gat gac gat gtc gta gtt tct ccc atg ttt gag tcc aca 577
Leu Leu Ser Asp Asp Asp Val Val Val Ser Pro Met Phe Glu Ser Thr
15 20 25
gct gca gat ttg ggg tct gtg gta cgc aag aac ctg cta tca gac tgc 625
Ala Ala Asp Leu Gly Ser Val Val Arg Lys Asn Leu Leu Ser Asp Cys
30 35 40
tct gtc gtc tct acc tcc cta gag gac aag cag cag gtt cca tct gag 673
Ser Val Val Ser Thr Ser Leu Glu Asp Lys Gln Gln Val Pro Ser Glu
45 50 55
gac agt atg gag aag gtg aaa gta tac ttg agg gtt agg ccc ttg tta 721
Asp Ser Met Glu Lys Val Lys Val Tyr Leu Arg Val Arg Pro Leu Leu
60 65 70 75
cct tca gag ttg gaa cga cag gaa gat cag ggt tgt gtc cgt att gag 769
Pro Ser Glu Leu Glu Arg Gln Glu Asp Gln Gly Cys Val Arg Ile Glu
80 85 90
aat gtg gag acc ctt gtt cta caa gca ccc aag gac tct ttt gcc ctg 817
Asn Val Glu Thr Leu Val Leu Gln Ala Pro Lys Asp Ser Phe Ala Leu
95 100 105
aag agc aat gaa cgg gga att ggc caa gcc aca cac agg ttc acc ttt 865
Lys Ser Asn Glu Arg Gly Ile Gly Gln Ala Thr His Arg Phe Thr Phe
110 115 120
tcc cag atc ttt ggg cca gaa gtg gga cag gca tcc ttc ttc aac cta 913
Ser Gln Ile Phe Gly Pro Glu Val Gly Gln Ala Ser Phe Phe Asn Leu
125 130 135
act gtg aag gag atg gta aag gat gta ctc aaa ggg cag aac tgg ctc 961
Thr Val Lys Glu Met Val Lys Asp Val Leu Lys Gly Gln Asn Trp Leu
140 145 150 155
atc tat aca tat gga gtc act aac tca ggg aaa acc cac acg att caa 1009
Ile Tyr Thr Tyr Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys Thr His Thr Ile Gln
160 165 170
ggt acc atc aag gat gga ggg att ctc ccc cgg tcc ctg gcg ctg atc 1057
Gly Thr Ile Lys Asp Gly Gly Ile Leu Pro Arg Ser Leu Ala Leu Ile
175 180 185
ttc aat agc ctc caa ggc caa ctt cat cca aca cct gat ctg aag ccc 1105
Phe Asn Ser Leu Gln Gly Gln Leu His Pro Thr Pro Asp Leu Lys Pro
190 195 200
ttg ctc tcc aat gag gta atc tgg cta gac agc aag cag atc cga cag 1153
Leu Leu Ser Asn Glu Val Ile Trp Leu Asp Ser Lys Gln Ile Arg Gln
205 210 215
gag gaa atg aag aag ctg tcc ctg cta aat gga ggc ctc caa gag gag 1201
Glu Glu Met Lys Lys Leu Ser Leu Leu Asn Gly Gly Leu Gln Glu Glu
220 225 230 235
gag ctg tcc act tcc ttg aag agg agt gtc tac atc gaa agt cgg ata 1249
Glu Leu Ser Thr Ser Leu Lys Arg Ser Val Tyr Ile Glu Ser Arg Ile
240 245 250
ggt acc agc acc agc ttc gac agt ggc att gct ggg ctc tct tct atc 1297
Gly Thr Ser Thr Ser Phe Asp Ser Gly Ile Ala Gly Leu Ser Ser Ile
255 260 265
agt cag tgt acc agc agt agc cag ctg gat gaa aca agt cat cga tgg 1345
Ser Gln Cys Thr Ser Ser Ser Gln Leu Asp Glu Thr Ser His Arg Trp
270 275 280
gca cag cca gac act gcc cca cta cct gtc ccg gca aac att cgc ttc 1393
Ala Gln Pro Asp Thr Ala Pro Leu Pro Val Pro Ala Asn Ile Arg Phe
285 290 295
tcc atc tgg atc tca ttc ttt gag atc tac aac gaa ctg ctt tat gac 1441
Ser Ile Trp Ile Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Leu Tyr Asp
300 305 310 315
cta tta gaa ccg cct agc caa cag cgc aag agg cag act ttg cgg cta 1489
Leu Leu Glu Pro Pro Ser Gln Gln Arg Lys Arg Gln Thr Leu Arg Leu
320 325 330
tgc gag gat caa aat ggc aat ccc tat gtg aaa gat ctc aac tgg att 1537
Cys Glu Asp Gln Asn Gly Asn Pro Tyr Val Lys Asp Leu Asn Trp Ile
335 340 345
cat gtg caa gat gct gag gag gcc tgg aag ctc cta aaa gtg ggt cgt 1585
His Val Gln Asp Ala Glu Glu Ala Trp Lys Leu Leu Lys Val Gly Arg
350 355 360
aag aac cag agc ttt gcc agc acc cac ctc aac cag aac tcc agc cgc 1633
Lys Asn Gln Ser Phe Ala Ser Thr His Leu Asn Gln Asn Ser Ser Arg
365 370 375
agt cac agc atc ttc tca atc agg atc cta cac ctt cag ggg gaa gga 1681
Ser His Ser Ile Phe Ser Ile Arg Ile Leu His Leu Gln Gly Glu Gly
380 385 390 395
gat ata gtc ccc aag atc agc gag ctg tca ctc tgt gat ctg gct ggc 1729
Asp Ile Val Pro Lys Ile Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly
400 405 410
tca gag cgc tgc aaa gat cag aag agt ggt gaa cgg ttg aag gaa gca 1777
Ser Glu Arg Cys Lys Asp Gln Lys Ser Gly Glu Arg Leu Lys Glu Ala
415 420 425
gga aac att aac acc tct cta cac acc ctg ggc cgc tgt att gct gcc 1825
Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu His Thr Leu Gly Arg Cys Ile Ala Ala
430 435 440
ctt cgt caa aac cag cag aac cgg tca aag cag aac ctg gtt ccc ttc 1873
Leu Arg Gln Asn Gln Gln Asn Arg Ser Lys Gln Asn Leu Val Pro Phe
445 450 455
cgt gac agc aag ttg act cga gtg ttc caa ggt ttc ttc aca ggc cga 1921
Arg Asp Ser Lys Leu Thr Arg Val Phe Gln Gly Phe Phe Thr Gly Arg
460 465 470 475
ggc cgt tcc tgc atg att gtc aat gtg aat ccc tgt gca tct acc tat 1969
Gly Arg Ser Cys Met Ile Val Asn Val Asn Pro Cys Ala Ser Thr Tyr
480 485 490
gat gaa act ctt cat gtg gcc aag ttc tca gcc att gct agc cag ctt 2017
Asp Glu Thr Leu His Val Ala Lys Phe Ser Ala Ile Ala Ser Gln Leu
495 500 505
gtg cat gcc cca cct atg caa ctg gga ttc cca tcc ctg cac tcg ttc 2065
Val His Ala Pro Pro Met Gln Leu Gly Phe Pro Ser Leu His Ser Phe
510 515 520
atc aag gaa cat agt ctt cag gta tcc ccc agc tta gag aaa ggg gct 2113
Ile Lys Glu His Ser Leu Gln Val Ser Pro Ser Leu Glu Lys Gly Ala
525 530 535
aag gca gac aca ggc ctt gat gat gat att gaa aat gaa gct gac atc 2161
Lys Ala Asp Thr Gly Leu Asp Asp Asp Ile Glu Asn Glu Ala Asp Ile
540 545 550 555
tcc atg tat ggc aaa gag gag ctc cta caa gtt gtg gaa gcc atg aag 2209
Ser Met Tyr Gly Lys Glu Glu Leu Leu Gln Val Val Glu Ala Met Lys
560 565 570
aca ctg ctt ttg aag gaa cga cag gaa aag cta cag ctg gag atg cat 2257
Thr Leu Leu Leu Lys Glu Arg Gln Glu Lys Leu Gln Leu Glu Met His
575 580 585
ctc cga gat gaa att tgc aat gag atg gta gaa cag atg caa cag cgg 2305
Leu Arg Asp Glu Ile Cys Asn Glu Met Val Glu Gln Met Gln Gln Arg
590 595 600
gaa cag tgg tgc agt gaa cat ttg gac acc caa aag gaa cta ttg gag 2353
Glu Gln Trp Cys Ser Glu His Leu Asp Thr Gln Lys Glu Leu Leu Glu
605 610 615
gaa atg tat gaa gaa aaa cta aat atc ctc aag gag tca ctg aca agt 2401
Glu Met Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Ile Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ser
620 625 630 635
ttt tac caa gaa gag att cag gag cgg gat gaa aag att gaa gag cta 2449
Phe Tyr Gln Glu Glu Ile Gln Glu Arg Asp Glu Lys Ile Glu Glu Leu
640 645 650
gaa gct ctc ttg cag gaa gcc aga caa cag tca gtg gcc cat cag caa 2497
Glu Ala Leu Leu Gln Glu Ala Arg Gln Gln Ser Val Ala His Gln Gln
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tca ggg tct gaa ttg gcc cta cgg cgg tca caa agg ttg gca gct tct 2545
Ser Gly Ser Glu Leu Ala Leu Arg Arg Ser Gln Arg Leu Ala Ala Ser
670 675 680
gcc tcc acc cag cag ctt cag gag gtt aaa gct aaa tta cag cag tgc 2593
Ala Ser Thr Gln Gln Leu Gln Glu Val Lys Ala Lys Leu Gln Gln Cys
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aaa gca gag cta aac tct acc act gaa gag ttg cat aag tat cag aaa 2641
Lys Ala Glu Leu Asn Ser Thr Thr Glu Glu Leu His Lys Tyr Gln Lys
700 705 710 715
atg tta gaa cca cca ccc tca gcc aag ccc ttc acc att gat gtg gac 2689
Met Leu Glu Pro Pro Pro Ser Ala Lys Pro Phe Thr Ile Asp Val Asp
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aag aag tta gaa gag ggc cag aag aat ata agg ctg ttg cgg aca gag 2737
Lys Lys Leu Glu Glu Gly Gln Lys Asn Ile Arg Leu Leu Arg Thr Glu
735 740 745
ctt cag aaa ctt ggt gag tct ctc caa tca gca gag aga gct tgt tgc 2785
Leu Gln Lys Leu Gly Glu Ser Leu Gln Ser Ala Glu Arg Ala Cys Cys
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cac agc act ggg gca gga aaa ctt cgt caa gcc ttg acc act tgt gat 2833
His Ser Thr Gly Ala Gly Lys Leu Arg Gln Ala Leu Thr Thr Cys Asp
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gac atc tta atc aaa cag gac cag act ctg gct gaa ctg cag aac aac 2881
Asp Ile Leu Ile Lys Gln Asp Gln Thr Leu Ala Glu Leu Gln Asn Asn
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atg gtg cta gtg aaa ctg gac ctt cgg aag aag gca gca tgt att gct 2929
Met Val Leu Val Lys Leu Asp Leu Arg Lys Lys Ala Ala Cys Ile Ala
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gag cag tat cat act gtg ttg aaa ctc caa ggc cag gtt tct gcc aaa 2977
Glu Gln Tyr His Thr Val Leu Lys Leu Gln Gly Gln Val Ser Ala Lys
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aag cgc ctt ggt acc aac cag gaa aat cag caa cca aac caa caa cca 3025
Lys Arg Leu Gly Thr Asn Gln Glu Asn Gln Gln Pro Asn Gln Gln Pro
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cca ggg aag aaa cca ttc ctt cga aat tta ctt ccc cga aca cca acc 3073
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tgc caa agc tca aca gac tgc agc cct tat gcc cgg atc cta cgc tca 3121
Cys Gln Ser Ser Thr Asp Cys Ser Pro Tyr Ala Arg Ile Leu Arg Ser
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Arg Arg Ser Pro Leu Leu Lys Ser Gly Pro Phe Gly Lys Lys Tyr
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gctgtgggga aagagaagag cagtcatggc cctgaggtgg gtcagctact ctcctgaaga 3230
aataggtctc ttttatgctt taccatatat caggaattat atccaggatg caatactcag 3290
acactagctt ttttctcact tttgtattat aaccacctat gtaatctcat gttgttgttt 3350
ttttttattt acttatatga tttctatgca cacaaaaaca gttatattaa agatattatt 3410
gttcacattt tttattgaat tccaaatgta gcaaaatcat taaaacaaat tataaaaggg 3470
a 3471
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Ser Val Val Arg Lys Asn Leu Leu Ser Asp Cys Ser Val Val Ser Thr
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Arg Gln Glu Asp Gln Gly Cys Val Arg Ile Glu Asn Val Glu Thr Leu
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> An artificial peptide sequence
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Ala Gln Pro Asp Thr Ala Pro Leu Pro Val
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ctacaagcac ccaaggactc t 21
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<212> DNA
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<223> An artificially synthesized primer for PCR
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agatggagaa gcgaatgttt 20
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<212> DNA
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<223> An artificially synthesized primer for PCR
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catccacgaa actaccttca act 23
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<212> DNA
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<223> An artificially synthesized primer for PCR
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Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
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Ala Gln Pro Asp Thr Val Pro Val Ser Val
1 5 10
Claims (9)
- 수탁번호 KCTC11940BP로 기탁된 아가로즈, 카라기난, 전분, 풀루난, 카르복시메칠셀룰로오즈(carboxylmethylcellulose; CMC), 자일란, 라미나린, 키틴 및 펙틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 다당류 분해 활성을 갖는 셀룰로파가(Cellulophaga) 속 균주.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 균주, 또는 이의 배양 상층액을 포함하는 다당류 분해용 조성물.
- 제 1항의 균주, 또는 이의 배양 상층액을 다당류에 접촉시키는 단계를 포함하는 다당류 분해 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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Birte Abt 등. Standards in Genomic Sciences . Vol. 4, No. 1, 페이지 72-80 (2011.03.04) * |
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