KR101475115B1 - 탐식작용 억제 효과를 가지는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 대식세포의 탐식작용을 억제하는 효과가 우수하므로 대식세포의 기능이상으로 인해 유발되는 자가 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

탐식작용 억제 효과를 가지는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 화합물{Compound having phagocytosis inhibitory effect for preventing or treating autoimmune diseases}

본 발명은 대식세포의 탐식작용을 억제하는 효과가 있는 화합물에 관한 것이다.

면역계의 기본은 외부에서 침입한 병원균이나 내부에서 발생한 이상 세포를 감시, 제거하는 것이다. 면역계가 이런 기본 기능을 수행하기 위해서는 자기 항원(self-antigen)에 반응하지 않는 자기 관용(self-tolerance)이 형성되어야 한다. 자기 관용이 형성되지 않거나 형성된 관용이 깨어지면 자기 항원에 대한 면역반응(자가면역, autoimmunity)이 생기고, 이로 인해 자가 면역질환(autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역질환은 동반된 질환이 없으면서 T 세포나 항체에 의해 일어나는 질환을 의미한다. 즉 자기 관용을 상실함으로써 생성된 자가 면역에 의해 자가 면역질환이 유발된다.

자가 면역질환은 자기반응(self-reactive) 림프구가 관용을 피해서 활성화되었을 때 발생하는데, 즉 자가 면역질환이 발생하려면 자기 관용 유지에 영향을 주는 susceptibility gene이 있어야 하고, 이런 유전자를 가진 사람에서 자가 면역질환이 발생하려면 자기 반응 림프구를 활성화시킬 수 있는 환경적 유발인자가 있어야 한다. 이와 같이 자가 면역질환은 susceptibility gene과 같은 내적 인자와 환경적 인자와 같은 외적 유발인자의 복합적 작용에 의해 발병하는 것으로 알려져 있다.

여러 다양한 기전에 의해 발병하는 자가 면역질환은 통상적으로 표적 장기를 기준으로 분류하고 있다. 일부 경우에는 장기 전체가 면역계의 모든 세포(대식세포, 림프구, NK세포, 중성구, 수지상세포)들의 공격을 받게 된다. CD8+ T 세포가 중요한 작동세포이기는 하나 한 종류의 세포에 의해서 발병하지는 않는다. 감염시에는 병원체와 처음 반응한 대식세포, NK세포, 중성구, 수지상세포와 같은 자연면역계가 림프구를 동원하고, CD4+ T 세포는 항원을 인지하고 cytokine을 분비하여 CD8+ T 세포를 활성화시킨다. CD8+ T 세포는 여러 가지 기전에 의해 세포를 죽인다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 따라서 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨-1, 인터류킨-2), 세포 사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자(산화질소, 활성산소종 등)를 방출하고, 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향 조절한다.

대식세포의 기능이상은 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역질환이나 암 등 다양한 질환을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있으므로 대식세포의 활성조절이 중요하다(Arthritis Res. (2000) 2(3): 189?202; Immunology. (2006) 119(3): 296?305; Arthritis Res Ther. (2011) 13(4): 228; J Pharmacol Exp Ther. (2010) 332(1):46-56; J Immunol. (1998) 160(7): 3585-93).

이에 따라, 대식 세포 기능 이상으로 인한 질환을 치료하기 위하여 대식세포의 활성을 억제할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 세포에 독성을 나타내지 않으면서 대식세포의 탐식작용을 억제하는 효과가 우수한 화합물을 찾고자 모색하던 중, 화학식 I로 표시되는 화합물을 규명함으로써 자가 면역질환에서 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

[화학식 I]

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 I]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 대식세포의 탐식작용을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 Rac2 또는 Cdc42의 GTP(guanosine triphosphate) 수치를 감소시키는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가 면역질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선, 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 제 I 형 당뇨병(diabetes mellitus), 염증성 장질환, 및 전신성 루프스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물의 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 및 액제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물, 식품용 조성물, 또는 화장료 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 약학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화합물 C10은 대식세포의 탐식작용을 억제하는 효과가 우수하므로 자가 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포에 독성을 나타내지 않는 특성이 있으므로 약물로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 유세포 분석법을 이용한 자이모산의 탐식작용을 나타낸 그래프이다.
도 2는 화합물 C10의 탐식작용 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 화합물 C10의 화학식을 나타낸 것이다.
도 4는 MTT 분석법을 이용하여 화합물 C10의 세포 독성을 확인한 그래프이다.
도 5는 화합물 C10 처리에 따른 Rac1, Rac2, 및 Cdc42의 활성 변화 여부를 알아보기 위해 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물이 대식세포의 탐식작용을 억제함으로써 자가 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

[화학식 I]

본 발명자들은 대식세포의 기능이상으로 인하여 발생하는 자가 면역질환을 치료하기 위한 대식세포의 탐식작용 억제제를 개발하기 위해 연구하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 마우스로부터 분리한 복강 대식 세포(CD11b⁺) 및 RAW264.7 세포를 대상으로 CTC(cytochalasin D) 또는 화학 라이브러리(chemical libraries)의 화합물들을 각각 전처리한 뒤 자이모산(zymosan)과 함께 배양 처리하고 유세포 분석을 수행하였다. 효모에 들어있는 자이모산은 보체(Complement)를 활성화 하고, 대식세포는 효모의 자이모산을 인식할 수 있는 수용체가 있기 때문에 일단 수용체와 자이모산이 결합하게 되면 대식세포를 활성화시켜 세포살해능력을 증강시키는 특징이 있다. 상기 유세포 분석 결과, CTC의 탐식작용 억제 효과와 같은 효과를 나타내는 화합물 I을 발견하고 C10으로 명명하였다(실시예 1-1 참조). 액틴섬유에 결합할 수 있고 액틴의 중합을 막을 수 있는 진균 대사 산물인 CTC는 탐식작용의 특이적인 저해제로 사용되어 유세포 분석기를 이용한 탐식작용 분석이 제대로 진행되고 있는지를 나타내는 양성대조군으로 사용되었다.

이에 더하여, 상기 화합물 C10에 대하여 MTT분석을 수행한 결과, C10은 대식 세포에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(실시예 1-2 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 화학식 I로 표시되는 화합물 C10의 탐식작용 억제 기전을 알아보기 위해, C10 처리 유무에 따른 신호전달 물질의 발현량을 측정하였다. 이를 위해 GTPase의 Rho family에 속하는 Rac1, Rac2, 및 Cdc42 단백질의 발현량을 대식세포주에서 웨스턴 블롯 기법으로 측정하였으며, 대식세포에서 자이모산의 탐식작용에 PI3K가 기여한다는 것이 알려진 바 있으므로(Sandra Olsson et al ., Molecular Immunology, Volume 44, Issue 7, March ), PI3K 억제제로 알려져 있는 LY294002를 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물 C10이 Rac2 및/또는 Cdc42의 GTP(guanosine triphosphate) 수치를 감소시키는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 화학식 I로 표시되는 화합물 C10이 대식세포의 탐식작용을 억제하여 자가 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 약학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 세포에 대한 독성을 나타내지 않으므로 여러 형태로 구현될 수 있으며, 바람직하게는 약학적 조성물, 식품용 조성물, 또는 화장료 조성물로 구현될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화학식 I로 표시되는 화합물은 대식세포의 탐식작용을 억제시키는 활성을 가짐으로써 자가 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가 면역질환”이라고 한다.

본 발명에서 상기 “자가 면역질환”은 자기항원에 대하여 일으키는 면역반응으로 인해 발생되는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 이러한 자가 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 다발성 경화증(MS, multiple sclerosis), 건선, 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 제 I 형 당뇨병(diabetes mellitus), 염증성 장질환, 또는 전신성 루프스 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 “치료”란 용어는“치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 자가 면역질환의 “치료”또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 자가 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 자가 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 자가 면역질환을 경감시킴.

(4) 자가 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 자가 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 또는 윤활제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 자가 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 또는 액제 등의 형태일 수 있으며 특정 제형에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있고, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 “약학적 조성물”은 자가 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

상기에서 “식품용 조성물”은 자가 면역질환 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 활용되는 것을 의미한다.

상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하는데, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 자가 면역질환 증상의 예방 또는 개선을 위한 본원발명의 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 기술한 것 이외에 본원발명의 자가 면역질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 본 발명에 따른 자가 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 “화장료 조성물”로 구현되어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제 등으로 제형화 될 수 있으며, 특정 제형에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물로 사용 시, 화장료의 제형에 맞게 물질을 더 첨가할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들어, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 바람직하게는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “개체”란 자가 면역질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는, 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 바람직하게는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으며, 본 발명의 조성물을 상기 개체에게 투여함으로써, 자가 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

C10 화합물 스크리닝 및 특성 연구

<1-1> 유세포 분석을 통한 탐식작용 분석

본 발명자들은 화학 라이브러리(chemical libraries)에서 자이모산(zymosan)의 탐식작용을 억제하는 물질을 스크리닝 하기 위해, C57BL/6 마우스에서 적출한 복강 대식세포 및 RAW264.7 대식세포 세포주에서 자이모산이 탐식되는 것을 억제하는 물질을 알아보았다. C57BL/6 마우스는 8주령에서 10주령인 것을 사용하였으며, 식수와 사료를 자유로이 섭취하게 하고, 상온(21 ± 3 ℃), 상습(50 ± 10 %), 그리고 12시간 간격의 낮/밤 주기를 가진 조도 시스템이 있는 사육장에서 사육하였다. 복강 대식세포는 Miltenyi Biotec에서 구입한 CD11b MicroBead, MiniMACS column, 및 MACS multi stand를 사용하여 추출하였고, RAW264.7 대식세포 세포주는 American Type Culture Collection에서 구입하여 10% 불활성 FBS, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하여 준비하였다. 그리고 마우스 복강 대식세포인 CD11b⁺ 및 RAW264.7 세포를 24-well 플레이트에 각각 4 x 10⁶ cells/ well, 2 x 10⁶ cells/ well 씩 분주하고, 2시간 동안 배양한 후 CTC(cytochalasin D) 또는 화학 라이브러리로 30분간 전처리하였다. 전처리한 각각의 세포들을 채취하여 배양액으로 세척하고 FITC-conjugated 자이모산과 5:1(자이모산:세포)의 비율로 한 시간 동안 37℃에서 배양 처리하였다. 한 시간 후 탐식되지 않은 자이모산은 배양액으로 세척하고, PBS 버퍼에 세포들을 재부유(re-suspension)한 다음 유세포 분석을 위한 FACS Calibur 장비와 Cellquest pro 소프트웨어(BD biosciences, San Jose)로 분석하였다.

유세포 분석을 이용한 화학 라이브러리 스크리닝은 도 1에 나타낸 바와 같이, CTC를 처리한 군에서는 자이모산만 처리한 군에 비해 자이모산의 탐식작용이 억제되는 것을 알 수 있으므로 CTC를 양성 대조군으로 하여 진행하였으며, 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, CD11b⁺ 및 RAW264.7 세포에서 자이모산의 탐식작용을 억제하는 효과가 우수한 소분자 물질로, 도 3의 화학식을 가지는 C10을 발견하였다.

<1-2> 세포 생존 능력 분석

상기 실시예 <1-1>에서 발견한 화합물 C10이 세포에 대해 독성을 나타내는지 알아보기 위해, MTT 방법을 이용한 세포 생존 능력 분석을 수행하였다. 먼저, 마우스 복강 대식세포(CD11b⁺) 및 RAW264.7 세포를 각각 5 x 10⁵ cells/ well , 2 x 10⁵ cells/ well 씩 96-well 플레이트에 분주하고 C10을 농도별로 각각 처리하여 24시간동안 배양한 다음, 10 μl의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액(5mg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis)을 각각의 well에 첨가한 뒤 2시간 동안 배양하였다. 그리고 100 μl의 가용화 용액(0.04 N HCl in isopropanol)을 첨가하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존 능력 분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, C10은 세포에 대해 거의 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있다.

상기 결과는 본 발명의 화합물 C10이 세포 독성을 나타내지 않는 특성이 있으므로 인간 등의 개체에 처리하는 약학적 조성물 및 기타 조성물로 이용될 수 있음을 의미한다.

C10 의 세포 내 작용기전

본 발명자들은 C10의 탐식작용 억제 기전을 알아보기 위해, RAW264.7 대식세포 세포주에 자이모산 및 C10을 처리하여 웨스턴 블롯 기법으로 관련 신호전달 물질의 발현량을 확인하였다. 이때, 대조군의 하나로 PI3K 억제제로 알려져 있는 LY294002를 사용하였다. Rac1, Rac2, 및 Cdc42는 각각 대응하는 항체와 Active Pull-Down and Detection 키트를 활용하여 추출하였으며, 95℃에서 5분간 열-변성시킨 세포 용해물과 침전 산물은 10% 또는 15%의 겔에서 SDS-PAGE 방법으로 분리한 다음 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 옮겼다. 분리된 용해물 및 침전 산물이 담긴 멤브레인은 비-특이적인 결합을 막기 위해 한 시간 동안 실온에서 blocking 과정을 거쳤으며, 각 신호전달 물질에 특이적인 항체와 함께 4℃에서 18시간 동안 진탕 배양기로 반응시켰다. 상기에서 사용된 항체는 mouse anti-Rac1 mAb (Thermo Scientific, 1:1,000), goat anti-Rac2 polyclonal Ab (abcam, 1:1000), rabbit anti-Cdc42 mAb(Cell Signaling, 1:1000), rabbit anti-Akt mAb, mouse anti-phosphor-Akt (Ser473) mAb (Cell Signaling, 1:1000), mouse anti-IκB-α mAb, mouse anti-phospho-IκB-α (Ser32 /36) mAb (Cell Signaling, 1:2000), rabbit anti-β-actin mAb (Cell Signaling, 1:5000) 이다. 이후 TBS-T 용액으로 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 3회 세척과정을 거치고, 각 항체와 반응하는 HRP-conjugated 2차 항체를 멤브레인과 한 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그리고 이차 항체도 마찬가지로 TBS-T 용액으로 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거한 다음 ChemiGlow West 용액을 반응시켜 Chemidoc 기기로 화학 발광을 측정하여 신호전달 물질의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 자이모산 처리된 군에서 C10의 처리는 Rac1, Rac2, 및 Cdc42의 GTP 수치를 감소시키는 것을 알 수 있다. 그러나 Rac1의 활성은 자이모산 처리된 군의 대조군과 그렇지 않은 군의 대조군에서 차이가 없으므로, 이는 Rac1이 자이모산의 탐식작용과 관계없음을 의미한다.

또한, 자이모산 처리에 따라 Rac2 및 Cdc42의 GTP 수치가 대조군에 비해 증가되는 상향조절 활성은 C10의 처리에 의해 하향조절(down-regulation) 되지만 PI3K 억제제인 LY294002에 의해서는 이러한 하향조절이 일어나지 않는 것을 알 수 있다.

상기 기작의 발견을 통해, 대식세포에서 Rac2 및 Cdc42의 활성을 하향조절하는 물질은 대식세포의 탐식작용 억제제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 시험관내(in vitro) 대식세포의 탐식작용 억제용 조성물.
   [화학식 I]
   

   

   
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 I의 화합물은 Rac2 또는 Cdc42의 GTP(guanosine triphosphate) 수치를 감소시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
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