KR101479148B1

KR101479148B1 - 주형 고정된 펩타이드 모방체

Info

Publication number: KR101479148B1
Application number: KR1020097020096A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 제이. 디마르코; 레쉬미 무케르지; 커스틴 모흘레; 존 앤써니 로빈슨; 헤이코 헨제; 바바라 로마그놀리; 다니엘 오브레흐트; 프랑크 곰베르트; 크리스티안 루딘; 얀 빔 브리블로에드
Original assignee: 폴리포 리미티드; 유니베르시태트 취리히
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2015-01-05
Also published as: KR20100014596A; WO2008104090A1; CN101641372A; HK1138011A1; PL2132221T3; NO342598B1; IL200312A0; DK2132221T3; US8921325B2; US20200399317A1; US10787486B2; US9879047B2; JP2010519331A; US20180127467A1; PT2132221E; CA2679414A1; EA200901178A1; NZ579875A; AU2007348171A1; US11421001B2

Abstract

Cys4와 Cys11 사이에 이황화 결합을 가지며 X가 Ala 또는 Tyr인, 사이클로(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-^DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-^DPro-Pro)인, 주형 고정된 β-헤어핀 펩타이드 모방체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은, CXCR4 길항 특성을 가지며, 건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나 감염 환자에서 바이러스성 진행을 서행 및 정지시키기 위해; 암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 또는 그로 인해 초래되거나, 또는 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 초래되는 경우에, 바이러스성 진행을 서행 및 정지시키기 위해; 면역 억제를 치료하기 위해; 염증을 치료하기 위해; 또는 특히 말초 혈액 줄기 세포 및/또는 간엽 줄기 세포(MSC) 및/또는 CXCR4-수용체에 의존하여 체류하는 그외 줄기 세포 등의 줄기 세포 가동화를 위해 사용될 수 있다. 이러한 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 혼성 고상- 및 액상 합성 전략을 기초로한 방법으로 펩타이드 화학 분야의 적합한 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

Description

주형 고정된 펩타이드 모방체{TEMPLATE-FIXED PEPTIDOMIMETICS}

본 발명은, CXCR4 길항 활성을 가지며, WO 2004/096840 A1에 구체적으로 기술되어 있진 않지만 일반적인 내용이 기술되어 있는, 주형 고정된 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 제공한다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 Cys4와 Cys11 사이에 이황화 결합을 가지며 X가 Ala 또는 Tyr인 사이클로(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-^DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-^DPro-Pro), 및 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.

본 발명에 있어서, 상술한 β-헤어핀 모방체 및 그의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 단계를 포함하는 공정으로 제조할 수 있다:

(a) 적절하게 관능화된 고형 지지체를 적절하게 N-보호된 Pro 유도체와 커플링하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 수득한 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(c) 수득되는 산물을 적절하게 N-보호된 ^DPro 유도체와 커플링하는 단계;

(d) 수득되는 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(e) 수득되는 산물을 적절하게 보호된 아미노산 유도체와 커플링하는 단계로서, 상기 아미노산 유도체는 바람직한 최종 산물에서 14번 위치, 즉 Lys이고 이의 측쇄에 존재하는 아미노기도 마찬가지로 적절하게 보호되어 있으며;

(f) 수득되는 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(g) 적절하게 N-보호된 아미노산 유도체들을 이용하여 단계 (e) 및 (f)와 실질적으로 동일한 단계를 수행하는 단계로서, 상기 아미노산 유도체들은 바람직한 최종 산물에서 13번 내지 1번 위치인, 즉 Gln, Tyr, Cys, Tyr, Arg, Dab, ^DPro, Ala, Ser, Cys, Ala 또는 Tyr, His 및 Tyr이고, 상기 N-보호된 아미노산 유도체들에 존재할 수 있는 임의의 관능기도 마찬가지로 보호되어 있으며;

(h) 4번 및 11번 위치의 Cys의 측쇄들 간에 이황화 β-가닥 결합을 형성하는 단계;

(i) 수득되는 산물을 고형 지지체로부터 탈착시키는 단계;

(j) 고형 지지체로부터 탈착된 산물을 고리화하는 단계;

(k) 아미노산 잔기 체인을 이루는 모든 아미노산의 관능기에 존재하는 모든 보호기를 제거하는 단계; 및

(l) 필요한 경우, 수득되는 산물을 약학적으로 허용가능한 염으로 변환하거나, 또는 수득되는 약학적으로 허용가능한 염 또는 허용불가능한 염을 대응되는 유리 화합물이나 여러가지 약학적으로 허용가능한 염으로 변환하는 단계.

상기 과정의 단계들은 펩타이드 화학 분야의 일반적인 당업자에게 잘 알려져 있는 방법들에 의해 수행할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나, 감염 환자, 또는 암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 또는 초래되는 경우, 또는 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 초래되는 경우에 바이러스성 진행을 느리게 하거나 또는 정지시키거나, 또는 면역 억제를 치료하기 위해, 또는 염증을 치료하기 위해, 또는 특히 말초 혈액 줄기 세포 및/또는 간엽 줄기 세포(MSC: mesenchymal stem cell) 및/또는 CXCR4-수용체에 의존하여 체류하는 그외 줄기 세포 등의 줄기 세포 가동화(stem cell mobilisation) 등의 매우 다양한 용도로 사용할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 그 자체를 투여하거나 또는 당업계에 잘 알려져 있는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 적절한 제형으로서 적용할 수 있다.

특히, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 골수로부터 동종이계 이식 또는 자가 이식으로 사용할 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoetic stem cell)의 분리를 증가시키기 위한 치료제로서 사용할 수 있다.

주입된 HSC를 이용한 급성 치료는 다발성 골수종 및 비-호지킨스 림프종과 같은 악성 종양을 치료하는 동안에 골수 제거 요법을 시술받은 환자들의 면역 기능을 회복시키기 위해 널리 사용되고 있다. 환자나 공여체에게 본 발명의 화합물과 같은 HCS 가동화제를 처리한 후, 부분 절제에 의해 말초 혈액으로부터 세포를 수집한다. HCS는 예컨대 환자에게 화학 요법을 시술한 후(자가 이식) 또는 공여체에서 수여체로 이식(동종이계 이식)한 후 반대로 이식하여, 면역 기능의 회복을 촉진시킨다(Fruauf et al., Br. J. Haematol. 122, 360-375 (2003)).

다른 HSC 치료 방법으로는, 예컨대 심장 마비의 경우 치료적 혈관 신생이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다(Shepherd RM et al, Blood 2006 108(12):3662-3667).

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 또한 HIV 감염, 또는 유방암, 뇌암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경모세포종, 비-호지킨스 림프종, 난소암, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 췌장암, 흑색종, 혈관신생 및 조혈 조직과 같은 암; 또는 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 지연형 과민증, 간질성 폐 질환(ILD), 특발성 폐 섬유종, ILD 관련 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 말초 혈관 질환, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 본 히펠 린도 질환(von Hippel Lindau disease), 전신성 아나필락시스 또는 과민 반응, 약물 알레르기, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 베체트 증후군, 점막염, 크론 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 연소자 당뇨병, 사구체신염, 자가면역 갑상선염, 동종이계 이식 거부 또는 이식-편대-숙주 질환 등의 이식 거부 반응, 염증성 장 질환, 염증성 피부병과 같은 염증 장애를, 치료 또는 예방, 또는 그래프트/이식 거부에 의해 유도되는 면역 억제 등의 면역 억제를 치료하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 2종 이상의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 혼합물로서 단독으로, 또는 다른 HSC 가동화제, 항-HIV 제제, 항미생물제, 항암제, 항염증제일 수 있는 물질과의 조합으로, 및/또는 다른 약학 활성 제제와 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 포함하는 약학 조성물은 기존의 혼합, 용해, 과립화, 코팅된 정제의 제조, 연화(levigating), 유화, 캡슐 내재화, 포착(entrapping) 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 약학 조성물은 1종 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 본 발명의 활성 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 약학적으로 이용할 수 있는 조제물로의 처리를 용이하게 하는 보조제를 이용하여 기존의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 방법에 따라 결정된다.

국소 투여용으로, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 액제, 겔제, 연고, 크림, 현탁제 등의 당업계에 잘 알려져 있는 제형으로 제형화할 수 있다.

전신 제형으로는 주사, 예컨대 피하, 정맥내, 근육내, 막내(intrathecal) 또는 복막내 주사에 의한 투여용 제형 뿐만 아니라 경피, 경점막, 경구 또는 폐 투여용 제형을 포함한다.

주사용으로는, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 바람직하기로는 한스 용액, 링거액 또는 생리 염수 완충액 등의 생리학적으로 적합한 완충제 중의 적절한 액제로 제형화할 수 있다. 상기 액제는 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 포함할 수 있다.

다른 예로, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 사용하기 전에, 적정 비히클, 예컨대 발열원이 없는 살균 수와 조합하기 위한, 분말 형태일 수 있다.

경점막 투여용으로, 당업계에 공지된 바와 같이 제형에 투과할 장벽에 적합한 침투제를 사용한다.

경구 투여의 경우, 화합물은 본 발명의 활성 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 당업계에 잘 알려져 있는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 쉽게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 치료할 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체를 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로 제형화 할 수 있다. 예컨대, 분말, 캡슐 및 정제와 같은 경구 제형의 경우, 적정 부형제로는 당, 예컨대 락토스, 슈크로스, 만니톨 및 소르비톨과 같은 당; 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가탄, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 조제물; 과립화제; 및 결합제와 같은 충진제를 포함한다. 필요에 따라, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 소듐 알기네이트와 같은 붕괴제를 첨가할 수 있다. 필요에 따라, 고형 투약 형태는 표준적인 방법으로 당으로 코팅하거나 장 코팅할 수 있다.

예컨대 현탁제, 엘리시르제 및 액제와 같은 경구 액체 조제물의 경우, 적정 담체, 부형제 또는 희석제로는, 물, 글리콜, 오일, 알코올 등을 포함한다. 또한, 향료, 보존제, 발색제 등을 첨가할 수 있다.

볼 투여의 경우, 조성물은 정제, 로젠제 등 일반적으로 제형화되는 형태를 취할 수 있다.

흡입 투여의 경우, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 일반적으로 가압 팩로로부터 에오로졸 스프레이 형태로 또는 네불라이저 형태로 전달되며, 적절한 추진체, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 이산화탄소 또는 그외 적합한 가스가 사용된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 측정한 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위해, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체와 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 포함하는, 예컨대 젤라틴 캡슐 및 약포로 제형화할 수 있다.

또한, 조성물은 코코아 버터나 그외 글리세리드와 같은 적정 좌제 베이스와 함께 좌제 등의 직장 또는 질 조성물로 제형화할 수 있다.

앞서 설명한 제형 이외에도, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 또한 데포트(depot) 조제물로서 제형화할 수도 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 이러한 데포트 조제물의 제조에서, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 적합한 폴리머성 또는 소수성 물질(예, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 난용성 염으로서, 제형화할 수 있다.

아울러, 당업계에 잘 알려져 있는 리포좀 및 에멀젼과 같은 다른 약학 전달 시스템을 사용할 수 있다. 디메틸설폭사이드와 같은 특정 유기 용매도 사용할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, 치료제를 포함하는 고형 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은, 지속 방출 시스템을 이용하여 전달할 수 있다. 다양한 지속 방출 물질이 확립되어 있으며, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 지속 방출형 캡슐에서는, 이의 화학적 특성에 따라, 수주 내지 최대 100일간 화합물을 방출시킨다. 치료제의 화학적 특성과 생리 안정성에 따라, 부가적인 단백질 안정화 전략을 채용할 수도 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는 하전된 잔기를 포함하고 있기 때문에, 임의의 전술한 제형에 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 포함될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 수계 및 기타 양성자 용매 중에서 해당 유리 형태 보다 더 가용성인 경향이 있다. 특히 적합한 약학적으로 허용가능한 염은, 카르복시산, 포스폰산, 설폰산 및 설팜산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 옥타노익산, 데카노익산, 도데카노익산, 글리콜산, 락트산, 퓨마르산, 숙신산, 아디픽산, 피멜산, 슈베르산, 아젤라산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 아미노산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 사이클로헥산카르복실산, 아다만탄카르복실산, 벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 만델산, 신남산, 메탄-설폰산, 에탄-설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 에탄-1,2-디설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 1,5-나프탈렌-디설폰산, 2-메틸벤젠설폰산, 3-메틸벤젠설폰산, 4-메틸벤젠설폰산, 메틸설푸르산, 에틸설푸르산, 도데실설푸르산, N-사이클로헥실설팜산, N-메틸-설팜산, N-에틸-설팜산, N-프로필-설팜산, 및 아스코르브산과 같은 다른 유기 양성자성 산 등과의 염을 포함한다. 적합한 유기 산으로는, 예컨대 염산, 황산 및 인산 등의 할로겐화 수소산(hydrohalic acid)이 있다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체는, 유리 형태, 약학적으로 허용가능한 염 형태, 또는 이의 조합으로, 일반적으로 의도한 목적을 달성하는데 유효한 양으로 사용될 것이다. 사용량은 특정한 사용에 따라 결정되는 것으로 이해된다.

HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 국소 투여의 경우, 치료학적 유효량은 예컨대 실시예에 기재되어 있는 시험관내 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 치료는, HIV 감염이 명백하거나 심지어 확인되지 않을 때에도 적용할 수 있다. 당업계의 전문가는 과도한 실험없이도 전형적인 HIV 감염을 치료하기 위한 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

전신 투여의 경우, 치료학적 유효량은 시험관내 분석으로부터 먼저 추산할 수 있다. 예로, 투여량은 세포 배양에서 결정된 IC₅₀(즉, 세포 배양물을 50%로 치사시키는 테스트 화합물의 농도) 등의 순환성 β-헤어핀 펩타이드 모방체 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 사용가능한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.

초기 투여량은 예컨대 동물 모델에서 당업계에서 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 결정할 수 있다. 당업자는 동물 데이타를 기초로 인간에 대한 투약을 쉽게 최적화할 수 있다.

항-HIV 제제로서 사용하기 위한 투여량은 치료 효과를 유지하는데 충분한 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 혈장내 수준을 제공하도록 개별적으로 조정할 수 있다. 치료학적으로 유효한 혈청 수준은 매일 다회 투여를 투약함으로써 달성할 수 있다.

국소 투약 또는 선택적 흡수의 경우, 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 유효한 국소 농도는 혈장 농도와 상관없을 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 치료학적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 것이다.

β-헤어핀 펩타이드 모방체의 투여량은 치료중인 개체, 개체의 체중, 통증 중증도, 투약 방식 및 담당 의사의 판단에 따라 결정할 것이다.

항-HIV 요법은 감염을 검출할 수 있거나 또는 심지어 검출불가능할 때에도 간헐적으로 반복 실시할 수 있다. 요법은 단독으로 또는 예컨대 다른 항-HIV 제제나 항암제, 또는 다른 항미생물제와 같은 다른 약물과 조합하여 제공될 수 있다.

본원에 기술된 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 치료학적 유효량은 정상적으로 실질적인 독성을 초래하지 않으면서 치료학적 이점을 제공할 것이다.

본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 독성은 예컨대 LD₅₀ (집단의 50%를 치사시키는 양) 또는 LD₁₀₀(집단의 100%를 치사시키는 양)을 결정함으로써, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준적인 약학적 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과의 양적 비율(dose ratio)이 치료 지수이다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득한 데이타는 인간에게 사용하기에 무독한 투여량 범위로 제형화하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 β-헤어핀 펩타이드 모방체의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효량을 포함하는 순환성 농도 범위내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 적용하는 투약 경로와 채택한 투약 형태에 따라 범위내에서 변경될 수 있다. 실제 제형, 투약 경로 및 투여량은 환자 상태에 비추어 개개 의사가 선택할 수 있다(예, Fingl et al. 1975, in : The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).

도 1은 실시예 1의 화합물(5 mg)과 비교 화합물 AMD3100의, 혈액 1 ml당 콜로니 형성 단위(CFU-GM)의 경시적 증가를 나타낸 것이다.

도 2는 실시예 2 화합물과 비교 화합물 AMD3100의, 혈액 1 ml당 콜로니 형성 단위(CFU-GM)의 경시적 증가를 나타낸 것이다.

도 3은 실시예 1의 화합물에 대한 혈액 1 ㎕ 당 CD34(+) 세포의 평균 갯수를 경시적으로 나타낸 것이다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만 어떠한 방식으로도 그 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다. 다음의 약어들이 본 실시예들에 사용된다.

HBTU: 1-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (Knorr et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930);

HOBt: 1-하이드록시벤조트리아졸;

DIEA: 디이소프로필에틸아민;

HOAT: 7-아자-1-하이드록시벤조트리아졸;

HATU: O-(7-아자-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(Carpino et al. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281).

1. 펩타이드 합성

첫 번째 보호된 아미노산 잔기와 수지의 커플링

0.5 g의 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100-200 mesh, 코폴리(스티렌-1% DVB) 폴리머 매트릭스, Cat. No. 01-64-0114, Novabiochem, Merck Biosciences Ltd.) (Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946) (1.4 mMol/g, 0.7 mmol)를, 건조시킨 플라스크에 충진하였다. 수지를 CH₂Cl₂(2.5 ml) 중에 현탁하고, 실온에서 30분간 일정하게 교반하면서 팽윤하도록 두었다. 상기 수지를 CH₂Cl₂(2.5 ml) 중의 488 ㎕(4eq)의 디이소프로필에틸아민(DIEA) 및 0.49 mMol(0.7eq)의 적절하게 보호된 첫 번째의 아미노산 잔기로 처리하고, 상기 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 수지를 30분 동안 30 ml (CH₂Cl₂/MeOH/DIEA : 17/2/1)에서 교반하고; 이어서, CH₂Cl₂(1x), DMF(1x), CH₂Cl₂(1x), MeOH(1x), CH₂Cl₂(1x),MeOH(1x), CH₂Cl₂(2x), Et₂O(2x)의 순서대로 세척하고, 6시간동안 진공하에서 건조하였다.

로딩은 전형적으로 0.6-0.9 mMol/g이었다.

하기 로딩 수지를 준비하였다: Fmoc-Pro-2-클로로트리틸수지.

완전히 보호된 펩타이드 단편의 합성

24 내지 96개의 반응 용기를 사용하여 Syro-펩타이드 합성기(MultiSynTech GmbH)로 합성을 수행하였다. 각각의 반응 용기에 60 mg(로딩전 수지의 중량)의 상기 수지를 넣었다. 반응 사이클을 하기와 같이 프로그램하여 합성을 수행하였다:

단계 시약 시간

1 CH₂Cl₂, 세척 및 팽윤 (수동) 1 x 3분.

2 DMF, 세척 및 팽윤 1 x 60분

3 40 % 피페리딘/DMF 2 x 5분.

4 DMF, 세척 5 x 1분.

5 5 당량(eq.)의 Fmoc 아미노산/DMF

+ 5 eq. HBT

+ 10 eq. DIEA 2 x 60분.

6 DMF, 세척 5 x 1분.

7 40 % 피페리딘/DMF 2 x 5분.

8 DMF, 세척 5 x 1분.

9 CH₂Cl₂, 세척 (합성의 종료시에) 3 x 1분.

단계 3 내지 6을 반복하여 각각의 아미노산을 추가하였다.

분석 방법:

분석용 HPLC 체류 시간(RT, 분으로 나타냄)을 용매 A(H₂O + 0.1% TFA) 및 B(CH₃CN + 0.1% TFA), 및 농도 구배: 0분: 95% A, 5% B; 0.5분: 95% A, 5% B; 20분: 40% A 60% B; 21분: 0% A, 100% B; 23분: 0% A, 100% B, 23.1분: 95% A, 5% B, 31분: 95% A, 5% B를 사용하여, Jupiter Proteo 90A, 150 x 2.0 mm(cod. 00F4396-B0-Phenomenex)로 측정하였다.

이황화 β-가닥 연결의 형성

합성을 종료한 후, 수지를 1시간 동안 건조 DNF 3 ml 중에서 팽창시켰다. 그 후 10 당량의 DMF(6 ml) 중의 요오드 용액을 반응조에 첨가하고, 1.5시간 동안 교반하였다. 수지를 여과한 다음, 신선한 DFMN(6 ml) 중의 요오드 용액(10 당량)을 첨가하여 다시 3시간 더 교반하였다. 수지를 여과한 다음 DMF(3x) 및 CH₂Cl₂ (3x)로 헹구었다.

펩타이드의 절단, 벡본 고리화, 탈보호화 및 정제

이황화 β-가닥 연결을 형성시킨 후, 수지를 CH₂Cl₂ 중의 1% TFA(v/v) 1 ml(0.14 mMol)에서 3분 동안 현탁하고, 여과하여, 여과물을 CH₂Cl₂(v/v) 중의 1 ml(1.15 mMol)의 20% DIEA로 중화하였다. 이러한 과정을 2번 반복하여 절단이 완결되도록 하였다. 수지는 1 ml의 CH₂Cl₂로 헹구었다. CH₂Cl₂ 층을 증발시켜 건조시켰다.

휘발성 물질을 제거하고, 시험관에 DMF 8 ml을 첨가하였다. 이어서, 건조 DMF(1 ml) 중의 HATU 2 당량 및 건조 DMF(1 ml) 중의 DMF 4 당량을 펩타이드에 첨가하여, 이 혼합물을 16시간동안 실온에서 교반하였다. 휘발성 물질은 증발시켜, 건조시켰다. 고리화된 펩타이드 조산물을 CH₂Cl₂ 7 ml에 용해하고, 수(4.5 ml)중의 10% 아세토니트릴로 3번 추출하였다. CH₂Cl₂ 층을 증발시켜 건조시켰다. 펩타이드를 완전히 탈보호하기 위해, 절단 칵테일 TFA : TIS : 물( 95: 2.5:2.5) 3 ml을 첨 가하고, 2.5시간 동안 혼합물을 교반하였다. 휘발성 물질을 증발시켜, 건조하고, 펩디트 조산물을 수(7 ml) 중의 20% AcOH에 용해하고, 이소프로필에테르(4 ml)로 3회 추출하였다. 수상을 모아, 증발하여 건조시키고, 잔류물을 분취용 역상 HPLC로 정제하였다.

산물은 동결건조 후, 백색 분말로 수득되었으며, 이를 HPLC-ESI-MS 분석 방법으로 분석하였다. 분취용 HPLC 및 ESI-MS를 수행한 이후의 순도 등의 분석 데이타는 표 1에 나타내었다.

실시예 1: 펩타이드를 수지에 그래프트한 L-Pro 아미노산에서부터 시작하여 합성하였다. 출발 수지는 Fmoc-Pro-2-클로로트리틸 수지이며, 이는 상술한 바와 같이 준비하였다. 선형 펩타이드는 전술한 과정에 따라 서열: 수지-Pro- ^DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-^DPro-Ala-Ser-Cys-Ala-His-Tyr 로 고상 지지체 상에서 합성하였다. 이황화 β-가닥 연결을 전술한 바와 같이 만들었다. 수지에서 산물을 잘라내고, 고리화 및 탈보호한 다음, 분취용 역상 LC-MS로 기술된 바와 같이 정제하였다.

산물은, 동결건조한 후, 백색 분말로 수득되었으며, 전술한 HPLC-ESI-MS 분석 방법으로 분석하였다([M+2H]²⁺: 933.1; RT: 10.47; UV-purity: 72%).

실시예 2: 펩타이드를 수지에 그래프트한 L-Pro 아미노산에서부터 시작하여 합성하였다. 출발 수지는 Fmoc-Pro-2-클로로트리틸 수지이며, 이는 상술한 바와 같이 준비하였다. 선형 펩타이드는 전술한 과정에 따라 서열: 수지-Pro- ^DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-^DPro-Ala-Ser-Cys-Tyr-His-Tyr로 고상 지지체 상에서 합성하였다. 이황화 β-가닥 연결을 전술한 바와 같이 만들었다. 수지에서 산물을 잘라내고, 고리화 및 탈보호한 다음, 분취용 역상 LC-MS로 기술된 바와 같이 정제하였다.

산물은, 동결건조한 후, 백색 분말로 수득되었으며, 전술한 HPLC-ESI-MS 분석 방법으로 분석하였다([M+2H]²⁺: 978.6; RT: 10.95; UV-purity: 82%).

2. 생물학적 방법

2.1. 펩타이드의 제조

동결건조된 펩타이드를 Microbalance(Mettler MT5)에서 무게를 측정하여 다른 언급이 없으면, 멸균수에 최종 농도 1 mg/ml로 용해하였다. 원액을 빛이 차단된 상태에서 +4 ℃에서 보관하였다.

2.2. Ca ² ^+- 분석: 펩타이드의 CXCR4 -길항 활성

인간 CXCR4가 안정적으로 형질감염된 마우스 프리-B 세포주 300-19에서 CXCR4 길항성에 대해 펩타이드를 분석하기 위해, 세포내 칼슘 증가를 Flexstation 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 모니터링하였다(하기 참조문헌 1, 2 및 3 참조). 세포를 실온에서 1시간 동안 분석 완충액(한스 밸런스 맞춘 염 용액, HBSS, 20 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA) 중에 칼슘 3 분석 키트(Molecular Devices) 로 배치(batch) 로딩한 다음, 표지된 세포 200,000를 블랙 96웰 분석 플레이트(Costar No. 3603)에 배분하였다. 분석 완충액 중의 20x 농축된 펩타이드 용액을 세포에 첨가하고, 전체 플레이트를 원심분리하여, 세포가 웰 바닥에 고정되게 하였다. 10 nM 기질 유래 인자-1(SDF-1)에 의해 유도한 칼슘 가동화를 90초간 Flexstation 384 (여기 485 nm, 방출 525 nm)에서 측정하였다. 베이스라인 이상의 형광 반응의 최대 변화로 길항제 활성을 계산하였다. 용량 반응 곡선 데이타(길항제 농도 대 최대 반응율%)를 SoftmaxPro 4.6 (Molecular Devices)을 이용하여 4 파라미터 로지스틱 식으로 만들어, IC₅₀ _% 값을 계산하였다.

2.3. FIGS -분석 ^TM

참고문헌 5에 따라 분석을 수행하였다. 실온에서 10 μM Tris-HCl에 용해시켜, 펩타이드 스톡 희석물(10 μM)을 제조하였다. 스톡 용액은 광 차단시켜 +4℃에 두었다. PBS(Phosphate Buffered Saline)에서 연속 희석하여 즉석으로 워킹 희석물을 제조하고, 세포 배양물에 직접 최종 부피 10 ㎕로 첨가하였다. 48시간 공배양한 후, 배양물을 PBS로 헹군 다음 PBS 중의 글루카르알데하이드/포름알데하이드(0.2 %/2 %)에서 5분간 노출시켰다. 측광적 정량을 위해, 고정된 배양물을 β-갈락토시다제 기질로서, 크로모포어 오르쏘-니트로페놀(ONP)로 효소적으로 변환되는 오르쏘-니트로-페닐-갈락토피라노시드(ONPG)와 함께 배양하였다. iEMS 96웰 플레 이트 리더에서 405 nm에서 웰의 광학 밀도를 측정하여 바로 판독하였다.

2.4. 세포독성 분석

HELA 세포(Acc57) 및 COS-7 세포(CRL-1651)에 대한 펩타이드의 독성을 MTT 환원법[하기 참조문헌 6 및 7 참조]을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 그 방법은 다음과 같다: HELA 세포 및 COS-7 세포를 각각 웰 당 7.0 x 10³ 및 4.5 x 10³ 세포 농도로 파종하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에, MTT 환원(하기 참조)한 시간 0(Tz)로 정하였다. 나머지 웰의 상층액을 버리고 새로운 배지를 넣어주고, 연속 희석한 펩타이드 12.5, 25 및 50 μM를 각 웰에 분배하였다. 각각의 펩타이드 농도를 3배수로 분석하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 계속 배양하였다. 이어서, 웰을 PBS로 1회 세척한 후, 100 μM MTT 시약(RPMI1640 및 DMEM 배지 각각 중에 0.5 mg/mL)을 상기 웰에 첨가하였다. 이를 37 ℃에서 2시간 동안 배양한 후, 배지를 뽑아내고, 100 ㎕의 이소프로판올을 각 웰에 첨가하였다. 용해된 산물의 595 nm에서의 흡광도(OD₅₉₅펩타이드)를 측정하였다. 각각의 농도에 대하여, 3번 실시한 실험 값들의 평균을 계산하였다. 증식 %는 하기와 같이 계산하고, 각각의 펩타이드 농도에 대하여 그래프를 그렸다: (OD₅₉₅펩타이드 - OD₅₉₅Tz - OD₅₉₅ 빈 웰) / (OD₅₉₅Tz - OD₅₉₅ 빈 웰) x 100%.

각 농도(50, 25, 12.5 및 0 μM) 에 대하여, 상응하는 증식 백분율 및 값 -50, (=TREND(C50:C0,%50:%0,-50))의 EXCEL(Microsoft Office 2000)의 추세선 함수를 사용하여, LC50 값(50%의 세포를 치사시키는 농도로 정의되는 치사량 농도)을 결정하였다. 각 농도(50, 25, 12.5 및 0 ㎍/ml)에 대하여, 상응하는 백분율 및 값 50, (=TREND (C₅₀:C₀,%₅₀:%₀,50)의 추세선 함수를 사용하여 GI50 (성장 저해) 농도를 결정하였다.

2.5. 세포 배양

'CCR5' 세포를 4500 mg/ml 글루코스, 10 % 우태아 혈청(FBS), 및 50 U/ml 페니실린과 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(Pen/Strept.)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Hut/4-3 세포는 Pen/Strept이 첨가된 RPMI + 10% FBS + 10 mM HEPES 배지에서 유지시켰다. HELA 세포와 CCRF-CEM 세포는 RPMI1640 + 5% FBS, Pen/Strept 및 2 mM L-글루타민 배지에서 유지시켰다. Cos-7 세포는 10% FCS, Pen/Strept. 및 2 mM L-글루타민이 첨가된 DMEM 배지 + 4500 mg/ml 글루코스에서 배양하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 세포 배지, 배지 첨가물, PBS-완충액, HEPES, Pen/Strept., L-글루타민과 혈청은 Gibco 사(Pailsey, UK)에서 구입하였다. 모든 고품질의 화합물들은 Merck 사(Darmstadt, Germany)에서 구입하였다.

2.6. 세포 용혈

펩타이드를 인간 적혈구(hRBC)에 대한 용혈 활성에 대하여 테스트하였다. 신선한 hRBC를 인산완충염수(PBS) 중에서 2000 x g에서 10분간 원심분리하여 3회 세척하였다. 100 μM 농도의 펩타이드를 20% v/v hRBC와 37℃에서 1시간 동안 인 큐베이션하였다. 최종 적혈구 농도는 대략 ml 당 0.9 x 10⁹ 세포이었다. PBS 단독 및 H₂O 중의 0.1% 트리톤 X-100의 존재 중에서 각각 hRBC의 배양으로 각각 0% 및 100%에 대한 값을 측정하였다. 시료를 원심분리하여 상층액을 PBS 완충액으로 20-배 희석하고, 시료를 540 nM에서 흡광도를 측정하였다. 100% 용혈값(OD₅₄₀H₂0)의 OD₅₄₀는 대략 1.3-1.8이었다. 용혈 %는 하기와 같이 계산하였다: (OD₅₄₀ 펩타이드/OD₅₄₀H₂0) x 100%.

2.7. 화학주성 분석 (세포이동 분석)

CCRF-CEM 세포의 기질 세포-유래 인자 1a(SDF-1)의 농도 구배에 대한 화학주성 반응을 Neuroprobe(5μ 구멍 크기)(Gaithersburg, MD)에서 구입한 일회용 분석플레이트를 사용하여 제조사의 설명서 및 이에 포함된 참조문헌[특히 하기 참조문헌 8 참조]에 따라 측정하였다. 간략하게 설명하면, 175 cm² 플라스크를 DPBS(Dubecco's phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, 10분 동안 또는 세포가 떨어질 때까지 트립신으로 처리하였다. 트립신을 혈청이 포함된 신선한 배지를 첨가하여 중화시키고, 세포를 펠렛화한 다음, DPBS로 1회 세척하고, RPMI + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 중에서 1-0.5 X 10⁷ 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 세포 상층액 45 ㎕를 동일한 분석 배지로 희석시킨 5 ㎕의 10배 농축된 PEM 펩타이드와 혼합하였다. 35 ㎕의 상기 혼합물을 분석 필터 상부에 적용하였다. 상기 세포는 (37℃에서) 1 nM SDF-1이 포함된 분석 플레이트의 하부 챔버로 이동할 수 있게 두 었다. 4시간 후에, 필터를 제거하고, MTT를 이동한 세포에 최종 농도 0.5 mg/ml로 첨가하고, 추가로 4시간 더 배양하였다. MTT로 표지한 후, 모든 배지를 제거하고, 100 ㎕의 이소프로판올 + 10 mM HCl를 세포에 첨가하였다. 595 nm(ABS₅₉₅)에서 흡광도를 Magellan software가 설치된 Tecan Genios 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 분석 플레이트에서, 공지된 세포수로 만든 표준 곡선에 대하여 ABS₅₉₅ 값을 비교하여 이동한 세포수를 결정한 후, 이를 SDF-1 농도에 대하여 그래프를 그려 시그모이드 곡선을 수득하고, IC₅₀ 값을 결정하였다. IC₅₀ 값은 로그 곡선을 평균 데이타 값에 대입하여 마이크로소프트 엑셀의 추세선 함수를 사용하여 결정하였다.

2.8 혈장안정성

405 ㎕의 혈장/알부민 용액을 폴리프로필렌(PP) 시험관에 넣고, 135 ㎕의 PBS 및 PBS, pH 7.4 중의 15 ㎕의 1 mM 펩타이드 유래의, 100 μM의 용액 B로부터 화합물 45 ㎕를 첨가하였다. 150 ㎕ 분취물을 10 kDa 필터 플레이트(Millipore MAPPB 1010 Biomax membrane) 각각의 웰에 가하였다. "0 분 대조군": 270 ㎕의 PBS를 PP 시험관에 넣고, 30 ㎕의 원액 용액 B를 첨가하고 볼텍스하였다. 150 ㎕의 대조군 용액을 상기 필터 플레이트의 한 웰에 넣고, "여과된 대조군"으로서 사용하였다.

추가의 150 ㎕의 대조군 용액을 수용기 웰(여액용 용기)로 직접 넣고 "비여과 대조군"으로 사용하였다. 증발 뚜껑을 포함하는 전체 플레이트를 37℃에서 60 분간 배양하였다. 혈장 시료(랫 혈장: Harlan Sera lab UK, 인간 혈장: Blutspendezentrum Zurich)를 15℃에서 4300 rpm(3500 g)에서 최소 2시간 동안 원심분리하여 100 ㎕ 여액을 수득하였다. "혈청 알부민" -시료 (인간 알부민으로부터 새로 준비: Sigma A-4327, 랫 알부민: Sigma A-6272, 모두 농도는 PBS 중의 40 mg/ml)의 경우, 대략 1시간 동안의 원심분리면 충분하다. 수용기 PP 플레이트의 여액을 하기와 같이 LC/MS로 분석하였다: 컬럼: Jupiter C18(Phenomenex), 이동상: (A) 물 중의 0.1% 포름산 및 (B) 아세토니트릴, 구배: 2분내에 5%-100% (B), 전자분무 이온화, MRM 검출(트리플 쿼드루풀). 피크 면적을 측정하여 삼중 값을 평균하였다. 결합을 100-(100 * T₆₀/T₀) 식에 의해 대조군 1 및 2의 백분율(여과 및 비여과 시간 0 분)로 측정하였다. 이들 값의 평균을 결정하였다(하기 참조문헌 9 참조).

3.0 생체내 실험

3.1. 마우스에서의 최대 허용 용량

a) 예비 실험으로, 실시예 1의 화합물을 주사용수나 0.9% 생리염수에 분산시킨 것을 정맥내 주사로 수컷 1마리와 암컷 1마리로 구성된 마우스 그룹(Crl:CD1(ICR))에게 35, 50, 70, 85, 100, 150, 250 또는 500 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 또한, 수컷 2마리 및 암컷 2마리로 구성된 2가지 그룹에 각각 투여량 90 및 100 mg/kg을 투여하고, 수컷 1마리와 암컷 1마리로 구성된 그룹에서 투 여량 50 mg/kg을 반복 투여하였다.

b) D1 마우스(3마리 마우스/그룹)를 이용하여 실시예 2의 화합물의 최대 허용 용량 실험(MTD)를 수행하였고, 정맥내, 복막내 및 피하 투여로 실시하였다.

3.2 마우스에서의 반복적인 독성 실험

적어도 14일간 마우스에 매일 정맥내 주사를 실시하여, 실시예 1의 화합물의 독성과 독성 동태성을 조사하였다. 12마리의 수컷과 12마리의 암컷으로 이루어진 마우스 Crl:CD1(ICR) 그룹들에 대조군이 포함된 투약 조제물(0.9% w/v 소듐 클로라이드가 포함된 50 mM 소듐 디하이드로 오르쏘포스페이트 완충액)이나 또는 투약 부피 5　mL/kg으로 POL6326을 8, 24 또는 40　mg/kg/day로 투약하였다.

그룹 당 성별 당 24마리의 동물로 이루어진 새탈라이트 그룹에 각 투약 수준을 포함시켰다. 독성 평가는 사망율, 임상 신호, 체중, 음식 소비량, 눈 검사, 임상 병태, 해부 병리 및 독성 동태학적 평가를 기초로 하였다.

3.3 줄기세포 가동화

a) 마우스 모델:

실험의 목적은 실시예 1 및 2의 화합물의, 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor)를 마우스 골수로부터 말초 혈액으로 이동시킬 수 있는 능력을, 시험관내 조혈 콜로니 분석을 이용하여 평가하고자 하는 것이다. 인간의 경우, 전구 세포 가동화에 대한 정확한 정보들은, CFU-GM(colony forming unit granulocyte-monocyte) 분석이나 FACS 분석에 의한 CD34(+) 세포의 충분성의 결정에 의해, 제시된다(하기 참조문헌 10 참조). 마우스의 경우, CD34는 줄기 세포에 대한 유용한 마커가 아니고, 대신 CFU-GM이 더 일반적으로 사용되고 있다(하기 참조문헌 11 참조).

실시예 1 및 2의 화합물이 뮤라인 줄기 세포(CFU-GM)를 가동화시키는 능력을 평가하기 위해, C3H/HeJ 암컷 마우스(Jackson Laboratory)에게 실시예 1 및 2의 화합물과 줄기 세포 가동화에 대한 대조군으로서 AMD3100 (Broxmeyer, et al, J Exp Med 201, 1307-1318), (현재 임상 III 상 단계임)을 피하 주사하였다. 테스트 그룹 당 5마리의 동물로부터 말초 혈액을 각 시간대별로 채혈하고, 유핵 세포 카운트(nucleated cell count)를 표준 분석으로서 수행하였다.

b) 원숭이 모델:

시노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)를 대상으로 말초 혈액 조혈 줄기세포의 가동화를 평가하였다. 실시예 1의 화합물을 서행 볼루스로서 원숭이 4마리(수컷 2 + 암컷 2)에게 2분에 거쳐 정맥내 주사하고, FACS 분석으로 CD34(+) 세포를 측정하였다. 독성 동태성 혈액 샘플링도 또한 수행하였다.

4.0. 결과

상기 2.2-2.8에 기술된 실험들의 결과는 하기 표 1 및 2에 나타내었다.

표 1

실험	IC₅₀ (nM) Ca² ⁺ 분석	FIGS IC50 (nM)	세포 독성 LC ₅₀ / GI ₅₀ Hela cells	용혈, 100 μM	IC₅₀ (μM) 세포 이동 분석
1	5.5	n.d.	>50	0.6	n.d.
2	4.1	24.7	94	0.3	0.5

n.d.: 미검출

표 2

실험	인간 혈장 안정성 t₁ _/2(min)	랫 혈장 안정성 t₁ _/2(min)
1	>240	>240
2	>300	>300

상기 3.1-3.3에 기술된 실험의 결과들은 하기에 나타내었다.

4.1: 마우스에서의 MTD 실험

a) MTD 실험, 실시예 1의 화합물

마우스에서 실시예 1의 화합물의 급성 최소 치사 정맥내 용량은 90 mg/kg을 초과하는 것으로 확인되었다.

b) MTD 실험, 실시예 2의 화합물

3가지 투여 경로 모두에서 테스트한 최고 용량은 120 mg/kg 볼루스였다. 이 용량에서, 동물들 모두 생존하였으며, 일부 약한 증상만 관찰되었다. 나타난 증상은 일부 행동 우울 장애, 경증의 청색증, 호흡 깊이(respiratory depth) 증가 및 근육 이완이었다.

4.2: 14-일 정맥재 주사 독성 및 독성 동태학적 실험

마우스에 실시예 1의 화합물을 정맥내 투약한 후 이 화합물에 대한 NOAEL 레벨은 40 mg/kg/day였다.

투약 단계의 마지막 주 동안에 체중, 체중 변화 또는 음식물 섭취 또는 눈 검사에 있어 처리에 따른 현저한 효과는 없었다.

40 mg/kg/day을 투여한 암컷에서, 실시예 1의 화합물의 투여는 백혈구 세포 와 절대 림프구의 수가 약간 높은 것과 관련있었다. 40 mg/kg/day을 투여한 수컷의 경우, 유사한 효과는 없었으며, 이러한 사소한 효과는 부작용으로 간주되지 않았다. 임상 화합 결과는 실시예 1의 투여에 영향을 받지 않았다. 장기의 무게 증가(8 mg/kg/day로 투여한 수컷의 신장과, 24 또는 40 mg/kg/day로 투여한 수컷의 정낭)는 우발적인 것으로 간주하였으며, 처리와는 무관하였다. 테스트 제품-관련 병변을 육안으로 검사 기록하였다. 동물 3마리(대조군 암컷 1마리, 8 mg/kg/day 투여한 수컷 1마리, 24 mg/kg/day 투여한 암컷 1마리)에서, 주사한 부위(꼬리)에 병소 부위에 붉고 딱딱한 부분이 관찰ㄹ되었으며, 이는 피하 주사 바늘 천공으로 인한 것이었다. 테스트 제품 관련 병변은 현미경으로 관찰하였을 때 관찰되지 않았다.

4.3: 줄기 세포 가동성

a) 마우스에서 줄기 세포 가동성, 실시예 1의 화합물:

실시예 1의 화합물을 5 mg/kg으로 투여하면, CFU-GM 혈액 세포의 수는 증가하였으며, 120분에 최대 효과를 보였으며, 투여 후 6시간에 베이스라인 수준으로 회복되었다(도 1), 동일한 분석에서, AMD3100(현재 줄기 세포 가동성에 대해 임상 III 실험 중임)을 비교물질로 사용하였다. 추적 실험에서, 실시예 1의 화합물의 CFU-GM 분비에 대한 용량 반응을 결정하였다(도 1). 마우스에서 CFU-GM 분비에 대한 실시예 1의 화합물의 명확한 용량 반응이 있었으며, 5 mg/kg에서 피크 레벨 증가를 보였다.

도 1은 실시예 1의 화합물(5 mg)과 기준 화합물 AMD3100의, 혈액 1 ml당 콜 로니 형성 단위(CFU-GM)의 경시적 증가를 나타낸 것이다.

b) 마우스에서 줄기 세포의 가동성, 실시예 2의 화합물

실시예 2의 화합물을 5 mg/kg으로 투여하면, 투여한 후 최대 6시간에 CFU-GM 혈액 세포의 수가 증가하였으며, 240분에 최대 효과를 나타내었지만, AMD3100의 투여시 대조군 마우스에 비해 30분과 60분에 전구 세포의 빈도와 수가 증가하였다(도 2).

도 2는 실시예 2 화합물과 기준 화합물 AMD3100의, 혈액 1 ml당 콜로니 형성 단위(CFU-GM)의 경시적 증가를 나타낸 것이다.

c) 원숭이에서의 줄기 세포 가동성, 실시예 1의 화합물

실시예 1의 화합물을 투여하면 시노몰거스 원숭이에서 CD34(+) 조혈 세포의 가동성이 유도되었다. 마우스에서 관찰된 바와 같이, 가동화의 개시는 신속하였으며, 2시간째에 피크 레벨을 보였다. 또한, 가동화는 일시적이었으며, 말초 혈액 중의 줄기 세포의 수는 베이스라인 수준으로 회복되었으며, 실시예 1의 화합물의 혈장내 수준도 감소하였다(도 3).

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Claims

Cys4와 Cys11 간에 이황화 결합을 가지며, X가 Ala 또는 Tyr인, 사이클로(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-^DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-^DPro-Pro)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 치료학적 활성 물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서,

CXCR4 길항 활성을 가지며,

건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나 감염 환자에서 바이러스성 진행을 서행 및 정지시키는데 유용하거나;

암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 또는 그로 인해 초래되는 경우 상기 암을 치료 또는 예방하는데 유용하거나;

면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 초래되는 경우에, 상기 면역 질환을 치료 또는 예방하는데 유용하거나;

면역 억제를 치료하는데 유용하거나;

염증을 치료하는데 유용하거나; 또는

말초 혈액 줄기 세포, 간엽 줄기 세포(MSC: mesenchymal stem cell) 및 CXCR4-수용체에 의존하여 체류하는 그외 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기 세포의 줄기 세포 가동화(stem cell mobilisation)에 유용한, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 줄기 세포 가동화(stem cell mobilization)용 약제.
제4항에 있어서, 상기 줄기 세포가 말초 혈액 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 CXCR4-수용체에 의존하여 체류하는 그외 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기 세포인, 약제.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 약학적으로 무활성인 담체를 포함하는, 건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나 감염 환자에서 바이러스성 진행을 서행 및 정지시키거나; 암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 그로 인해 초래되는 경우 상기 암을 치료 또는 예방하거나; 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 초래되는 경우에 상기 면역 질환을 치료 또는 예방하거나; 면역 억제를 치료하거나; 혹은 염증을 치료하기 위한 약학 조성물.
제6항에 있어서, 경구, 국소, 경피, 주사, 볼, 경점막, 폐 또는 흡입 투여에 적합한 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 정제, 당의정제, 캡슐제, 액제(solutions, liquids), 겔제, 경고제, 크림제, 연고제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제, 스프레이제, 네불라이져(nebuliser) 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
건강한 개체에서 HIV 감염을 예방하거나 감염 환자에서 바이러스성 진행을 서행 및 정지시키거나; 암이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 또는 그로 인해 초래되는 경우 상기 암을 치료 또는 예방하거나; 면역 질환이 CXCR4 수용체 활성으로부터 매개되거나 초래되는 경우에 상기 면역 질환을 치료 또는 예방하거나; 면역 억제를 치료하거나; 혹은 염증을 치료하기 위한 약제의 제조에 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 약제는 CXCR4 길항 활성을 가지는 것인 방법.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조 방법으로서,

(a) 관능화된 고형 지지체를 N-보호된 Pro 유도체와 커플링하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 수득한 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(c) 수득되는 산물을 N-보호된 ^DPro 유도체와 커플링하는 단계;

(d) 수득되는 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(e) 수득되는 산물을 N-보호된 아미노산 유도체와 커플링하는 단계로서, 상기 N-보호된 아미노산 유도체는 최종 산물에서 14번 위치, 즉 Lys이고 이의 측쇄에 존재하는 아미노기도 마찬가지로 보호되어 있으며;

(f) 수득되는 산물에서 N-보호기를 제거하는 단계;

(g) N-보호된 아미노산 유도체들을 이용하여 단계 (e) 및 (f)와 동일한 단계를 수행하는 단계로서, 상기 아미노산 유도체들은 최종 산물에서 13번 내지 1번 위치인, 즉 Gln, Tyr, Cys, Tyr, Arg, Dab, ^DPro, Ala, Ser, Cys, Ala 또는 Tyr, His 및 Tyr이고, 상기 N-보호된 아미노산 유도체들에 존재할 수 있는 임의의 관능기도 마찬가지로 보호되어 있으며;

(h) 4번 및 11번 위치의 Cys의 측쇄들 간에 이황화 β-가닥 결합을 형성하는 단계;

(i) 수득되는 산물을 고형 지지체로부터 탈착하는 단계;

(j) 고형 지지체로부터 탈착한 산물을 고리화하는 단계;

(k) 아미노산 잔기 체인을 이루는 모든 아미노산의 관능기에 존재하는 모든 보호기를 제거하는 단계; 및

(l) 수득되는 산물을 약학적으로 허용가능한 염으로 변환하거나, 또는 수득되는 약학적으로 허용가능한 염 또는 허용불가능한 염을 대응되는 유리 화합물이나 여러가지 약학적으로 허용가능한 염으로 변환하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.