KR101472924B1 - 신규 바이러스 벡터 - Google Patents

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마코토 마츠모토
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각코우호우진 지치 이카다이가쿠
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Abstract

본 발명은 이중 프로모터의 조절하에 바이러스 유전자에 융합된 외래 유전자를 발현할 수 있는 재조합 전달벡터 및 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조방법, 및 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제에 관한 것이다.

Description

신규 바이러스 벡터{NOVEL VIRAL VECTOR}
본 발명은 신규한 전달벡터(transfer vector), 상기 전달벡터와 배큘로바이러스(baculovirus) DNA의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 획득한 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제(예를 들어, 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환 예방 또는 치료용 약제)에 관한 것이다.
배큘로바이러스(Baculovirus)는 곤충 세포들을 이용한 목적 단백질을 산업적으로 생산하는 방법을 위한 벡터로 사용되고 있다. 최근에는, 상기 배큘로바이러스가 곤충 세포들뿐만 아니라 포유류 세포들 외래 유전자를 도입할 수 있음이 발견되었고, 상기 벡터가 치료용 유전자를 도입할 수 있는 가능성이 발견되었다. 특허 문헌 1에서는 배큘로바이러스의 초기 유전자(early gene)에서 파생된 프로모터에서 바이러스의 비-구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 부위, 및 후기 유전자(late gene)에서 파생된 프로모터에서 바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 부위로 구성된 다중 독립적 프로모터들을 가지는 재조합 바큘로스 발현벡터가 개시되었다.
또한, 특허 문헌 2에서는 외생적 유전자(exogenous genes)가 다중 독립적 프로모터들에 연결된 벡터로부터 발현되기 위하여 조절하는 프로모터를 포함하는 비-포유류 DNA 바이러스가 세포내로 도입한 후, 상기 외생적 유전자를 포유류 세포내에서 발현하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 3에서는 배큘로바이러스를 이용한 유전자 재조합 기술로 단백질을 생산하는 방법이 개시되었고, 이는 원하는 단백질을 암호화하는 유전자에 배큘로바이러스의 gp64 유전자를 연결하여 획득한 융합 유전자를 발현시키고, 원하는 단백질을 바이러스 입자에 융합시킨 형태로 생산하고, 원하는 단백질이 융합된 바이러스 입자를 수득하고, 원하는 단백질을 수득하기 위해 바이러스 입자로부터 원하는 단백질을 절단함으로써 단백질을 생산하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 4에서는 배큘로바이러스 발현 시스템, 숙주세포(host cell)에서 활성이고 비-수용성 세포(non-acceptable cell)에서 비활성인 첫 번째 프로모터에 작동가능한 형태로 연결된 검출 마커를 암호화하는 첫번째 핵산 서열, 및 비-수용성 세포에서 활성인 두번째 프로모터에 작동가능한 형태로 연결된 외래 핵산 서열을 포함하는 두번째 핵산 서열을 포함하는 다중 독립적 프로모터를 가지는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터가 개시되었다.
또한, 특허 문헌 5에서는 닭 β 액틴(chicken β actin) 유래 CAG 프로모터에 연결된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 항원-발현 재조 합 배큘로바이러스 벡터를 인플루엔자 바이러스의 감염에 대한 예방 효과를 가지기 때문에 백신 제형으로의 이용이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 6에서는 세포 표면에 발현가능한 단백질들을 암호화하는 유전자가 배큘로바이러스 프로모터에 연결되고 상기 프로모터는 포유류 세포로부터 유래된 플라스미드, 및 세포 표면에 발현가능한 단백질들을 암호화하는 유전자가 2개의 배큘로바이러스 프로모터에 연결되고 상기 프로모터 각각은 곤충 세포내에 공동-형질도입된 플라스미드 내에 공동-형질도입 단계를 포함하는 배큘로바이러스 벡터를 제조하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 7에서는 인플루엔자 바이러스 HA 유래 cDNA가 CAG 프로모터내에 통합된 재조합 배큘로바이러스를 이용한 인플루엔자 바이러스로의 감염에 대한 항-인플루엔자 바이러스 활성에 관한 연구를 규명하였고, 이는 재조합 배큘로바이러스뿐만 아니라 야생형 배큘로바이러스가 활성을 가지는 것이 개시되었다.
이런 진로로, 최근에는 다양한 재조합 배큘로바이러스가 개발되었고, 이를 이용한 포유류용 약제 개발이 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 이용하여 연구되었다.
당업계에서는, 신규한 구조를 가지는 재조합 배큘로바이러스 벡터, 및 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환, 또는 암 등과 같은 질환에 효과있는 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 이용하는 약제형, 특히 백신 제형의 개발이 요구되어지고 있다.
특허 문헌 1: 일본 등록특허 제 3366328호, 다중 프로모터 배큘로바이러스 발현 시스템 및 결손 입자 산물.
특허 문헌 2: WO98/011243, 변형된 암호화 단백질을 가지는 비-포유류 DNA 바이러스.
특허 문헌 3: 일본 특허공개 제 2002-235236-A호, 단백질을 생산하는 방법.
특허 문헌 4: 일본 특허공개 제 2003-284557-A호, 신규한 배큘로바이러스-형질도입 벡터 및 외래 유전자의 발현을 위한 재조합 배큘로바이러스.
특허 문헌 5: WO02/062381, 배큘로바이러스 벡터 백신.
특허 문헌 6: WO04/029259, 배큘로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터의 제조 방법 및 유전자 도입 방법.
특허 문헌 7: 일본 특허공개 제 2005-15346-A호, 배큘로바이러스-포함 항-바이러스제.
<해결하고자 하는 과제>
본 발명의 목적은 신규한 재조합 전달벡터, 상기 재조합 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 이용하는 약제, 특히 백신 제형을 제공하는 것이다.
<과제 해결 수단>
본 발명자들은 곤충 세포 및 곤충 세포와는 다른 척추동물(특히, 포유류, 조류 및 어류) 세포 내에서 원하는 면역원성(immunogenicity)을 가지는 단백질, 또는 사이토카인과 면역원성을 가지는 부분 단백질 또는 단백질을 발현할 수 있는 신규한 구조를 가지는 전달벡터, 및 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 규명하였다. 상기 재조합 배큘로바이러스를 제공함으로써, 감염성 질환에 대한 유효한 예방 또는 치료 효과를 가지는 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제가 추가적으로 연구되었다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 재조합 배큘로바이러스가 원하는 약제로서 효과를 가지는 것을 규명하였다.
또한, 본 발명에 의하면, 신규한 구조를 가지는 재조합 전달벡터, 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법이 확인되었고, 상기 재조합 배큘로바이러스 자체가 표적 세포들에서 면역원성을 가지는 단백질을 발현할 수 있는 약제로서 유용하고, 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환에 대한 예방용 약제로서 유용하다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 [1] 내지 [30]에서 보여주는 발명을 제공한다.
[1] 하나의 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터(vertebrate promoter) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터(baculovirus promoter)를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는, 이중 프로모터와 융합 유전자가 통합된 구조를 포함하는 전달벡터 제조 방법.
[2] [1]에 따른 방법에 있어서, 상기 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터는 포유류에서 기능할 수 있는 포유류 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
[3] [1] 또는 [2]에 따른 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자는 배큘로바이러스 gp64(baculovirus gp64) 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein) 유전자, 제 1 유형 인간 면역결핍 바이러스 당단백질(type I human immunodeficiency virus glycoprotein) 유전자, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 막 당단백질(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein) 유전자, 제 A 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질(type A influenza virus hemagglutinin protein) 유전자, 제 B 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질 유전자, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein) 유전자 및 쥐 헤파타이티스 바이러스 S 단백질(murine hepatitis virus S protein) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[4] [1] 또는 [2]에 따른 방법에 있어서, 상기 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1a(elongation factor 1a) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[5] [1] 또는 [4]에 따른 방법에 있어서, 상기 배큘로바이러스 프로모터는 다각체 단백질(polyhedrin) 프로모터, p10 프로모터, IE1 프로모터, IE2 프로모터, p35 프로모터, p39 프로모터 및 gp64 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[6] [1] 또는 [5]에 따른 방법에 있어서, 상기 면역성 외래 유전자는 말라리아(malaria) 항원, 인플루엔자(influenza) 항원, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, SARS 바이러스 항원, 웨스트나일열(West Nile fever) 바이러스 항원, 뎅기열(dengue fever) 바이러스 항원, HIV 항원, HCV 항원, 리슈마니아(leishmania) 항원, 트리파노조마(trypanosoma) 항원 및 류코사이토준(leucocytozoon) 항원 단독, 또는 사이토카인(cytokine)을 가지는 상기 항원 유전자군으로부터 선택된 어느 하나의 융합 항원으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[7] [1] 또는 [6]에 따른 방법에 있어서, 상기 전달벡터는 pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64 및 pCP-H1N1/HA1-vp39로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[8] 하나의 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터(vertebrate promoter) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터(baculovirus promoter)를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는, 이중 프로모터와 융합 유전자가 통합된 구조를 포함하는 전달벡터를 제조하는 단계; 상기 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA를 곤충의 숙주세포내로 공동-형질도입(co-transfecting)시키는 단계; 및 상기 재조합 배큘로바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 제조 방법.
[9] [8]에 따른 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자는 배큘로바이러스 gp64(baculovirus gp64) 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein) 유전자, 제 1 유형 인간 면역결핍 바이러스 당단백질(type I human immunodeficiency virus glycoprotein) 유전자, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 막 당단백질(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein) 유전자, 제 A 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질(type A influenza virus hemagglutinin protein) 유전자, 제 B 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질 유전자, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein) 유전자 및 쥐 헤파타이티스 바이러스 S 단백질(murine hepatitis virus S protein) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[10] [8]에 따른 방법에 있어서, 상기 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1a(elongation factor 1a) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[11] [8] 또는 [10]에 따른 방법에 있어서, 상기 배큘로바이러스 프로모터는 다각체 단백질(polyhedrin) 프로모터, p10 프로모터, IE1 프로모터, IE2 프로모터, p35 프로모터, p39 프로모터 및 gp64 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[12] [8] 또는 [11]에 따른 방법에 있어서, 상기 면역성 외래 유전자는 말라리아(malaria) 항원, 인플루엔자(influenza) 항원, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, SARS 바이러스 항원, 웨스트나일열(West Nile fever) 바이러스 항원, 뎅기열(dengue fever) 바이러스 항원, HIV 항원, HCV 항원, 리슈마니아(leishmania) 항원, 트리파노조마(trypanosoma) 항원 및 류코사이토준(leucocytozoon) 항원 단독, 또는 사이토카인(cytokine)을 가지는 상기 항원 유전자군으로부터 선택된 어느 하나의 융합 항원으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[13] [8] 또는 [12]에 따른 방법에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스는 AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
[14] 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자가 하나의 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터 및 또 하나의 배큘로바이러스 프로모터를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림에 연결되어 통합된 구조를 포함하는 전달벡터.
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[15] [14]에 따른 전달벡터에 있어서, 상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자는 배큘로바이러스 gp64(baculovirus gp64) 유전자, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein) 유전자, 제 1 유형 인간 면역결핍 바이러스 당단백질(type I human immunodeficiency virus glycoprotein) 유전자, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 막 당단백질(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein) 유전자, 제 A 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질(type A influenza virus hemagglutinin protein) 유전자, 제 B 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질 유전자, 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein) 유전자 및 쥐 헤파타이티스 바이러스 S 단백질(murine hepatitis virus S protein) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전달벡터.
[16] [14]에 따른 전달벡터에 있어서, 상기 척추동물에서 기능할 수 있는 척추동물 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1a(elongation factor 1a) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전달벡터.
[17] [14] 내지 [16]에 따른 전달벡터에 있어서, 상기 배큘로바이러스 프로모터는 다각체 단백질(polyhedrin) 프로모터, p10 프로모터, IE1 프로모터, IE2 프로모터, p35 프로모터, p39 프로모터 및 gp64 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전달벡터.
[18] [14] 내지 [17]에 따른 전달벡터에 있어서, 상기 면역성 외래 유전자는 말라리아(malaria) 항원, 인플루엔자(influenza) 항원, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, SARS 바이러스 항원, 웨스트나일열(West Nile fever) 바이러스 항원, 뎅기열(dengue fever) 바이러스 항원, HIV 항원, HCV 항원, 리슈마니아(leishmania) 항원, 트리파노조마(trypanosoma) 항원 및 류코사이토준(leucocytozoon) 항원 단독, 또는 사이토카인(cytokine)을 가지는 상기 항원 유전자군으로부터 선택된 어느 하나의 융합 항원으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전달벡터.
[19] [14] 내지 [18]에 따른 전달벡터에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스는 pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64 및 pCP-H1N1/HA1-vp39로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 전달벡터.
[20] [8] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 재조합 배큘로바이러스 제조 방법에 의해 제조된 재조합 배큘로바이러스.
[21] AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 [20]에 따른 재조합 배큘로바이러스.
[22] [20] 내지 [21]에 따른 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 약학적 조성물.
[23] [22]에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
[24] [20] 내지 [21]에 따른 상기 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 근육주사(intramuscularly), 비강분무(intranasally) 또는 흡입(inhalation)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
[25] AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 백신.
[26] [25]에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 근육주사(intramuscularly), 비강분무(intranasally) 또는 흡입(inhalation)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 백신.
[27] AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 및 치료제.
[28] [27]에 있어서, 상기 약제는 근육주사(intramuscularly), 비강분무(intranasally) 또는 흡입(inhalation)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 및 치료제.
[29] AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 및 AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
[30] [29]에 있어서, 상기 백신은 근육주사(intramuscularly), 비강분무(intranasally) 또는 흡입(inhalation)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
<발명의 실시를 위한 형태>
본 발명에 있어서, 아미노산, 펩티드, 염기 서열 및 핵산의 약어는 IUPAC-IUB에 의해 정의된 Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9(1984)에서 IUPAC-IUB 정보인 "염기 서열 및 아미노산 서열을 포함하는 명세서 작성 가이드라인"(특허 사무소) 및 당업계에 공통적으로 사용되는 기록에 준수한다.
본 발명에 있어서, DNA 분자는 이중 가닥 DNA뿐만 아니라, 상기 이중 가닥 DNA를 구성하는 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 포함하는 단일 가닥 DNA를 포함하며, 이의 길이는 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 면역성 외래 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 분자)는 별도의 언급이 없으면 게놈 DNA를 포함하는 이중 가닥 DNA, 및 cDNA를 포함하는 단일 가닥 DNA(센스 사슬), 상기 센스 사슬에 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 DNA(안티센스 사슬) 및 이들의 합성 DNA 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 분자는 기능적 부위로 한정되지 않으며, 발현 억제 부위, 암호화 부위, 리더 서열, 엑손 및 인트론 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함한다. 특정 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 및 특정 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드는 이의 단편(fragments), 상동체(homologs), 유도체(derivatives) 및 돌연변이(mutants)를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 DNA는 자연적으로 발생하는 대립형질 돌연변이, 비-자연적으로 발생하는 돌연변이, 및 결핍, 치환, 추가 및 삽입을 가지는 돌연변이를 포함한다. 그러나, 이들 돌연변이들은 돌연변이 전 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 기능과 실질적으로 동일한 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명에 있어서, 하나의 척추동물 프로모터(말라리아 프로모터, 조류 프로모터, 어류 프로모터) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는, 이중 프로모터와 융합 유전자가 통합된 구조를 포함하는, 재조합 배큘로바이러스를 생산하는 플라스미드를 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역성 외래 유전자는 상기 이중 프로모터의 다운스트림(downstream) 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자의 업스트림(upstream)에 위치되는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 약제 또는 백신의 유효성분으로 척추동물에 사용될 수 있다. 상기 척추동물로는 말, 돼지, 양, 염소, 원숭이, 쥐, 개 및 고양이 등 인간을 포함한 포유류, 닭, 메추라기, 거위, 데블러(dabbler), 비둘기, 칠면조, 핀타도스(pintados) 및 앵무새 등과 같은 조류, 옐로우테일(yellow tail), 어덜트 옐루우테일(adult yellowtail), 도미(sea bream), 방어(amberjack), 전갱이(Scad), 줄무늬 강꼬치고기(striped jack), 줄무늬 벤자리 무리(striped pigfish), 연어(salmon), 등푸른 연어(blueback salmon), 잉어(carp), 붕어(crucian carp), 무지개 송어(rainbow trout), 민물송어(brook trouts) 및 아마고 송어(amago trout) 등과 같은 어류 등을 예로 들 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 본 발명은 하나의 척추동물 프로모터가 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터에 연결된 이중 프로모터의 조절하에 곤충세포 내에서 발현이 가능한 바이러스 막 단백질을 암호화하는 유전자를 유전자 및 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자가 통합된 신규한 구조를 포함하는 전달벡터를 제공한다. 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA를 곤충세포내로 공동-형질도입함으로써 상동 재조합을 유도함으로써, 배큘로바이러스 프로모터의 조절하에 있고, 곤충세포 내에서 발현하며, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 융합 단백질을 생산할 수 있는 융합 유전자가 통합되어 있는 재조합 배큘로바이러스를 획득하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 재조합 배큘로바이러스가 척추동물에 투여되었을 때, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질 및 면역성 단백질의 융합 단백질이 백신 성분으로 기능할 수 있다. 상기 척추동물에 투여된 재조합 배큘로바이러스는 척추동물세포내에 침입하고, 목적의 바이러스 게놈 유래 면역성 외래 항원을 가지는 융합 항원이 척추동물세포에서 생산되며, DNA 백신으로서 기능한다.
그러므로, 포유류의 경우, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 포유류에 투여함으로써 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질 및 면역성 단백질의 융합 단백질이 항원으로서 존재하고, 상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질 및 면역성 단백질의 융합 단백질은 포유류의 세포에서 생산되며, 이의 면역잠재적 활성때문에 바이러스, 원생동물 및 박테리아의 감염에 대한 예방 및 치료제로 기능할 것으로 사료된다.
전달벡터와 함께 공동-형질도입되는 배큘로바이러스 DNA는 야생형, 돌연변이 및 재조합 배큘로바이러스 DNA 중 어느 하나가 될 수 있다. 상기 공동-형질도입되는 숙주세포는 예를 들어 밤나방(Spodoptera frugiperda)과 같은 곤충 유래 세포를 포함한다.
본 발명에 있어서, 말라리아, 인플루엔자 및 튜버쿨로시스 등의 감염성 질환, 자가면역 질환 및 암의 예방 및 치료용 백신 치료를 포함하는 면역치료의 면역원인 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 예를 들어, 말라리아 항원, 인플루엔자 항원 및 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 등과 같은 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 면역성 외래 유전자로 나타낸다.
여기서, 상기 "외래 유전자"는 외부로부터 도입된 유전자를 의미하고, 동일한 유전자가 세포내에 존재할지라도 상기 "외래 유전자"에 상응한다.
본 발명에 있어서, 면역원인 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 말라리아, 인플루엔자 및 튜버쿨로시스 등의 감염성 질환, 자가면역 질환 및 암 등의 원인 물질에 대한 면역성을 가지는 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자라면 상기 면역원인 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로서 특별히 제한하지 않는다. 이런 면역성을 가지는 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 예는 하기를 포함한다.
상기 말라리아 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면의 표면 항원 CSP(Circumsporozoite Protein), 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1(merozoite surface protein 1), 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구 덩이에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질 및 AMA1 단백질 등을 예로 들 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 HA 항원(hemagglutinin antigen), NA 항원(neuraminidase antigen), M2 항원(matrix protein antigen) 및 NP 항원(nucleoprotein antigen) 등과 같은 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다.
상기 튜버쿨로시스의 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 HSP65(65-kDa 열 충격 단백질), α-항원(항원85A, 항원85B, 항원85C), Mtb72f, MDP-1, ESAT-6, MPB51, Mtb8.8, Mtb9.9, Mtb32, Mtb39 및 Mtb11 등과 같은 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다.
척추동물 유전자와 관련하여, 포유류 유전자는 인간, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이, 쥐, 개 및 고양이 등에서의 감염성 질환에 대한 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다. 조류 유전자는 닭, 데블러(dabbler), 비둘기, 칠면조, 핀타도스(pintados) 및 앵무새(parrot) 등에서의 감염성 질환에 대한 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다. 어류 유전자는 옐로우테일(yellow tail), 어덜트 옐루우테일(adult yellowtail), 도미(sea bream), 방어(amberjack), 전갱이(scad), 줄무늬 강꼬치고기(striped jack), 줄무늬 벤자리 무리(striped pigfish), 연어(salmon), 등푸른 연어(blueback salmon), 잉어(carp), 붕어(crucian carp), 무지개 송어(rainbow trout), 민물송어(brook trouts) 및 아마고 송어(amago trout) 등에서의 감염성 질환에 대한 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다.
상기 포유류, 조류 및 어류에서의 감염성 질환과 관련성이 보고된 병원성 유전자는 GenBank 등록 병원성 유전자 등의 공용 데이타가 저장된 기관으로부터 용이하게 이용가능하다.
본 발명에 있어서, 면역성 외래 유전자는 인체 외부에 존재하는 상기 면역 항원들 외에, 예를 들어, IL-12 유전자, IL-6 유전자, IL-6 수용체 유전자, IL-2 유전자, IL-18 유전자, IFN-g 유전자 및 M-CSF 유전자 등의 인체 내부에 존재하는 사이토카인 유전자들, 또는 유전자 재조합 기술을 이용하여 면역성을 가지는 항원과 상기 항원성 단백질과 융합함으로써 획득된 융합 유전자들 역시 이들이 외부로부터 도입된다면 본 발명의 면역성 외래 유전자에 포함될 수 있다.
본 발명은 면역성 외래 유전자를 가지는 전달벡터, 및 이의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 제공할 뿐만 아니라, 면역성 외래 유전자를 가지는 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 상기 약학적 조성물로 구성되는 백신 제형을 제공한다.
본 발명에 사용되는 배큘로바이러스는 곤충에서 감염을 유발하는 곤충 병원성 바이러스이고, 유전자로서 환식 이중 가닥(cyclic double strand) DNA를 가지는 DNA 바이러스군(Baculoviridae)이다. 상기 바이러스 군은 핵다면체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus; NPV)가 감염의 마지막 단계에서 감염된 세포내 핵에서 다면체인 세포 함유물을 만드는 것을 의미한다. 상기 바이러스는 발현될 외래 유전자가 다면체 유전자 대신 삽입되어도, 문제없이 감염되고, 성장하며, 많은 양으로 원하는 외래 유전자 산물을 생산한다. 따라서, 최근에 상기 바이러스는 원하는 단백질의 생산에 실질적으로 적용되고 있다.
본 발명에 사용된 배큘로바이러스로서, 오토그라파 캘리포니카 핵다면체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus: AcNPV), 봄빅스 모리 핵다면체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus: BmNPV), 오르기아 슈도츄가타 핵다면체병 바이러스(Orgyia pseudotsugata Nuclear Polyhedrosis Virus: OpNPV) 및 리만트리아 디스퍼 핵다면체병 바이러스(Lymantria disper Nuclear Polyhedrosis Virus: LdNPV)가 예시될 수 있다.
상기 배큘로바이러스 DNA는 본 발명의 전달벡터와 상동 재조합을 수행할 수 있는 DNA일 수 있다. 특히, 본 발명의 전달벡터와 상동 재조합을 수행할 수 있는 상기 배큘로바이러스 DNA의 바이러스 유전자는 거대한 130 kbp이고, 15 kbp 또는 그 이상의 면역성 외래 유전자가 삽입될 수 있다. 배큘로바이러스 유전자 자체는 척추동물 세포에서 거의 발현되지 않는다. 따라서, 상기 배큘로바이러스의 세포독성은 고려될 필요가 거의 없으며, 이는 해로운 면역반응이 유도되지 않음이 생각된다.
(1) 본 발명의 전달벡터 및 전달벡터의 제조
면역성 외래 유전자 DNA 의 제조
DNA 바큘로 바이러스 벡터의 성분 중 하나인, 바이러스 유전자에 융합될 수 있는 면역성 외래 유전자는 본 발명의 목적의 면역성을 가지는 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 정보를 기초로 합성하거나, 면역성 외래 유전자의 핵산 서열 정보를 기초로 한 면역성 외래 유전자의 암호화 부위의 핵산 서열에 대응하는 DNA를 직접 합성(화학적 DNA 합성 방법)함으로써 용이하게 제조 및 획득될 수 있다. 일반적인 유전자 공학 기술은 상기 제조에 적용될 수 있다(예를 들어, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989; Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" edited by the Japanese Biochemistry Society, 1986).
상기 DNA의 합성 방법으로서, 화학적 합성은 포스페이트 트리에스테르 방법(phosphate triester method), 포스페이트 아미디트 방법(phosphate amidite method)(J. Am . Chem . Soc ., 89, 4801, 1967; ibid., 91, 3350, 1969; Science , 150, 178, 1968; Tetrahedron Lett ., 22, 1859, 1981; ibid ., 24, 245, 1983) 및 이의 조합 방법 등이 예시 될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 DNA는 포스페이트 아미디트 방법 또는 포스페이트 트리에스테르 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있고, 상업적으로 이용가능한 자동 올리고뉴클레오티드 합성자(synthesizer)를 이용하여 합성될 수 있다. 이중 가닥 단편은 상보적인 사슬이 합성되고, 적절한 조건 하에서 화학적으로 합성된 단일 가닥으로 상보적인 사슬을 풀고, DNA 폴리머라제를 이용하여 화학적으로 합성된 단일 가닥에 적절한 프라이머 서열로 상보적인 사슬을 추가함으로써 획득될 수 있다.
본 발명에서 제조된 면역성 외래 유전자 DNA의 구체적인 양상으로서, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열, 말라리아 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 또는 인플루엔자 바이러스 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열로 구성된 DNA가 예시될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 DNA는 면역성을 가지는 항원 단백질의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열의 전장 DNA 서열에 한정되지 않고, DNA 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 단백질이 면역성을 가지는 한 부분적인 서열을 암호화하는 DNA 서열이 될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 DNA는 인체내에 존재하는 예를 들어, IL-12 유전자, IL-1 유전자, IL-6 유전자, IL-6 수용체 유전자, IL-2 유전자, IL-18 유전자, IFN-α 유전자, IFN-β 유전자, IFN-γ 유전자, TNF 유전자, TGF-β 유전자, GM-CSF 유전자 및 M-CSF 유전자 등의 사이토카인에 대한 항원성을 가지는 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 융합함으로써 획득될 수 있다.
상기 융합된 DNA 서열은 항원성을 가지는 항원 단백질의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 사이토카인 유전자의 DNA 서열을 암호화하는 전장에 한정되지 않고, 부분적인 DNA 서열이 될 수 있다.
본 발명에 사용된 면역성 외래 유전자의 DNA는 상기 부분적인 DNA 서열을 가지는 DNA 분자에 한정되지 않고, 각 아미노산 잔기에 대한 선택적 코돈을 결합 및 선별함으로써 획득된 DNA 서열을 가질 수 있다. 상기 코돈의 선별은 표준 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이때 이용되는 숙주세포에서 코돈의 이용빈도가 고려될 수 있다(Nucleic Acids Res., 9, 43, 1981).
본 발명에 사용된 유전자 공학 기술에 의해 면역성 외래 유전자의 DNA를 제조하는 방법은 구체적으로 표준 방법들에 따라 면역성 외래 유전자의 DNA를 발현하는 적절한 기원으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 상기 면역성 외래 유전자에 대한 본래의 발현 산물에 대항하는 적절한 프로브 또는 항체를 이용하여 상기 라이브러리로부터 원하는 클론을 선별함으로써 수행될 수 있다(Proc . Natl . Acad . Sci., USA., 78, 6613, 1981; Science , 222, 778, 1983).
상기 게놈 DNA의 기원으로서, 면역성 외래 유전자의 DNA를 발현하는 다양한 세포들, 조직들 및 이들로부터 유래된 배양된 세포들이 예시될 수 있다. 특히, 상기 기원으로서 말라리아 기생충으로 감염된 적혈구의 추출물, 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포의 추출물 또는 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis)의 추출물이 사용되는 것이 바람직하다. 상기 기원으로부터 총 DNA 및 RNA의 추출 및 분리, mRNA의 분리 및 정제, 및 cDNA의 획득 및 클로닝은 표준 방법에 따라 수행될 수 있다.
또한, 면역성 외래 유전자의 DNA의 제조은 각 면역원의 mRNA을 추출하고, 상기 RNA에 폴리 A(poly A)를 첨가하고, 폴리 A-결합된 RNA를 수집하고, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하고, 상기 cDNA의 양쪽 말단에 제한효소 부위를 첨가하고, 각 파지(phage)내로 cDNA를 통합하여 제조된 파지 라이브러리를 이용하고, 아울러 상기 기원으로서 추출물을 이용한 면역성 조직 또는 세포로부터 mRNA의 추출, 분리 및 정제에 의해 획득된 각 면역원의 cDNA 라이브러리를 이용하여 획득함으로써 수행될 수 있다.
상기 cDNA 라이브러리 유래 면역성 외래 유전자의 DNA를 스크리닝하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 일반적인 방법들에 따라 수행될 수 있다. 상기 특별한 방법으로서, 예를 들어 상기 cDNA에 의해 생산되는 단백질에 대한 특이적인 항체(항-말라리아 항체, 항-인플루엔자 항체, 항-M. 튜버쿨로시스 항체 등)을 이용하여 면역학적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선별하는 방법; 목적 DNA 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 이용하는 프라크 잡종방법(plaque hybridization method) 콜로니 잡종방법(colony hybridization method); 및 이들의 조합이 예시될 수 있다.
상기 잡종 방법에 이용된 프로브로서, 면역성 외래 유전자의 DNA 서열에 대한 정보를 기초로 화학적으로 합성된 DNA 단편들이 일반적이다. 이미 획득된 면역성 외래 유전자 및 이의 단편의 DNA 서열은 상기 프로브로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 면역성 외래 유전자의 DNA 서열 정보를 기초로 고안된 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 상기 스크리닝을 위한 프로브로서 이용될 수 있다.
상기 프로브로 사용되는 DNA(뉴클레오티드들)은 면역성 외래 유전자의 DNA 서열에 대응하는 부분적인 DNA(뉴클레오티드들)이고, 적어도 15개의 연속적인 DNA를 가지는, 바람직하게는 적어도 20개의 연속적인 DNA를 가지는, 더 바람직하게는 적어도 30개의 연속적인 DNA를 가지는 것이다. 또한, 상기 DNA를 생산하는 양성 클론(positive clone)은 상기 프로브로 사용될 수 있다.
면역성 외래 유전자의 DNA가 획득되었을 때, PCR에 의한 DNA/RNA 증폭 방법(Science , 230, 1350, 1985)은 적절하게 이용될 수 있다. 특히, 전장 cDNA가 라이브러리로부터 일부 획득되었을 때, RACE 방법(cDNA 말단의 급속한 증폭; Jikken Igaku 12(6), 35, 1994), 특히 5'-RACE 방법(M. A. Frohman, et al., Proc . Natl . Acad. Sci ., USA., 8, 8998, 1988)이 적절하게 적용된다.
상기 PCR에 사용된 프라이머는 면역성 외래 유전자의 DNA 서열 정보를 기초로 고안될 수 있고, 표준 방법에 따라 합성될 수 있다. 이런 프라이머로서, 실시예에서 보여주는 바와 같이, 면역성 외래 유전자의 DNA가 내부에 통합될 수 있는 벡터의 양쪽 말단에 첨가되는 DNA 일부(SP6 프로모터 프라이머 및 T7 터미네이터 프라이머)가 이용될 수 있다.
PCR에 의해 증폭되는 DNA/RNA 단편의 분리/정제는 예를 들어 젤 전기영동 등의 표준 방법에 따라 수행될 수 있다.
상기와 같이 획득한 면역성 외래 유전자의 DNA 또는 다양한 DNA 단편에 대해서, 이들의 DNA 서열들은 예를 들어, 디디옥시 방법(dideoxy method)(Proc . Natl . Acad. Sci., USA., 74, 5463, 1977) 또는 맥삼-길버트 방법(Maxam-Gilbert method)(Methods in Enzymology, 65, 499, 1980), 또는 상업적으로 이용가능한 서열 키트 등의 표준 방법에 따라 결정될 수 있다.
바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화할 수 있는 유전자는 곤충세포에서 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질로서 발현될 수 있고, 목적 세포에서 면역성 외래 유전자를 융합함으로써 융합 단백질로서 발현될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자이면 어떤 것도 될 수 있다.
상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로서, 예를 들어 gp64 단백질(GenBank Accession No. L22858), 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein)(GenBank Accession No. M21416), 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein)(KOS; GenBank Accession No. K01760), 제 1 유형 인간 면역결핍 바이러스 gp120(type I human immunodeficiency virus gp120)(GenBank Accession No. U47783), 인간 호흡기 세포융합 막 바이러스 당단백질(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein)(GenBank Accession No. M86651), 제 A 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질(type A influenza virus hemagglutinin protein)(GenBank Accession No. U38242), 또는 배큘로바이러스와 밀접하게 관련된 바이러스의 막 단백질의 유전자가 예시될 수 있다. 본 발명에 있어서, 실시예에서 보는 바와 같이 gp64 유전자가 바람직한 예시가 될 수 있다.
상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 목적 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 정보를 기초로 합성하거나, 면역성 외래 유전자의 DNA의 생산을 병행하는 경우로서 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 아미노산 서열 정보를 기초로 한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대응하는 DNA을 직접 합성(화학적 DNA 합성)함으로써 용이하게 제조 및 획득될 수 있다.
바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 대응하는 DNA 서열은 암호화 부위의 전장에 한정되지 않으며, 부분적인 DNA 서열로 구성되는 DNA일 수 있다.
면역성 외래 유전자의 DNA 분자의 제조를 병행하는 경우, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 DNA는 일반적인 유전자 공학 기술(예를 들어, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989; Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" edited by the Japanese Biochemistry Society, 1986)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역성 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위가 통합되어 있고, 바이러스 입자의 아미노산을 암호화하는 유전자(부분)가 미리 도입된, 상업적으로 이용가능한 벡터 플라스미드가 이용될 수 있다.
척추동물 프로모터
본 발명에 이용된 전달벡터의 성분 중 하나인 척추동물 프로모터(척추동물에서 작용할 수 있는)로서, 포유류 프로모터, 조류 프로모터 및 어류 프로모터 등의 프로모터들이 예시될 수 있다.
포유류 프로모터
본 발명에 이용된 전달벡터의 성분 중 하나인 포유류 프로모터(포유류에서 작용할 수 있는)로서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1α(elongation factor 1α) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터가 예시될 수 있다.
조류 프로모터
조류 프로모터로서, 액틴(actin) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, 연장인자(elongation factor) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 및 알부민(albumin) 프로모터가 예시될 수 있다.
어류 프로모터
어류 프로모터로서, 액틴(actin) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터 및 연장인자(elongation factor) 프로모터가 예시될 수 있다.
배큘로바이러스 프로모터
본 발명에 이용되는 배큘로바이러스 전달벡터의 성분 중 하나인 배큘로바이러스 프로모터로서, 다각체 단백질(polyhedrin) 프로모터, p10 프로모터, IE1 프로모터, p35 프로모터, p39 프로모터 및 gp64 프로모터가 예시될 수 있다.
재조합 전달벡터의 제조
본 발명은 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포 모두에서 항원 단백질로서 목적 면역성 외래 유전자를 발현할 수 있는 구조를 가지는 신규 전달벡터에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 제조된 신규 전달벡터의 구조는 원하는 면역성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열은 하나의 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 및 또 하나의 배큘로바이러스 프로모터가 연결된 프로모터의 다운스트림에 연결되는 점에서 특정된다. 하나의 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 및 또 다른 배큘로바이러스 프로모터인 두 개의 프로모터의 DNA 서열을 포함하는 DNA 부위들은 직접적으로 연결되거나, 간섭(intervening) DNA 서열이 상기 두 프로모터의 DNA 서열 사이에 존재할 수 있다(그러나, 이런 경우에, 각 프로모터는 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포에서 활성을 가지는 것이 필수적이다). 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 또는 연결되는 배큘로바이러스 프로모터 중 어느 하나는 그들의 프로모터 부위에서 발현되는 유전자에 더 밀접하게 배열될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 배큘로바이러스는 포유류 프로모터 보다 발현되는 유전자에 더 밀접하게 배열되어 있다.
상기 구조에 있어서, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 원하는 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자에 관하여, 이들 두 유전자는 직접적으로 연결되거나, 간섭 DNA 서열이 그 들 사이에 존재할 수 있다(그러나, 이는 프레임쉬프트(frameshift)가 유발하지 않게 DNA를 배열하는 것이 필수적이다). 원하는 면역성을 가지는 외래 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 항원 제시 부위(antigen presenting region)는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질에 융합되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질로부터 유래하는 원하는 면역성을 가지는 외래 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 절단 없이 융합된 형태로 이용되는 것이 필수적이다.
이런 두 유전자들을 포함하는 융합 유전자는 미리 형성된 후 벡터 내로 통합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 유전자가 미리 벡터 내에 통합된 후, 연속적으로 다른 유전자가 벡터내 융합 유전자를 형성하기 위해 벡터 내로 통합될 수 있다.
상기 조작(manipulation)에 관하여, 상기 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 및 배큘로바이러스 프로모터의 프로모터 부위, 및 본 발명의 전달벡터로서 원하는 구조의 일부로서 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 부위를 이미 가지고 있는 상업적으로 이용가능한 발현벡터가 이용될 수 있다. 상기 발현벡터를 이용함으로써, 원하는 성분들이 원하는 면역성 외래 유전자가 제한 효소로 선택적으로 절단하거나, 또 다른 벡터로 통합되거나, 또는 플라스미드 내 이미 통합된 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 DNA 부위의 N 말단 부위 내로 원하는 면역성 외래 유전자를 삽입함에 의해 벡터의 클로닝 부위 내 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 융합되는 DNA 서열이 삽입됨으로써 삽입될 수 있다.
단백질의 검출에 관하여, His-태그(tag) 또는 HVS-태그는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 원하는 면역성 외래 유전자를 융합하는 DNA 서열의 C 말단 부위에 폴리 A 테일(poly A tail) 앞에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 재조합 융합 단백질의 발현, 정제 및 검출에 관하여, 8개의 아미노산으로 구성된 플래그(FLAG) 서열을 암호화하는 DNA 서열은 프로모터 부위, 및 원하는 면역성 외래 유전자가 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 융합되는 부위 사이에 펩티드 태그로서 삽입될 수 있다. 본 발명에 있어서, 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포 모두에서 항원 단백질로서 원하는 면역성 외래 유전자를 발현할 수 있는 구조를 가지는 플라스미드 벡터는 이의 일부를 이미 충족하는 구조를 가지는 상업적으로 이용가능한 플라스미드를 이용함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드의 아미노산 서열은 척추동물 세포내에서 효소로 융합 단백질을 절단하기 위해 사이에 삽입될 수 있다. 본 발명의 전달벡터로, 척추동물 세포, 특히 포유류 세포에서 전사 활성을 증가하기 위한 인핸서(enhancer)는 상기 두 프로모터 업스트림(upstream)에 배열되거나, 숙주에서 발현되는 단백질의 세포외 분비를 촉진하는 신호 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이 융합 및 발현되는 유전자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 척추동물 세포에서 효과적인 래빗 베타 글로불린 터미네이터(rabbit β globulin terminator)와 같은 척추동물 터미네이터 부위는 융합 및 발현되는 유전자의 전사 다운스트림을 종결하기 위해 배열될 수 있다.
상기와 같이, 배큘로바이러스 입자 내에서 원하는 면역성을 발현할 수 있는 면역성 외래 유전자 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 발현할 수 있는 전달벡터가 제조될 수 있다.
전달벡터 및 이의 제조 방법의 구체적인 예시에 관하여, 실시예에서 보는 바와 같이, 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터로서 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 프로모터, CMV 프로모터로부터 변형된 CAG 프로모터, 및 CMV 인핸서가 융합된 유비퀴틴(ubiquitin; UBB) 프로모터, 및 배큘로바이러스 프로모터로서 다각체(polyhedrin; Polh) 프로모터가 연결되고, 외래 유전자로서 인플루엔자 바이러스 항원 유전자, 말라리아 항원 유전자 및 M. 튜버쿨로시스 항원 유전자와 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로서 gp64 항원 유전자가 융합된 DNA 서열이 통합된 구조로 구성되는 전달벡터는 pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64 및 pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 및 pCP-H1N1/NP-vp39가 예시될 수 있다.
(2) 재조합 배큘로바이러스의 제조
본 발명은 하나의 척추동물 프로모터(vertebrate promoter) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터(baculovirus promoter)를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는, 이중 프로모터와 융합 유전자가 통합된 구조를 포함하는 전달벡터를 제조하는 단계; 상기 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA가 숙주 세포내로 공동-형질도입하는 단계; 및 상기 재조합 바큘로 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 배큘로바이러스의 제조 방법을 제공한다.
상기 재조합 배큘로바이러스의 제조 방법에 있어서, 숙주내로 원하는 재조합 DNA(전이 벡터)를 도입하는 방법 및 그 외 형질전환 방법은 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 다양한 방법, 예를 들어 일반적인 유전자 재조합 기술(Science, 224, 1431, 1984; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5990, 1983)에 따라 수행될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 재조합 DNA(전이 벡터)는 Ohno 등, "Tanpaku Jikken Protocol 1 Functional analysis, Saibo Kogaku Bessatu Jikken Protocol Series, 1997, Shujunsha"의 문헌을 참고하여 발현 및 제조될 수 있다. 곤충 세포 조작, 유전자 재조합 및 공동-형질도입의 일반적인 기술에 관하여, 곤충 세포에서 재조합 바이러스를 만드는 잘 알려진 방법과 동일한 방법이 이용될 수 있다(Yoshiharu Matsuura, Proteins, Nucleic acids and Enzymes, 37:211-222, 1992; Yoshiharu Matsuura, Saibo 33(2):30-34,2001).
결과물인 재조합 배큘로바이러스는 표준 방법에 따라 배양될 수 있다. 배양함으로써 요구된 바와 같이 고안된 본 발명의 면역성 외래 유전자의 DNA 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 융합된 융합 산물(발현된 산물)이 세포 내, 세포 밖 또는 세포막에 발현, 생산(축적) 및 분비된다.
배양을 위해 사용된 배지로서, 일반적으로 사용되는 다양한 배지가 적절하게 선택될 수 있고 적용되는 숙주 세포에 의존하여 사용되며, 상기 배양은 숙주 세포의 성장에 적절한 조건하에서 수행될 수 있다.
상기 재조합 배큘로바이러스 제조 방법은 보다 바람직하게 상기 제조된 전달벡터로 상동 재조합을 수행하기 위해 배큘로바이러스 DNA를 제조하고, 숙주 세포로서 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 파생된 Sf-9 세포와 Sf-21 세포, 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)로부터 파생된 Tn5 세포[Invitrogen에서 공급받은 하이 파이브 세포(high five cell)] 등의 곤충 세포내로 상기 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA를 공동-형질도입하는 단계를 포함한다.
전달벡터와 상동 재조합을 수행하기 위해 제조된 배큘로바이러스 DNA는 야생형, 돌연변이 또는 재조합 배큘로바이러스 DNA 중 어느 하나일 수 있다.
배큘로바이러스 DNA는 이중 프로모터 부위, 면역성 외래 유전자 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자에서의 DNA가 융합된 융합 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 유래 DNA를 제외한, 본 발명의 전달벡터와 상동 재조합을 하기 위해 전달벡터로 사용되는 이중 프로모터의 업스트림에 위치하는 배큘로바이러스 DNA로부터 유래되는 DNA에 대한 상동의 DNA 구조를 가지는 한 상동 재조합의 가능성을 높일 수 있다.
상동 재조합을 유도하기 위해, 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA는 1: 1 내지 10:1의 중량비에서 혼합되는 것이 바람직하다.
공동-형질도입의 단계에 의해 동시에 곤충 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 배양한 후, 바이러스의 플라크(plaque)가 배지에서 현탁된 배양 상청액으로부터 제조된 다음, 재조합 바이러스를 포함하는 용액을 얻기 위한 볼텍스(vortex)에 의해 아가로부터 용출된다.
상기 과정에서, 상업적으로 이용가능한 배큘로바이러스 DNA가 이용될 수 있고, 이는 예를 들어 다각체 유전자가 AcNPV로부터 제거된 BacVector-1000 DNA 및 BacVector-2000 DNA(Novagen으로부터 공급받음)을 사용할 수 있다.
상동 재조합을 위해 곤충 세포 내로 상기 획득한 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA의 공동-형질도입은 상기 기재된 상업적으로 이용가능한 벡터 형질도입 키트(Novagen으로부터 공급받은 BacVector Transfection Kits)를 이용하여 상기 벡터 형질도입 키트에 첨부된 지시에 따라 수행될 수 있다. 상기 과정에서, 제조된 전달벡터는 재조합 배큘로바이러스를 얻기 위해 Sf-9 세포 등의 곤충 세포에 배큘로바이러스 DNA와 함께 공동-형질도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 따라서, pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 및 pCP-H1N1/NP-vp39 등의 전달벡터, 및 배큘로바이러스 DNA가 이용되고, 이들은 AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 재조합 배큘로바이러스를 얻기 위해 Sf-9 곤충 세포 내에 공동-형질도입된다.
또한, AcNPV-Dual-H5N1/HA1 및 AcNPV-Dual-SARS/S 등의 재조합 배큘로바이러스는 획득될 수 있다.
상기 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 추가적으로, 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 다른 방법으로서, 전체 배큘로바이러스 게놈이 통합된 파지미드[phagemid(bacmid)]에 대한 트랜스포손(transposon)을 이용하여 대장균(Escherichia coli)에서 효율적으로 외래 유전자를 삽입하는 방법이 사용 가능하다. 상기 방법에 따라, 재조합 배큘로바이러스는 미생물 세포로부터 유래한 바이러스 유전자를 낳는 파지미드를 추출하고, 이를 곤충 세포 내에 형질도입함으로써 용이하게 제조 및 수집될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스를 제조하는 상기 방법에 의해 획득된 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 정제는 공공연하게 알려진 바이러스 정제 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스의 정제를 위해, 예를 들어, 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 의해 획득된 저장 바이러스(일반적으로 1 x 107-8 pfu/mL)의 0.5 내지 1.0 mL가 Sf-9 세포 등의 곤충 세포(1 x 107 cells/10 cm dish)에 접종되고, 배양 상청액이 상기 감염 후 몇 일(4일)에 수집되고, 원심분리에 의해 획득된 바이러스 펠릿(pellet)이 PBS 등의 완충용액에서 현탁된다. 상기 결과물인 현탁액은 바이러스 밴드를 수집하기 위해 원심분리(25,000 rpm, 60분, 4℃)될 때, 10 내지 60%의 슈크로즈 구배(sucrose gradient)로 적용되었다. 상기 수집된 바이러스는 추가적으로 PBS에 현탁되고, 이어서 원심분리(25,000 rpm, 60분, 4℃)되고, 결과물인 정제된 재조합 바이러스 펠릿이 4℃에서 PBS 등의 완충용액에서 저장되었다.
상기 결과물인 정제된 재조합 바이러스의 감염도 적정농도(infectivity titer)는 Sf-9 세포 등의 곤충 세포를 이용하여 플라크 분석(VIROLOGY 4th Edition, p29-32, 2001)에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 예시된 재조합 바이러스에 있어서, 배큘로바이러스 gp64의 N 말단은 상기 바이러스 입자 외부에 노출되고, 이의 C 말단은 상기 바이러스 입자 내부에 노출된다. 따라서, 원하는 면역성 외래 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 gp64의 N 말단에 융합된다면, 상기 바이러스 입자의 성분으로서 존재는 곤충 세포에서 바이러스 단백질 입자 외부에 노출되고, 따라서 본 발명의 백신 제형의 목적을 위해 적절한 항원이 더 용이하게 존재될 수 있다.
(3) 본 발명의 약학적 조성물(본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제)
본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분인 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 상기 (2)에서 보여주는 유전자 공학 기술에 의해 획득될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 배큘로바이러스 DNA, 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 본 발명의 면역성 외래 유전자를 융합한 융합 유전자가 곤충 세포 및 척추동물 세포, 특히 인간을 포함한 포유류 유래 세포에서 발현될 수 있기 위해 제조된 전달벡터의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 것이 중요하다.
특히, 본 발명은 AcNPV-Dual-H1N1/HA1 , AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 또는 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 재조합 배큘로바이러스 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서 유효성분인 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 감염성 항원에 대한 감염 예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 가지고, 이런 작용 또는 활성은 표적 세포 또는 조직의 감염과 관련된 질환의 경과를 위해 이용될 수 있다. 상기 감염에 의해 영향을 받은 표적 세포는, 예를 들어 혈구(blood cell)를 포함하고, 그 외 표적 세포는 간장 세포(hepatic cell), 신장 세포(renal cell), 뇌 세포(brain cell), 폐 세포(lung cell), 상피 세포(epithelial cell) 및 근육 세포(muscular cell)를 포함한다. 상기 세포를 포함하는 조직은 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 동맥 및 정맥(arterial and venous vein), 위(stomach), 소장(intestine), 요도(urethra), 피부(skin) 및 근육(muscle)을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 예를 들어, 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면의 표면 항원 CSP, 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1, 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구의 덩이(knob)에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질 및 AMA1 단백질 등의 말라리아 항원뿐만 아니라 예를 들어, HA 항원, NA 항원, M2 항원 및 NP 항원 등의 인플루엔자 항원을 증가시키고, 감염성 적정농도(예를 들어, 바이러스 감염성 적정농도)를 줄인다. 따라서, 상기 약학적 조성물로 투여된 인간을 포함한 포유류의 생존기간 및 생존율은 투여되지 않은 개체들에 비해 증가된다. 그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 특히 말라리아 및 인플루엔자 바이러스로 감염에 대한 예방 또는 치료제로 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 파필로마(papilloma) 바이러스, 허피스(herpes) 바이러스, 에이즈(AIDS) 바이러스, 헤파터티스 C(hepatitis C) 바이러스, 사스(SARS) 바이러스, 웨스트나일열(west nile fever) 바이러스 및 뎅기열(dengue fever) 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 질환, 말라리아(malaria), 트리파노소마(trypanosome) 및 리슈마니아(leishmania) 기생충에 의해 유발되는 기생충 질환, 및 이질(dysentery), 장티푸스(enteric fever), 콜레라(cholera), 폐렴균(pneumococcus), MRSA, VRE, 임균(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아(Chlamydia), 매독(syphilis) 및 결핵(tuberculosis) 등의 박테리아에 의해 유발되는 박테리아 질환 등과 같은 병원체들 및 그들의 복합체에 의해 유발되는 감염성 질환에 대해 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 이용함으로써 예방 또는 치료제로서 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분이 되는 재조합 배큘로바이러스를 획득하기 위한 전달벡터 내에 인간을 제외한 척추동물에 대한 면역성 외래 유전자를 사용함으로써, 조류 인플루엔자 백신(chicken influenza vaccine), 소 트리파노소마 백신(bovine trypanosome vaccine) 및 일본 숭어 콜드워터 질환 백신(Japanese trout cold water disease vaccine)으로서 표적 세포 및 조직의 감염과 관련된 질환의 경과에 대해 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 이용함으로써 본 발명의 약학적 조성물을 이용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 재조합 배큘로바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다.
척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류 또는 포유류 세포에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 감염-예방 효과에 관하여, 예를 들어 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 및 약학적 투여를 위해 추가될 수 있는 조성물에 의해 제조된 약학적 조성물은 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류에서 근육주사(intramuscularly), 비강분무(intranasally) 또는 흡입(inhalation)으로 투여되고, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로 여러번 연속적으로 면역된다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 흡입으로 투여된다.
또한, 감염에 대한 예방 효과는 본 발명의 약학적 조성물로 여러번 면역시키고, 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류를 대상으로 하는 병원체를 투여하고, 특정 기간이 지난 후, 재조합 배큘로바이러스가 유효성분으로 포함된 본 발명의 약학적 조성물로 투여된 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류와 투여되지 않은 개체들의 생존율을 비교함으로써 평가될 수 있다.
(4) 본 발명의 백신
병원체 감염에 대한 예방적 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 나타내는 원하는 면역성을 가지는 본 발명의 면역성 외래 유전자에 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 융합시킨 융합 DNA 서열의 발현 산물을 포함하는, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 또는 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 재조합 배큘로바이러스는 곤충 세포로부터 유래되는 돌출된 바이러스 입자로서 정제된다. 그때, 바이러스 입자의 성분이 되는 외래 항원 단백질은 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류에 바이러스 입자의 형태로 약학적 조성물을 투여함으로써 획득한 면역성(체액성 면역 및 세포성 면역)을 촉진하고, 융합 DNA 서열의 발현 산물인 항원 단백질은 척추동물 세포, 특히 인간을 포함한 포유류 세포에서 획득한 면역성(체액성 면역 및 세포성 면역)을 추가로 촉진하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스는 백신으로 유용하다.
특히, 본 발명은 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 재조합 배큘로바이러스 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 백신을 제공한다.
일반적으로 상기 (3)의 약학적 조성물인 백신은 감염에 대한 예방적 효과를 증가시키고, 예를 들어 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면의 표면 항원 CSP, 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1, 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구의 덩이(knob)에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질 및 AMA1 단백질 등의 말라리아 항원, 및 HA 항원, NA 항원, M2 항원 및 NP 항원 등의 인플루엔자 항원과 같은 병원성 유기체에 대한 감염성 적정농도(예를 들어, 바이러스 감염성 적정농도)를 줄인다. 따라서, 감염된 인간을 포함한 포유류에서 생존기간 및 생존율을 본 발명의 약학적 조성물이 투여되지 안은 개체들과 비교함으로써, 상기 백신이 말라리아 및 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료제로서 특히 유용하다.
본 발명의 백신은 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 파필로마(papilloma) 바이러스, 허피스(herpes) 바이러스, 에이즈(AIDS) 바이러스, 헤파터티스 C(hepatitis C) 바이러스, 사스(SARS) 바이러스, 웨스트나일열(west Nile fever) 바이러스 및 뎅기열(dengue fever) 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 질환, 말라리아(malaria), 트리파노소마(trypanosome) 및 리슈마니아(leishmania) 기생충에 의해 유발되는 기생충 질환, 및 이질(dysentery), 장티푸스(enteric fever), 콜레라(cholera), 폐렴균(pneumococcus), MRSA, VRE, 임균(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아(Chlamydia), 매독(syphilis) 및 결핵(tuberculosis) 등의 박테리아에 의해 유발되는 박테리아 질환 등과 같은 병원체들 및 그들의 복합체에 의해 유발되는 감염성 질환에 대해 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 이용함으로써 예방 또는 치료제로서 유용하다.
본 발명의 백신의 유효성분이 되는 재조합 배큘로바이러스를 획득하기 위한 전달벡터 내에 인간을 제외한 척추동물에 대한 면역성 외래 유전자를 사용함으로써, 조류 인플루엔자 백신(chicken influenza vaccine), 소 트리파노소마 백신(bovine trypanosome vaccine) 및 일본 숭어 콜드워터 질환 백신(Japanese trout cold water disease vaccine)으로서 표적 세포 및 조직의 감염과 관련된 질환의 경과에 대해 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 이용함으로써 본 발명의 백신을 이용할 수 있다.
본 발명의 백신의 유효성분인 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39 등의 재조합 배큘로바이러스는 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 감소시키는 활성을 가지고, 상기 작용 또는 활성은 표적 세포 또는 조직의 감염과 관련된 질환의 경과에 이용될 수 있다. 상기 감염에 의해 영향을 받은 표적 세포는 예를 들어, 혈구(blood cell)를 포함하고, 그 외 표적 세포는 간장 세포(hepatic cell), 신장 세포(renal cell), 뇌 세포(brain cell), 폐 세포(lung cell), 상피 세포(epithelial cell) 및 근육 세포(muscular cell)를 포함한다. 상기 세포를 포함하는 조직은 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 동맥 및 정맥(arterial and venous vein), 위(stomach), 소장(intestine), 요도(urethra), 피부(skin) 및 근육(muscle)을 포함한다.
상기 (3)의 약학적 조성물로서 본 발명의 백신은 약학적으로 유효한 양의 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다.
상기 백신은 표준 방법에 따라 상기 (3)의 약학적 조성물과 같이 약학적으로 허용가능한 약학적 조성물 형태로 제조될 수 있다. 상기 담체는 예를 들어, 멸균 생리식염수 및 멸균 완충 생리식염수 등의 생리학적으로 허용가능한 용액을 포함할 수 있다.
상기 백신(이하, 제형은 약학적 조성물에서와 같다)은 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)를 유효성분으로 포함하는 리포좀 제형으로 제조될 수 있고, 보조제와 결합될 수 있다. 본 발명의 백신(약학적 조성물)의 특별한 예시는 리포좀 제형을 포함할 수 있다. 상기 리포좀 제형은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스가 막 성분으로서 산성 인지질을 이용하거나 막 성분으로서 중성 인지질 및 산성 인지질을 이용한 리포좀에 보유되는 제형이 될 수 있다.
상기 막 성분에 사용되는 중성 인지질 및 산성 인지질은 특별히 한정되지 않고, 리포좀 제형으로 일반적으로 사용되는 다양한 지질이 단독으로, 또는 둘 이상의 혼합물이 될 수 있다.
리포좀 막은 산성 인지질 단독, 또는 중성 인지질과 산성 인지질을 혼합한 것을 이용한 표준 방법에 따라 형성된다. 중성 인지질을 혼합한 것의 경우, 혼합되는 산성 인지질의 비율은 리포좀 막 성분에 있어서 약 0.1 내지 100 mol%, 바람직하게는 1 내지 90 mol%, 더 바람직하게는 10 내지 50 mol%가 될 수 있다.
상기 리포좀이 제조될 때, 콜레스테롤 등이 첨가될 수 있다. 이는 인지질의 유동성을 조절할 수 있고 더 용이하게 리포좀을 제조할 수 있다. 상기 콜레스테롤은 일반적으로 상기 인지질의 양과 동일한 양으로 첨가되고, 상기 인지질의 양과 동일한 양에 대해 0.5배 첨가 및 혼합되는 것이 더 바람직하다.
리포좀 제형에서 유효성분 및 산성 인지질의 비율에 관해서, 산성 인지질의 비율은 유효성분에 대해 상대적으로 약 0.5 내지 100 당량, 바람직하게는 약 1 내지 60 당량 및 더 바람직하게는 약 1.5 내지 20 당량이 될 수 있다.
본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 유효성분으로 이용되는 양은 몇 mol% 내지 몇십 mol%, 바람직하게 약 5 내지 10 mol%, 및 일반적으로 약 5 mol%이 될 수 있다.
상기 리포좀 제형의 제조, 농도 및 입자 직경 조절은 표준 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 상기 기재된 다양한 첨가물은 요구되면 상기 리포좀 제형과 결합될 수 있다. 또한, 지방산[예를 들어, 베헤닌산(behenic acid), 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 미리스트산(myristic acid), 올레인산(oleic acid)], 알킬기(alkyl group), 콜레스테릴기(cholesteryl group) 및 이와 유사한 종들이 상기 리포좀 제형에 혼합 및 이용될 수 있다. 또한, 이들의 혼합에 의해 제조된 리포좀 제형의 제조는 표준 방법(Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M. C. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin, 1998)에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 바람직하게 백신 조성물로 이용될 수 있다. 상기 백신을 사용할 때, 이는 항-감염(항-말라리아 또는 항-인플루엔자) 효과를 증진시키기 위해 약학적으로 유효한 양의 보조제와 함께 이용되는 것이 바람직하다.
상기 보조제로서, 백신 유형에 일반적으로 사용되는 것은 제한 없이 사용될 수 있다. 이의 예로서, 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant), 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide), BCG, IL-12, N-아세틸무라민-L-알라닐-D-이소글루타민(N-acetylmuramine-L-alanyl-D-isoglutamine), 티모신 알파1(thymosin α1) 및 QS-21가 예시될 수 있다. 상기 첨가되는 보조제의 양은 이의 투여 후 인간 또는 동물에서의 면역 반응의 일종으로서 나타나는 연화증(softening), 피부의 홍진(erythema), 열(fever), 두통(headache) 및 근육통(muscular pain)에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 본 발명의 백신(약학적 조성물)은 면역 반응-촉진 펩타이드 및 항박테리아제(합성 항박테리아제) 등과 같은 공공연히 알려진 약학적 물질과 함께 이용될 수 있다.
선택적인 약제 및 보조제는 백신(약학적 조성물)에 추가적으로 포함될 수 있다. 이의 예로서, 본 발명의 제조합 배큘로바이러스의 세포내 흡수를 돕는 칼슘 등의 약제가 예시될 수 있다. 리포좀 등의 약제 및 보조제, 및 용이한 형질도입을 만드는 플루오르카본 유화제(fluorocarbon emulsifier), 코클레이트(cochleate), 세관(tubule), 금 입자(golden particle), 생물분해성이 있는 마이크로스피어(biodegradable microsphere) 및 양이온성 중합체(cationic polymer) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)(제형)에 포함된 유효성분의 양은 특별히 제한되지 않고, 약학적으로 유효한 양이라면 넓은 범위로부터 선택될 수 있다. 백신(약학적 조성물)의 투여량은 특별히 제한되지 않고, 원하는 치료효과, 투여방법(투여경로), 치료기간, 환자의 나이 및 성별, 및 기타 조건에 의존하여 넓은 범위로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분인 재조합 배큘로바이러스가 인간에 투여될 때, 재조합 바이러스의 PFU의 대해서, 환자당 102 내지 1012 PFU, 바람직하게는 105 내지 1010 PFU 및 더 바람직하게는 106 내지 109 PFU의 재조합 배큘로바이러스가 투여된다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분인 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)의 투여량은 백신 숙주내로 도입되는 발현가능한 DNA의 양 또는 전사된 RNA의 양으로서 넓은 범위로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 국소 부위(예를 들어, 폐 조직 내, 간 내, 근육 내 및 뇌 내) 내로 벡터가 PBS(인산 완충 식염수) 또는 식염수에 현탁된 재조합 배큘로바이러스 현탁액을 직접 주사, 코 또는 공기를 통해 흡입, 또는 혈관[예를 들어, 동맥 내(intra-arterial), 정맥 내(intravenous) 및 문맥 내(in portal vein)] 투여함으로써 투여될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 초기 투여 및 추가적인 백신 투여 후 상태를 관찰함으로써 한 번이 아닌 한 번 내지 여러 번 투여되는 것이 바람직하다. 이는 원하는 효과를 증가시키기 위한 가능성을 야기한다. 상기 백신(약학적 조성물)을 투여한 후 본 발명의 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)로 구성된 약학적 조성물로 추가적으로 면역시키는 것이 가능하다. 또한, 혼합될 수 있는 상기 다양한 약제의 조합은 백신(약학적 조성물)의 투여에 의한 치료적 효과를 증가시키는 가능성이 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 실시예에 있어서, 본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분 중 하나인 재조합 배큘로바이러스가 원하는 면역성 외래 유전자와 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 유합시킴으로써 획득된 융합 유전자가 배큘로바이러스 DNA로 도입된 전달벡터의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스가 약학적으로 허용가능한 담체(투여되는 투여량 및 농도가 인간을 포함한 척추동물에 대한 비-독성이고, 제형에서 다른 성분과 양립할 수 있는)와 단위 투여량을 주입할 수 있는 형태로 제형될 수 있다. 예를 들어, 상기 제형은 바람직하게 재조합 배큘로바이러스에 대해 해로운 것으로 공공연히 알려진 항산화 및 기타 화합물을 포함하지 않는다.
상기 담체는 동일 성질 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질 등과 같은 보조제를 적은 양으로 적절하게 포함한다. 상기 물질은 투여되는 투여량 및 농도에 있어서 인간을 포함한 포유류에 대한 비-독성을 가지고, 이는 인산(phosphoric acid), 시트르산(citric acid), 숙신산(succinic acid), 아세트산(acetic acid) 및 기타 유기산 등의 완충용액 또는 이의 염, 및 아스코르브산(ascorbic acid) 등의 항산화제, 저분자량(예를 들어, 약 10개 이하의 잔기) 폴리펩타이드[예를 들어, 폴리알기닌(polyarginine) 또는 트리펩타이드(tripeptide)], 단백질[예를 들어, 혈청 알부민(serum albumin), 젤라틴(gelatin) 또는 면역글로불린(immunoglobulin)], 아미노산[예를 들어, 글라이신(glycine), 글루탐산(glutamic acid), 아스팔르트산(aspartic acid) 또는 알기닌(arginine)], 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물[셀룰로즈(cellulose) 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노오스(mannose) 또는 덱스트린(dextrin)를 포함], 킬레이트제(chelating agent)(예를 들어, EDTA), 당알콜(sugar alcohol)[예를 들어, 만니톨(mannitol) 또는 솔비톨(sorbitol)], 반대이온(counterion)(예를 들어, 나트륨), 및/또는 비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)[예를 들어, 폴리소르베이트(polysorbate), 폴록사머(poloxamer)]를 포함할 수 있다.
재조합 배큘로바이러스를 포함하는 약학적 백신(조성물)은 대표적으로 봉인된 앰풀(ampoule), 또는 수용액(aqueous solution) 또는 친액성물(lyophilized product)로의 물약병(vial) 등의 1회 또는 다수 투여 용기로 저장될 수 있다.
본 발명의 백신(조성물)을 포함하는 약학적 조성물은 환자 개개의 임상적 조건(예를 들어, 예방 또는 치료되는 조건), 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 백신(조성물)의 전달되는 부위, 표적 조직, 투여 방법, 섭생(regimen) 및 당업계에 공공연히 알려진 기타 요인을 고려하여 우수의료기준(Good Medical Practice)에 일치하는 형태로 투여된다. 그러므로, 본 발명의 백신(조성물)의 적절한 투여량은 상기 고려하에서 결정된다.
<효과>
본 발명에 따르면, 신규한 재조합 전달벡터, 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법이 제공된다. 본 발명의 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제들은 말라리아, 인플루엔자, 결핵 및 간염 등과 같은 감염성 질환, 암 및 자기면역(autoimmune) 질환에 대한 예방 또는 치료제, 또는 세포성 약(cellular medicine) 및 백신 제형으로 유용하게 이용될 수 있다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 효과(바이러스 감염성 농도)를 보여주는 그림이다.
도 2는 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1의 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 효과(생존기간)를 보여주는 그림이다.
도 3은 전달벡터로부터 인플루엔자 바이러스 HA 유전자(H1N1/HA1), M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) Hsp65 유전자(Hsp65) 또는 말라리아 기생충 CSP 유전자(PbCSP)를 생산하는 재조합 배큘로바이러스에 의해 감염된 곤충세포에서 상기 융합 산물의 발현을 웨스턴 블랏 분석(Western blotting analysis)한 결과를 보여주는 그림이다:
레인(Lane) 1: AcNPV-WT;
레인 2: AcNPV-Dual-H1N1/HA1;
레인 3: AcNPV-WT;
레인 4: AcNPV-Dual-Hsp65;
레인 5: AcNPV-WT; 및
레인 6: AcNPV-Dual-PbCSP.
도 4는 척추동물세포에서 재조합 전달벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스가 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) Hsp65 유전자 및 gp64 유전자의 융합 산물을 발현하는 것을 형광표지 염색한 결과를 보여주는 그림이다:
(A): AcNPV-Dual-Hsp65로 형질도입된 HepG2 세포들; 및
(B): AcNPV-WT로 형질도입된 HepG2 세포들.
도 5는 포유류 동물세포에서 재조합 전달벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스가 인플루엔자 HA 항원 유전자 및 gp64 유전자에 의해 암호화되는 융합 단백질을 발현하는 것을 면역침강(immunoprecipitation)에 의해 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 면역침강된 HepG2 세포는 재조합 배큘로바이러스에 도입되었다. HepG2 세포는 각각 AcNPV-WT로 형질도입(레인 1), AcNPV-CMV-H1N1/HA 전장(full)으로 형질도입(레인 2), 또는 AcNPV-Dual-H1N1/HA1으로 형질도입(레인 3)되었다. 상기 형질도입 3시간 후, 세포들은 12시간 동안 [35S] 메티오닌(methionine)으로 표지되었다. 세포 용해물은 H1N1 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스 유래 혈청으로 면역침강되었다.
도 6은 곤충세포에서 재조합 전달벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자에서 말라리아 기생충 CSP 유전자 및 gp64 유전자의 융합 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 분석한 결과를 보여주는 그림이다:
레인 1: AcNPV-WT;
레인 2: AcNPV-CMV-PbCSP;
레인 3: AcNPV-PbCSPsurf; 및
레인 4: AcNPV-Dual-PbCSP.
도 7은 척추동물 프로모터를 교환함으로써 획득된 HA1 항원 재조합 배큘로바이러스가 HeLa 세포에서 HA1 및 gp64의 융합 산물을 발현하는 것을 RT-PCR로 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 8은 재조합 배큘로바이러스로 접종된 마우스 유래 혈청에서 PbCSP 항원에 특이적인 IgG 항체의 생산을 보여주는 그림이다.
도 9는 재조합 배큘로바이러스로 접종된 마우스 유래 비장(spleen) 세포에서 PbCSP의 CTL 에피토프(epitope)에 대해 반응하는 INF-γ-생산 세포의 수를 보여주는 그림이다.
도 10은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-M2e에 의한 예방 효과(바이러스 감염성 적정농도(title))를 보여주는 그림이다.
도 11은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-CP-HA1/NC99에 의한 예방 효과(바이러스 감염성 적정농도)를 보여주는 그림이다.
도 12는 4가지 다른 경로를 통해 투여된 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1에 의해 유도된, 혈액 내에서 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 IgG 항체의 생산을 보여주는 그림이다.
도 13은 4가지 다른 경로를 통해 투여된 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1에 의해 유도된, 코 점막액(nasal wash) 및 폐포 점막액(alveolar wash) 내에서 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 IgG 항체 및 IgA 항체의 생산을 보여주는 그림이다.
도 14는 4가지 다른 경로를 통해 투여된 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1에 의해 비강(nasal cavity) 내에서 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 효과(바이러스 감염성 적정농도)를 보여주는 그림이다.
도 15는 4가지 다른 경로를 통해 투여된 재조합 배큘로바이러스 AcNPV-Dual-H1N1/HA1에 의해 폐내(intrapulmonary) 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 효과(바이러스 감염성 적정농도)를 보여주는 그림이다.
이하, 본 발명은 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예들은 단지 예시일뿐이며, 본 발명을 한정하지 않는다.
< 실시예 1> 본 발명의 전달벡터 플라스미드 및 이의 제조 방법
(1) 본 발명의 전달벡터 플라스미드 pTriEx - Hsp65 - gp64 의 제조
(1.1) 플라스미드 pBACsurf - CSP 의 제조
본 발명자들은 플라스모듐 베르게이(Plasmodium berghei) ANKA 종 유래 게놈 DNA, 쥐 Igk 분비의 신호서열 및 FLAG 서열을 Yoshida 등의 방법(Yoshida, S., et al., B.B.R.C., 271, 107-115, 2000)에 따라 융합시킨 서열을 포함하는 NheI-NotI 단편을 획득한 후, pcDNA3.1(Invitrogen으로부터 공급받음)의 NheI-NotI 부위에 상기 NheI-NotI 단편을 삽입함으로써 플라스미드 pcDNA-CS87을 제조하였다.
말라리아 기생충 플라스모듐 베르게이 ANKA로 감염된 BALB/c 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하였고, QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)를 이용하여 플라스모듐 베르게이 게놈 DNA를 추출하였다. 이어서, 상기 플라스모듐 베르게이 게놈 DNA를 프라이머 pbCSP1-F1: 5'-GGAGGGCTAGC ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGATCCACTGCAGGACTACAAGGACGTAGACAAGGGATATGGACAAAATAAAGCATCCAAGCCC-3'(서열번호: 1)(새롭게 만들어진 NheI 부위는 한 줄의 밑줄로 나타내었고, 쥐 Igk 분비의 신호서열은 이탤릭체로 나타내었으며, FLAG 서열은 굵은 글씨체로 나타내었다) 및 PbCSP-R1: 5'-GGAGGGCGGCCGCATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3'(서열번호: 2)(새롭게 만들어진 NheI 부위는 한 줄의 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR은 30 사이클(cycle)[30 초 동안 94℃에서 변성(denaturing), 1분 동안 55℃에서 어닐링(annealing) 및 2분 동안 72℃에서 연장(extending)]로 PfuDNA 폴리머라제(polymerase)(Stratagene로부터 공급받음)를 이용하여 수행되었다. 상기 PCR 산물은 글리코실 포스파티딜 이노시톨(glycosyl phosphatidyl inositol; GPI) 고정 부위(anchor)를 가지지 않으며, 기존의 신호서열을 대신해서 쥐 Igk 분비의 신호서열에 융합된 PbCSP를 암호화하였다.
상기 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 NheI/NotI로 절단한 다음, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen으로부터 공급받음)의 NheI/NotI 부위에 삽입함으로써, 그 결과물인 플라스미드인 pcDNA-CS87를 고안하였다. 상기 pcDNA-CS87 플라스미드는 CMV 프로모터, 쥐 Igk 분비의 신호서열, PbCSP 유전자에 의해 암호화되는 단백질(21 내지 299 아미노산에 대응하는), 소 성장 호르몬 유래 폴리 A 신호(poly A signal) 및 폴리 A 서열을 포함하였다.
PbCSP 유래 펩타이드의 21 내지 305 위치의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 단편은 제한효소 PstI 및 SmaI로 pcDNA-CS87를 절단함으로써 획득하였고, 상기 DNA 단편을 pBACsurf-1 (Novagen으로부터 공급받음)의 PstI 및 SmaI 부위 내로 삽입하여, pBACsurf-CSP로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.2) 플라스미드 pBACsurf - Hsp65 의 제조
QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)을 이용하여 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv 종으로부터 게놈 DNA를 추출하고, PCR로 클로닝함으로써 Hsp65 유전자를 획득하였다. 즉, M. 튜버쿨로시스 H37Rv 종으로부터 추출된 게놈 DNA를 프라이머, phsp65-F1:
5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3'(서열번호: 3)(BglII 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 phsp65-R1: 5'-AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3'(서열번호: 4) (NotI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
상기 PCR 산물을 정제한 후, 제한 효소 BglII/NotI로 절단한 다음, pCDNA-CS87에서 BamHI/NotI 부위에 연결하여, pcDNA-Ighsp65로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
상기 pcDNA-Ighsp65 플라스미드는 쥐 Igk 분비의 신호서열이 hsp65 유전자에 융합된 구조였다.
상기 PCR은 주형으로서 pcDNA-Ighsp65를, 프라이머로서 phsp65-F2: 5'-CACCCCTGCAGG ACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3'(서열번호: 5)(Sse8387I, EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었고, FLAG 서열은 이탤릭체로 나타내었다) 및 phsp65-R2: 5'-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3'(서열번호: 6)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다.
상기 결과물인 Hsp65 유전자 DNA 단편(약 1660 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen로부터 공급받음) 내로 클론시킨 후, Sse8387I/Cfr9I로 절단한 다 음, 상기 획득된 pBACsurf-CSP(Yoshida et al. Virology 316: 161-70, 2003)의 PstI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, pBACsurf-Hsp65로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.3) 플라스미드 pENTR - gp64 의 제조
상기 PCR은 주형으로서 pBACsurf-1(Novagen으로부터 공급받음)을, 프라이머로 pPolh-F2: 5'-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3'(서열번호: 7)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다), 및 pgp64-R2: 5'-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3'(서열번호: 8)(KpnI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 그 결과물인 gp64 유전자 DNA 단편(약 1700 bp)를 플라스미드 pENTR-gp64를 제조하기 위해 pENTR/D-TOPO 내로 삽입하였다.
그 결과, pENTR-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.4) 본 발명의 전달벡터인 pDual - Hsp65 - gp64 의 제조
pBACsurf-Hsp65를 PstI/Cfr9I로 절단한 후, hsp65 유전자 DNA 단편(약 1660 bp)을 pENTR-gp64의 PstI/Cfr9I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pENTR-hsp65-gp64를 제조하였다.
아울러, pENTR-hsp65-gp64를 RsrII/KpnI로 절단한 후, 다각체 프로모터(polyhedrin promoter) 및 hsp65-gp64 유전자로 구성되는 DNA 단편(약 3360 bp)을 pTriEx-3(Novagen으로부터 공급되는)의 RsrII/KpnI에 삽입하여, 원하는 이중 프로모터에 의해 발현이 조절되는 전달벡터 플라스미드 pDual-Hsp65-gp64를 제조하였다.
(2) 본 발명의 전달벡터인 pDual - PbCSP - gp64 의 제조
상기 (1.1.1)에서 획득된 플라스미드 pBACsurf-CSP를 PstI/Cfr9I로 절단한 후, PbCSP 유전자 DNA 단편(약 890 bp)을 pDual-Hsp65-gp64의 PstI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, 플라스미드 pDual-PbCSP-gp64를 제조하였다.
(3) 본 발명의 전달벡터인 pDual - H1N1 / HA1 - gp64 의 제조
QIAamp MiniElute Virus Spin Kit(QIAGEN)를 이용하여 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종으로 감염된 MDCK 세포의 배양 상청액으로부터 RNA를 추출된 후, 상기 RNA를 프라이머 HA-f: 5'-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3'(서열번호: 9)(SbfI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 HA-r: 5'-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3'(서열번호: 10)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용한 RT-PCR로 증폭시켰다. 상기 결과물인 전장 1700 bp을 가지는 인플루엔자 바이러스 HA 유전자 단편을 pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시켰다.
상기 결과, pCR-Blunt-HA로 고안된 플라스미드를 제조하였다. 상기 PCR은 주형으로서 pCR-Blunt-HA를, 프라이머로서 5'-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3'(서열번호: 11)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 pHA-R1: 5'-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3'(서열번호: 12)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 H1N1/HA1 유전자 DNA 단편(약 1000 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시킨 후, pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, 플라스미드 pDual-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(4) 본 발명의 전달벡터인 pDual - PbTRAMP - gp64 의 제조
말라리아 기생충(malaria parasite) 플라스모듐 베르게이(P. berghei) ANKA로 감염된 BALB/c 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하였고, QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)을 이용하여 플라스모듐 베르게이 게놈 DNA를 추출하였다.
PbTRAMP 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 이용한 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머 pTRAMP-F1: 5'-CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3'(서열번호: 13)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 pTRAMP-R1: 5'-CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3'(서열번호: 14)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 PbTRAMP DNA 단편(약 800 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론한 후, EcoRI/Cfr9I로 절단한 다음, pBACsurf-Hsp65의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pBACsurf-PbTRAMP로 고안된 플라스미드를 제조하였다. 이어서, 상기 pBACsurf-PbTRAMP를 EcoRI/Cfr9I로 절단한 후, PbTRAMP 유전자 DNA 단편(약 860 bp)을 pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pDual-PbTRAMP-gp64를 제조하였다.
(5) 본 발명의 전달벡터인 pDual - PbAMA1D123 - gp64 의 제조
말라리아 기생충 플라스모듐 베르게이(P. berghei) ANKA로 감염된 BALB/c 마우스로부터 혈액 샘플을 채취되었고, QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)을 이용하여 플라스모듐 베르게이 게놈 DNA를 추출하였다.
PbAMA1 유전자 도메인 123(D123) 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머 pAMA1-F1: 5'-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3'(서열번호: 15)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 pAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3'(서열번호: 16)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 PbAMA1D123 DNA 단편(약 1280 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen로부터 공급받음) 내로 공급한 후, EcoRI/Cfr9I로 절단한 다음, pBACsurf-Hsp65의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pBACsurf-PbAMA1D123로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
이어서, 상기 pBACsurf-PbAMA1D123를 EcoRI/Cfr9I로 절단한 후, PbAMA1D123 유전자 DNA 단편(약 1280 bp)을 상기 (1.4)에서 획득한 pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위 내에 삽입하여, 플라스미드 pDual-PbAMA1D123-gp64를 제조하였다.
(6) 본 발명의 전달벡터인 pDual-PbMSP119-gp64의 제조
말라리아 기생충 플라스모듐 베르게이(P. berghei) ANKA로 감염된 BALB/c 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하였고, QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)을 이용하여 플라스모듐 베르게이 게놈 DNA를 추출하였다.
PbMSP119 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머 pMsp1-F1: 5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3'(서열번호: 17)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다) and pMsp1-R1: 5 -CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3'(서열번호: 18)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 PbMSP119 DNA 단편(약 450 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen로부터 공급받음) 내로 공급한 후, PstI/Cfr9I로 절단한 다음, pBACsurf-Hsp65의 PstI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pBACsurf-PbMSP119로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
이어서, 상기 pBACsurf-PbMSP119를 PstI/Cfr9I로 절단한 후, PbMSP119 유전자 DNA 단편(약 450 bp)을 pDual-Hsp65-gp64의 PstI/Cfr9I 부위 내에 삽입하여, 플라스미드 pDual-PbMSP119-gp64를 제조하였다.
(7) 본 발명의 전달벡터인 pDual - PfCSP - gp64 의 제조
QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)를 이용하여 플라스모듐 원충 3D7 종으로 감염된 인간 적혈구(erythrocyte)로부터 원충 말라리아 기생충인 플라스모듐 원충(P. falciparum)의 게놈 DNA를 추출하였다. PfCSP 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머 pPfCSP-F1: 5'-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3'(서열번호: 19)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 pPfCSP-R1: 5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3'(서열번호: 20)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 PfCSP DNA 단편(약 1100 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시킨 후, EcoRI/Cfr9I로 절단한 다음, pDual-PbAMA1D123-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pDual-PfCSP-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(8) 본 발명의 전달벡터인 pDual - PfAMA1 - gp64 의 제조
QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)를 이용하여 플라스모듐 원충 3D7 종으로 감염된 인간 적혈구로부터 원충 말라리아 기생충인 플라스모듐 원충(P. falciparum)의 게놈 DNA를 추출하였다. PfAMA1 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머pPfAMA1-F1: 5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3'(서열번호: 21)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었고, FLAG 서열을 이탤릭체로 나타내었다) 및 pPfAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3'(서열번호: 22)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 PfAMA1 DNA 단편(약 3500 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시킨 후, PstI/Cfr9I로 절단한 다음, pDual-PbAMA1D123-gp64의 PstI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pDual-PfAMA1-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(9) 본 발명의 전달벡터인 pDual - Pfs25 - gp64 의 제조
QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)를 이용하여 플라스모듐 원충 3D7 종으로 감염된 인간 적혈구로부터 원충 말라리아 기생충인 플라스모듐 원충(P. falciparum)의 게놈 DNA를 추출하였다. Pfs25 유전자를 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR로 클론하였다. 즉, 상기 PCR은 프라이머 pPfs25-F1: 5'-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3'(서열번호: 23)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다), 및 pPfs25-R1: 5'-CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3'(서열번호: 24)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 Pfs25 DNA 단편(약 530 bp)을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시킨 후, EcoRI/Cfr9I로 절단한 다음, pDual-PbAMA1D123-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하였다. 그 결과, pDual-Pfs25-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(10) 본 발명의 전달벡터인 pDual - H5N1 / HA1 - gp64 의 제조
HA1 유전자를 조류 인플루엔자 바이러스(bird influenza virus) H5N1로부터 합성한 후, pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pDual-H5N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(11) 본 발명의 전달벡터인 pDual - SARS /S- gp64 의 제조
사스(SARS) 바이러스의 S 유전자를 합성한 후, pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pDual-SARS/S-gp64를 제조하였다.
(12) 본 발명의 전달벡터인 pCP - H1N1 / HA1 - gp64 의 제조
주형으로서 pCR-H1N1/HA1-gp64를, 프라이머로서 Polh-f RsrII(5'-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3'; 서열번호: 25)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 GP64-r DraIII(5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3'; 서열번호: 26)(DraIII 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 2700 bp의 DNA 단편을 제한 효소 RsrII 및 DraIII로 pDual-H1N1/HA1-gp64를 절단함으로써 획득된 벡터에 연결하여, pCP-H1N1/HA1-gp64을 제조하였다.
(13) 본 발명의 전달벡터인 pCAP - H1N1 / HA1 - gp64 의 제조
제한 효소 RsrII 및 DraIII로 절단하여 획득한 HA1과 gp64 유전자 단편을 제한 효소 RsrII 및 DraIII로 pTriEx-1.1(Novagen으로부터 공급받음)을 절단함으로써 획득한 벡터 내로 삽입하여, 플라스미드 pCAP-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(14) 본 발명의 전달벡터인 pCU - H1N1 / HA1 - gp64 의 제조
CMV 인핸서(enhancer) 부위를 증폭하기 위해, 주형으로서 pTriEx3.1을, 프라이머로서 CMVenh-f FseI(5'-GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3'; 서열번호: 27)(FseI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 CMVenh-r KpnI(5'-GGGGGTACCCATGGTAATAGCGATGACTAATACG-3'; 서열번호: 28)(KpnI 부위는 밑줄로 나타내었다)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한, UBB 프로모터 부위를 증폭하기 위해, 주형으로서 인간 게놈 DNA를, 프라이머로서 UBBp-f KpnI(5'-GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3'; 서열번호: 29)(KpnI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 UBBp-r RsrII(5'-GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3'; 서열번호: 30)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 두 단편을 제한효소 FseI 및 RsrII로 pCP-H1N1/HA1-gp64를 절단함으로써 획득된 벡터에 연결하여, pCU-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(15) 본 발명의 전달벡터인 pDual - H1N1 / NP - gp64 의 제조
주형으로서 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 유래 게놈 DNA를, 프라이머로서 NP-f EcoRI(5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3'; 서열번호: 31(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 NP-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3'; 서열번호: 32)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편을 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단한 후, 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단된 pDual-H1N1/HA1-gp64 내로 삽입하여, pDual-H1N1/NP-gp64를 제조하였다.
(16) 본 발명의 전달벡터인 pDual - H1N1 / M2 - gp64 의 제조
주형으로서 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 유래 게놈 DNA를, 프라이머로서 M2-f EcoRI(5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3'; 서열번호: 33)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 M2-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC-3'; 서열번호: 34)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편을 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단한 후, 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단된 pDual-H1N1/HA1-gp64 내로 삽입하여, pDual-H1N1/M2-gp64를 제조하였다.
(17) 본 발명의 전달벡터인 pDual - H1N1 / NAe - gp64 의 제조
주형으로서 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 유래 게놈 DNA를, 프라이머로서 NAe-f EcoRI(5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3'; 서열번호: 35)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 NAe-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3'; 서열번호: 36)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편을 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단한 후, 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단된 pDual-H1N1/HA1-gp64 내로 삽입하여, pDual-H1N1/NAe-gp64를 제조하였다.
(18) 본 발명의 전달벡터인 pDual - M2e - gp64 의 제조
주형으로서 pDual-H1N1/M2-gp64를, 프라이머로서 M2-f EcoRI(5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3'; 서열번호: 37)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 M2e-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA-3'; 서열번호: 38)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편을 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단한 후, 제한효소 EcoRI 및 Cfr9I로 절단된 pDual-H1N1/HA1-gp64 내로 삽입하여, pDual-M2e-gp64를 제조하였다.
(19) 본 발명의 전달벡터인 pCP - HA1 / NC99 - gp64 의 제조
HA1 유전자 단편을 증폭하기 위해, QIAamp MiniElute Virus Spin Kit(QIAGEN)를 이용하여 냉동 저장(frozen stock)의 인플루엔자 바이러스 NewCaledonia/20/99(NC99)로부터 RNA를 추출한 후, 프라이머로서 HA1-f EcoRI(5'-GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC-3'; 서열번호: 39)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 HA1-r Cfr9I(NC99)(5'-GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3'; 서열번호: 40)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편 및 pCP-H1N1/HA1-gp64를 제한 효소 EcoRI 및 Cfr9I로 처리하였다. pCP-H1N1/HA1-gp64의 HA1 도입 부위에 NC99로부터 유래된 HA1 유전자 단편을 새롭게 삽입하여, pCP-HA1/NC99-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(20) 본 발명의 전달벡터인 pCP - H1N1 / HA0 - gp64 의 제조
전장 HA 유전자를 증폭하기 위해, 주형으로서 pCR-Blunt-HA를, 프라이머로서 HA0-f EcoRI(5'-GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG-3'; 서열번호: 41)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 HA2-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3'; 서열번호: 42)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편 및 pCP-H1N1/HA1-gp64를 제한 효소 EcoRI 및 Cfr9I로 처리하였다. pCP-H1N1/HA1-gp64의 HA1 도입 부위에 HA0 유전자 단편을 새롭게 삽입하여, pCP-H1N1/HA0-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(21) 본 발명의 전달벡터인 pCP - H1N1 / HA2 - gp64 의 제조
HA 유전자의 HA2 부위를 증폭하기 위해, 주형으로서 pCR-Blunt-HA를, 프라이머로서 HA2-f EcoRI(5'-GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG-3'; 서열번호: 43)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 HA2-r Cfr9I(5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3'; 서열번호: 44)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편 및 pCP-H1N1/HA1-gp64를 제한 효소 EcoRI 및 Cfr9I로 처리하였다. pCP-H1N1/HA1-gp64의 HA1 도입 부위에 HA2 유전자 단편을 새롭게 삽입하여, pCP-H1N1/HA1-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(22) 본 발명의 전달벡터인 pCP - H1N1 / HA1 - vp39 의 제조
vp39 유전자 부위를 증폭하기 위해, 주형으로서 BacVector-2000 Transfection Kit(Novagen)에 부착된 배큘로바이러스 DNA를, 프라이머로서 vp39-f(5'-CTTACTAGTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCGGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3'; 서열번호: 45)(SpeI 부위는 한 줄의 밑줄로 나타내었고, EcoRI 부위는 굵은 글씨로 나타내었다) 및 vp39-r(5'-CTTCACTTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGCCCGGGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3'; 서열번호: 46)(DraIII 부위는 한 줄의 밑줄로 나타내었고, SmaI 부위는 굵은 글씨로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 증폭된 단편 및 pDual-H1N1/HA1-gp64를 제한 효소 SpeI 및 DraIII로 절단한 후 또 다른 것으로 연결하여, pDual-vp39를 제조하였다. 이어서, 주형으로서 pDual-H1N1/HA1-gp64을, 프라이머로서 Polh-S1(5'-GCTAACCATGTTCATGCC-3'; 서열번호: 47) 및 HA1-r EcoRI(5'-GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC-3'; 서열번호: 48)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편은 EcoRI로 절단하여, HA1 유전자를 제조하였다. 상기 결과물인 단편을 EcoRI로 절단한 pDual-vp39에 삽입하여, pCP-H1N1/HA1-vp39를 제조하였다.
(23) 본 발명의 전달벡터인 pCP - H1N1 / NP - vp39 의 제조
주형으로서 pDual-H1N1/NP-gp64을, 프라이머로서 NP-f5 EcoRI(5'-ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3'; 서열번호: 49)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 NP-r EcoRI(5'-ACGGAATTCATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3'; 서열번호: 50)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 단편을 EcoRI로 절단하였다. 상기 결과물인 단편을 EcoRI로 절단된 pDual-vp39에 삽입하여, pCP-H1N1/NP-vp39를 제조하였다.
< 참조예 1> pBACgus - CMV - PbCSP 의 제조
(1.1) pcDNA - GL3 ( luc )의 제조
본 발명자들은 pGL3-인핸서(Enhancer)(Promega)를 제한 효소 HindIII/XbaI로 절단한 후, 루시퍼라제 유전자 DNA 단편(약 1690 bp)을 pcDNA3.1(Invitrogen로부터 공급받음)의 HindIII/XbaI 부위에 연결하여, pcDNA-GL3(luc)로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.2) pBACgus - CMV - IgHsp65 의 제조
삭제
pcDNA-IgHsp65를 BglII/SphI로 절단한 후, CMV 프로모터, 쥐 Igk 신호서열을 전달하는 Hsp65 유전자, 및 소 성장 호르몬 유래 폴리 A 신호(poly A signal)로 구성되는 유전자 카세트(cassette)(약 2850 bp)를 pBACgus-1(Novagen)의 BglII/SphI 부위에 삽입하여, pBACgus-CMV-IgHsp65로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.3) pBACgus - CMV - GL3 의 제조
상기 획득된 플라스미드 pcDNA-GL3(luc)를 제한 효소 NheI/XbaI로 절단한 후, 루시퍼라제 유전자 DNA 단편(약 1690 bp)을 플라스미드 pBACgus-CMV-IgHsp65의 NheI/XbaI 부위에 삽입하여, pBACgus-CMV-GL3로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.4) pBACgus - CMV - PbCSP 의 제조
제한 효소 PstI 및 SmaI로 플라스미드 pBACsurf-CSP를 절단함으로써 PbCSP 펩타이드의 위치 21 내지 305에 대응하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 단편을 획득하였고, 상기 DNA 단편(약 850 bp)을 상기 획득한 pBACgus-CMV-GL3의 PstI 및 SmaI 부위에 삽입하여, pBACgus-CMV-PbCSP로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.5) pBACgus - CMV - HA - full 의 제조
pCR-Blunt-HA를 BamHI/Sse8387I로 절단한 후, HA 유전자 DNA 단편(약 1750 bp)을 pBluescript II(KS-)의 BamHI/PstI 부위에 삽입하여, pBluescript-HA를 제조하였다.
또한, 상기 pBluescript-HA를 HindIII/XbaI로 절단한 후, HA 유전자 DNA 단편(약 1800 bp)을 상기 (1.3)에서 획득한 pBACgus-CMV-GL3의 HindIII/XbaI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pBACgus-CMV-HA-full를 제조하였다.
< 실시예 2> 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 및 이의 제조 방법
(1) 재조합 배큘로바이러스 제조용 키트(Novagen으로부터 공급받은 BacVector-2000 Transfection Kit)를 이용하여 상기 <실시예 1>에서 제조한 pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39 및 pCP-H1N1/NP-vp39의 각각의 전달벡터와 상기 <참조예 1>에서 획득된 플라스미드, pBACgus-CMV-PbCSP 및 pBACgus-CMV-HA-full를 Sf-9 세포들 내로 공동-형질도입함으로써 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다.
상기 제조된 재조합 배큘로바이러스는 각각 AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-CMV-H1N1/HA-full, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 및 AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39로 고안되었다.
상기 Sf-9 세포들을 배양용 150 mm 플레이트(Akita Sumitomo Bakelite Co., Ltd.로부터 공급받음) 당 2 x 107 세포가 되도록 배양하였고, 상기 기재된 각각의 배큘로바이러스는 약 5 정도의 감염 다중도(infection multiplicity)로 감염시켰다. 약 5 내지 6일 후, 상청액을 채취하기 위해 상기 배지를 25분 동안 4℃에서 10,000 xg으로 원심분리하였고, 바이러스 입자를 얻기 위해 추가로 90분 동안 4℃에서 25,000 rpm으로 Beckman 초원심분리기(ultracentrifuge)[SW28 스윙 로터(swing rotor)]를 이용하여 원심분리하였다.
(2) 재조합 배큘로바이러스 제조용 키트(Novagen으로부터 공급받은 BacVector-2000 Transfection Kit)를 이용하여, BacVector-2000 DNA와 상기 <실시예 1>에서 제조된 pDual-H5N1/HA1-gp64 및 pDual-SARS/S-gp64인 각각의 전달벡터를 Sf-9 세포들 내로 공동-형질도입함으로써 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 배큘로바이러스를 각각 AcNPV-Dual-H5N1/HA1 및 AcNPV-Dual-SARS/S로 고안하였다.
상기 Sf-9 세포들을 배양용 150 mm 플레이트(Akita Sumitomo Bakelite Co., Ltd.로부터 공급받음) 당 2 x 107 세포가 되도록 배양하였고, 상기 기재된 각각의 배큘로바이러스를 약 5 정도의 감염다중도(infection multiplicity)로 감염시켰다. 약 5 내지 6일 후, 상청액을 채취하기 위해 상기 배지를 25분 동안 4℃에서 10,000 xg으로 원심분리하였고, 바이러스 입자를 얻기 위해 추가로 90분 동안 4℃에서 25,000 rpm으로 Beckman 초원심분리기(ultracentrifuge)[SW28 스윙 로터(swing rotor)]를 이용하여 원심분리하였다.
< 실시예 3> 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 약학적 효과 실험
(말라리아 백신에 대한 약학적 효과 실험)
(말라리아 감염 예방 효과)
3. 실험 방법
3.1 백신 접종
본 발명자들은 백신용 재조합 바이러스 용액을 3주 간격으로 3번 BALB/c 암컷 마우스에게 접종하였다. 대퇴(thigh) 근육 내로 주사한 경우, 투여량이 0.2 mL/body였고, 상기 바이러스 용액은 바이러스 양이 5 x 106 pfu/body가 되도록 제조하였다.
3.2 마우스의 말라리아 감염
각 마우스군을 마우스용 마취 용액으로 마취하였고, 3번의 백신을 접종한 3주 후에, 플라스모듐 베르게이(Plasmodium berghei) ANKA 2.34 클론으로 감염된 아노펠레스 스테펜시(Anopheles Stephensi) SDA 500 종이 상기 마우스들을 물게 함으로써 말라리아 감염시켰다.
3.3 각 군에서 마우스 생존율의 계산
말라리아로 감염시킨 후, 각 군의 사망 건수를 센 다음, 각 군에서 마우스의 생존율을 계산하였다.
3.4 본 발명의 약학적 조성물의 백신으로서 말라리아 감염 예방 효과
약리학적 효과 실험의 결과는 표 1에 나타내었다. 각 군의 생존율은 표 1의 오른쪽 종열에 나타내었다.
표 1에서 보는 바와 같이, 말초혈액(peripheral blood) 내에 말라리아로 감염된 적혈구가 확인된 전체 마우스는 감염 후 38일 이내에 사망하였다. 종충(sporozoite) 단계에서 항원(CSP) 유전자가 삽입된 재조합 바이러스 중, 실시예 2에서 획득한 전달벡터(AcNPV-Dual-PbCSP)를 포함하는 재조합 배큘로바이러스(실시예 1(2))가 접종된 군(4번 군)에서는, 100%의 감염 예방 효과가 관찰되었다.
야생형 배큘로바이러스(2번 군)에서는, 대조군(1번 군)과 차이가 관찰되지 않았다. 포유류 프로모터(AcNPV-CMV-PbCSP, 참조예 1의 벡터를 포함)를 이용한 실시예 2에서 획득한 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 군(3번 군)에서는, 대조군에 비해 조금 더 높은 생존율이 관찰되었고, 이는 약하지만 바이러스 접종에 의한 효과를 나타낸다는 가능성을 제시한다.
각 군의 마우스의 생존율
군 번호 생존 수/건 수 생존율(%)
1번 군(무) 5/20 25
2번 군(AcNPV-WT) 6/20 30
3번 군(AcNPV-CMV-PbCSP) 5/10 50
4번 군(AcNPV-Dual-PbCSP) 10/10 100
< 실시예 4> 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 약리학적 효과 실험
(인플루엔자 바이러스로서 약리학적 효과 실험)
(인플루엔자 바이러스 감염 예방 효과)
4. 실험 방법
4.1 백신
본 발명자들은 백신용 바이러스 용액을 2주 간격으로 2번 BALB/c 암컷 마우스에게 접종하였다. 상기 백신 바이러스를 인슐린 주사용 29G 주사기를 이용하여, 대퇴(thigh) 근육 내로 106.5 pfu/마우스로 주사하였다.
4.2 시험용 바이러스 용액의 제조
인플루엔자 바이러스로 감염시킬 때, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 종의 저장된 바이러스 용액을 실내온도에서 자연적으로 녹였다. 실험용 바이러스 용액을 제조하기 위해, 0.1% 살균 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함하는 둘베코 인산 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline; D-PBS)를 이용하여, 상기 녹인 바이러스 용액을 하기도(lower respiratory tract) 감염을 위해 1000 TCID50/0.05 mL로 희석하였고, 상기도(upper respiratory tract) 감염을 위해 1000 TCID50/0.005 mL로 희석하였다.
4.3 바이러스 용액의 비강내 접종
두 번째 백신 접종 2주 후에, 마우스를 0.5 mL의 마우스용 마취 용액을 근육내 투여에 의해 마취시켰다. 상기 4.2에서 제조한 인플루엔자 바이러스 용액을 상기도(upper respiratory tract) 감염을 위해 0.005 mL로, 또는 하기도(lower respiratory tract) 감염을 위해 0.05 mL로 마우스의 코에 접종하였다.
4.4. 폐의 샘플링
바이러스 접종 3일 후, 0.1 mL/미우스의 마우스용 마취 용액을 각 군에 4마리의 마우스에게 근육내로 투여하였고, 마취 하에 복대동맥(aorta abdominalis)으로 출혈시킴으로써 안락사시켰다. 이어서, 상기 마우스를 해부한 후, 폐를 무균적으로 적출하였다.
4.5 인플루엔자 바이러스의 접종 후 마우스의 생존율 기록
인플루엔자 바이러스의 접종 후 11일이 되는 날까지, 마우스의 생존율을 하루에 한번 확인 및 기록하였다.
4.6 폐 호모제네이트 ( homogenate ) 및 희석액의 제조
폐 호모제네이트를 3 mL의 0.1% BSA, 10 mM HEPES, 항생물질을 포함한 MEM(Minimum Essential Medium)(GIBCO)를 첨가한 후, 폴리트론 균질기(polytron homogenizer)를 이용함으로써 제조하였다. 상기 폐 호모제네이트를 저온배관(cryotube)에 분배한 후, 초저온 냉동기(ultralow temperature freezer)에서 저장하였다.
10배 또는 100.5배의 희석은 항생물질 및 트립신(SIGMA, T-4549, 2 ㎍/mL)이 첨가된 MEM 배지를 이용하여 제조되었다.
4.7 세포 성장을 위한 배지의 제조
세포 성장(MEM + 10% FBS)용 배지를 50 mL의 태아 소 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 첨가함으로써 제조한 후, 사용할 때까지 냉각 장치에 저장하였다.
4.8 개( canine ) 신장으로부터 유래된 MDCK ( Madin - Darby canine kidney )의 배양
냉동 및 저장된 MDCK 세포들을 온수에서 급속으로 녹인 후, 세포 성장용 10 mL의 배지에 현탁한 다음, 원심분리(1000 rpm, 5분, 4℃)함으로써 상청액을 제거하였다. 원심분리에 의해 채취된 세포 펠릿(pellet)을 세포 성장용 배지에 현탁하였다. 상기 세포는 배양 플라스크에 분주한 후, 37℃에서 5% CO2로 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 배양 개시 후에 세포의 형태 및 성장을 현미경으로 관찰하였고, MDCK 세포가 융합하기 직전에 상기 세포를 D-PBS(-)로 세척하였으며, 세포에 트립신 + EDTA를 처리하여 분산시킨 후, 세포 성장용 배지에 현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 배양 플라스크에 분주한 후, 세포 패시지(cell passage)를 제조하기 위해 새로운 세포 성장용 배지를 첨가하였다.
4.9 바이러스 성장용 배지의 제조(유지 배지)
0.1%의 BSA를 500 mL의 MEM(10 mM HEPES 완충용액을 첨가)에 첨가한 배지를 바이러스 성장(MEM + 0.1% BSA)용 배지로 하여, 사용할 때까지 냉각 장치에 저장하였다.
4.10 바이러스 감염성 적정농도( infectivity titer )의 측정(세포 변성 효과, CPE 방법)
배양 플라스크에서 MDCK 세포가 융합되기 직전에, 세포들을 분산시키기 위해 세포에 트립신 + EDTA를 처리한 후, 세포 수를 센 다음, 6 x 105 cells/mL의 MDCK 세포 현탁액을 유지 배지를 이용하여 제조하였다. 상기 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배한 후, 37℃에서 5% CO2로 CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.
그 다음날에, 상기 세포가 부착되었음을 확인한 후, 미리 제조한 각 폐 호모제네이트 희석액을 96-웰 플레이트에서 6 웰에 대해서 각 웰에 0.05 mL로 분배한 다음, 3일 동안 37℃에서 5% CO2로 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양 후 3일째 날에, 각 웰에 있는 세포가 변성되는지 확인한 후, 상기 세포를 고정 및 착색하기 위해 30% 포르말린-포함 클리스탈 바이올렛(formalin-containing crystal violet) 용액을 분배한 다음, 폐에서 바이러스의 감염성 적정농도를 Reed-Munch 방법에 의해 계산하였다.
4.11 마우스에서( in vivo ) 바이러스의 감염성 적정농도에 대한 각 백신의 효과
대조군(AcNPV-WT로 접종된) 및 실험군[실시예 1(3)에서 획득한 전달벡터인 AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 포함하는 재조합 배큘로바이러스, 및 참조예 1에서 획득한 전달벡터인 AcNPV-CMV-H1N1/HA full을 포함하는 재조합 배큘로바이러스]에서 쥐 폐 호모제네이트(murine lung homogenate)의 감염성 적정농도를 비교하였다. 각 바이러스 감염성 적정농도는 로그(logarithm)로 변환하였다. 각 군의 치료 효과는 다중도를 고려하여 터키 테스트(Tukey test)(Release 8.1, SAS Institute Japan Ltd)에 의해 분석되었다.
그 결과는 도 1에서 보여준다.
인플루엔자 바이러스의 감염 후 생존기간에 대한 각 백신의 효과
대조군(AcNPV-WT로 접종된) 및 백신 접종군(AcNPV-Dual-H1N1/HA1 또는 AcNPV-CMV-H1N1/HA full로 접종)에서 생존기간은 로그 랭크 테스트(log rank test)를 이용하여 비교하였고, 그 결과는 도 2에서 보여준다.
통계학적 분석은 SAS 시스템(SAS Institute Japan,R.8.1)을 이용하여 수행되었다. 유의 수준은 5%였다.
4.12 폐에서 바이러스의 감염성 적정농도
AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 근육 내로 접종한 군에서, 감염 6일 후 폐에서 바이러스의 감염성 적정농도는 대조군(AcNPV-WT로 접종)에 비해 유의성 있게 억제되었다(p=0.0009). 한편, AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 근육 내로 접종한 군에서, 감염 6일 후 폐에서 바이러스의 감염성 적정농도는 AcNPV-CMV-H1N1/HA full을 접종한 군에 비해 유의성 있게 억제되었다(p=0.0094).
4.13 생존기간
AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 근육 내로 접종한 군에서 생존기간은 대조군(AcNPV-WT로 접종)에 비해 유의성 있게 연장되었다(p=0.0031). 한편, AcNPV-CMV-H1N1/HA full을 근육 내로 접종한 군에서 생존기간은 AcNPV-CMV-H1N1/HA full을 근육 내로 접종한 군에서 생존기간은 대조군(AcNPV-WT로 접종)에 비해 유의성 있는 차이가 없었다(p=0.7851). AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 근육 내로 접종한 군에서 생존기간은 cNPV-CMV-H1N1/HA full을 근육 내로 접종한 군에 유의성 있게 연장되었다(p=0.0031).
상기 평가 시스템에 있어서, 마우스는 인플루엔자 바이러스 폐렴(pneumonia) 및 사망을 유발한다. 따라서, 근육 내로 AcNPV-Dual-H1N1/HA1을 접종함으로써 폐렴에 의한 마우스의 사망을 감소시키기는 것은 폐에서 바이러스의 성장이 억제되는 것으로 생각될 수 있다.
< 실시예 5> 곤충 세포에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 유래 백신 항원의 발현 실험
본 발명자들은 Sf-9 세포를 12-웰 플레이트에서 3 x 106 세포/웰로 배양하였고, 실시예 2에서 획득한 AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-Hsp65 또는 AcNPV-Dual-H1N1/HA1, 또는 대조군으로 야생형 배큘로바이러스인 AcNPV-WT의 배큘로바이러스 입자를 약 5정도의 감염 다중도로 감염시켰다. 3 내지 4일 후, 상기 배양 상청액을 제거한 후, 상기 플레이트를 PBS로 3번 세척한 다음, 2% 2-멀캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 래물리 용액(Leamuli solution)[트리스-염산염(Tris-hydrochloride) pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤(glycerol), 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)] 0.2 mL/웰을 세포를 완전히 용해하기 위해 첨가하였다. 샘플은 5분 동안 95℃로 끓인 후, SDS-PAGE에서 전기영동하였다. 상기 전기영동으로 단백질을 PVDF 막(Millipore로부터 공급받은 Immobilon-P)으로 이동시킨 후, 12시간 동안 4℃로 블락 에이스(block ace)(Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 공급받음)에 막을 담금으로써 블라킹하였다. 웨스턴 블랏(Western blotting)은 하기의 절차로 수행하였다. 각 배큘로바이러스로 감염된 Sf-9 세포 유래 단백질이 이동된 막을 1차 항체로서 마우스 항-FLAG 단클론 항체(Sigma로부터 공급받음)와 함께 배양한 다음, 2차 항체(Vector로부터 공급받음)로서 비오틴(biotin)-표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체와 함께 배양하였다. 추가로, 단백질의 밴드를 검출하기 위해, 아비딘(avidin)-표지된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)(GIBCO-BRL로부터 공급받음)를 추가하였고, NBT/BCIP(GIBCO-BRL로부터 공급받음)로 색을 현상하였다.
상기 결과는 도 3에서 보여준다.
도 3은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스 내 전달벡터로부터 인플루엔자 바이러스 HA 유전자, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) Hsp65 유전자(Hsp65) 또는 말라리아 기생충 CSP 유전자의 융합 항원의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 분석(Western blotting analysis)을 보여준다. 상기 도면에서, 1번 레인(lane)은 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT) 유래 밴드를 나타내고, 2번 레인은 인플루엔자 바이러스 HA 유전자가 본 발명의 이중 프로모터에 삽입된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1) 유래 밴드를 나타내고, 3번 레인은 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT) 유래 밴드를 나타내고, 4번 레인은 M. 튜버쿨로시스 Hsp65 유전자가 본 발명의 이중 프로모터에 삽입된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-Hsp65) 유래 밴드를 나타내고, 5번 레인은 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT) 유래 밴드를 나타내고, 6번 레인은 말라리아 기생충 CSP 유전자가 본 발명의 이중 프로모터 하에 삽입된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-PbCSP) 유래 밴드를 나타낸다.
상기 도면에서, 레인 2, 4 및 6에서 보는 바와 같이, 면역성 외래 항원 유전자와 gp64 유전자의 발현 융합 산물에 대응하는 밴드는 각 항원 유전자 및 gp64 유전자가 본 발명의 이중 프로모터 하에 융합 및 발현되는 재조합 배큘로바이러스에서 관찰되었다.
이로부터, 면역성 외래 항원 유전자와 gp64 유전자는 곤충 세포에서 융합 및 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6> 포유류에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 유래 백신 항원의 발현 실험
본 발명자들은 HepG2 세포를 약 1의 감염 다중도에서 AcNPV-Dual-Hsp65, 또는 대조군으로서 AcNPV-WT로 감염시켰다. 24시간 후, 배양 상청액을 제거하였고, 플레이트를 PBS로 세 번 세척하였으며, -20℃에서 냉각시킨 아세톤 에탄올 용액(7:3)을 첨가하여 5분 동안 -20℃에서 세포를 고정시켰다. 블라킹은 실내온도에서 5% 정상 염소 혈청(Sigma로부터 공급받음)을 추가함으로써 수행되었다. 연속적으로, 1차 항체로서 마우스 항-Hsp65 항체(Yoshida et al., Vaccine 2005)를, 그 다음 FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L)(BIOSOURCE)를 첨가한 후 배양하였다. 반응된 세포를 현광 현미경으로 검출하였다.
또한, HepG2 세포를 세포 배양용 100 mm 플레이트 당 1 x 107 세포를 배양한 후, 약 5의 감염 다중도에서 배큘로바이러스 입자, AcNPV-Dual-H1N1/HA1 또는 AcNPV-CMV-H1N1/HA full, 또는 대조군으로서 AcNPV-WT로 감염시켰다. 2시간 후, 배양 상청액을 제거하였고, 플레이트를 PBS로 세 번 세척한 후, 메치오닌(methionine) 및 시스테인(cysteine)을 포함하지 않은 배지(PBS 대신 투석된 10% FBS가 Dulbecco's Modified Eagle 배지에 첨가됨(Invitrogen))에서 배양하였다. 동위원소-표지 메치오닌 및 시스테인 용액(TRANS35S-LABEL MP Biomedicals, Inc.)을 최종 농도 5 mCi/mL로 첨가하였다. 12시간 후, 배양 상청액을 제거하였고, 플레이트를 PBS로 세 번 세척한 후, 상기 세포를 샘플로 만들기 위해 0.5 mL의 RIPA 완충용액(1% Sodium deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 10 mM Tris-HCl[pH 7.5])으로 세척하였다. 상기 샘플을 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스 유래 혈청이 미리 흡수된 단백질 A-세파로즈 CL-4B(Protein A-Sepharose CL-4B)(Pharmacia) 담체에 첨가한 후, 2시간 동안 냉장고에서 배양하였다. 상기 담체를 RIPA 완충용액으로 5번 세척한 후, 2% 2-멀캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 Leamuli 용액을 첨가하였고, 상기 샘플을 5분 동안 95℃에서 끓인 다음, 6% SDS-PAGE로 전기영동하였다. 상기 전기영동 후, 겔을 건조시킨 후, 항체와 반응한 단백질을 방사능 사진 촬영(autoradiography)으로 검출하였다.
상기 결과는 도 4 및 도 5에서 보여준다.
도 4(A)는 HepG2 세포에서 재조합 배큘로바이러스 내 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) Hsp65 유전자의 발현을 나타내는 형광 표지된 항체로 염색된 세포를 보여준다.
도 4(B)는 야생형 배큘로바이러스가 HepG2 세포에 첨가된 경우를 보여준다.
상기 도 4(A)로부터, 본 발명의 이중 프로모터를 가지는 전달벡터를 이용한 재조합 배큘로바이러스가 포유류 세포에서 목적 항원을 발현할 수 있음을 알 수 있다.
이는 본 발명의 재조합 전달벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스가 인간을 포함한 포유류에 투여될 때, 포유류 세포 내로 침입하고, 포유류 프로모터가 작동되며, 목적 외래 항원 유전자 및 gp64 유전자가 획득된 면역성을 유발하기 위해 포유류 세포 내에서 융합되는 것을 제시한다.
도 5는 인플루엔자 바이러스 HA 항원이 포유류 세포 내에서 이중 프로모터 하에 통합된 재조합 배큘로바이러스에서 융합 항원의 발현의 면역침강 분석을 보여준다. 상기 도면에서, 1번 레인은 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT)를 나타내고, 2번 레인은 인플루엔자 바이러스 HA 항원 유전자가 CMV 프로모터 하에 통합된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CMV-H1N1/HA full)를 나타내고, 3번 레인은 인플루엔자 바이러스 HA 항원 유전자가 gp64 유전자와 융합되고 이중 프로모터 하에 발현하도록 통합된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)를 나타낸다.
상기 인플루엔자 바이러스 HA 항원 유전자가 CMV 프로모터 하에 통합된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CMV-H1N1/HA full) 및 인플루엔자 바이러스 HA 항원 유전자가 gp64 유전자와 융합되고 이중 프로모터 하에 발현하도록 통합된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)에 있어서, HA 항원을 포함하는 단백질 등과 같은, 인플루엔자 바이러스로 감염된 혈청과 특이적으로 반응하는 단백질이 HepG2 세포에서 새롭게 합성되는 것을 알 수 있다.
이로부터, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스가 포유류 세포에서 각 원하는 면역성 외래 항원 유전자에 의해 암호화되는 항원 단백질을 발현하고, 상기 재조합 배큘로바이러스가 인간을 포함한 포유류에 투여되었을 때, 인간 세포에서 융합 유전자를 발현하고, 획득된 항원에 특이적인 면역성이 유발될 수 있는 것으로 생각된다.
< 실시예 7> 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자[비리온( virion )]에 존재하는 백신 항원 내 융합 항원의 동정 실험
본 발명자들은 초원심분리에 의해 채취된 배큘로바이러스 입자, AcNPV-WT, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-PbCSPsurf 또는 AcNPV-Dual-PbCSP의 각 0.005 mL 바이러스 농축 용액에, 0.005 mL Leamuli 용액(2x)을 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 끓인 후, 6% SDS-PAGE에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 상기 단백질들은 PVDF 막(Millipore로부터 공급받은 Immobilon-P)으로 이동되었고, 12시간 동안 4℃에서 블락 에이스(block ace)(Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 공급받음)에 막을 담금으로써 블라킹을 수행하였다. 하기의 절차에 따라 웨스턴 블랏을 수행하였다. 바이러스 입자 단백질이 이동된 막을 1차 항체로서 마우스 항-FLAG 단클론 항체(Sigma로부터 공급받음)와 배양한 다음, 2차 항체로서 비오틴(biotin)-표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체(Vector로부터 공급받음)와 배양하였다. 게다가, 아비딘(avidin)-표지 알칼리 포스파타아제(GIBCO-BRL로부터 공급받음)를 첨가한 후, 상기 단백질의 밴드를 검출하기 위해 NBT/BCIP(GIBCO-BRL로부터 공급받음)로 색을 현상하였다.
상기 결과는 도 6에서 보여준다.
도 6은 전달벡터로부터 제조된 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자에서 말라리아 CSP 유전자(PbCSP)의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 분석을 보여준다. 상기 도면에서, 1번 레인은 야생형 배큘로바이러스를 나타내고, 2번 레인은 PbCSP 항원 유전자가 포유류 프로모터의 조절 하에 삽입된 전달벡터로부터 제조된 재조합 배큘로바이러스를 나타내고, 3번 레인은 PbCSP 항원 유전자가 gp64 유전자와 융합하고 배큘로바이러스 다각체(polyhedrin) 프로모터의 조절 하에 발현하도록 삽입된 전달벡터로부터 제조된 재조합 배큘로바이러스를 나타내고, 4번 레인은 PbCSP 항원 유전자가 gp64 유전자와 융합하고 이중 프로모터의 조절 하에 발현하도록 삽입된 전달벡터로부터 제조된 재조합 배큘로바이러스를 나타낸다. 상기 배큘로바이러스를 전기영동한 후, 융합된 PbCSP 유전자 및 gp64 유전자의 발현 산물을 확인하였다.
AcNPV-PbCSPsurf 및 AcNPV-Dual-PbCSP에 관한, 3번 및 4번 레인에서 보는 바와 같이, 융합 항원의 존재를 나타내는 강한 밴드가 재조합 바이러스 입자에서 확인되었다.
이와 같이 <실시예 7>로부터, 본 발명의 재조합 전달벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스에서, 원하는 면역성 외래 유전자에 융합된 gp64 유전자의 발현 산물이 재조합 바이러스 입자에 존재할 수 있는 것을 알 수 있다.
< 실시예 8> 프로모터의 교환에 의해 지속된 유전자 발현
1) 프로모터의 교환에 의해 지속된 유전자 발현
본 발명자들은 재조합 바이러스가 배양된 세포에서 항원 발현을 유지하는지를 확인하기 위해, HeLa 세포를 AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 또는 AcNPV-CU-H1N1/HA1로 감염시킨 후, 항원 발현을 확인하였다. 상기 세포를 24-웰 플레이트에서 1.0 x 104 cells/well로 접종한 후, 상기 바이러스를 MOI=10, 20, 100으로 감염시킨 다음, 1시간 동안 부착시켰다. 연속으로, 상기 바이러스를 세포 배양 상청액으로부터 제거한 후, 상기 세포를 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 세포를 시간마다 채취한 후, RNA를 추출하였다. RT-PCR을 주형으로서 상기 추출된 RNA를, 프라이머로서 HA1_F01[5'-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3'(서열번호: 51)] 및 HA1_R01[5'-GGGTGATGAATACCCCACAG-3'(서열번호: 52)]를 사용하여 수행하였다.
그 결과, 상기 발현은 모두 3가지 형태로 확인되었고, CMV 프로모터가 본 발명의 재조합 배큘로바이러스와 관련된 또 다른 진핵(eukaryotic) 프로모터로 변환될 수 있는 것을 확인하였다.
도 7은 RT-PCR에 의해 HeLa 세포에서 유전자 발현을 검출한 결과를 보여준다. M은 전기영동을 위한 DNA 마커를 나타낸다. 샘플은 하기와 같다:
1. 야생형 바이러스를 MOI=10으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
2. 야생형 바이러스를 MOI=20으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
3. 야생형 바이러스를 MOI=100으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
4. AcNPV-CP-H1N1/HA1를 MOI=10으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
5. AcNPV-CP-H1N1/HA1를 MOI=20으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
6. AcNPV-CP-H1N1/HA1를 MOI=100으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
7. AcNPV-CU-H1N1/HA1를 MOI=10으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
8. AcNPV-CU-H1N1/HA1를 MOI=20으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
9. AcNPV-CU-H1N1/HA1를 MOI=100으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
10. AcNPV-CAP-H1N1/HA1를 MOI=10으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
11. AcNPV-CAP-H1N1/HA1를 MOI=20으로 감염시킨 세포 유래 RNA; 및
12. AcNPV-CAP-H1N1/HA1를 MOI=100으로 감염시킨 세포 유래 RNA;
상기 샘플을 상기 감염 후 0시간, 1일, 4일 및 7일에 채취한 후, RT-PCR로 증폭한 다음, 상기 증폭된 DNA를 전기영동하였다.
< 실시예 9> PbCSP 항원 재조합 바이러스에 의해 유도된 항체의 적정농도 및 세포성 면역
1. 백신 접종
본 발명자들은 백신용 재조합 바이러스 용액을 3주 간격으로 세 번 BALB/c 암컷 마우스에게 접종하였다. 접종량은 대퇴 근육에 근육내 주사를 위한 1 x 108 pfu/body의 바이러스 양에 대응하여 0.2 mL/body를 조제하였다. 야생형 바이러스(AcNPV-WT), AcNPV-PbCSPsurf(Yoshida et al. Virology 316: 161-70, 2003) 또는 AcNPV-Dual-PbCSP를 백신으로 주사하였다.
2. 마우스의 해부
마지막 면역 후 3주째에 마우스를 안락사하였고, 상기 마우스로부터 혈청 및 비장을 적출하였다. 상기 혈청을 특이적 항체 적정농도를 측정하기 위해 사용하였고, 상기 비장은 ELISPOT 분석을 위해 사용되었다.
3. 항체 적정농도의 측정
항체 적정농도를 대장균(Escherichia coli)에서 인위적으로 발현시킨 후, 정제/회복시킨 PbCSP 재조합 단백질을 고정시킨 플레이트를 이용한 ELISA로 측정하였다. 상기 ELISA를 표준 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 바이러스를 접종하지 않았거나 야생형 바이러스를 접종한 군에서 항체 적정농도의 증가가 없는 반면에, AcNPV-PbCSPsurf를 접종하거나 AcNPV-Dual-PbCSP를 접종한 군에서 특이적 항체 적정농도의 증가가 확인되었다.
도 8은 비접종군, 야생형 바이러스 접종군, AcNPV-PbCSPsurf 접종군 및 AcNPV-Dual-PbCSP 접종군에서 PbCSP에 특이적인 IgG 항체의 적정농도를 보여준다.
4. ELISPOT 분석을 이용한 세포성 면역의 평가
ELISPOT 분석을 면역된 마우스 유래 비장 세포를 이용하여 수행하였다. 상기 마우스 유래 비장 세포를 준비한 후, 적절한 수의 상기 세포를 MultiScreen-IP(Millipore)에 첨가하였다. 이에 PbCSP의 CD8 에피토프(epitope)로 알려진 펩티드(아미노산 서열: SYIPSAEKI; 서열번호: 53)를 첨가한 후, 밤새 배양하였다. 이어서, ELISPOT Mouse IFN-γ ELISPOT Set(BD Sciences)를 이용하여 반응을 수행하였고, AEC substrate set(BD Sciences)를 이용하여 색을 현상하였다. 항원에 특이적으로 반응하는 세포수를 색채화된 점(colored spot)을 측정하여 확인하였다. 그 결과, 비-바이러스, 야생형 바이러스 또는 AcNPV-PbCSPsurf를 접종한 군에서는 항원 특이적인 세포가 확인되지 않은 반면에, AcNPV-Dual-PbCSP를 접종한 군에서는 106 비장 세포당 약 350개의 반응된 세포가 확인되었다. 이는 AcNPV-Dual-PbCSP가 AcNPV-PbCSPsurf 보다 더 유의성 있게 세포성 면역을 유도할 수 있음을 보여준다.
도 9는 비-접종군, 야생형 바이러스 접종군, AcNPV-PbCSPsurf 접종군 및 AcNPV-Dual-PbCSP 접종군에서 PbCSP의 CTL 에피토프(epitope)에 대해 특이적인 INF-γ-생산 세포의 수를 보여준다.
< 실시예 10> 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신의 항-바이러스 효과를 확인하는 실험
( M2e 재조합 배큘로바이러스의 효과를 확인하는 실험)
본 발명자들은 M2e 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-M2e)를 마우스당 3.4 x 108 PFU의 양으로 2주 간격으로 두 번 대퇴 근육에 접종하였다. 상기 마우스를 마지막 백신 접종 2주 후에, 1000 TCID50의 바이러스를 포함하는 0.005 mL 용액을 비강분무(intranasally)로 접종하여 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시켰다. 상기 감염 후 6일째에, 상기 마우스를 안락사시킨 후, 폐를 적출한 다음, MDCK 세포를 이용하여 상기 폐에 있는 바이러스의 양을 검출하였다. 그 결과, 인플루엔자 바이러스는 AcNPV-Dual-M2e로 접종된 모든 마우스에서 검출되지 않았다. 역시, 이는 HA1 재조합 배큘로바이러스 백신(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)(마우스당 1.0 x 107 PFU)를 대퇴 근육내에 접종한 군에서와 동일한 효과였다.
도 10은 PBS 군, AcNPV-Dual-M2e 접종군 및 AcNPV-Dual-H1N1/HA1 접종군에서 인플루엔자 바이러스로 감염된 6일 후 폐내 바이러스의 양을 보여준다.
< 실시예 11> HA1 / NC99 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 예방 효과를 확인하는 연구
본 발명자들은 HA1/NC99 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CP-HA1/NC99)를 마우스당 1.0 x 108 PFU의 양으로 2주 간격으로 두 번, 대퇴 근육에 접종하였다. 상기 마우스를 마지막 백신 접종 2주 후에, 1000 TCID50의 바이러스를 포함하는 0.05 mL 용액을 비강(nasal cavity)내에 접종하여 인플루엔자 바이러스 A/NewCaledonia/20/99로 감염시켰다. 상기 감염 후 3일째에, 상기 마우스를 안락사시킨 후, 폐를 적출한 다음, MDCK 세포를 이용하여 상기 폐에 있는 바이러스의 양을 검출하였다. 그 결과, 인플루엔자 바이러스는 AcNPV-CP-H1N1/NC99로 접종된 4마리의 마우스 중 3마리에서 검출되지 않았다.
도 11은 PBS 군, 야생형 바이러스(AcNPV-WT) 접종군 및 AcNPV-CP-HA1/NC99 접종군에서 인플루엔자 바이러스로 감염된 3일 후 폐내 바이러스의 양을 보여준다.
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< 실시예 12> 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여 경로에 의존하는 특이적인 항체를 확인하는 연구
본 발명자들은 HA1 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)를 코에 점적약(nasal drop)으로 0.005 mL의 바이러스 용액을 접종, 코에 주사(rhinovaccination)로 0.05 mL의 바이러스 용액을 접종, 기도(respiratory tract)를 통하여 0.05 mL의 바이러스 용액을 접종, 및 대퇴 근육에 근육 주사(muscular injection)를 통하여 0.05 mL의 바이러스 용액을 접종함으로써, 마우스당 2.0 x 107 PFU의 양으로 2주 간격으로 두 번 접종하였다.
마지막 접종 2주 후, 코 점막액(nasal wash), 폐포 점막액(alveolar wash) 및 혈청을 채취한 다음, 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 항체의 발현을 확인하였다. 항체 적정농도를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염된 MDCK 세포의 추출물이 고정된 플레이트를 이용한 ELISA로 측정하였다. 상기 ELISA를 표준 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 특이적인 IgG 항체는 코 주사(rhinovaccination) 군, 기관내 주사(intratracheal vaccination) 군 및 근육내 주사(intramuscular vaccination) 군에서 확인되었다. 특히, 상기 항체는 기관내 주사군에서 강하게 유도되는 것이 확인되었다. 유사하게, 항원 특이적인 IgG 항체는 코 점막액 및 폐포 점막액에서 확인되었고, 특히 상기 항체는 기관내 주사군에서 강하게 유도되는 것이 확인되었다. 게다가, 기관내 주사군에서, 항원 특이적인 IgA의 생산이 폐포 점막액에서 확인되었다.
도 12는 코 점적약 투여군, 코 주사 투여군, 기관내 주사 투여군 및 근육내 주사 투여군에서 혈액 내 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 IgG 항체를 측정한 ELISA의 결과를 보여준다.
도 13은 코 점적약 투여군, 코 주사 투여군, 기관내 주사 투여군 및 근육내 주사 투여군에서 코 점막액 및 폐포 점막액 내 인플루엔자 바이러스에 대한 특이적인 IgG 및 IgA 항체를 측정한 ELISA의 결과를 보여준다.
< 실시예 13> 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여 경로에 따른 효과를 확인하는 연구
본 발명자들은 HA1 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)를 코 점적약, 코 주사, 기도를 통해 또는 근육내 주사의 경로에 의해 마우스당 2.0 x 107 PFU의 양으로 2주 간격으로 두 번 접종하였다. 마지막 접종 2주 후, 상기 마우스를 1000TCID50의 바이러스를 포함하는 0.05 mL 용액을 비강(nasal cavity)내에 접종하여 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시켰다. 상기 감염 후 3일째에 코 점막액을 채취하였고, 감염 후 6일째에 폐를 적출한 다음 MDCK 세포를 이용하여 폐내 바이러스 양을 검출하였다. 그 결과, 감염 3일 후 비강내 바이러스 양은 코 주사 투여군 및 기관내 투여군에서 현저하게 줄었다. 게다가, 기관내 투여군에서, 감염 6일 후 폐내 바이러스 양은 근육내 주사군에 비해 유사 또는 더 낮게 검출되었다.
도 14는 코 점적약 투여군, 코 주사 투여군, 기관내 주사 투여군 및 근육내 주사 투여군에서 인플루엔자 바이러스감염 3일 후 코 점막액내 바이러스 양을 보여준다.
도 15는 코 점적약 투여군, 코 주사 투여군, 기관내 주사 투여군 및 근육내 주사 투여군에서 인플루엔자 바이러스감염 6일 후 폐내 바이러스 양을 보여준다.
<서열목록 프리텍스트 >
서열번호 1 및 2는 플라스모듐 베르게이(Plasmodium berghei) ANKA 종 유래 게놈 DNA의 PCR용 프라이머 PbCSP-F 및 PbCSP-R1의 서열이다.
서열번호 3 및 4는 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv 유래 게놈 DNA의 PCR용 프라이머 phsp65-F1 및 phsp65-R1의 서열이다.
서열번호 5 및 6은 pcDNA-IgHsp65를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 phsp65-F2 및phsp65-R2의 서열이다.
서열번호 7 및 8은 gp64 유전자 DNA 단편을 획득하기 위한, pBACsurf-1(Novagen으로부터 공급받음)을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pPolh-F2 및 pgp64-R2의 서열이다.
서열번호 9 및 10은 인플루엔자 바이러스 HA 유전자 단편을 생산하기 위한, PCR용 프라이머 HA-f 및 HA-r의 서열이다.
서열번호 11 및 12는 pCR-Blunt-HA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pHA-F1 및 pHA-R1의 서열이다.
서열번호 13 및 14는 PbTRAMP 유전자의 PCR용 프라이머 pTRAMP-F1 및 pTRAMP-R1의 서열이다.
서열번호 15 및 16은 PbAMA1 유전자 도메인 123(D123)의 PCR용 프라이머 pAMA1-F1 및 pAMA1-R1의 서열이다.
서열번호 17 및 18은 PbMSP119 유전자의 PCR용 프라이머 pMsp1-F1 및 pMsp1-R1의 서열이다.
서열번호 19 및 20은 PfCSP 유전자의 PCR용 프라이머 pPfCSP-F1 및 pPfCSP-R1의 서열이다.
서열번호 21 및 22는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum) 3D7 유래 PfAMA1 유전자의 PCR용 프라이머 pPfAMA1-F1 및 pPfAMA1-R1의 서열이다.
서열번호 23 및 24는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum) 유래 Pfs25 유전자의 PCR용 프라이머 pPfs25-F1 및 pPfs25-R1의 서열이다.
서열번호 25 및 26은 pDual-H1N1/HA-gp64를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 Polh-f RsrII and GP64-r DraIII의 서열이다.
서열번호 27 및 28은 CMV 인핸서 부위(enhancer region)의 PCR용 프라이머 CMVenh-f FseI 및 CMVenh-r KpnI의 서열이다.
서열번호 29 및 30은 UBB 프로모터 부위(promoter region)의 PCR용 프라이머 UBBp-f KpnI 및 UBBp-r RsrII의 서열이다.
서열번호 31 및 32는 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종 유래 게놈 DNA의 RT-PCR용 프라이머 NP-f EcoRI 및 NP-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 33 및 34는 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종 유래 게놈 DNA의 RT-PCR용 프라이머 M2-f EcoRI 및 M2-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 35 및 36은 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종 유래 게놈 DNA의 RT-PCR용 프라이머 NAe-f EcoRI 및 NAe-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 37 및 38은 pDual-H1N1/M2-gp64를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 M2-f EcoRI 및 M2e-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 39 및 40은 NewCaledonia/20/99(NC99) 유래 게놈 DNA의 RT-PCR용 프라이머 HA1-f EcoRI 및 HA1-r Cfr9I(NC99)의 서열이다.
서열번호 41 및 42는 pCR-Blunt-HA을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 HA0-f EcoRI 및 HA2-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 43 및 44는 pCR-Blunt-HA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 HA2-f EcoRI 및 HA2-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 45 및 46은 vp39 유전자 부위의 PCR용 프라이머 vp39-f 및 vp39-r의 서열이다.
서열번호 47 및 48은 HA1 유전자 단편의 PCR용 프라이머 Polh-S1 및 HA1-r EcoRI의 서열이다.
서열번호 49 및 50은 pDual-H1N1/NP-gp64를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 NP-f 5 EcoRI 및 NP-r EcoRI의 서열이다.
서열번호 51 및 52는 AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 및 AcNPV-CU-H1N1/HA1의 발현 검출용 프라이머의 서열이다.
서열번호 53은 PbCSP의 CD8 에피토프(epitope)로 알려진 폴리펩티드이다.
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<212> DNA <213> primer <400> 6 cccgggcgaa atccatgcca cccatgtcgc cgccacc 37 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> primer <400> 7 cacccggacc ggataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataag 48 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 8 ggtaccatat tgtctattac ggtttctaat catac 35 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 9 cctgcaggta tgaaggcaaa cctactggtc 30 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 10 gcccgggcga tgcatattct gca 23 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> primer <400> 11 caccgaattc gacacaatat gtataggcta ccatgcg 37 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 12 cccgggcacc tctggattgg atggacggaa tg 32 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 13 caccgaattc aaaattgata cgaaaaaaaa tgaag 35 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 14 cccgggcttt taattttgag gagtctttat tttc 34 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> primer <400> 15 caccgaattc aatccatggg aaaagtatac ggaaaaatat 40 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> primer <400> 16 cccgggcttc tctggtttga tgggctttca tatgcac 37 <210> 17 <211> 75 <212> DNA <213> primer <400> 17 caccctgcag gactacaagg acgacgatga caagcacata gcctcaatag ctttaaataa 60 cttaaataaa tctgg 75 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> primer <400> 18 cccgggttcc cataaagctg gaagagctac agaatacacc 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> primer <400> 19 caccgaattc ttattccagg aataccagtg ctatggaagt 40 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 20 cccgggcttt ttccatttta caaatttttt tttc 34 <210> 21 <211> 73 <212> DNA <213> primer <400> 21 caccctgcag gactacaagg acgacgatga caagcagaat tattgggaac atccatatca 60 aaatagtgat gtg 73 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 22 cccgggcttt cattttatca taagttggtt tatg 34 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> primer <400> 23 caccgaattc aaagttaccg tggatactgt atgcaaaaga gga 43 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 24 cccgggcagt acatatagag ctttcattat ctat 34 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 25 gggcggaccg gataattaaa atgataacca tctcg 35 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> primer <400> 26 gggcacttag tgatattgtc tattacggtt tctaatc 37 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> primer <400> 27 gggggccggc cctagttatt aatagtaatc aattac 36 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 28 gggggtaccc atggtaatag cgatgactaa tacg 34 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 29 gggggtacct cgaggaaggt ttcttcaact c 31 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> primer <400> 30 gggcggtccg gacctagttt aaaagtaaaa cataag 36 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 31 acggaattcc attcaattca aactgga 27 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 32 gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a 31 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 33 cggaattcat gagtcttcta accgagg 27 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 34 gatcccgggc ctccagctct atgctgac 28 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 35 acggaattcc attcaattca aactgga 27 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 36 gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a 31 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 37 cggaattcat gagtcttcta accgagg 27 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 38 gatcccgggc atcacttgaa ccgttgca 28 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 39 gatgaattcg acacaatatg tataggctac c 31 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 40 gatcccgggc tctggattga atggatggga tg 32 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 41 ggggaattca tgaaggcaaa cctactgg 28 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 42 gatcccgggc gatgcatatt ctgca 25 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 43 gatgaattca tatttggagc cattgccg 28 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 44 gatcccgggc gatgcatatt ctgca 25 <210> 45 <211> 75 <212> DNA <213> primer <400> 45 cttactagta tggactacaa ggacgacgat gacaaggaat tcggcggcgg cggctcggcg 60 ctagtgcccg tgggt 75 <210> 46 <211> 66 <212> DNA <213> primer <400> 46 cttcacttag tgatggtgat gatggtggtg cccggggctt taaagcttga cggctattcc 60 tccacc 66 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 47 gctaaccatg ttcatgcc 18 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 48 ggggaattca cctctggatt ggatggac 28 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 49 acggaattca tggcgtccca aggcacc 27 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 50 acggaattca ttgtcgtact cctctgcatt g 31 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 51 gagctgaggg agcaattgag 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 52 gggtgatgaa taccccacag 20 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 epitope of PbCSP <400> 53 Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile 1 5

Claims (31)

  1. 하기의 융합 DNA 서열을 갖는 DNA 서열 구조를 포함하고, 서로 연결된 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter) 및 CMV 프로모터를 포함하는 듀얼(dual) 프로모터에 의해 조절되는 재조합 AcNPV(Autographa californica nucleopolyhedrosis virus)를 유효성분으로 포함하는 말라리아 백신으로 사용하기 위한 약학적 조성물:
    (A) 말라리아 기생충인 플라스모듐 원충(P. falciparum) 3D7 균주의 PfCSP를 암호화하는 DNA 서열, 및
    (B) 바이러스 입자(particle)의 요소가 될 수 있는 배큘로바이러스 gp64 단백질의 아미노산을 암호화하는 진뱅크 등록번호(GenBank Accession No.) L22858의 DNA 서열.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (A)의 DNA 단편은 말라리아 기생충인 플라스모듐 원충(P. falciparum) 3D7 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 수득할 수 있고, 그 후에 EcoRI 및 Cfr9I으로 절단; 및
    상기 (B)의 DNA 단편은 pBACsurf-1을 주형으로 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 수득할 수 있고, 그 후에 RsrII 및 KpnI으로 절단한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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