KR101478304B1 - Pharmaceutical composition for treating or preventing neuroinflammatory disease - Google Patents

Abstract

본 발명은 명세서 내에 정의된 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating or preventing neuroinflammatory diseases, comprising a compound of the formula (1) as defined in the description or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Description

신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating or preventing neuroinflammatory disease}[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing neuroinflammatory disease,

본 발명은 명세서 내에 정의된 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for treating or preventing neuroinflammatory diseases, comprising a compound of the formula (1) as defined in the description or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다.The central nervous system consists of neurons and glial cells. The glial cells account for about 90% of total brain cells, and the volume accounts for about 50% of the whole brain. The glial cells can be further classified into three types: astrocytes, microglia, and oligodendrocytes.

이 중, 소교세포는 분화된 대식세포(specialized macrophage)의 일종으로, 뇌에 널리 분포한다. 소교세포는 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어활동에 참여하는 역할을 한다. 또한, 소교세포는 만성뇌질환에 있어서 다양한 신경 독소 및 전염증 매개체를 분비함으로써 신경염증을 증가시켜 신경세포사 및 탈수초의 원인이 된다. 뇌손상 또는 신경성염증 자극에 대한 반응으로, 소교세포는 산화질소(nitric oxide, NO), 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하며 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다. Among these, micrographs are a type of specialized macrophages that are widely distributed in the brain. Microglia not only act as phagocytic cells that swallow up tissue debris and dead cells, but also participate in the brain defense activities of the brain. In addition, microglial cells secrete various neurotoxins and proinflammatory mediators in chronic brain diseases, thereby increasing nerve inflammation and causing neuronal death and dehydration. In response to brain injury or neurogenic inflammatory stimuli, the microglial cells are exposed to nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS), proinflammatory cytokines, prostaglandins and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a ) And the like, thereby contributing to nerve inflammation. Activated microglia move into the damaged neural tissue area and predispose to and destroy microbes and cell debris.

그러나 염증세포로서의 소교세포의 역할이 항상 유익한 것은 아니며, 현재 조절되지 않은 소교세포의 활성화는 지속적으로 과도한 신경염증을 유발하여 퇴행성 신경질환을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있다(Gonzalez-Scarano and Baltuch, Annu Rev Nerosci 22:219-240, 1999). 즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하며, 이러한 소교세포의 활성화 및 신경염증과 관련된 질환으로는 뇌허혈, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 및 근위축성 측색경화증 등의 다양한 신경학적 및 신경퇴행성 질환이 알려져 있다(Allan SM, Rothwell NJ, Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev neurosci. 2001;2;734-744). 따라서, 소교세포의 염증성 활성화는 엄격하게 조절되어야 할 필요가 있다.However, the role of microglial cells as inflammatory cells is not always beneficial, and the activation of microcytotoxic cells, which are not currently regulated, is believed to cause a variety of central nervous system pathologies including degenerative neurological diseases by continuously causing excessive neuroinflammation (Gonzalez -Scarano and Baltuch, Annu Rev Nerosci 22: 219-240, 1999). Thus, functionally activated microglia produce and secrete inflammatory mediators, resulting in neuronal cell death. Examples of diseases associated with activation of neuronal cells and neuroinflammation include cerebral ischemia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, (Allan SM, Rothwell NJ, Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev neurosci . 2001; 2; 734-744). Thus, the inflammatory activation of microglia needs to be tightly regulated.

신경염증 질환 치료제에 관한 종래 기술로, 한국등록특허 제1143382호에는 피리미딜이미다졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 약학 조성물을 제공하고 있고, 한국공개특허 제2013-0037236호에는 신규 화합물 피롤로[3,2-d]피리미딘-4-온 유도체를 제공하며, 이 화합물이 신경염증성 장애의 치료에도 효과가 있음을 개시하고 있다. 또한 미국공개특허 제 2008-0027031호에는 소교세포의 활성을 억제하는 조성물로서 레티노이드를 제공하고 있다. 그러나, 아직까지 광범위한 신경염증 질환에 적용 가능하도록 그 효과가 명확히 검증되고 상용화된 물질은 없는 실정이다. Korean Patent Registration No. 1143382 discloses a pharmaceutical composition comprising a pyrimidylimidazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and Korean Patent Publication No. 2013-0037236 Discloses a novel compound pyrrolo [3,2-d] pyrimidin-4-one derivatives, which compounds are effective in the treatment of neuroinflammatory disorders. Also, U.S. Published Patent Application No. 2008-0027031 provides a retinoid as a composition for inhibiting the activity of microglial cells. However, there are no commercially available substances whose effects have been clearly verified to be applicable to a wide range of neuroinflammatory diseases.

이에, 본 발명자들은 소교세포의 활성화 및 신경염증 관련 반응을 다각적으로 저해함으로써 광범위한 신경염증 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 연구한 결과, 본 발명에서 화학식 1로 정의된 화합물이 염증자극에 의해 활성화된 소교세포에서 IL-10, IL-1β 및 TNF-α의 발현을 억제하고, NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합을 약화시키며, ERK와 JNK의 활성을 억제함을 확인하였으며, 나아가 다양한 신경염증 동물모델을 통하여 상기 화합물이 신경염증을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 화합물이 신경염증과 관련된 소교세포의 활성을 효과적으로 억제하여 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 루게릭 질환, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증 등과 같은 다양한 신경염증 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have studied to develop a substance capable of fundamentally treating a wide range of neuroinflammatory diseases by variously inhibiting activation of neuronal cells and neuroinflammatory responses, and as a result, it has been found that the compound defined by the formula (1) Inhibited the expression of IL-10, IL-1 [beta] and TNF- [alpha], weakened DNA binding of NF- [kappa] B or AP-1 and inhibited the activity of ERK and JNK, Various neuronal inflammatory animal models have shown that the compounds have an effect of inhibiting neuronal inflammation. Accordingly, the compound effectively inhibits the activity of microglia associated with neuroinflammation and is useful as a preventive or therapeutic agent for various neuroinflammatory diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, Creutzfeldt-Jakob disease and multiple sclerosis The present invention has been completed.

본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neuroinflammatory diseases, which comprises a compound of the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for treating neuroinflammatory diseases comprising administering to a subject an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a food composition for improving neuroinflammatory diseases comprising a compound of the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.In one aspect of the present invention, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neuroinflammatory diseases, which comprises a compound represented by the following general formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 화합물명이 "(3R)-(+)-[2-(4-메톡시벤젠설포닐)-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-하이드록사메이트"이며, 종래 MMP-8 억제제로서 실험용으로 시판되던 물질로, 질환 치료와 관련한 활성이 알려진 바 없다. 본 발명에 이르러 상기 화합물이 소교세포 활성화 및 신경염증 반응을 억제하는 활성을 가지며, 이를 통하여 종국적으로 신경염증 질환 치료에 사용할 수 있다는 것이 처음 규명되었다. In the present invention, the compound of formula (I) is a compound represented by the formula: (3R) - (+) - [2- (4-methoxybenzenesulfonyl) -1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline- Mate ", which is a commercially available substance as a conventional MMP-8 inhibitor, and its activity relating to the treatment of diseases is not known. It has now been found that the compounds of the present invention have activity to inhibit microglia activation and neuroinflammatory responses and thus ultimately can be used in the treatment of neuroinflammatory diseases.

본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 신경염증 질환 치료의 유효성분으로서, 결정다형체, 수화물, 무수물 또는 용매화물 등 다양한 형태로 존재할 수 있다. 상기 화합물은 당업계에 알려진 다양한 유기합성법에 의하여 화학적으로 제조될 수 있고, 또는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.In the present invention, the compound of Chemical Formula 1 may be present in various forms such as crystalline polymorph, hydrate, anhydride, or solvate as an active ingredient for treating neuroinflammatory diseases. The compounds may be chemically prepared by various organic synthesis methods known in the art, or commercially available ones may be used.

또한, 본 발명은 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, ‘약학적으로 허용 가능한 염’이란 상기 화합물과 부가염을 형성한 것이라면 한정되지 않으며, 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. The present invention also includes pharmaceutically acceptable salts of the above compounds. The term "pharmaceutically acceptable salt" in the present invention is not limited as long as it forms an addition salt with the above compound, and includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.

적합한 산 부가염의 예로는 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 과염소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 옥살산, 구연산, 숙신산, 타타르산, 포름산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글리콜산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔-p-설폰산, 나프탈렌-2-설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염을 포함한다. Examples of suitable acid addition salts include inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, bromic acid, perchloric acid, hydroiodic acid and the like; Organic carboxylic acids such as oxalic acid, citric acid, succinic acid, tartaric acid, formic acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, glycolic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid and salicylic acid; Sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluene-p-sulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid and the like.

적합한 염기 부가염의 예로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등에 의해 형성된 염기 부가염을 포함한다.Examples of suitable base addition salts include alkali metal or alkaline earth metal salts formed by lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium and the like; Amino acid salts such as lysine, arginine and guanidine; Base addition salts formed by organic salts such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, diethanolamine, choline, triethylamine and the like.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식 1 의 구조를 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.The compound of formula (I) according to the present invention can be converted into a salt thereof by a conventional method, and the preparation of the salt can be easily carried out by a person skilled in the art based on the structure of the formula (1) without any explanation.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 신경염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 제공됨을 특징으로 한다.The compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention is characterized by being provided as an active ingredient for the prevention or treatment of neuroinflammatory diseases.

본 발명에서 "예방"이라 함은, 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 "치료"라 함은 질환 또는 질병의 발전의 억제, 질환 또는 질병의 경감, 및 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.In the present invention, "prevention" means suppressing the occurrence of a disease or a disease in an animal which has never been diagnosed as having a disease or disease but tends to be susceptible to such disease or disease. In the present invention, the term "treatment" means suppressing the development of a disease or a disease, alleviating a disease or a disease, and eliminating a disease or a disease.

본 발명에서는 본원 화합물의 신경염증 억제 활성을 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통하여 검증하였다.In the present invention, the neuronal inflammation inhibitory activity of the present compounds was verified through various in vitro and in vivo experiments.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 화합물이 LPS 염증 자극에 의하여 활성화된 소교세포(microglia)에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 의 분비를 감소시키고, 산화질소(NO) 및 활성산소종의 생성을 감소시키는 반면, 항염증 인자인 IL-10의 생성은 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 상기 화합물이 활성화된 소교세포에서 신경염증과 관련된 MAP 인산화효소 신호전달에 관여하는 인자들을 감소시킬 뿐만 아니라, 염증 관련 전사인자인 NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합활성을 감소시켜 항염증 효과 및 소교세포 활성화 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 1 내지 도 4).In a specific embodiment of the present invention, the compounds of the present invention reduce the secretion of inflammatory cytokines TNF-a and IL-6 in microglia activated by LPS inflammation stimulation and inhibit nitric oxide (NO) and activity While it decreased the production of oxygen species, while the production of IL-10, an anti-inflammatory factor, was increased. In addition, the compound not only reduces the factors involved in neuroinflammation-related MAP kinase signaling in microglia activated with the compound, but also decreases the DNA binding activity of the inflammation-related transcription factor NF-κB or AP-1, (Fig. 1 to Fig. 4).

또한, LPS 염증 자극에 의하여 전신염증이 유발된 생쥐에 본 발명의 화합물을 처리한 경우, 혈액과 뇌척수액, 뇌피질 내의 TNF-α 및 IL-1β의 발현이 억제됨을 확인하였으며, 소교세포의 활성화 역시 감소됨을 확인하였다 (도 5 내지 도8).In addition, when the compounds of the present invention were treated with the compounds of the present invention induced by systemic inflammation by LPS inflammation stimulation, the expression of TNF-α and IL-1β in blood and cerebrospinal fluid and brain cortex was inhibited, (Fig. 5 to Fig. 8).

또한, MCAo/Rep 자극을 이용하여 허혈성 뇌졸중을 유발한 후, 본 발명의 화합물을 처리하였을 때, TNF-α의 발현 감소, 소교세포의 활성화 감소 뿐만 아니라 뇌졸중에 의한 뇌세포 손상이 극명하게 감소되었음을 알 수 있었다 (도 9 내지 도 14).In addition, when the compounds of the present invention were treated after inducing ischemic stroke using MCAo / Rep stimulation, the expression of TNF-α and the decrease of activation of microglial cells as well as brain cell damage due to stroke were significantly reduced (Figs. 9 to 14).

따라서, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 다양한 신경염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Accordingly, the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of various neuroinflammatory diseases.

본 발명에서 신경염증 질환은, 신경계의 과도한 염증 반응에 의하여 발생되는 질환이라면 제한 없이 적용될 수 있다. 예를 들어, 소교세포의 활성화 및 신경염증이 매개된 질환으로 알려져 있는, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증을 예시할 수 있으나, 본 발명의 범위가 상기 질환에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, neuroinflammatory diseases can be applied without limitation as long as they are diseases caused by an excessive inflammatory reaction of the nervous system. Alzheimer ' s disease, Parkinson ' s disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, post-traumatic stress disorder, depression, which are known to be mediators of neuronal inflammation, , Schizophrenia or amyotrophic lateral sclerosis, but the scope of the present invention is not limited to the above diseases.

또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체, 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 안정화제, 보존제, 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. The composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or diluent that does not significantly stimulate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, and water for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose, Carrier and the like. Such a pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of one or more ingredients selected from the group consisting of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, Other conventional additives such as stabilizers, preservatives, antioxidants, buffers and bacteriostats may be added.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액 등이 있으며, 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약, 에멀젼, 시럽 및 캡슐 등이 있다. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods. Representative examples of formulations for parenteral administration include injectable aqueous solutions or suspensions, and the like can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be formulated by injection in saline or buffer solution. In addition, formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills, emulsions, syrups and capsules.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환의 치료 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for treating neuroinflammatory diseases, comprising administering to a subject an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 질환의 치료를 필요로하는 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.The term "administering" in the present invention means introducing the pharmaceutical composition of the present invention into a subject in need of treatment of the disease by any appropriate method, and the administration route of the composition of the present invention is a route May be administered via a variety of routes, including oral or parenteral routes.

상기 투여 대상인 개체는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물이 될 수 있으며, 경구, 경피, 피하, 정맥, 또는 뇌혈관내 주사를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. The subject to be treated may be a mammal such as a mouse, a mouse, a livestock, a human, and the like, and may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or intracerebral injection.

본 발명의 치료방법은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.The method of treatment of the present invention comprises administering the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the practitioner within the scope of sound medical judgment. For purposes of the present invention, the specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend upon a variety of factors, including the type and extent of the response to be achieved, the specific composition including whether or not other agents are used, the age, weight, And various factors including diet, time of administration, route of administration and minute of composition, duration of treatment, drugs used or co-used with the specific composition, and similar factors well known in the medical field.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a food composition for improving neuroinflammatory diseases, comprising the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.In the present invention, the term " food " means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, preferably a state of being able to be directly eaten through a certain processing step, , Health functional foods, beverages, food additives and beverage additives.

상기 본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 각종 건강보조 식품류 등에 첨가될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용될 수 있다.The food composition of the present invention can be added to various foods, candies, chocolates, beverages, gums, tea, vitamin complexes, various health supplements and the like, and can be used in the form of powders, granules, tablets, pills, capsules or drinks .

또한 상기 본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 이외에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 이 외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 증진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.The food composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. There are no particular limitations other than those containing the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof. For example, it may further contain various flavors or natural carbohydrates. In addition, the food composition of the present invention includes components that are ordinarily added during the manufacture of food, and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, and seasonings. In addition, various additives such as various nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants, enhancers, factic acid and salts thereof, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, Preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.

또한, 상기 식품에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 염의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In the food, the amount of the compound or salt thereof may be 0.00001% to 50% by weight of the total food. When the food is a beverage, the amount of the compound or salt thereof may be 0.001 g to 50 g , Preferably 0.01 g to 10 g, but is not limited thereto.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 소교세포(microglia)에서 TNF-α, IL-6, 산화질소(NO) 및 활성산소종의 생성 감소, IL-10의 생성 증가, 및 MAP 인산화효소 신호전달 감소를 통하여 활성화된 소교세포를 억제함으로써, 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.
The compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention is useful for the reduction of TNF-α, IL-6, nitric oxide (NO) and active oxygen species production in microglia, And MAP kinase signal transduction. Thus, the present invention can be effectively used as a pharmaceutical composition and food composition for preventing or treating neuroinflammatory diseases.

본 발명 명세서 '화학식 1의 화합물'은 도면 내에서 '화합물'로 표기하였다.
도 1은 LPS 로 활성화된 BV2 소교세포로부터 유리되는 TNF-α, 산화질소 및 IL-6의 생성이 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 2는 LPS 자극으로 활성화된 BV2 소교 세포에서 생성되는 세포 내 활성 산소종의 억제를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS에 의해 활성화된 JNK, ERK, p38, MK2가 본 발명의 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 NF-κB 또는 AP-1 복합체 형성이 본 발명의 화합물에 의하여 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 전신염증 모델 쥐에서 본 발명의 화합물의 신경염증 억제효과를 나타낸 것으로서 혈청(serum)내에서 TNF-α가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 6은 전신염증 모델 쥐에서 본 발명의 화합물의 신경염증 억제효과를 나타낸 것으로서 뇌척수액(CSF)내에서 TNF-α가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 7은 뇌피질에서 TNF-α, IL-1β 단백질 발현이 감소된 것을 나타낸 것이다.
도 8은 Iba1 염색을 통해서 소교세포의 활성화가 감소되었음을 나타낸 것이다.
도 9는 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, TTC염색법을 통해 뇌경색 부위가 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 10은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, 뇌경색의 부피가 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, 신경학적 사항들의 점수가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 12는 허혈성 뇌졸중 모델의 선조체(striatum) 및 뇌피질(cortex) 부위에서 본 발명의 화합물에 의해 뇌세포의 사멸이 감소되었음을 나타낸다.
도 13은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 효과를 관찰한 것으로서, 소교세포의 활성화가 감소된 것을 나타낸 것이다.
도 14는 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 효과를 관찰한 것으로서, TNF-α의 생성이 감소된 것을 나타낸 것이다.The compound of formula (I) of the present invention is represented by 'compound' in the figure.
Figure 1 shows that the production of TNF-a, nitric oxide and IL-6 liberated from LPS-activated BV2 microglia is inhibited.
Figure 2 shows inhibition of intracellular reactive oxygen species produced in BV2 microglia activated by LPS stimulation.
FIG. 3 shows that JNK, ERK, p38, and MK2 activated by LPS are decreased in a concentration-dependent manner by the compound of the present invention.
Figure 4 shows that NF-kB or AP-1 complex formation is reduced by the compounds of the present invention.
Figure 5 shows the neuroinflammation inhibitory effect of the compounds of the present invention in the systemic inflammatory model rats, indicating that TNF-a was reduced in the serum.
Figure 6 shows the inhibitory effect of the compounds of the present invention on neuroinflammation in systemic inflammatory model rats, indicating a decrease in TNF-a in cerebrospinal fluid (CSF).
Fig. 7 shows that the expression of TNF-a, IL-1 beta protein is decreased in the cerebral cortex.
Figure 8 shows that the activation of microglial cells was reduced through Iba1 staining.
FIG. 9 shows the neuroprotective effect of the compound of the present invention in an ischemic stroke model, showing that the cerebral infarction area was reduced through TTC staining.
FIG. 10 shows the neuroprotective effect of the compound of the present invention in an ischemic stroke model, showing a decrease in the volume of cerebral infarction.
FIG. 11 shows the neuroprotective effect of the compounds of the present invention in an ischemic stroke model, indicating that the scores of neurological symptoms were reduced.
Figure 12 shows that brain cell death was reduced by compounds of the present invention at the striatum and cortex sites of the ischemic stroke model.
Figure 13 shows the effect of the compounds of the present invention in an ischemic stroke model, indicating that activation of microglia was reduced.
Figure 14 shows the effect of the compounds of the present invention in an ischemic stroke model, indicating that the production of TNF- [alpha] is reduced.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1. 활성화된  1. Activated 소교세포주에서From micro cell line 본 발명 화합물의 항염증 효과 The anti-inflammatory effect of the compound of the present invention

1-1. 소교세포(1-1. Small cell ( microgliamicroglia )의 배양) Culture

생쥐 유래 소교세포주인 BV2 세포는 미국세포주 은행 (ATCC)에서 그 스톡(stock)을 구입하였으며, 질소탱크에 얼려두었다가 실험하기 전에 녹여서 계대배양 후 사용하였다. BV2세포의 배양을 위하여 10% 우태아 혈청(fetal Bovine Serum, Welgene, Korea) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Welgene, Korea)을 포함하는 둘베코 개량 이글 배지 (dulbeccos modified Eagle? medium, Welgene, Korea)을 사용하였으며, 5% CO₂를 포함하는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
Mouse BV2 cells were purchased from the American Cell Line Bank (ATCC), frozen in a nitrogen tank, and then melted prior to the experiment and used for subculture. BV2 cells were cultured in Dulbeccos modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum (Welgene, Korea) and 1% penicillin / streptomycin (Welgene, Korea) , Welgene, Korea) and cultured at 37 ° C in an incubator containing 5% CO ₂ .

1-2. 소교세포의 활성화1-2. Activation of microglia

상기 실시예 1-1의 방법으로 준비한 마우스 유래의 BV2 소교세포를 48-웰 (48-well) 플레이트에 1.0 X 10⁵ 세포수/ml의 농도로 분주한 후, 실험군의 웰에 본 발명의 화합물을 전처리하고, 1시간 후 LPS (lipopolysaccharide) 100ng/ml을 처리하여 소교세포 활성화를 유발한 후 6시간 또는 18시간 배양하였다. 이 배양배지의 상등액을 수집하여, 실험을 위해 -70℃에 보관하였다. 또한 정상세포 및 활성화된 세포를 수합하여 -70℃에 보관하였다.
The mouse-derived BV2 micrograph prepared by the method of Example 1-1 was dispensed into a 48-well plate at a concentration of 1.0 X 10 ⁵ cells / ml, and the compound of the present invention After 1 hour, LPS (lipopolysaccharide) was treated with 100 ng / ml to induce microglial activation and cultured for 6 hours or 18 hours. The supernatant of this culture medium was collected and stored at -70 ° C for the experiment. Normal and activated cells were combined and stored at -70 ° C.

1-3. 1-3. 활성화 된Active 소교세포 배지 내 산화질소 및 사이토카인 농도 측정  Determination of nitric oxide and cytokine concentration in microbial cell culture medium

본 발명의 화합물의 소교세포 활성화 억제 효과를 측정하기 위해, 활성화된 소교세포의 염증성 또는 항염증성 물질의 배지 내 유리 정도를 알아보는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 화합물은 켈바이오켐(Calbiochem, 미국)에서 구입하여 사용하였다.In order to measure the inhibitory effect of the compound of the present invention on the activation of microcytotoxicity, the following experiment was carried out to determine the degree of the inflammatory or antiinflammatory activity of activated microglia in the medium. The compound was purchased from Calbiochem (USA) and used.

상기 실시예 1-1의 방법으로 수득한 마우스 유래의 BV2 소교세포의 배양 상등액 내 산화질소 농도는 그리스(Griess) 반응법을 사용하여 측정하였으며 (Woo et al., Mol. Brain Res., 113, pp86-96, 2003), 종양괴사인자-알파(TNF-α 및 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10)의 농도는 각 사이토카인의 효소 면역측정 키트 (Pharmingen사, San Diego, USA)를 이용하여 샌드위치 효소면역측정법 (sandwich ELISA)을 이용하여 측정하였다 (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243-252, 2004).The concentration of nitric oxide in the culture supernatant of BV2 microglobulin cells derived from the mouse obtained by the method of Example 1-1 was measured using the Griess reaction method (Woo et al., Mol. Brain Res., 113, The levels of TNF-α and interleukin-6 (IL-6) and interleukin-10 (IL-10) were measured using an enzyme immunoassay kit (Pharmingen, San (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243-252, 2004) using sandwich enzyme immunoassay (San Diego, USA).

실험결과, 본 발명의 화합물에 의해 LPS 로 활성화된 BV2 소교세포로부터 유리되는 TNF-α의 생성이 현저하게 감소됨을 확인하였고, 산화질소 및 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 또한 본 발명의 화합물을 처리할 경우, 항염증 인자인 IL-10의 생성을 증가시키는 것을 알 수 있었다 (도 1).
As a result of the experiment, it was confirmed that the production of TNF- [alpha] liberated from BV2 microglia activated by LPS was significantly reduced by the compound of the present invention, and the production of nitric oxide and IL-6 was inhibited in a concentration-dependent manner. It was also found that treatment of the compounds of the present invention increased the production of IL-10, an anti-inflammatory factor (Fig. 1).

1-4. 1-4. 활성화 된Active 소교세포 내  Intracellular 활성산소종Active oxygen species 측정 Measure

본 발명의 화합물이 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 상위인자인 세포내 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS)에 미치는 영향을 측정하기 위해, 상기 실시예 1-1의 방법으로 수득한 마우스 유래의 BV2 소교세포에 50μM H₂DCF-DA (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)를 처리한 후, 빛을 차단한 상태로 37℃에서 30분간 방치하였으며, 세포 내 활성산소(ROS) 생성정도를 나타내는 DCF 형광 정도를 형광 광도계 또는 공초점 현미경 (confocal microscope)을 이용하여 측정하였다.In order to measure the effect of the compound of the present invention on reactive oxygen species (ROS) in the cell, which is an important factor that plays an important role in inflammatory diseases, the mouse-derived BV2 The cells were treated with 50 μM H ₂ DCF-DA (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) for 30 min at 37 ° C in the absence of light, and DCF The degree of fluorescence was measured using a fluorescence photometer or confocal microscope.

실험결과, 본 발명의 화합물이 LPS 자극으로 활성화된 BV2 소교 세포에서 생성되는 세포 내 활성 산소종을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었고, 특히 본 발명의 화합물 10μM 이상에서는 대조군과 유사한 수준으로 감소됨을 알 수 있었다(도 2).
As a result of the experiment, it was confirmed that the compound of the present invention inhibits the intracellular reactive oxygen species produced in the BV2 microglia activated by the LPS stimulation in a concentration-dependent manner. In particular, when the compound of the present invention is 10 μM or more, (Fig. 2).

1-5. 1-5. 활성화 된Active 소교세포 내  Intracellular MAPMAP 인산화효소의 활성화 정도 측정 Measurement of activation level of phosphorylase

본 발명의 화합물이 LPS에 의하여 활성화된 소교세포에 미치는 효과를 확인하기 위해 다양한 신경염증 질환에서 중요한 역할을 하는 MAP 인산화효소 (MAP kinase) 신호전달 체계의 인자에 대한 웨스턴 블라팅법 (western blotting)을 수행하였다.In order to confirm the effect of the compounds of the present invention on LPS-activated microglia, Western blotting of factors of MAP kinase signal transduction system, which plays an important role in various neuroinflammatory diseases, Respectively.

LPS (100ng/ml)만을 3시간동안 단독 처리한 BV2 소교세포 및 LPS 처리 1시간 전 본 발명의 화합물을 처리한 BV2 소교세포로부터 세포 추출물 (cell extract)을 분리하였다(Woo et al., Mol. Brain Res., 113, pp86-96, 2003). 세포 (1.0 X 10⁵ 세포수)에 1ml 용해 완충액 [lysis buffer; 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 30mM NaCl, 1% Triton x-100, 0.1% SDS, 0.1% Sodium Deoxycholate, 1mM EDTA]을 첨가한 후, 얼음에서 15분간 방치한 후 13200 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻었다. 세포 추출물의 단백질 양은 바이오라드사 (Bio-rad, CA, USA)의 단백질 정량 키트를 이용하여 측정하였다. Cell extracts were isolated from BV2 microglia alone treated with LPS (100 ng / ml) for 3 hours and BV2 microglia treated with compound of the present invention 1 hour before LPS treatment (Woo et al., Mol. Brain Res., 113, pp86-96, 2003). To the cells (1.0 X 10 ⁵ cells) were added 1 ml of lysis buffer [lysis buffer; After addition of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 30 mM NaCl, 1% Triton x-100, 0.1% SDS, 0.1% Sodium Deoxycholate and 1 mM EDTA), the mixture was left on ice for 15 minutes and centrifuged at 13200 rpm for 15 minutes To obtain a cell extract. The protein content of the cell extract was measured using a protein quantification kit from Bio-Rad (CA, USA).

단백질 활성을 확인하기 위하여 50μg의 세포 추출물을 12% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리 아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮겨주었다. 분리된 단백질이 옮겨진 막은 항체와의 비특이적인 결합을 막기 위해 TBST 완충액[10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5% Tween-20]에 10%로 녹인 탈지유(skim milk)로 블라킹(blocking)하고, 각각의 인산화된 단백질(p-JNK, p-ERK, p-p38, p-MK2)을 인지하는 1차 항체 (Cell Signaling Technology, USA)를 3% BSA (Bovine Serum Albumin) 용액을 이용하여 1:1000의 비율로 희석하여 반응시켰다. 1차 항체를 인지하는 Horseradish peroxidase-conjugated-2차 항체 (Bio-rad, CA, USA)는 TBST 완충액에 5%로 녹인 skim milk에 1:1000의 비율로 희석하여 반응시킨 후 Enhanced chemiluminescence detection 키트를 사용하여 관찰하였다. To confirm the protein activity, 50 μg of the cell extract was electrophoresed using 12% SDS (sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane from which the separated protein was transferred was blocked with skim milk dissolved in TBST buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20) at 10% to prevent nonspecific binding to the antibody, A primary antibody (Cell Signaling Technology, USA) recognizing the respective phosphorylated proteins (p-JNK, p-ERK, p-p38, p-MK2) was diluted with 3% BSA (Bovine Serum Albumin) 1000. ≪ / RTI > The Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Bio-rad, CA, USA), which recognizes the primary antibody, was diluted 1: 1000 in skim milk dissolved in TBST buffer to 5%, and reacted with an enhanced chemiluminescence detection kit .

실험 결과, LPS에 의해 활성화된 JNK, ERK, p38, MK2는 본 발명의 화합물에 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(도 3). 이를 통해 본 발명의 화합물이 MAP 인산화효소를 조절함으로써 항염증 효과를 낸다는 것을 알 수 있었다.
As a result, it was confirmed that JNK, ERK, p38, and MK2 activated by LPS were reduced in a concentration-dependent manner to the compound of the present invention (FIG. 3). It was thus found that the compounds of the present invention have anti-inflammatory effects by controlling MAP kinase.

1-6. 1-6. 활성화 된Active 소교세포 내  Intracellular NFNF -κB 및 -KB and APAP -1 활성 측정-1 activity measurement

본 발명의 화합물이 소교세포 활성화를 조절하는데 중요한 역할을 하는 전사인자(transcription factor)인 NF-κB, AP-1에 대하여 억제 효과를 나타내는지 여부를 측정하기 위하여 겔 지연 어세이 (Electrophoretic Mobility Shift Assay; EMSA)를 실시하였다(Park et al., J. Neuroimmunol ., 168, pp 56-64, 2005).In order to determine whether the compound of the present invention has an inhibitory effect on NF-κB, AP-1, which is an important transcription factor that regulates the activation of microglial cells, an electrophoretic mobility shift assay ; EMSA) (Park et al., J. Neuroimmunol . , 168, pp 56-64, 2005).

LPS (100ng/ml)만을 3시간동안 단독 처리한 BV2 소교세포 및 LPS 처리 1시간 전 본 발명의 화합물을 처리한 BV2 소교세포로부터 핵추출물 (nuclear extract)을 분리하였다(Woo et al., Mol . Brain Res., 113, pp 86-96, 2003). 세포 (1.0 X 10⁵ 세포수)에 1ml 용해 완충액 [lysis buffer; 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 10mM NaCl, 3mM MgCl₂, 1% NP-40]을 첨가한 후, 얼음에서 4분간 방치하고 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 추출 완충액 [extraction buffer; 20mM HEPES, 20% Glycerol, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM EDTA, 300mM NaCl, 1mM DTT, 1mM PMSF]을 첨가한 후, 얼음에서 30분간 방치한 후, 13200 rpm에서 20분간 원심분리하여 핵추출물을 얻었다. 핵추출물의 단백질 양은 바이오라드사 (Bio-rad, CA, USA)의 단백질 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 5μg의 핵추출물을 γ-³²P-ATP로 표지된 NF-κB 올리고뉴클레오타이드 탐침(oligonucleotide probe: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3' 또는 γ-³²P-ATP로 표지된 AP-1 올리고뉴클레오타이드 탐침(oligonucleotide probe: 5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3')과 섞어 얼음 위에서 30분간 방치하여 DNA-단백질 복합체 (DNA-protein complex)를 생성하였다. 생성된 DNA-단백질 복합체를 확인하기 위하여 5% 아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 후 자기방사법 (autoradiography)을 실시하였다. Nuclear extracts were isolated from BV2 microglia alone treated with LPS (100 ng / ml) for 3 hours and BV2 microglia treated with compound of the present invention 1 hour before LPS treatment (Woo et al., Mol . Brain Res ., 113, pp 86-96, 2003). To the cells (1.0 X 10 ⁵ cells) were added 1 ml of lysis buffer [lysis buffer; After the addition of 10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl ₂ and 1% NP-40], the precipitate was left on ice for 4 minutes and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. 20 mM Glycerol, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM EDTA, 300 mM NaCl, 1 mM DTT and 1 mM PMSF] was added to each well and left on ice for 30 minutes, followed by centrifugation at 13200 rpm for 20 minutes to obtain a nuclear extract . The protein content of the nuclear extract was determined using a protein quantification kit from Bio-Rad (CA, USA). The labeled nuclear extracts from 5μg to γ- ³² P-ATP NF-κB oligonucleotide probe (oligonucleotide probe: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ' or labeled with γ- ³² P-ATP AP- 1 complex (DNA-protein complex) was generated by mixing with an oligonucleotide probe (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3 ') on ice for 30 minutes. Were electrophoresed using 5% acrylamide gel and autoradiography was performed.

실험 결과, LPS 에 의하여 증가된 NF-κB 또는 AP-1 복합체 형성이 본 발명의 화합물에 의하여 감소됨을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 화합물은 NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합활성을 감소시켜 항염증 효과를 나타내고, 이로 인해 소교세포의 활성을 억제함을 알 수 있었다(도 4).
As a result of the experiment, it was confirmed that the compound of the present invention decreased the formation of NF-κB or AP-1 complex by LPS, and the compound of the present invention decreased the DNA binding activity of NF-κB or AP-1, Inflammatory effect, thereby inhibiting the activity of microglial cells (Fig. 4).

실시예Example 2. 전신염증모델  2. Systemic inflammation model 생쥐에서In mice 본 발명 화합물의  The compound of the present invention 신경염증Nerve inflammation 억제 효과 관찰 Observe the inhibitory effect

2-1. 전신염증모델 생쥐에 본 발명 화합물의 투여2-1. Administration of the compounds of the invention to systemic inflammatory model mice

생후 10주된 C57BL6 수컷 마우스를 무작위로 대조군(control)과 LPS (5mg/kg 복강내 투여)처리군으로 나누고, LPS 처리군은 다시 본 발명의 화합물이 함유되지 않은 비이클(vehicle) 투여군과 본 발명의 화합물 투여군(1mg/kg 또는 5mg/kg 복강내 투여)으로 나누어 실험하였다. 본 발명의 화합물은 1% DMSO가 포함된 정상 식염수에 녹였으며 비이클과 본 발명의 화합물은 LPS 처리 4일전부터 매일 투여하여 관찰하였다.
10 weeks old C57BL6 male mice were randomly divided into a control group and a group treated with LPS (5 mg / kg intraperitoneal), and the LPS-treated group was divided into a vehicle-treated group containing no compound of the present invention, Compound administration group (1 mg / kg or 5 mg / kg intraperitoneal administration). The compound of the present invention was dissolved in normal saline containing 1% DMSO, and the vehicle and the compound of the present invention were observed by daily administration from 4 days before the LPS treatment.

2-2. 혈청과 뇌척수액 내 2-2. Serum and cerebrospinal fluid TNFTNF -α단백질 수준 측정-α protein level measurement

실시예 2-1에 의해 LPS 투여 후 3시간에 pentobarbital (120 mg/kg, 복강내 투여) 마취하에 하대정맥에서 혈액을 얻어 혈청을 분리하였다. 뇌척수액은 Fleming 등의 방법 (J. Neuroimmunol., 4, pp129-140, 1983)을 이용하여 isoflurane 마취하에 배측 제1경추 부위 절개 후, 큰수조(cistern magna) 부위에서 유리모세관을 이용하여 추출하였다. 혈액과 뇌척수액 내 TNF-α 수준은 효소 면역측정 키트 (Pharmingen사, San Diego, USA)를 이용하여 샌드위치 효소면역측정법 (sandwich ELISA)을 이용하여 측정하였다 (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243-252, 2004).The blood was obtained from the inferior vein under pentobarbital (120 mg / kg, intraperitoneal) anesthesia 3 hours after the administration of LPS according to Example 2-1, and the serum was separated. Cerebrospinal fluid was extracted using a glass capillary tube in a large cistern magna after incision of the first cervical vertebrae under isoflurane anesthesia using the method of Fleming et al. (J. Neuroimmunol., 4, pp. 129-140, 1983). TNF-α levels in blood and cerebrospinal fluid were measured using a sandwich ELISA using an enzyme immunoassay kit (Pharmingen, San Diego, USA) (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243- 252, 2004).

LPS 를 처리하여 전신염증을 유발한 경우 대조군에 비하여 말초혈액의 혈청과 뇌척수액내 TNF-α수준이 현저히 증가하였다(각각 6.7배 및 6.55배, 도 5 및 도 6). 본 발명의 화합물을 투여한 경우 혈청 내에서는 용량의존적으로 TNF-α수준이 감소하였고 5mg/kg 투여군에서 현저히 감소하였다(도 5). 반면 뇌척수액에서는 본 발명의 화합물 1mg/kg과 5mg/kg 투여한 경우 모두 비이클 투여군에 비해 통계적으로 의미있는 TNF-α발현 감소를 보였다(도 6). 이러한 결과를 통하여 본 발명의 화합물의 전신투여가 전신염증에 의한 말초혈액 및 뇌내 염증성 사이토카인 TNF-α발현 증가를 억제함을 의미한다.
When LPS was treated to induce systemic inflammation, serum TNF-α levels in peripheral blood and cerebrospinal fluid were significantly increased (6.7-fold and 6.55-fold, respectively, FIGS. 5 and 6) compared to the control. In the case of administration of the compound of the present invention, the level of TNF-α was decreased in a dose-dependent manner in serum, and decreased significantly in the 5 mg / kg administration group (FIG. On the other hand, in the case of administration of 1 mg / kg of the compound of the present invention and 5 mg / kg of the compound of the present invention, CSF decreased statistically significant expression of TNF-α compared to the vehicle-treated group (FIG. These results indicate that systemic administration of the compounds of the present invention inhibits the increase of TNF-α expression in peripheral blood and brain inflammatory cytokines due to systemic inflammation.

2-3. 본 발명의 화합물에 의한 2-3. By the compounds of the present invention 뇌조직내In brain tissue 염증성 사이토카인  Inflammatory cytokine TNFTNF -α와 -α and ILIL -1β단백질 발현 감소-1β protein expression

본 발명의 화합물의 뇌내 염증억제 반응 여부를 확인하기 위하여 LPS 투여 후 3시간에 마우스를 희생시켜 뇌피질을 분리, Park 등의 방법 (J. Pharmacol. Exp. Ther., 341, pp59-67, 2012)을 이용하여 단백질을 얻고 웨스턴 블롯을 이용하여 뇌피질의 TNF-α와 IL-1β 발현 정도를 측정하였다. 대조군에 비하여 LPS 투여 후 TNF-α가 3.9배 증가하였으며 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 TNF-α 발현의 변화가 비이클 투여와 차이가 없었으나 본 발명의 화합물을 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비하여 현저하게 감소하였다(40% 감소, 도 7). 또한, LPS 투여 후 대조군에 비하여 IL-1β가 3.7배 증가하였으며, 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 IL-1β발현의 변화가 비이클 투여와 차이가 없었으나 본 발명의 화합물을 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비하여 IL-1β의 발현이 현저하게 감소하였다(50% 감소, 도 7). 이러한 결과는 뇌척수액내 TNF-α발현과 유사하게 본 발명의 화합물이 뇌피질내 염증성 사이토카인의 발현 증가를 억제함을 의미한다.
In order to confirm the inhibition of brain inflammation of the compound of the present invention, mice were sacrificed at 3 hours after the administration of LPS to separate the brain cortex, and they were isolated by the method of Park et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., 341, pp 59-67, 2012 ), And the expression of TNF-α and IL-1β in the brain cortex was measured by Western blotting. TNF-alpha was increased 3.9-fold after LPS administration compared to the control group. When 1 mg / kg of the compound of the present invention was administered, the change of TNF-α expression was not different from that of the vehicle, but when the compound of the present invention was administered at 5 mg / (40% reduction, Fig. 7). In addition, IL-1β increased 3.7-fold compared to the control group after LPS administration, and when the compound of the present invention was administered at 1 mg / kg, the change in IL-1β expression did not differ from the vehicle administration, (50% reduction, Fig. 7), compared to the vehicle administration. These results indicate that the compounds of the present invention inhibit the expression of inflammatory cytokines in the cerebral cortex similarly to the expression of TNF-a in cerebrospinal fluid.

2-4. 본 발명의 화합물에 의한 소교세포 활성화 감소2-4. Reduction of microglial activation by the compounds of the present invention

뇌염증반응 중 하나인 소교세포 활성화 정도를 확인하기 위하여, 소교세포 표지자인 Iba1항체를 이용하여 뇌피질 조직의 면역형광염색을 하기의 방법대로 실시하였다. Immunofluorescent staining of cerebral cortical tissues was performed by the following method using a small cell marker, Iba1 antibody, in order to confirm the extent of microglial activation, one of the brain inflammatory responses.

LPS 투여 후 3시간에 pentobarbital (120 mg/kg, 복강내 투여)로 마취하고 식염수를 심장에 관류시켜 혈액 제거 후 0.1M phosphate buffer로 만든 4% paraformaldehyde로 뇌를 고정하여 적출한 뇌를 30% sucrose용액에 넣어 저장시켰다. Cryostat에서 뇌의 배측해마(bregma에서 -2.0과 -0.3 mm사이)를 포함한 부위를 30μm두께로 관상방향의 뇌절편을 얻어 젤라틴으로 코팅된 유리 슬라이드에 붙여 슬라이드 면역형광염색을 수행하였다. 뇌절편의 슬라이드를 Iba1 (1:500) 항체가 포함된 TBS에 하룻밤 반응시키고 다음날 1차 항체를 씻어내고 fluorescein isothiocyanate (1:1000)가 붙은 2차 항체와 1시간 반응시켰다. 2차 항체를 씻어낸 후 슬라이드를 Vectashield로 마운팅하고 형광현미경을 이용하여 Iba1표지된 세포를 관찰하였다. 활성화된 소교세포(진하고 둥근 모양)의 정량화를 위하여 마우스 1마리당 2개의 연속적인 뇌절편에서 뇌피질의 면적 500 μm² 3개의 부분에서 Iba1 표지세포 수를 계산, 평균값을 구하였다. The brain was anesthetized with pentobarbital (120 mg / kg, intraperitoneal) 3 hours after LPS administration and the brains were fixed with 4% paraformaldehyde prepared with 0.1 M phosphate buffer after removing blood by saline infusion through the heart. The brain was extracted with 30% sucrose Solution. The sections containing the hippocampus (between -2.0 and -0.3 mm in the bregma) of the brain in the cryostat were subjected to slide immunofluorescence staining by attaching the brain sections to the gelatin-coated glass slides in a thickness of 30 μm. The slides of the brain slices were reacted with TBS containing Iba1 (1: 500) antibody overnight, and the next day, the primary antibody was washed out and reacted with the secondary antibody with fluorescein isothiocyanate (1: 1000) for 1 hour. After washing the secondary antibody, the slides were mounted with Vectashield and Iba1-labeled cells were observed using a fluorescence microscope. For the quantification of activated microglia (dark and round shape), the area of the brain cortex in two consecutive brain slices per mouse was 500 μm ² 3 The number of Iba1-labeled cells was calculated and the average value was obtained.

염색결과, 대조군에 비하여 LPS 투여 후 활성화된 Iba1 표지세포의 수가 증가하였다(10.12±1.45 대 41.17±2.95, p<0.01). 또한 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 활성화된 소교세포의 수가 비이클 투여와 차이가 없었으나 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비해 그 수가 현저히 감소하였다(20.0±3.82, p<0.01; 도 8). 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 뇌 내 TNF-α와 IL-1β 발현 감소와 더불어 소교세포의 활성화를 억제함으로써 염증 반응을 감소시키는 것을 의미한다.
As a result of staining, the number of activated Iba1-labeled cells increased after LPS administration (10.12 ± 1.45 vs. 41.17 ± 2.95, p <0.01). When the compound of the present invention was administered at a dose of 1 mg / kg, the number of activated microglia was not different from that of the vehicle, but the number of the microglial cells was significantly decreased compared with the vehicle administration (20.0 ± 3.82, p <0.01 8). These results indicate that the compounds of the present invention reduce the inflammatory response by inhibiting the activation of microglial cells, together with a decrease in TNF-α and IL-1β expression in the brain.

실시예Example 3. 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명 화합물의 신경보호 및 항염증 효과 3. Neuroprotective and antiinflammatory effects of the compounds of the present invention in an ischemic stroke model

본 발명의 화합물의 허혈성 뇌졸중 모델에서의 신경보호효과는, 관련 약 개발에 널리 사용되고 있는 국소뇌허혈 동물 시험법인 middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAo/Rep)을 이용한 생체 내 시험법에서 그 효과를 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 화합물의 신경보호효과의 기전을 탐색하기 위해 기존에 확립되어 시행되어 온 소교세포 활성화 정도와 염증성 사이토카인인 TNF-α 수준을 측정하였다. 특히, TNF-α는 허혈성 뇌졸중에서 나타나는 신경세포손상의 매개체이며, 본 발명의 화합물에 의해서도 감소할 수 있으므로 유의한 지표라 할 수 있다.
The neuroprotective effect of the compounds of the present invention in an ischemic stroke model can be confirmed in an in vivo test using middle cerebral artery occlusion / reperfusion (MCAo / Rep), an animal test that is widely used in the development of related drugs there was. In order to investigate the mechanism of the neuroprotective effect of the compounds of the present invention, the degree of microglial activation and the level of TNF-α, which is an inflammatory cytokine, have been established. In particular, TNF-a is a mediator of neuronal damage in ischemic stroke, and can be reduced by the compound of the present invention, which is a significant index.

3-1. 허혈성 뇌졸중 모델 구축 및 본 발명의 화합물 투여3-1. Construction of an ischemic stroke model and administration of the compound of the present invention

MCAo/Rep 자극은 일시적인 국소 허혈성 뇌졸중을 유발하는 것이다. 이를 위해 몸무게가 28-32 g 나가는 ICR 수컷 흰쥐 (7주령, Orientbio, korea)를 사용하고, 실험동물은 전 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며 낮밤주기는 12시간 (light/dark cycle)으로 조절되는 실험실 환경에서 유지하였다. 본 연구의 모든 실험동물 연구방법은 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)의 승인을 받은 가천대학교 암당뇨연구원의 실험동물위원회의 지침을 준수하였다. 국소 혈류를 막기 위한 MCAo는 산소와 질소 혼합기체 (70%/30%)와 2% isoflurane으로 동물을 흡입 마취시킨 후에, 목의 중앙 절개로 동물의 오른쪽 총경동맥 (CCA, common carotid artery)을 노출시킨 뒤, 총경동맥의 분기점을 찾아 내경동맥 (ICA, internal carotid artery)과 외경동맥 (ECA, external carotid artery)를 조심스럽게 분리 한 후에 총경동맥과 외경동맥을 봉합사로 묶었다. 분기점에서 나일론 봉합사를 삽입해 중간대뇌동맥 (MCA, middle cerebral artery)의 근위부를 막히게 한 다음 내경동맥을 봉합사로 단단히 묶어 준 후, 목 절개 부위는 봉합사로 봉합하고 90분간 동물을 방치하였다. 90분 MCAo 자극 후 수술한 쥐를 다시 흡입마취를 시킨 후 국소 혈류를 막기 위해 내경동맥에 삽입한 나일론 봉합사를 제거하고 목 절개 부위를 재 봉합하여 혈액을 재관류 (reperfusion) 시킨 후, 본 발명의 화합물을 중간대뇌동맥 재관류 후에 즉시 5 mg/kg으로 복강으로 일 회 주사하였다.
MCAo / Rep stimulation is a transient ischemic stroke. For this purpose, ICR male rats (7 weeks old, Orientbio, korea) weighing 28-32 g were used, and the animals were allowed to eat solid feed and water freely during the whole experimental period. ). &Lt; / RTI &gt; All of the experimental animal study methods in this study adhered to the guidelines of the Laboratory Animals Committee of the Cancer Diabetes Research Institute of Gachon University, which was approved by the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). MCAo was used to anesthetize the animals with oxygen and nitrogen mixture (70% / 30%) and 2% isoflurane and then to expose the right common carotid artery (CCA) (ICA) and external carotid artery (ECA), and then the total carotid artery and external carotid artery were sutured. A nylon suture was inserted at the fork to block the proximal portion of the middle cerebral artery (MCA), and the internal carotid artery was tightly bound to the suture. The neck incision was closed with suture and the animal was left for 90 minutes. After 90 minutes of MCAo stimulation, the operated rats were inhaled again by inhalation anesthesia, and the nylon suture inserted into the internal carotid artery was removed to re- duce the local blood flow. The blood was reperfused by suturing the neck incision site, Was injected intraperitoneally 5 mg / kg once intraperitoneally.

3-2. 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌손상 측정3-2. Measurement of Brain Damage by Ischemic Stroke

허혈성 뇌졸중에 의한 뇌손상은 뇌 절편을 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St.Louis, MO) 용액으로 염색하여 뇌경색 크기를 측정/분석함으로써 손상 정도를 판단하였다. 뇌경색 크기 측정을 위해 재관류 22시간 후에 쥐를 희생시켜 조심스럽게 뇌를 적출한 후에 뇌를 brain matrix을 이용하여 2 mm 두께의 관상절편 (coronal slices)으로 자른 후, 관상절편을 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St.Louis, MO) 용액에 넣고 37℃에서 30분간 염색한 후 10% 포르말린으로 고정하였다. 뇌경색 부위를 측정하기 위해서 카메라로 염색된 관상절편을 촬영하고, Image J 프로그램을 사용하여 뇌의 부피와 뇌경색 부피 (TTC로 염색되지 않은 부위)를 측정한 후에 뇌경색 정도는 다음과 같은 계산법으로 산출하였다. Brain injury caused by ischemic stroke was assessed by assessing cerebral infarct size by measuring staining of brain slices with 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St. Louis, MO) solution. After 22 hours of reperfusion, the brains were carefully sacrificed and the brain was cut into 2-mm-thick coronal slices using a brain matrix. 5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St. Louis, Mo.) for 30 min at 37 ° C and fixed with 10% formalin. To measure the area of cerebral infarction, a corneal section stained with a camera was taken and the brain volume and cerebral infarct volume (the area not stained with TTC) were measured using the Image J program and the degree of cerebral infarction was calculated by the following calculation .

[뇌경색 정도 (infarct volume, %)=전체 뇌경색의 부피/전체 뇌 부피×100][Infarct volume (%) = total volume of cerebral infarction / total brain volume x 100]

TTC 염색 결과 MCAo/Rep 실험군 (대조군)과 재관류 후 본 발명의 화합물을 투여한 실험군 (약물투여군)의 손상 정도는 확연한 차이를 보였다(도 9). 계산식에 의해 도출된 대조군과 약물투여군의 뇌경색 부피는 각각 29.17%과 18.90% 이며, 본 발명의 화합물의 처리로 인해 뇌경색 크기는 대조군에 비해 약 35.21%의 통계학적으로 유의한 수준의 감소를 보였다 (P=0.0452) (도 10).
As a result of TTC staining, the degree of damage of the MCAo / Rep experimental group (control group) and the test group (drug administration group) administered with the compound of the present invention after reperfusion showed a marked difference (FIG. 9). The cerebral infarct volume of the control group and the drug administration group obtained by the calculation formula were 29.17% and 18.90%, respectively, and the cerebral infarct size was reduced by about 35.21% compared with the control group due to the treatment of the compound of the present invention P = 0.0452) (Fig. 10).

3-3. 허혈성 뇌졸중에 의한 신경행동학적 변화 측정3-3. Measurement of Neurobehavioral Changes by Ischemic Stroke

TTC 염색법 의한 결과와 유사한 결과가 대조군과 약물처리군의 신경학적인 행동변화 시험법에서도 도출되었다. 뇌졸중 모델의 신경학적 행동변화 시험법은 기확립된 방법을 사용하였으며, 평가는 motor test, sensory test, beam balance test, relfex absent and abnormal movement의 4가지 항목으로 분류하여 실시하였다. 평가에서 도출된 점수 (neurological score)는 총 18점을 만점으로 하여 산출하였으며, 꼬리를 들었을 때 앞발과 뒷발의 굴곡, 머리 각도를 각각 1점으로 측정하고, 바닥 위에 올려 놓았을 때 운동신경, 반사신경, 감각신경, 균형감각 등의 손상 정도를 기 확립된 기준법에 의해 점수를 부여하였다. 신경학적 행동변화 시험 결과, 약물투여군에서 대조군 대비 유의적 감소를 관찰하였다 (P=0.0047) (도 11).
Results similar to those obtained by the TTC staining method were also derived from the neurological behavior test of the control group and the drug treatment group. The neurological behavioral change test of the stroke model was performed using the established method. The evaluation was divided into four categories: motor test, sensory test, beam balance test, relfex absent and abnormal movement. The neurological score was calculated from the total score of 18 points. When the tail was lifted, the flexion and head angle of the forelegs and hind feet were measured at 1 point, and when they were placed on the floor, The degree of impairment of nerves, sensory nerves, and balance senses were scored by established standard methods. Neurological behavioral changes were significantly reduced in the drug-treated group compared to the control group (P = 0.0047) 11).

3-4. 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌세포 사멸 측정3-4. Measurement of brain cell death by ischemic stroke

본 발명의 화합물의 신경보호효과 기전을 확인하기 위해 조직학적 방법을 활용하였고, 이를 통해, 각 실험군의 조직절편에서 뇌세포 사멸, 소교세포 활성화, TNF-α 생성 정도를 측정하고 대조군과 비교분석하였다. In order to confirm the mechanism of neuroprotective effect of the compounds of the present invention, histological methods were used and the degree of brain cell death, microglial activation and TNF-α production was measured and compared with the control group in the tissue sections of each experimental group .

조직학적 방법에 사용하는 조직 절편은 모든 실험이 끝난 후 획득하였고, 상세한 실험법은 다음과 같다. 재관류 22시간 후에 실험동물을 마취제 (Zoletil50 10 mg/kg + Rompun 3 mg/kg) 근육주사로 마취 한 후에, 심장을 통한 관류고정을 진행하였다. 심장의 좌심실에서 대동맥방향으로 바늘을 삽입하고 연동펌프를 사용해 phosphate buffer saline (PBS)를 관류시킨 뒤 혈액이 완전히 제거되면 4% paraformaldehyde를 관류시켜 조직을 고정하였다. 고정 과정 후 뇌를 제거하고 4% paraformaldehyde 용액에 담가 4 ℃에서 16시간 보관하여 추가고정을 한 후, PBS로 세척하고 동결과정에서 조직 손상을 방지하기 위해 30% sucrose 용액에 하루 이상 방치하였다. Sucrose에 완전히 잠긴 뇌는 OCT 용액을 사용하여 동결조직 샘플을 만들고, 이후 microtome을 이용해 20 ㎛ 두께의 동결조직 절편을 gelatin coating 된 slide에 붙여서 말린 후 실험에 사용하였다. The tissue sections used in the histological method were obtained after the completion of all the experiments, and the detailed experimental methods were as follows. Twenty-two hours after reperfusion, the animals were anesthetized with an intramuscular injection of anesthetic (Zolethyl 50 10 mg / kg + Rompun 3 mg / kg), followed by perfusion through the heart. The needle was inserted in the left ventricle of the heart in the direction of the aorta, and perfused with phosphate buffer saline (PBS) using a peristaltic pump. After the blood was completely removed, the tissue was fixed by perfusion with 4% paraformaldehyde. After fixation, the brain was removed and immersed in 4% paraformaldehyde solution. The cells were stored at 4 ° C for additional 16 hours, washed with PBS, and left in a 30% sucrose solution for more than one day to prevent tissue damage during freezing. Brains completely immersed in sucrose were prepared by freezing tissue samples using OCT solution, and then frozen sections of 20 μm thickness were attached to gelatin coated slides using a microtome and used for the experiment.

약물처리에 의한 뇌세포의 생존여부를 확인하기 위하여 모든 니슬소체 (Nissl body)를 염색하는 니슬 염색 (Nissl staining)을 시행하였다. 먼저 슬라이드에 부착된 동결조직 절편을 ethyl alcohol 용액을 활용하여 rehydration 시킨 후에 0.2% cresyl violet acetate (Sigma, St.Louis, MO) 용액으로 조직을 염색하고, 염색된 조직절편을 증류수로 세척하고 dehydration 과정을 거친 뒤 xylene으로 투명화하고 mounting 용액 (Merck KGaA, Germany)을 이용하여 봉입하였다. 니슬 염색법 결과, 정상군에 비해 뇌졸중 자극이 가해진 실험군 (대조군)의 뇌피질(cortex)Nissl staining for staining all Nissl bodies was performed to confirm the survival of brain cells by drug treatment. First, the frozen tissue slices attached to the slides were rehydrated with ethyl alcohol solution, and stained with 0.2% cresyl violet acetate (Sigma, St. Louis, MO) solution. The stained tissue sections were washed with distilled water and dehydrated , Transparent with xylene and sealed with mounting solution (Merck KGaA, Germany). As a result of the nissl staining, the brain cortex of the experimental group (control group)

과 선조체(striatum)에서 많은 뇌세포 손상이 유발됨을 확인하였고, 본 발명의 화합물을 처리함으로써 뇌졸중에 의한 뇌세포 손상이 극명하게 감소되었음을 확인하였다 (도 12).
And striatum, and it was confirmed that brain damage caused by stroke was significantly reduced by treating the compound of the present invention (FIG. 12).

3-5. 허혈성 뇌졸중에 의한 소교세포 활성화와 3-5. Activation of microglial cells by ischemic stroke TNFTNF -α 측정-α measurement

소교세포 활성화 및 TNF-α 생성 여부는 동결조직 절편을 특이적 항체를 활용하는 면역조직화학 염색법에 적용하여 확인하였다. 소교세포 활성화 및 TNF-α 생성 측정을 위해 사용된 특이적 항체는 anti-Iba-1 (소교세포 활성화 확인 지표) 및 anti-TNF-α (TNF-α 생성 확인 지표) 이며, 면역조직화학 염색법은 다음과 같이 진행되었다. 동결조직절편이 부착된 슬라이드를 0.05M PBS로 세척한 뒤에 4% paraformaldehyde 용액으로 재고정하고, 조직 내의 과산화수소의 비특이적 반응을 차단하기 위해 1% H₂O₂로 15분 동안 반응시켰다. 이 후 5% normal donkey serum을 가하고 1시간 동안 실온에서 반응시킴으로써 비특이적 면역반응을 제거한 뒤에 1차 항체 goat polyclonal anti-Iba1 (Iba1 1:500, Abcam plc, UK)과 rabbit polyclonal anti-TNF-α (TNF-α 1:100, Abcam plc, UK)를 가하고 4 ℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 다시 조직을 세척한 후 바이오틴(biotin)이 붙은 2차 항체를 2시간 동안 가한 후에 세척하였다. Avidin-biotin peroxidase complex (Vector Laboratories)을 90분 동안 조직에 가한 후에 세척하고, 0.01% H₂O₂를 포함하는 0.02% 3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Sigma, St.Louis, MO, USA)로 발색하고, 발색된 조직 절편을 dehydration 한 후, xylene으로 투명화하고 mounting 용액을 이용하여 봉입하였다. 염색된 조직을 현미경으로 관찰하여 사진을 촬영한 후 뇌졸중 자극이 가해진 반구를 기준으로 염색된 세포 수를 산출하여 통계처리 하였다. Microglial activation and TNF-α production were confirmed by immunohistochemical staining using a specific antibody. The specific antibodies used for microglial activation and measurement of TNF-α production were anti-Iba-1 (small cell activation markers) and anti-TNF-α (an indicator of TNF-α production), and immunohistochemical staining Proceed as follows. The slides with frozen tissue sections were washed with 0.05 M PBS, and fixed with 4% paraformaldehyde solution and reacted with 1% H ₂ O ₂ for 15 minutes to block non-specific reaction of hydrogen peroxide in the tissues. After incubation with 5% normal donkey serum for 1 hour at room temperature, the nonspecific immunoreactivity was removed and then the primary antibody goat polyclonal anti-Iba1 (Iba1 1: 500, Abcam plc, UK) and rabbit polyclonal anti-TNF- TNF-α 1: 100, Abcam plc, UK) was added and reacted at 4 ° C for 16 hours or longer. After the tissue was washed again, biotin-labeled secondary antibody was added for 2 hours and then washed. Avidin-biotin peroxidase complex (Vector Laboratories ) for 90 minutes 0.02% 3, after the washing was added to the tissues, including 0.01% H ₂ O ₂ for the 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Sigma , St.Louis, MO, USA ), And the developed tissue sections were dehydrated, clarified with xylene, and sealed with mounting solution. The stained tissue was observed with a microscope, and the number of stained cells was calculated based on the hemispheres to which the stroke stimulus was applied.

허혈성 뇌졸중 자극에 의해 자극에 가해진 뇌의 반구에서 활성화된 소교세포 수가 증가하였고 (138.8±7.4개), 본 발명의 화합물을 처리함으로써 그 수가 감소되었으며 (47.67±10.73개), 감소 정도는 통계적으로 유의함 (P＜0.01)을 확인하였다 (도 13). The number of microglia activated in the hemisphere of the brain that was stimulated by ischemic stroke stimulation increased (138.8 +/- 7.4), and the number of microglia decreased (47.67 +/- 10.73) by treatment with the compound of the present invention, and the degree of decrease was statistically significant (P &lt; 0.01) (Fig. 13).

또한, 허혈성 뇌졸중 자극에 의해 자극에 가해진 뇌의 반구에서 염증성 사이토카인인 TNF-α를 생성하는 세포 수가 증가하였고 (648.3±64.70개), 본 발명의 화합물을 처리함으로써 그 수가 감소되었으며 (402.8±74.73개), 감소 정도는 통계적으로 유의함 (P＜0.05)을 확인하였다 (도 14).
In addition, the number of cells producing TNF-a, an inflammatory cytokine, was increased (648.3 +/- 64.70) in the hemisphere of the brain subjected to stimulation by ischemic stroke stimulation, and the number was decreased by treatment with the compound of the present invention (402.8 +/- 74.73 ), And the degree of decrease was statistically significant (P <0.05) (Fig. 14).

Claims (7)

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는,
허혈성 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]

A pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
A pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic stroke.
[Chemical Formula 1]

제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 산 부가염 또는 염기 부가염인 약학 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the pharmaceutically acceptable salt of the compound of formula (I) is a pharmaceutically acceptable acid addition salt or base addition salt.
삭제delete 제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
삭제delete 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는,
허혈성 뇌졸중의 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]

CLAIMS 1. A composition comprising a compound of formula &lt; RTI ID = 0.0 &gt; (I) &lt; / RTI &
A food composition for improving ischemic stroke.
[Chemical Formula 1]

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