KR101453796B1 - Nano-micro hybridfiber-based cell culture construct and assay chip comprising the same - Google Patents

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곽종영
정영훈
김창근
진송완
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Abstract

The present invention relates to a nano-micro hybrid fiber-based three-dimensional cell culturing structure and an assay chip including the same. More specifically, the present invention relates to a nano-micro hybrid fiber-based cell culturing structure, an assay chip including the same, and a method for analyzing cells using the assay chip, wherein the cell culturing structure includes a cell culturing support for adhering and culturing one or more cells, and the support is formed in a three-dimensional mat shape made of hybrid fibers of nano fibers and micro fibers, so that the cells are permeated and adhered in the support. The nano-micro hybrid fiber-based cell culturing structure according to the present invention can simultaneously and three-dimensionally culture one or more cells. Accordingly, the cell culturing structure according to the present invention can be used as an assay chip which can measure and analyze the permeation and adhesion of the cells, the shape of the cells, the connection between the cells, or the movement between the cells. Moreover, using the assay chip according to the present invention, the interaction and bonding of various immunity cells and disease cells can be measured in real time, so that the cells can be three-dimensionally analyzed in real time.

Description

나노-마이크로 하이브리드섬유 기반 세포배양 구조체 및 이를 포함하는 에세이칩{NANO-MICRO HYBRIDFIBER-BASED CELL CULTURE CONSTRUCT AND ASSAY CHIP COMPRISING THE SAME}NANO-MICRO HYBRIDFIBER-BASED CELL CULTURE CONSTRUCT AND ASSAY CHIP COMPRISING THE SAME <br> <br> <br> Patents - stay tuned to the technology NANO-MICRO HYBRIDFIBER-BASED CELL CULTURE CONSTRUCT AND ASSAY CHIP COMPRISING THE SAME

본 발명은 나노-마이크로 하이브리드섬유 기반 3차원 세포배양 구조체와, 이를 포함하는 에세이 칩에 관한 것으로, 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상으로 이루어지는 세포배양 지지체를 포함함으로써, 1종 이상의 세포가 상기 지지체 내로 침윤·부착시켜 배양 가능한 세포 배양 구조체와 이를 포함하는 에세이 칩, 상기 에세이칩의 제조방법 및 상기 에세이칩을 이용한 세포분석방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nano-microhybrid fiber-based three-dimensional cell culture construct and an essay chip comprising the same, and includes a cell culture support having a three-dimensional structure formed of hybrid fibers of nanofiber- , A cell culture construct capable of culturing at least one cell by infiltrating or adhering into the support, an assay chip containing the same, a method of producing the assay chip, and a cell analysis method using the assay chip.

면역세포는 외부항원을 인식하는 역할을 수행할 뿐만 아니라, 질환세포의 종양항원을 인식하는 중요한 역할도 한다. 현재까지 주로 연구된 면역반응은 외부 항원에 의해 유발되는 면역반응에 관한 것이지만, 최근 질환세포에 의해서도 강력한 면역반응이 유발되며 그 중요성이 매우 크다는 사실이 인식되고 있다. 또한, 질환세포가 면역세포에는 어떠한 영향을 주는가를 측정할 필요가 있게 되었다.Immune cells play an important role not only in recognizing external antigens but also in recognizing tumor antigens in disease cells. Although the immune responses that have been mainly studied so far are related to the immune responses induced by external antigens, it is recognized that recently immune responses are also induced by disease cells and their importance is very high. In addition, it has become necessary to measure how disease cells affect immune cells.

그러나 아직까지는 이러한 질환세포에 의해 유도되는 면역세포의 반응을 측정하기 위한 효율적인 시스템의 개발이 되어 있지 않을 뿐 만 아니라, 세포간 면역반응을 측정하는 시험관 내(in vitro) 수준의 방법에 관해서도 연구가 잘 이루어져 있지 않은 실정이다. However, until now, there has not yet been developed an efficient system for measuring the response of immune cells induced by these disease cells, and studies on the in vitro level method of measuring the intercellular immune response It is not well established.

또한, 국내외적으로 인체 내 종양미세환경을 모사한 시험관 내 수준에서 암세포에 대한 면역세포의 인식, 이동, 활성화 측정을 목표로 하는 연구는 아직 거의 없는 실정이다.In addition, there are few studies aiming at measuring the recognition, migration, and activation of immune cells against cancer cells at the in vitro level simulating the tumor microenvironment in the human body.

이와 같이, 면역세포와 질환세포의 상호작용에 대한 측정이 현재 transwell 막을 이용하거나, 미소유체관을 통한 이동 측정이 가능한 스크리닝 단계의 수준에 머무르고 있는 이유는, 면역세포와 질환세포의 3차원적 동시 배양을 위한 시스템이나 플랫폼이 개발되어 있지 않은 데 그 이유가 있다. 따라서 이러한 중요성 때문에 현재 국내외적으로 미세유체역학 장치를 이용하여 세포 간 상호작용의 인터페이스 측정에 관한 연구가 진행되고 있으며, 이 연구는 부착분자에 의한 세포와 세포 사이의 직접적인 부착 정도를 측정하는 정도의 초기 개발 단계 수준이며, 세포와 세포 사이의 상호작용이 이루어지는 인터페이스를 관찰할 수 있는 미세유체역학장치의 개발에 대한 연구는 현재 진행 중에 있다.The reason why the measurement of the interaction between immune cells and diseased cells is currently at the level of the screening step using the transwell membrane or the measurement through the microfluidic channel is that the three- There is no reason to develop a system or platform for cultivation. Because of this importance, the interfacial interfacial interaction measurement using the microfluid dynamics device is currently being carried out domestically and internationally. This study is based on the observation that the degree of direct adhesion between cells and cells The development of a microfluid dynamics device capable of observing the interfacial interaction between cells and cells at the initial stage of development is underway.

한편, 나노섬유 및 나노입자 등의 나노구조체의 개발은 주로 세포를 나노섬유에 부착· 배양한 후 증식시킨 것으로, 조직재생용으로 개발된 것이 보고되어 있으며, 주로 피부 및 골조직 재생을 위한 차폐막을 제작하기 위한 것이 대부분이다.On the other hand, the development of nanostructures such as nanofibers and nanoparticles has been reported to have been developed for tissue regeneration, mainly by attaching and culturing cells to nanofibers and then propagating, and mainly used for the production of shielding films for skin and bone regeneration Most of them.

관련하여 국내 공개특허 제10-2007-0024092호에는 나노-마이크로 다공성 지지체를 개시하고 있으나, 나노-마이크로 사이즈를 가져서 세포가 부착할 수 있는 넓은 표면적을 만들어 세포와 접촉할 수 있는 표면부문에 관한 내용이 개시되어 있고, 또한, 다공성 지지체로서 수십 마이크로미터의 직경을 가지며 일정한 형태와 강도가 있는 지지체로 구성되어 있어 조직모사가 다소 어려운 단점이 있다.Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-2007-0024092 discloses a nano-microporous support, but it has a nano-microsized size and has a large surface area capable of adhering cells, And the porous support is composed of a support having a diameter of several tens of micrometers and a uniform shape and strength, which is a drawback in that it is somewhat difficult to simulate a tissue.

또한, 나노섬유가 면역조직과 같은 연질 조직의 세포 지지를 위한 효과적인 구조체 중 하나로써 사용될 수 있으나, 현재까지 나노구조체는 연질조직과 같이 면역세포를 3차원적으로 배양하기 위한 나노구조체로서 세포 지지체는 그 형상 제어가 곤란하여 다양한 조직으로 구성된 연질조직의 제작에는 어려움을 가지고 있다. In addition, nanofibers can be used as one of effective structures for cell support of soft tissues such as immune tissues. To date, nanostructures are nanostructures for culturing immune cells three-dimensionally, such as soft tissue, It is difficult to control the shape thereof and it is difficult to fabricate a soft tissue composed of various tissues.

또한, 바이오칩은 점차 그 형태가 세포칩, 조직칩, 나아가 장기칩으로 발전해 나가고 있는데, 이러한 칩들은 생체내부의 공간적(spatial), 시간적(temporal) 조건을 정교하게 모사(mimicking)함으로써, 복잡한 생화학적 생체 내(in vivo) 환경을 이해할 수 있는 새로운 기회를 제공하고는 있으나, 면역세포의 배양칩은 면역세포가 가지는 면역반응의 특성으로 인하여 공학적인 접근으로 많은 제한이 동반되고 있어서, 제한적인 수준에서만 나노공학 기반의 생체재료를 활용하고 있는 실정이다. 현재까지 주로 개발된 것은 2차원적 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것이 전부이다.In addition, biochips are gradually being developed into cell chips, tissue chips, and even long-term chips. These chips are capable of deliberately mimicking the spatial and temporal conditions of the living body, Although it provides a new opportunity to understand the in vivo environment, the immune cell culture chip has many limitations due to the engineering approach due to the immune response of immune cells, And biomaterials based on nanotechnology are utilized. Up to now, all that has been developed is the two-dimensional nanofiber sheet and the nanofiber support for tissue culture using the same.

면역세포가 질환세포를 인식하여 상호작용하는 면역 네트워크 칩을 개발하기 위해서는, 면역세포(혹은 조직) 및 질환세포(암 조직) 등 다수의 조직이 연관되어 있기 때문에, 세포간의 상호작용을 2차원적인 배양상태에서는 세포와 세포사이의 비특이적인 접촉으로 인하여 세포간의 상호작용의 정확한 측정이 이루어지는 힘든 실정이다.In order to develop immune network chips in which immune cells recognize and interact with disease cells, a number of tissues such as immune cells (or tissues) and diseased cells (cancer tissues) are involved, In the cultured state, nonspecific contact between cells and cells makes it difficult to accurately measure interactions between cells.

따라서, 3차원적 조직칩을 개발하는 동시에, 다수의 세포 사이 네트워크를 구성하고, 모사하는 측정이 필요하고, 이 경우 특히 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유기반 세포배양구조체를 3차원 인공지지체로 적용하기 위해서는, 세포배양구조체 내부에 세포의 침윤, 배양 및 이동이 가능하도록 제작하는 것이 요구된다.
Therefore, it is necessary to develop a three-dimensional tissue chip, to construct a large number of intercellular networks, and to perform simulated measurement. In this case, particularly, a hybrid fiber-based cell culture structure of nanofiber-micro fiber is applied as a three- It is required to prepare the cell culture structure so that it can infiltrate, cultivate and move the cells inside the cell culture structure.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 요구에 착안하여, 나노섬유-미아크로섬유의 하이브리드 섬유기반 세포배양구조체로서 세포가 침윤·부착되어 3차원적으로 배양되고, 세포의 활성 측정이 가능한 세포배양 구조체 및 이를 포함하는 에세이칩을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention focused on the above-mentioned needs, and as a hybrid fiber-based cell culture construct of nanofiber-microarray fibers, the present inventors have proposed a cell culture construct capable of measuring the activity of cells by three- And completed the present invention.

따라서 본 발명은 1종 이상의 세포가 부착· 배양되는 세포배양지지체를 포함하는 세포배양 구조체이고, 상기 지지체는 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상으로 이루어지고, 상기 세포는 상기 지지체 내로 침윤· 부착되는 것을 포함하는, 나노-마이크로 하이브리드섬유 기반 세포배양 구조체를 제공하는 것을 제1 해결과제로 한다.Therefore, the present invention is a cell culture construct comprising a cell culture support in which at least one cell is adhered and cultured, and the support is in the form of a mat having a three-dimensional structure formed of hybrid fibers of nanofiber-microfibers, The present invention provides a nano-microhybrid fiber-based cell culture construct, which comprises infiltrating and adhering into a support.

또한, 본 발명은 상기 나노-마이크로 하이브리드섬유기반 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 제공하는 것을 제2 해결과제로 한다. It is another object of the present invention to provide an assay chip comprising the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct.

또한, 본 발명은 상기 에세이칩의 제조방법을 제공하는 것을 제3 해결과제로 한다.In addition, the present invention provides a method for manufacturing the above-described assay chip.

또한, 본 발명은 상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동의 측정을 통한 세포분석 방법을 제공하는 것을 제4 해결과제로 한다.
In addition, the present invention provides a method for analyzing cells by measuring the invasion / attachment of cells, the shape of cells, the intercellular junction, or the intercellular movement as the assay method using the above-mentioned assay chip.

상기 과제를 해결하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따르면,In order to solve the above problems, according to a first aspect of the present invention,

1종 이상의 세포가 부착·배양되는 세포배양 지지체를 포함하는 세포배양 구조체이고,A cell culture construct comprising a cell culture support wherein at least one cell is attached and cultured,

상기 지지체는 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상으로 이루어지고,The support is formed in a mat shape of a three-dimensional structure formed of hybrid fibers of nanofiber-microfibers,

상기 세포는 상기 지지체 내로 침윤·부착되는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드섬유 기반 세포배양 구조체가 제공된다.
Wherein the cells are infiltrated into and adhered to the support.

또한 본 발명의 제2 측면에 따르면,According to a second aspect of the present invention,

상기 세포배양 구조체를 포함하여, 배양된 세포의 침윤· 부착을 측정·분석하는 것을 특징으로 하는 에세이칩이 제공된다.
An assay chip comprising the cell culture construct and measuring and analyzing the infiltration and adhesion of the cultured cells.

또한 본 발명의 제3 측면에 따르면,According to a third aspect of the present invention,

기판 상에 고분자 코팅층을 형성하는 단계; 및 Forming a polymer coating layer on a substrate; And

상기 고분자 코팅층 상에 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유를 이용하여 3차원 구조를 갖는 매트 형상의 세포배양 지지체를 형성하는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 나노섬유-마이크로섬유 하이브리드 섬유기반 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩의 제조방법이 제공된다.
And forming a mat-like cell culture support having a three-dimensional structure by using hybrid fibers of nanofiber-microfibers on the polymer coating layer. The nanofiber-microfiber hybrid fiber-based cell A method for producing an assay chip comprising a culture construct is provided.

또한 본 발명의 제4 측면에 따르면,According to a fourth aspect of the present invention,

1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 상기 세포배양 지지체 내로 침윤·부착시켜 배양하는 제1 단계; 및A first step of infiltrating / attaching at least one cell or a culture solution of the cell into the cell culture support and culturing; And

상기 지지체 내 상기 배양된 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 측정·분석하는 제2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드섬유기반 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 세포분석방법이 제공된다.
And a second step of measuring and analyzing the infiltration / attachment of the cultured cells in the support, the morphology of the cells, the intercellular junction, or the intercellular movement, and the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct A method for analyzing cells using an assay chip is provided.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 나노-마이크로 하이브리드섬유기반 세포배양 구조체는 1종 이상의 세포를 동시에 3차원적으로 배양할 수 있는 효과가 있다. 따라서 본 발명에 따른 상기 세포배양 구조체는 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동의 측정·분석이 가능한 에세이칩으로 이용될 수 있다. As described above, the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct according to the present invention has an effect of three-dimensionally culturing one or more cells simultaneously. Therefore, the cell culture construct according to the present invention can be used as an assay chip capable of measuring and analyzing cell invasion / adhesion, cell morphology, intercellular junction or intercellular movement.

또한, 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 실시간 세포분석이 가능한 효과가 있다. 즉 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 여러 종류의 면역세포와 질환세포의 상호작용 및 결합을 실시간으로 측정할 수 있게 되어 실시간으로 3차원적 세포분석이 가능하게된다. 특히, 본 발명에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석방법의 경우, 밀도를 낮춘 나노-마이크로 하이브리드섬유기반 세포배양 구조체 내에 면역세포와 질환세포를 3차원적으로 배양함으로써 세포의 침윤· 부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 실시간으로 분석할 수 있는 효과가 있다.
In addition, it is possible to perform real-time cell analysis through measurement of cell culture and cell migration using the assay chip according to the present invention. In other words, by using the assay chip according to the present invention, it is possible to measure the interaction and binding between various kinds of immune cells and diseased cells in real time, thereby enabling real-time three-dimensional cell analysis. In particular, in the case of a cell analysis method using an assay chip according to the present invention, immune cells and disease cells are cultured three-dimensionally in a nano-microhybrid fiber-based cell culture structure having a reduced density, , Intercellular junctions or intercellular migration can be analyzed in real time.

도 1은 본 발명에 따른 나노-마이크로 하이브리드섬유의 제작을 위한 전기방사법의 모식도(위)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고밀도 섬유(Compact Nanofiber) 지지체와 하이브리드 섬유(Hybrid-Nanofiber) 지지체 외형(아래)을 제공한다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고밀도 섬유(Compact NFS)와 하이브리드 섬유(Hybrid NFS) 각각의 제작조건과 SEM사진을 나타낸 것이고 도 2c는 고밀도 섬유와 하이브리드 섬유 지지체에 FITC-결합 콜라겐을 코팅한 후, 공극의 크기를 측정한 결과(도 2c)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩 제조공정 모식도(A) 및 제작된 에세이칩의 실제모형의 이미지(B)를 나타낸 것이다.
도 4, 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착되어 있는 CT-26 대장암세포의 공초점 현미경 관찰결과, 고배율 형광현미경 관찰결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착·배양되어 있는 수지상세포의 전자현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착·배양되어 있는 CT-26 대장암세포의 침윤정도를 공초점현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착·배양되어 있는 A20 림프종 세포의 침윤정도를 공초점현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착·배양되는 A20 림프종 세포의 배양 시간대별 세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 부착·배양되는 CT-26 대장암세포의 침윤 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 수지상세포의 분화 및 성숙화의 유도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 분화 및 성숙화가 유도된 수지상세포의 형태분석을 확인한 데이터를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 수지상세포의 성숙화에 따른 세포내 단백질 활성화 정도를 측정한 데이터를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 세포증식의 정도를 측정한 데이터를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 시간대 별로 세포증식의 정도를 CCK8 키트로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 수지상세포와 항암제를 처리한 CT-26 대장암세포의 공배양에 따른 세포모양의 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서, 마우스 림프종 조직으로부터 분리한 암조직 세포의 증식을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 고밀도 섬유 지지체의 콜라겐 코팅 농도에 따라 지지체 내에 분포하는 세포를 측정한 결과(A)와, 콜라겐으로 코팅한 지지체에서 배양한 세포의 형태학적 특징을 측정한 데이터(B)를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 콜라겐 코팅한 지지체에 배양(A)한 후, 콜라게나아제를 처리(B)하고, 트립신 EDTA를 처리(C)한 후의 데이터를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 지지체에 콜라겐이 코팅되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체에 콜라겐 농도에 따른 지지체 내 콜라겐 코팅정도를 공초점 현미경의 여러 기법을 사용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 발명의 일 실시예에 따라 콜라겐으로 코팅한 지지체에 대장암세포의 침윤 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23a, b는 본 발명의 일 실시예에 따라 콜라겐으로 코팅한 지지체에 CT-26 대장암세포와 A20 림프종세포가 침윤한 것을 측정한 전자현미경(SEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 콜라겐을 코팅한 섬유 지지체상에 수지상세포의 분화 성숙화한 모양과 LPS에 의한 면역세포 활성화를 확인한 데이터를 나타낸 것이다.1 is a schematic view of an electrospinning method for fabricating nano-microhybrid fibers according to the present invention and a Compact Nanofiber support and a Hybrid-Nanofiber support fabricated according to an embodiment of the present invention. It provides the appearance (below).
FIGS. 2A and 2B show manufacturing conditions and SEM photographs of each of the high density fibers (Compact NFS) and the hybrid fibers (Hybrid NFS) fabricated according to an embodiment of the present invention. FIG. -Bonded collagen, and the size of the pores was measured (Fig. 2C).
FIG. 3 is a schematic view (A) of an essay chip manufacturing process according to an embodiment of the present invention and an image (B) of an actual model of the produced essay chip.
FIGS. 4 and 5 show high-magnification fluorescence microscopic observation results of a CT-26 colon cancer cell adhering to a cell culture support according to an embodiment of the present invention as a result of a confocal microscopic observation.
6 shows electron microscopic observation results of dendritic cells adhered and cultured on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 shows the results of confocal microscopy of the degree of invasion of CT-26 colon cancer cells adhered and cultured on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 shows the results of confocal microscopy of the degree of infiltration of A20 lymphoma cells attached to and cultured on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 shows the results of confirming the number of cells per A20 lymphoma cells cultured for a period of time to be adhered and cultured on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 shows the results of confirming the infiltration of CT-26 colon cancer cells attached to and cultured on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
11 shows the results of confirming induction of differentiation and maturation of dendritic cells in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 shows data showing morphological analysis of dendritic cells induced differentiation and maturation in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 shows data on the degree of activation of intracellular proteins according to the maturation of dendritic cells in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 14 shows data obtained by measuring the degree of cell proliferation in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 15 shows the results of measurement of the degree of cell proliferation in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention with time using a CCK8 kit. FIG.
FIG. 16 shows the results of cell morphology according to the co-culture of CT-26 colon cancer cells treated with dendritic cells and anticancer agents in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
17 shows the results of confirming the proliferation of cancer tissue cells isolated from mouse lymphoma tissue in a culture dish and a hybrid fiber support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 18 is a graph showing the results of measurement of cells distributed in a supporter according to collagen coating concentration of a high-density fibrous scaffold according to an embodiment of the present invention, and (A) measurement of morphological characteristics of cells cultured on a collagen- And data (B).
FIG. 19 shows data obtained after culturing (A) on a collagen-coated supporter according to an embodiment of the present invention, followed by treatment with collagenase (B) and treatment with trypsin EDTA (C).
FIG. 20 shows a result of checking whether collagen is coated on a support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 21 shows the results of measurement of the degree of collagen coating in the supporter according to collagen concentration, using various techniques of confocal microscopy, on a cell culture support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 22 shows the result of confirming the degree of infiltration of colon cancer cells into a collagen-coated supporter according to an embodiment of the present invention.
23A and 23B are electron microscopic (SEM) photographs showing that CT-26 colorectal cancer cells and A20 lymphoma cells infiltrate into a collagen-coated support according to an embodiment of the present invention.
FIG. 24 shows data showing maturation of dendritic cells in dendritic cells and activation of immune cells by LPS on a collagen-coated fibrous support according to an embodiment of the present invention.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 제1 측면에 따르면,According to a first aspect of the present invention,

1종 이상의 세포가 부착· 배양되는 세포배양 지지체를 포함하는 세포배양 구조체이고,A cell culture construct comprising a cell culture support wherein at least one cell is attached and cultured,

상기 지지체는 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상으로 이루어지고,The support is formed in a mat shape of a three-dimensional structure formed of hybrid fibers of nanofiber-microfibers,

상기 세포는 상기 지지체 내로 침윤·부착되는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드섬유 기반 세포배양 구조체를 제공한다.Wherein the cells are infiltrated into the support and adhere to the support.

본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유 지지체는 마이크로 직경과 나노직경을 갖는 마이크로 섬유 및 나노섬유의 집합체로서 3차원적 매트릭스의 구조를 갖는 매트형상인 것이 특징이다. 이에 따라 상기 지지체는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하게 된다. 특히, 생체적합성 고분자를 이용하여 제작되는 생체적합성 고분자 섬유의 경우 세포의 통과가 가능할 정도로 다수의 공극(PORE)을 형성하고 있어 세포의 침윤·부착 및 이에 따른 세포배양이 가능하게 된다.  In the present invention, the hybrid fiber support is an aggregate of micro fibers and nanofibers having a micro diameter and a nano diameter, and is a mat shape having a three-dimensional matrix structure. Accordingly, the support has a large surface area in a small space, is strong in durability, is very easy to handle, can be manufactured in various forms, and is easily chemically bonded with various materials. In particular, a biocompatible polymer fiber fabricated using a biocompatible polymer forms a large number of pores so that cells can pass therethrough, allowing infiltration and attachment of cells and cell culture therefor.

이 때, 상기 하이브리드 섬유 지지체 내 세포의 부착은 주로 나노섬유에서 이루어지고, 마이크로 섬유에 의하여 공극의 크기를 증가시킴에 따라 3차원 매트릭스 구조를 형성하게 되는 것이다. 따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유는 상기 나노섬유 55~85 중량%과 마이크로 섬유 15~45 중량%로 구성되는 것이 적합하다. 상기 나노섬유가 상기 범위를 초과하여 포함하는 경우에는 공극률이 저하됨에 따라 세포의 침윤·부착이 이루어지지 않아 세포배양이 상기 지지체 상부(TOP)에서만 이루어지게 되고, 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 공극률이 지나치게 높아짐에 따라 세포의 침윤에 의하여 상기 지지체 하부(BOTTOM)에서만 세포의 배양이 일어나게 되는 문제점이 있으므로 상기 범위 내에서 혼합되어 하이브리드 섬유를 구성하는 것이 바람직하다. 이 경우, 보다 바람직하게는 상부에서는 마이크로 섬유의 비율이 40% 이상으로 많이 함유되고, 하부에서는 마이크로 섬유의 비율이 30중량% 이하로 적게 함유되도록 하이브리드 섬유를 구성할 때 상부에서 하부로 세포의 침윤부착이 잘 일어날 수 있다. At this time, adhesion of the cells in the hybrid fiber support is mainly performed in nanofibers, and a three-dimensional matrix structure is formed by increasing the size of voids by microfibers. Accordingly, it is preferable that the hybrid fiber according to the present invention is composed of 55 to 85% by weight of the nanofiber and 15 to 45% by weight of the microfiber. When the nanofibers are contained in a range exceeding the above range, cell infiltration and attachment are not performed as the porosity is lowered, so that cell cultivation is performed only in the upper part of the supporter (TOP) It is preferable to form hybrid fibers by mixing within the above range because there is a problem that cells are cultured only in the lower part of the support (BOTTOM) due to infiltration of cells. In this case, more preferably, when the hybrid fiber is constituted such that the proportion of micro fibers is more than 40% and the proportion of micro fibers is less than 30% by weight in the upper part, Adhesion can occur well.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유 지지체는 전기방사법에 의해 형성될 수 있다. 상기 전기방사법은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 하이브리드 섬유를 제조한다. 상기 하이브리드 섬유의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생제적합성 고분자 섬유의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.Also preferably, in the present invention, the hybrid fiber support may be formed by electrospinning. The electrospinning may be carried out by a method used in the production of conventional nanofibers. For example, a polymer solution is prepared by dissolving a biocompatible polymer in a solvent, and the polymer solution is injected into an electrospinning device and discharged to prepare a biocompatible polymer hybrid fiber having a porous structure. The concentration of the solvent, the concentration of the polymer solution, the voltage to be used for electrospinning, the scattering distance, and the flow rate used in the production of the polymer solution used for the production of the hybrid fiber may be determined by the kind of the polymer used or the physical properties of the desired biocompatible polymer fiber And the like.

또한 본 발명에서 사용하는 상기 생체적합성 고분자 하이브리드 섬유에 있어서, 하이브리드 섬유 지지체의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 필요에 따라 고분자 용액의 농도, 전기방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있는바, 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유는 100 나노미터 ~ 1.5 마이크로미터의 직경을 가지는 나노섬유와 마이크로섬유를 이용하여 3차원 매트릭스 구조를 갖는 매트형상으로 제작되는 것이 바람직하다. 이 때 상기 하이브리드 섬유 지지체는 그 두께가 50~500마이크로미터, 보다 바람직하게는 70~100마이크로미터인 것이 적합하다. 보다 바람직하게는 상기 하이브리드 섬유 지지체는 PCL을 재료로 하여 전기방사법으로 제조된 것으로, 평균 700 나노미터 ~ 1.2 마이크로미터의 직경으로 평균 70 마이크로미터의 두께를 가지는 매트로 제작되도록 한다.Further, in the biocompatible polymer hybrid fiber used in the present invention, the diameter, porosity, and porosity of the hybrid fiber support can be controlled by appropriately adjusting the concentration of the polymer solution and the condition of electrospinning as needed In the present invention, it is preferable that the hybrid fibers are produced in the form of a mat having a three-dimensional matrix structure by using nanofibers having a diameter of 100 nanometers to 1.5 micrometers and micro fibers. In this case, the thickness of the hybrid fiber support is preferably 50 to 500 micrometer, more preferably 70 to 100 micrometer. More preferably, the hybrid fiber support is manufactured by electrospinning using PCL as a material, and is manufactured as a mat having an average diameter of 700 nm to 1.2 micrometer and an average thickness of 70 micrometer.

따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 하이브리드 섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 코팅될 수 있다. 상기 생체적합성 고분자를 이용하여 하이브리드 섬유 지지체를 코팅할 경우, 상기 하이브리드 섬유 지지체 표면에 생체적합성 고분자 코팅층이 형성되어 지지체의 표면에 세포가 균일성 있게 부착·배양할 수 있고, 세포의 침윤·부착의 효율을 더 높일 수 있게 된다. 특히, 바람직하게는 콜라겐으로 코팅되어지는 것이 적합하다.  Preferably, in the present invention, the hybrid fibers are selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid ), Poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate) (PHBV), poly (lactic acid) (L-lactide) -co- (D-lactide)], poly [(L-lactide)], poly (ester urethane) (PVA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinyl pyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline (PAN) One or more biocompatible polymers, or copolymers thereof, or mixtures thereof. When the hybrid fiber support is coated with the biocompatible polymer, a biocompatible polymer coating layer is formed on the surface of the hybrid fiber support, and cells can be uniformly adhered and cultured on the surface of the support. The efficiency can be further increased. Particularly, it is preferable to be coated with collagen.

또한, 본 발명에서 사용하는 상기 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있다.The nanofibers used in the present invention may be selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate) (PHBV), polydioxane (D-lactide)], poly [(L-lactide)], poly (ester urethane) (PEUU) (PA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline (PAN) from the group consisting of poly [ethylene-co- (vinyl alcohol)] (PVOH), polyacrylic acid One or more biocompatible polymers selected therefrom, copolymers thereof, or mixtures thereof.

또한, 본 발명에서 상기 세포배양 구조체는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성될 수 있다.
Also, in the present invention, the cell culture construct may be selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane Cellulose, and silicone rubber.

또한, 본 발명의 제2 측면에 따르면,According to a second aspect of the present invention,

상기 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반 세포배양 구조체를 포함하여, 배양된 세포의 침윤· 부착을 측정·분석하는 것을 특징으로 하는 에세이칩이 제공된다. 상기 에세이칩은 세포의 침윤·부착 및 배양이 가능한 3차원적 세포배양 구조체를 포함함으로써 세포의 침윤· 부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 칩 수준에서 측정하여 실시간으로 세포분석이 가능하게 된다. 특히 바람직하게는, 상기 본 발명에 있어서 콜라겐 등의 생체적합성 고분자로 코팅한 하이브리드 섬유 지지체를 기반으로 하는 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 사용함으로써, 상기 지지체 내로 세포의 침윤·이동을 칩 수준에서 실시간으로 측정할 수 있어 효과적인 세포분석이 가능하게 된다.
Wherein the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct includes the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct, and the infiltration and adhesion of the cultured cells are measured and analyzed. The assay chip includes a three-dimensional cell culture structure capable of infiltrating, adhering, and culturing cells, thereby allowing cell infiltration and attachment, cell morphology, intercellular junction, or intercellular movement to be measured at the chip level, . Particularly preferably, in the present invention, by using an assay chip comprising a cell culture construct based on a hybrid fiber support coated with a biocompatible polymer such as collagen, infiltration and migration of cells into the support can be performed at a chip level It can be measured in real time, enabling effective cell analysis.

또한, 본 발명의 제3 측면에 따르면,According to a third aspect of the present invention,

기판 상에 고분자 코팅층을 형성하는 단계; 및Forming a polymer coating layer on a substrate; And

상기 고분자 코팅층 상에 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유를 이용하여 3차원 구조를 갖는 매트 형상의 세포배양 지지체를 형성하는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 나노섬유-마이크로섬유 하이브리드 섬유기반 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩의 제조방법이 제공된다. And forming a mat-like cell culture support having a three-dimensional structure by using hybrid fibers of nanofiber-microfibers on the polymer coating layer. The nanofiber-microfiber hybrid fiber-based cell A method for producing an assay chip comprising a culture construct is provided.

바람직하게는 상기 에세이칩은, 상기 지지체 내로 1종 이상의 세포를 침윤·부착시켜 배양함으로써 배양된 세포의 침윤·부착을 측정·분석하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 에세이칩은 본 발명의 제2 측면에서 상술한 바와 같은 에세이칩으로, 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반 세포배양 구조체를 포함하여 배양된 세포의 침윤· 부착을 측정·분석하는 에세이칩인 것이 특징이다.Preferably, the assay chip is characterized in that the infiltration and adhesion of the cultured cells are measured and analyzed by incubating one or more cells in the support and incubating the cells. In this case, the assay chip is an assay chip as described in the second aspect of the present invention, which is an assay chip for measuring and analyzing the infiltration and adhesion of cultured cells including the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct Feature.

또한 상기 고분자 코팅층은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 형성될 수 있다.The polymer coating layer may be formed of a material selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethylmethacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU) And may be formed from at least one selected from the group consisting of.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
Preferably, in the present invention, the substrate is selected from the group consisting of silicon, quartz, ceramic, alumina, titania and glass.

또한 본 발명의 제4 측면에 따르면,According to a fourth aspect of the present invention,

상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서, As an assay method using the above assay chip,

1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 상기 세포배양 지지체 내로 침윤·부착시켜 배양하는 제1 단계; 및A first step of infiltrating / attaching at least one cell or a culture solution of the cell into the cell culture support and culturing; And

상기 지지체 내 상기 배양된 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 측정·분석하는 제2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 섬유기반 세포배양 구조체를 포함하는 에세이칩을 이용한 세포분석방법에 관한 것이다.And a second step of measuring and analyzing the infiltration / attachment of the cultured cells in the support, the morphology of the cells, the intercellular junction, or the intercellular movement, and the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct The present invention relates to a method for analyzing cells using an assay chip.

상기 본 발명의 세포분석방법에 의하면 상기 제1 단계는, According to the cell analysis method of the present invention,

1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 상기 세포배양 지지체 내로 침윤·부착시켜 배양하는 단계 및 상기 세포배양 구조체 내로 세포배양용 조성물을 주입하여 상기 부착·배양된 세포를 추가 배양하는 추가 배양단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.Culturing the at least one cell or a culture solution of the cell by infiltrating and adhering the cell culture support into the cell culture support, and further culturing the cell by adding the cell culture composition into the cell culture construct to further culture the adhered and cultured cells .

더 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 지지체 내에 형광염색제를 더 주입하여 부착·배양된 세포의 형태에 대한 세포분석을 수행하게 된다.More preferably, in the present invention, a fluorescent dye is further injected into the support to perform cell analysis on the type of cells attached and cultured.

상기 본 발명의 세포분석방법에 의하면 상기 제2 단계는, According to the cell analysis method of the present invention, in the second step,

1종 이상의 면역세포 또는 면역세포 배양액과, 1종 이상의 질환세포 또는 질환세포의 배양액을, 상기 세포배양 지지체 내로 침윤·부착시켜 면역세포 및 질환세포가 동시에 배양이 이루어지도록 하는 것을 특징으로 한다.Characterized in that at least one kind of immune cell or immune cell culture solution and at least one kind of disease cell or disease cell culture solution are infiltrated into the cell culture support and adhered thereto so that the immune cells and disease cells are simultaneously cultured.

상기 배양시, 상기 면역세포의 활성화제 또는 질환세포의 치료제를 상기 지지체 내로 더 주입하여 배양할 수 있다.During the culturing, the immune cell activator or the therapeutic agent for the diseased cell may be further injected into the support and cultured.

상기 본 발명에 있어서 상기 제 2단계는 질환 세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 분석하는 것을 특징으로 하고, 면역세포의 활성화 및 이동을 실시간으로 측정할 수 있게 되어 세포간 상호작용에 대한 세포분석을 수행하게 된다.In the present invention, the second step is characterized by analyzing the degree of damage, death and proliferation of diseased cells, and it is possible to measure the activation and migration of immune cells in real time, .

더 상세하게는 형광염색 처리단계를 포함함으로써 면역세포의 이동수를 실시간으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 처리한 항체를 이용하여 질환 세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 직접 측정할 수 있게 된다.More specifically, the inclusion of a fluorescence dyeing step not only allows measurement of the number of immune cell movements in real time, but also can directly measure damage, death and proliferation of diseased cells using a fluorescently treated antibody.

바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 세포의 활성 측정은, 상기 부착·배양된 면역세포 및 질환세포 내에 인산화된 단백질의 정도를 분석함으로써 활성정도를 측정할 수 있게 된다.Preferably, in the present invention, the activity of the cell can be measured by analyzing the degree of the phosphorylated protein in the immune cells and diseased cells attached and cultured.

또한 바람직하게는 세포내 골격을 이루는 단백질인 액틴, 팩실린 등의 활성이나 단백질 양을 측정할 수 있으며, 세포간 연결을 담당하는 부착분자를 측정할 수 있게 된다.Also, it is possible to measure the activity and protein amount of actin, pacilin, etc., which are proteins forming the intracellular skeleton, and it is possible to measure the adhesion molecules responsible for cell interactions.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포는 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 구제적인 예로서 본 발명의 일 실시예에서는 면역세포로서 수지상세포를 사용하였다. 이 때 상기 수지상 세포는 인간 혈액으로부터 수지상세포를 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 수지상세포 배양용 배지에서 GGM-CSF 및 IL-4 등의 사이토카인을 처리하여 수지상세포로 분화시켜 얻을 수 있다. 수지상 세포 중 성숙형 수지상 세포는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 처리하여 얻으며, 수지상세포의 성숙화는 표면 항원인 CD86의 발현 양을 통하여 확인할 수 있다.Preferably, the immune cell of the present invention is at least one selected from the group consisting of macrophages, dendritic cells, NK cells, T cells and B cells. As an example, dendritic cells were used as immune cells in one embodiment of the present invention. At this time, the dendritic cells can be obtained by separating dendritic cells from human blood or treating bone marrow cells isolated from mouse bone marrow with dendritic cell culture medium to treat dendritic cells such as GGM-CSF and IL-4 with cytokines . Among dendritic cells, mature dendritic cells are obtained by treatment with lipopolysaccharide, and maturation of dendritic cells can be confirmed by expression of CD86, a surface antigen.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 질환세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.Also preferably, the disease cell according to the present invention is characterized in that the disease-induced cell is included.

또한 바람직하게는 상기 질환세포는 암세포인 것을 특징으로 한다. 상기 암세포는 간암세포, 대장암세포, 위암세포, 폐암세포, 자궁암세포, 유방암세포, 갑상선암세포, 림프암세포 및 췌장암세포 등에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장암세포와 림프암 세포를 이용하였다.Preferably, the disease cell is a cancer cell. The cancer cells may be one or more selected from liver cancer cells, colon cancer cells, stomach cancer cells, lung cancer cells, uterine cancer cells, breast cancer cells, thyroid cancer cells, lymphocytic cells and pancreatic cancer cells. In one embodiment of the present invention, colon cancer cells and lymphocyte cells were used.

또한 바람직하게는 상기 질환 세포는 암세포이고, 상기 질환의 치료제는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. Preferably, the disease cell is a cancer cell, and the therapeutic agent for the disease is doxorubicin, etoposide, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin, May be at least one selected from the group consisting of teniposide, amsacrine, epirubicin, merbarone and piroxantrone hydrochloride.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포의 배양액은, 상기 면역세포와 반응하여 면역세포의 이동을 촉진하는 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 활성성분으로서 케모카인을 더 포함하도록 함으로써 수지상세포가 활성형으로 전환되어 케모카인에 반응하여 림프조직 등으로 이동을 촉진하도록 하였다.
Preferably, the culture medium for the immune cells further comprises an active ingredient which accelerates the migration of immune cells by reacting with the immune cells. In one embodiment of the present invention, the dendritic cells are converted into an active form by further including a chemokine as an active ingredient, so as to promote migration to lymphoid tissue or the like in response to the chemokine.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the concept of the invention to those skilled in the art. To fully disclose the scope of the invention to a person skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.

실시예 1: 전기방사법에 의한 나노-마이크로 하이브리드섬유 섬유의 제작 및 SEM 분석Example 1: Fabrication and SEM analysis of nano-microhybrid fiber fiber by electrospinning

본 실시예에서는 전기방사법을 이용하여 전기방사기의 조건을 조절함으로써 나노섬유-마이크로섬유의 하이브리드 섬유를 제작하였다. 이를 위해, 나노미터와 마이크로미터 직경의 고분자 섬유가 적절한 비율로 조절되어 있으며 고분자 섬유간 공간이 확보되도록, 기존의 전기방사장치에서 다음과 같은 차이점을 가지도록 하여 제작하였다. In this embodiment, hybrid fibers of nanofiber-microfibers were fabricated by controlling the condition of the electrospinning apparatus by electrospinning. For this purpose, the polymer fibers of nanometer and micrometer diameter are adjusted at an appropriate ratio, and the space between the polymer fibers is secured by making the following differences in the conventional electrospinning apparatus.

먼저, 도 1에 나타낸 바와 같이 기존의 전기방사장치에서는 단순한 금속판을 집적판으로 사용(1)하고 있으나, 본 실시예(2)에서는 피치크기를 0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 사용하였다. 또한 이 위해 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하였다. 대면적의 고분자 섬유 매트의 제작 및 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 하기 위해 집적판은 지그제그 경로(raster scanning)를 따라 움직였으며, 이때 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 하였다. First, as shown in FIG. 1, in the conventional electrospinning apparatus, a simple metal plate is used as an integrated plate (1), but in the present embodiment (2), a metal grid plate of a square grid shape having a pitch size of 0.5 to 1 mm Were used. For this purpose, a 0.5 ~ 1 mm thick glass plate was coated and the intensity of the electric field was simultaneously controlled, so that the polymer fibers were concentrated around the metal wires constituting the mesh, and the generation rate of the polymer fibers of the micrometer diameter was also increased. In order to make large-scale polymer fiber mats and to assemble them to a relatively uniform thickness, the integrated plate was moved along the raster scanning, and the size of the path was adjusted to the size of the mat to be manufactured .

도 1에는 상기 나노-마이크로 하이브리드섬유의 제작을 위한 전기방사법의 모식도(위)와 제작되는 고밀도 섬유 매트와 하이브리드 섬유 매트의 외형(아래)을 나타내었다. 도 1을 참고하면 상기 하이브리드 섬유 매트의 경우 내부에 공극이 형성되어 3차원 매트릭스의 구조를 가짐을 확인할 수 있다. FIG. 1 shows a schematic view of the electrospinning method for fabricating the nano-micro hybrid fibers (above) and the appearance (below) of the high density fiber mats and the hybrid fiber mats to be produced. Referring to FIG. 1, voids are formed in the hybrid fiber mat to have a three-dimensional matrix structure.

또한 도 2a 및 도 2b에 상기 고밀도 섬유(Compact NFS)와 하이브리드 섬유(Hybrid NFS) 각각의 제작조건과 SEM사진을 나타내었다. 고밀도 섬유의 경우 상부와 하부 모두 나노섬유의 부피비율이 85%이상으로, 공극이 거의 없는 촘촘한 구조를 하고 있음을 확인할 수 있었고, 하이브리드 섬유의 경우 하부는 나노섬유의 부피비가 74%정도이고, 상부의 경우 나노섬유의 부피비가 58%이고 마이크로 섬유의 부피비가 41%정도이고 하부에 비하여 상부에 공극이 많이 형성되어 상부에서 하부로 세포가 침윤될 수 있음을 확인할 수 있었다. 2A and 2B show production conditions and SEM photographs of the high density fibers (Compact NFS) and the hybrid fibers (Hybrid NFS), respectively. In the case of high-density fibers, it was confirmed that the volume ratio of the nanofibers in both the upper and lower portions was 85% or more, and that the hybrid structure had a compact structure with almost no voids. In the case of hybrid fibers, the volume ratio of the nanofibers was 74% The volume ratio of nanofibers was 58%, the volume ratio of microfibers was about 41%, and it was confirmed that the cells were infiltrated from the upper part to the lower part by forming many pores on the upper part compared with the lower part.

또한 상기 고분자 섬유 지지체의 공극의 측정은 고밀도 섬유와 하이브리드 섬유를 형광을 입힌 콜라겐으로 코팅한 후 형광현미경으로 공극의 차이를 주사현미경(SEM)으로 관찰하였다. 공극 지역은 무작위로 30군데를 지정하여 평균을 내어 결과를 분석하였다. 또한 도 2c는 상기 공극의 크기를 측정한 결과를 나타낸 것으로 하이브리드 섬유에서 공극의 크기가 두 배 이상인 것을 확인할 수 있다.
The pores of the polymer fiber support were coated with high-density fiber and hybrid fiber collagen coated with fluorescence, and then observed by a scanning electron microscope (SEM) using a fluorescence microscope. The pore area was randomly assigned to 30 sites, and the results were averaged. FIG. 2C shows the result of measuring the size of the voids. It can be seen that the size of voids in the hybrid fibers is more than double.

실시예 2: 슬라이드 글라스에 부착시킨 나노-마이크로 하이브리드섬유 지지체 기반 세포배양 에세이 칩 제작Example 2: Fabrication of a nano-microhybrid fiber support-based cell culture assay chip attached to a slide glass

본 실시예에서는 상기 하이브리드 섬유 지지체에 여러 종류의 세포를 부착 및 배양한 후, 지지체 내 세포가 3차원적으로 침윤. 배양되는 것을 관찰하기 위한 모형을 제작하고 세포분석을 실시하였다. In this embodiment, after attaching and culturing various kinds of cells to the hybrid fiber support, the cells in the support are three-dimensionally infiltrated. A model for observing the culture was prepared and cell analysis was performed.

이를 위해, 슬라이드용 유리 기판 상에 PDMS로 코팅한 뒤, 상기 실시예 1에서 제조한 나노-마이크로 하이브리드섬유를 세포배양을 위한 지지체로서 부착하고, 그 위에 고정용 플라스틱과 PDMS로 형성된 배양구조체를 고정시켜 에세이칩을 제작하였다. To this end, the slide glass substrate was coated with PDMS, the nano-microhybrid fibers prepared in Example 1 were attached as a support for cell culture, and the culture structure formed of the fixing plastic and the PDMS was fixed thereon To prepare an essay chip.

본 실시예에 따른 제작공정은 도 3A에 나타내었고, 도 3B는 본 실시예에 따른 에세이칩 제작의 실제 모형을 나타낸 것이다.
The fabrication process according to this embodiment is shown in Fig. 3A, and Fig. 3B shows an actual model of the fabrication of an assay chip according to this embodiment.

실시예 3: 고분자 섬유 지지체에서의 세포배양 측정 1Example 3: Measurement of cell culture in a polymer fiber support 1

CT-26 대장암세포를 배양접시와 고밀도 나노섬유 지지체 및 하이브리드 섬유 지지체에서 세포를 배양하고 actin에 대한 항체를 1:500으로 반응시키고 FITC 이차항체를 사용해 공초점 현미경으로 관찰하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 고밀도 섬유 지지체보다 하이브리드 섬유 지지체에서 세포가 가지가 좀 더 뻗어 있는 것을 확인할 수 있었다. CT-26 colon cancer cells were cultured in a culture dish, a high-density nanofiber support, and a hybrid fiber support, reacted with actin antibody at 1: 500, and observed with a confocal microscope using FITC secondary antibody. Respectively. As can be seen from FIG. 4, it was confirmed that the cells were more extended in the hybrid fiber support than the high-density fiber support.

또한 도 5에 2D와 3D 환경에서 고배율 형광현미경 사진으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 세포 모양이 다른 것을 확인할 수 있었다. Also, FIG. 5 shows the result of high magnification fluorescence microscopy in 2D and 3D environments, and it was confirmed that the cell shape is different.

또한 도 6은 고밀도 섬유와 하이브리드 섬유 지지체에서 부착배양된 수지상세포를 1500배율과 3000배율로 전자현미경 사진을 나타낸 것이다. 고밀도 섬유에서는 표면 쪽에 수지상세포가 부착되어 있었고 하이브리드 섬유 지지체에서는 수지상세포가 좀 더 안쪽에 부착되어 있음을 확인할 수 있다.
6 shows electron microscope photographs of dendritic cells adhered and cultured in high-density fibers and hybrid fiber supports at 1500 magnification and 3000 magnification. In the high density fiber, the dendritic cells were attached to the surface side and the dendritic cells were attached to the inside of the hybrid fiber support more.

실시예 4: 고분자 섬유 지지체에서의 세포배양 측정 2Example 4: Measurement of cell culture on a polymer fiber support 2

고밀도 섬유(Compact NFS)와 하이브리드 섬유(Hybrid NFS) 지지체 내에 CT-26 대장암세포 및 A20 림프종 세포를 배양하고, 세포의 침윤 정도를 공초첨 현미경으로 관찰하여 세포가 검출되는 깊이를 측정하였다. 그 결과는 도 7 및 도 8에 나타내었다. CT-26 colorectal cancer cells and A20 lymphoma cells were cultured in a compact NFS and a hybrid NFS support, and the depth of cells was measured by observing the extent of cell invasion with a balloon microscope. The results are shown in FIG. 7 and FIG.

도 7을 참고하면 하이브리드 섬유 지지체에 배양한 CT-26 대장암세포가 보다 깊은 위치에서 검출되는 것을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 7, it can be seen that CT-26 colon cancer cells cultured on a hybrid fiber support were detected at a deeper position.

도 8을 참고하면 하이브리드 섬유 지지체에 배양한 A20 림프종 세포가 고밀도 섬유 지지체에서 배양한 세포보다 지지체 내부로 보다 깊숙하게 들어가 있었다. 공초점 현미경의 z-stack 기능을 사용하여 촬영한 경우 하이브리드 섬유 지지체에서 A20 림프종세포가 32.7 마이크로미터까지 침윤을 하였고 고밀도 섬유 지지체에서는 20 마이크로미터까지 세포가 침윤하였다. Referring to FIG. 8, A20 lymphoma cells cultured on a hybrid fibrous scaffold were deeper than the cells cultured on a high-density fibrous scaffold. When photographed using the confocal microscope z-stack function, A20 lymphoma cells infiltrated to 32.7 micrometers in the hybrid fiber support and up to 20 micrometers in the high-density fiber support.

또한 도 9는 상기 A20 세포의 시간대별 배양 후, 배양액으로 세척하고 지지체에 부착된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것으로, 하이브리드 섬유 지지체에서 배양된 경우 부착된 세포의 수가 현저하게 많은 것을 확인할 수 있었다. 이는 3차원 매트릭스 구조를 형성하기 때문에, 내부에 공극이 형성되어 세포가 지지체 내부로 침윤되고, 지지체 내부의 표면적이 넓어짐에 따라 세포가 지지체 섬유에의 부착이 용이하게 되기 때문인 것으로 판단된다.
FIG. 9 shows the result of measuring the number of cells attached to the supporter by washing with the culture solution after the time-scale culturing of the A20 cell, and it was confirmed that the number of cells attached to the supernatant when cultured in the hybrid fiber support was remarkably large there was. This is because it forms a three-dimensional matrix structure, and thus it is considered that the cells are formed into voids inside the cells, so that the cells are infiltrated into the support and the cells are easily attached to the support fibers as the surface area inside the support becomes wider.

실시예 5: 고분자 섬유 지지체에서 배양된 세포의 침윤 여부 확인Example 5: Confirmation of infiltration of cells cultured in a polymer fiber support

고밀도 섬유와 하이브리드 섬유 지지체에 CFSE로 염색된 CT-26 대장암세포를 배양하였다. 또한, DAPI로 핵을 염색(0시간, 72시간)한 후, 동결절편 방법으로 하이브리드 섬유 지지체 내에 침윤한 세포를 확인하였다. 섬유 지지체의 아래 및 위 면에 필터 페이퍼를 붙이고 OCT로 굳힌 후 냉동시켰다. 이후 조직절단기로 8 마이크로미터의 직경으로 절단한 다음 형광현미경으로 세포를 관찰하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다. CT-26 colon cancer cells stained with CFSE were cultured on high density fibers and hybrid fiber supports. After nuclear staining with DAPI (0 hr, 72 hr), cells infiltrated into the hybrid fiber support were identified by the frozen section method. The filter paper was attached to the lower and upper surfaces of the fiber support, and the filter paper was frozen after being hardened with OCT. After cutting to a diameter of 8 micrometers with a tissue cutter, the cells were observed under a fluorescence microscope. The results are shown in Fig.

도 10을 참고하면, 고밀도 섬유 지지체에서 배양시 시간이 경과하여도 지지체 표면에서만 CFSE와 DAPI로 염색된 것을 확인하였으나, 하이브리드 섬유 지지체에서 배양시 72시간 경과후 지지체 내부에서 CFSE와 DAPI로 염색된 CT-26 대장암세포를 확인하였다.
10, it was confirmed that CFSE and DAPI stained only on the surface of the high-density fibrous scaffold even after the incubation. However, after 72 hours of incubation in the hybrid fibrous scaffold, the scaffolds stained with CFSE and DAPI -26 colon cancer cells.

실시예 6: 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 수지상세포의 활성 측정Example 6: Measurement of dendritic cell activity in a culture dish and a hybrid fiber support

5~6주령이 된 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수세포를 분리하고 분리된 골수세포(1x106 cells/ml)를 RPMI-1640배지(10% 소 태아혈청,100 U/ml 페니실린,100 μg/ml 스트렙토마이신 함유)에 분사하여 배양기(10% CO2, 37℃)에서 배양하였다.Bone marrow cells were isolated from the thighs and calves of mice aged 5 to 6 weeks old and isolated bone marrow cells (1x10 6 cells / ml) were cultured in RPMI-1640 medium (10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml Streptomycin) and cultured in an incubator (10% CO 2, 37 ° C).

수지상세포로 분화 유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. 특이적 단백질 표면인자인 CD11c 및 MHC class II를 이용하여 분화된 수지상 세포를 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분화된 수지상 세포를 분리하였다. For induction of differentiation into dendritic cells, 15 ng / ml granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 15 ng / ml interleukin-4 (IL-4) were co-cultured for 7 days. Differentiated dendritic cells were identified using CD11c and MHC class II, which are specific protein surface factors, and CD11c microbeads were used to separate differentiated dendritic cells.

배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서, 세포활성화를 위하여 LPS (100 ng/ml)를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에 대하여 수지상세포의 PE 형광를 붙인 성숙화마커인 MHC-II 항체를 사용하여 수지상세포의 분화 및 성숙화의 유도를 관찰하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11을 참고하면, 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 CD11c 양성인 세포 및 MHC-II를 발현하는 세포는 붉은색으로 염색되는 것을 확인하였다. On the culture plate and hybrid fiber scaffold, MHC-II antibody, which is a maturation marker with PE fluorescence attached to dendritic cells, was used for cell activation and control groups treated with LPS (100 ng / ml) And induction of maturation. The results are shown in Fig. Referring to FIG. 11, it was confirmed that CD11c positive cells and MHC-II expressing cells in the culture dish and the hybrid fiber support were stained red.

도 12는 Actin에 대한 항체를 사용하여 형광 염색한 뒤, 수지상세포의 분화 및 성숙화의 유도를 고배율로 관찰하여 그 결과를 나타낸 것으로, 성숙화된 수지상세포에서 다양한 세포질 돌기가 3차원 방향으로 뻗어져 있는 것을 확인하였다. FIG. 12 shows fluorescent dyes using an antibody against Actin, followed by induction of differentiation and maturation of dendritic cells at a high magnification, showing that various cellular processes in matured dendritic cells are extended in three dimensions Respectively.

도 13은 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에 부착된 수지상세포의 활성화 정도에 따른 세포내 단백질 활성화 정도를 Focal adhesion kinase (FAK)로 인산화하여 형광염색한 뒤 관찰한 결과를 나타낸 것으로, 자극을 받지 않은 수지상세포(iDC)의 인산화된 FAK의 분포는 2D의 배양접시에서 배양한 경우 세포막 주위로 둥글게 나타났으나 3D 하이브리드 섬유 지지체에서는 나노섬유와 부착하는 부위에 잘 나타남을 확인할 수 있다. 또한 수지상 세포를 LPS로 자극을 주었을 경우(mDC) 2D의 배양접시에서 배양한 수지상 세포의 인산화된 FAK는 세포부착면에 따라서 patch 형으로 나타났으나, 하이브리드 나노섬유 지지체에서 자극을 받았을 때는 섬유면에 접촉한 세포표면에 집중적으로 증가하는 것으로 나타났다.
FIG. 13 shows the results of fluorescence staining of the dendritic cells with a degree of activation of the dendritic cells attached to the culture dish and the hybrid fiber support, followed by fluorescence staining with Focal adhesion kinase (FAK) The distribution of phosphorylated FAK in cells (iDC) was rounded around the cell membrane when cultured in a 2D culture dish, but in the 3D hybrid fibrous scaffold, it appeared well at the site of adherence with the nanofibers. In addition, when dendritic cells were stimulated with LPS, the phosphorylated FAK of dendritic cells cultured in (mDC) 2D dish appeared patch-like on the cell attachment surface, but when stimulated by hybrid nanofiber scaffold, Of the cell surface.

실시예 7: 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 BrdU를 이용한 세포증식 측정Example 7: Measurement of cell proliferation using BrdU in a culture dish and a hybrid fiber support

일반적으로 세포증식을 측정하는 방법으로서 세포주기의 S-상에서 DNA 복제가 얼마나 잘 일어나는지를 측정하는 BrdU 에세이를 주로 사용한다. 이에 본 실시예에서는 2D 배양접시와 3D 하이브리드 섬유 지지체에서 혈청의 유무에 따라 암세포의 증식정도를 비교 측정하였다. 이를 위해, 2D 배양접시와 3D 하이브리드 섬유 지지체에 CT-26 대장암세포(2ㅧ105 cells/100μl)을 넣고, 24시간 동안 혈청을 무 첨가하여 배양하였다. 그리고 각각 혈청을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹을 4시간 이상 배양한 후에 BrdU(sigma)를 넣고 4시간 동안 반응시켰다. In general, the BrdU assay is used to measure how well the DNA replication occurs on the S-phase of the cell cycle as a measure of cell proliferation. Thus, in the present embodiment, the degree of proliferation of cancer cells was measured according to the presence or absence of serum in a 2D culture dish and a 3D hybrid fiber support. For this, CT-26 colon cancer cells (2 × 10 5 cells / 100 μl) were added to a 2D culture dish and a 3D hybrid fiber support, and the cells were cultured for 24 hours without addition of serum. After incubation for 4 hours or longer, the cells were treated with BrdU (Sigma) for 4 hours.

다음으로 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, BrdU 항체(Cell Signaling사, 1000배 희석)를 넣고 염색을 한 후, 현미경으로 관찰하여 그 세포수를 측정하였다. 측정결과는 도 14에 나타내었는 바, 도 14를 참고하면, 2D 배양접시에서 배양한 세포의 증식은 혈청을 첨가함으로써 2배 증가하는 것을 확인할 수 있었지만, 3D 하이브리드 섬유 지지체에서 혈청 첨가에 의한 세포의 증식은 더디게 일어나는 것을 관찰하였다.
Next, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde, stained with BrdU antibody (Cell Signaling, 1000-fold dilution), and then observed with a microscope to measure the number of cells. The results of the measurement are shown in FIG. 14. As shown in FIG. 14, it can be confirmed that the growth of the cells cultured in the 2D culture dish is doubled by the addition of serum. However, in the 3D hybrid fibrous scaffold, Proliferation was observed to occur slowly.

실시예 8. 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 세포증식 확인을 위한 CCK-8 측정 Example 8. Measurement of CCK-8 for confirming cell proliferation in a culture dish and a hybrid fiber support

세포의 증식을 측정하는 또 다른 방법으로서, CCK-8을 사용하여 배양접시, 고밀도 섬유 지지체, 하이브리드 섬유 지지체에서 혈청의 첨가 유무에 따른 세포의 증식을 6일 동안 관찰하였다. 각각의 경우에 CT-26 대장암세포를 1x103개 배양하였다. As another method for measuring cell proliferation, CCK-8 was used to observe cell proliferation with or without addition of serum in a culture dish, a high-density fiber support, and a hybrid fiber support for 6 days. In each case, 1 x 10 3 CT-26 colon cancer cells were cultured.

도 15는 상기 배양에 따른 세포증식을 그래프로 나타낸 것으로, 배양 3일 후 부터 혈청이 첨가된 배지에서 세포의 증식이 증가하기 시작하였는데, 하이브리드 섬유 지지체에서 배양한 CT-26 대장암세포는 배양접시에서 보다는 느리게 증식하였으나 고밀도 섬유 지지체에서 보다는 빠르게 증식함을 확인하였다.
FIG. 15 is a graph showing cell proliferation according to the culture. From the third day after the culture, cell proliferation began to increase in the medium supplemented with serum. CT-26 colon cancer cells cultured on a hybrid fiber support were cultured on a culture plate But it proliferated more rapidly than in high density fibrous scaffolds.

실시예 9: 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 암세포 및 수지상세포의 공배양 및 세포간 연결 관찰Example 9: Co-culture and intercellular junction of cancer cells and dendritic cells in a culture dish and a hybrid fiber support

배양접시와 하이브리드 나노섬유 지지체에 CT-26 대장암세포를 배양하고 항암제인 mitoxanthrone을 1 μg/ml을 넣고 1시간 동안 반응시킨 후 배양액으로 세척을 하고 다시 18시간 배양한 다음 여기에 암세포와 수지상세포를 5:1 비율로 혼합하여 세포의 모양을 관찰하였다(도 16). CT-26 colon cancer cells were cultured on a culture plate and a hybrid nanofiber support, and mitoxanthrone (1 μg / ml) was added for 1 hour. The cells were washed with the culture solution and cultured for 18 hours. Then, cancer cells and dendritic cells 5: 1 ratio to observe the shape of the cells (Fig. 16).

도 16을 참고하면, 하이브리드 섬유 지지체에서 수지상세포가 항암제를 처리하여 죽어가는 CT-26 대장암 세포 쪽으로 이동하기 위하여 수지상 세포질을 뻗고 있는 것을 3차원적으로 관찰할 수 있었다.
Referring to FIG. 16, it was possible to three-dimensionally observe that the dendritic cells in the hybrid fiber support stretch the dendritic cytoplasm to migrate to dying CTC-26 colon cancer cells by treating with anticancer agents.

실시예 10: 배양접시 및 하이브리드 섬유 지지체에서 마우스 림프종 조직으로부터 분리한 조직세포의 배양Example 10: Culture of tissue cells isolated from mouse lymphoma tissue on a culture plate and a hybrid fiber support

B16 마우스 흑생종 암세포를 C57/BL6 마우스에 1x106개를 피하주사하고 7일 후 발생한 암조직을 분리하였다. Collagenase 처리를 한 조직에서 추출한 조직의 모든 세포를 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 각각 배양한 후 PE가 결합된 CD45 항체(붉은색)와 FITC결합 actin(녹색)과 DAPI로 염색(푸른색)하여 암조직 세포의 형태를 확인하여 그 결과를 도 17에 나타내었다. 이 때, 세포의 증식은 BrdU 기법을 사용하였다. B16 mouse melanoma cancer cells were subcutaneously injected into C57 / BL6 mice at 1 × 10 6 cells, and cancer tissues were isolated after 7 days. All cells of the tissue extracted from the collagenase-treated tissue were cultured on a culture plate and a hybrid fiber support, and stained with blue-colored CD45 antibody (red), FITC-conjugated actin (green) and DAPI The morphology of the tissue cells was confirmed and the results are shown in Fig. At this time, the cell proliferation was performed using the BrdU technique.

도 17을 참고하면, 녹색 염색이 확인되는 것으로 보아 배양접시와 하이브리드 섬유 지지체에서 암조직 세포의 성장을 확인할 수 있다.
Referring to FIG. 17, the green staining was confirmed, and the growth of cancer tissue cells in the culture dish and the hybrid fiber support can be confirmed.

실시예 11: 콜라겐에 의한 하이브리드 섬유 지지체내 세포의 침윤 측정Example 11 Measurement of Infiltration of Hybrid Fiber Supported Cells by Collagen

본 실시예에서는 하이브리드 섬유 지지체에 세포외 기질 성분인 콜라겐을 첨가하여 코팅하였을 때, 세포의 침윤 및 분포에 영향이 있는가를 확인하였다. In this example, it was confirmed whether there was an effect on cell infiltration and distribution when the extracellular matrix collagen was coated on the hybrid fiber support.

이를 위해 고밀도 섬유 지지체를 다양한 농도의 형광염색한 콜라겐으로 처리하고, 12시간 정도 방치하여 상기 고밀도 섬유 지지체를 콜라겐으로 코팅한 후, CT-26 대장암 세포를 배양하였다. For this purpose, high-density fibrous scaffolds were treated with fluorescent stained collagen at various concentrations, and the high-density fibrous scaffolds were coated with collagen for 12 hours. Then, CT-26 colon cancer cells were cultured.

도 18에 상기 대장암세포를 배양 후 지지체 내에 분포하는 세포를 측정한 결과를 나타내었고(A), 콜라겐으로 코팅한 고밀도 섬유 지지체에서 배양한 암세포의 형태적인 특징적 그림의 데이터를 나타내었는(B) 바, 0.03%의 콜라겐을 처리하였 때 고밀도 섬유 지지체 내로 세포의 침투가 현저하였으며, 세포의 분포가 일정하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. FIG. 18 shows the result of measuring the cells distributed in the supporter after culturing the colon cancer cells (A) and FIG. 18 (B) showing the morphological characteristic data of the cancer cells cultured in the collagen- , And 0.03% collagen, the penetration of the cells into the high-density fibrous support was remarkable, and the distribution of the cells was constant.

또한, 도 19는 상기 콜라겐으로 코팅한 고밀도 섬유 지지체에 배양한 후(A), 콜라게나제를 처리한 후(B), 다시 트립신 EDTA를 처리한 후(C)를 나타낸 것이다. 고밀도 섬유 지지체에서의 세포들은 콜라게나제와 트립신 EDTA 처리에 의하여 대부분 탈착되는 것을 관찰할 수 있었다. Fig. 19 shows (C) after (A) culturing on a high-density fibrous support coated with collagen, (B) after treatment with collagenase, and (c) treatment with trypsin EDTA. Cells in high density fibrous scaffolds were mostly desorbed by collagenase and trypsin EDTA treatment.

또한, 도 20은 적색형광인 rhodamine을 섞어서 제작한 하이브리드 섬유 지지체에 콜라겐을 얹고 코팅을 한 후 콜라겐이 잘 코팅되는가를 확인하기 위하여 FITC가 결합된 콜라겐을 0.03%로 하이브리드 섬유 지지체에 첨가하여 상기 지지체에 코팅된 것을 형광현미경으로 확인한 데이터를 나타낸 것이다. 도 20을 참고하면, 하이브리드 섬유 지지체가 녹색의 형광물질로 균일하게 코팅되는 것을 확인할 수 있다. FIG. 20 shows the results obtained by adding collagen bonded with FITC to the hybrid fiber support in an amount of 0.03% in order to confirm whether the collagen was coated after coating with a collagen on the hybrid fiber support prepared by mixing rhodamine as a red fluorescence, The results are shown in the data obtained by fluorescence microscopy. Referring to FIG. 20, it can be confirmed that the hybrid fiber support is uniformly coated with a green fluorescent material.

또한, 도 21은 고밀도 섬유 지지체 및 하이브리드 섬유 지지체에 콜라겐을 얹었을 때 농도에 따른 지지체 내 콜라겐 코팅정도를 공초점 현미경의 여러 기법을 사용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이를 참고하면, 여러 농도의 FITC-결합 콜라겐을 나노섬유 지지체 위에 얹고 24시간 뒤에 Range selection, Ortho, 2.5D, Z-stack-gallery, 및 Z-stack-3D의 분석법으로 콜라겐의 코팅정도를 고밀도 나노섬유 지지체와 하이브리드 나노섬유 지지체에서 비교분석하였을 때 하이브리드 섬유 지지체가 더욱 깊이 염색되는 것으로 나타났고, 0.03%에서 보다 깊이 코팅되는 것으로 확인되었다. 21 shows the results of measurement of the degree of collagen coating in the supporter by using various techniques of a confocal microscope when the collagen is placed on the high-density fiber support and the hybrid fiber support. As a result, the FITC-bound collagen was placed on a nanofiber support, and after 24 hours, the degree of coating of the collagen was measured by the method of Range selection, Ortho, 2.5D, Z-stack- Compared with the fibrous support and the hybrid nanofiber support, the hybrid fiber support was found to be dyed more deeply and to be more deeply coated at 0.03%.

또한, 도 22는 고밀도 섬유 지지체 및 하이브리드 섬유 지지체의 콜라겐 코팅 유무에 따라 공초점 현미경의 z-stack으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 콜라겐으로 코팅을 한 경우 세포들은 더욱 깊숙한 곳에 위치하는 것으로 관찰되었다.
FIG. 22 shows the z-stack of the high-density fiber support and the hybrid fiber support with or without the collagen coating, and it was observed that the cells were located deeper when coated with collagen.

실시예 12: 콜라겐에 의한 지지체내 세포의 침윤 측정 1Example 12 Measurement of Infiltration of Cells in Support by Collagen 1

콜라겐 0.03%를 코팅하고 고밀도 섬유 지지체와 하이브리드 섬유지지체에서 CT-26 대장암세포 및 A20 림프종세포를 24시간 동안 각각 배양한 후 세포의 침윤정도를 관찰하기 위하여 측정하였다. 0.03% of collagen and CT-26 colon cancer cells and A20 lymphoma cells were cultured in high density fiber support and hybrid fiber support for 24 hours, respectively.

이 때, 주사전자현미경 촬영을 위한 전 처리과정으로 각각의 섬유 지지체에 부착된 CT-26 대장암세포 및 A20 림프종세포는 4% 포름알데하이드로 하루 동안 고정을 하고 동결건조를 시킨 뒤 부착된 모양을 관찰하였다.At this time, CT-26 colon cancer cells and A20 lymphoma cells adhered to each fibrous scaffold as a pretreatment for scanning electron microscopy were fixed with 4% formaldehyde for a day, lyophilized, and observed attached Respectively.

또한, 도 23a 및 도 23b에 상기 관찰결과를 나타내었는 바, 고밀도 섬유 지지체보다 하이브리드 섬유 지지체 내로 세포가 더 침윤되어 있는 것을 확인할 수 있다.
23A and 23B show the results of the observation, it can be confirmed that cells are more intruded into the hybrid fiber support than the high-density fiber support.

실시예 13: 콜라겐에 의한 지지체내 세포의 침윤 측정 2Example 13 Measurement of Infiltration of Cells in Support by Collagen 2

콜라겐을 코팅한 것과 코팅을 하지 않은, 2D 배양접시와 3D 하이브리드 섬유 지지체에 각각 수지상세포를 넣고 24시간 동안 배양하고, 수지상세포의 성숙화 정도를 FITC가 결합된 액틴 항체를 사용하여 세포의 모양을 관찰하였다. 또한, LPS에 의해 활성화된 수지상세포는 PE가 결합된 MHC-II 항체를 염색하여 확인하였다. 그 결과는 도 24에 나타내었다.Dendritic cells were plated on collagen-coated and uncoated 2D culture dishes and 3D hybrid fiber supports, respectively, and cultured for 24 hours. The degree of maturation of dendritic cells was measured using FITC-conjugated actin antibody Respectively. In addition, dendritic cells activated by LPS were identified by staining PE-bound MHC-II antibody. The results are shown in Fig.

도 24를 참고하면 콜라겐 코팅에 의하여 수지상세포가 지지체 섬유를 따라 뻗어있는 모양을 확인할 수 있고, LPS에 의하여 활성화가 이루어진 것을 확인할 수 있다.
Referring to FIG. 24, it can be confirmed that the dendritic cells are stretched along the support fibers by the collagen coating, and activation by LPS can be confirmed.

이와 같은 실시예의 결과로부터 본 발명의 나노-마이크로 하이브리드섬유기반 세포배양 구조체는 3차원 매트릭스 구조의 매트형상의 하이브리드 섬유로 이루어진 지지체에 의하여 1종 이상의 세포를 동시에 3차원적으로 배양할 수 있는 것으로 기대된다. 이에 따라 상기 세포배양 구조체는 배양된 세포의 침윤·부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동의 측정·분석이 가능한 에세이칩으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
From the results of these examples, it can be concluded that the nano-microhybrid fiber-based cell culture construct of the present invention is capable of three-dimensionally culturing one or more cells simultaneously by a support made of a mat- do. Accordingly, the cell culture construct may be used as an assay chip capable of measuring and analyzing the infiltration / adhesion of the cultured cells, the morphology of the cells, the intercellular junction, or the intercellular movement.

이상 본 발명은 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.While the present invention has been described with reference to the particular embodiments and drawings, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It is to be understood that various changes and modifications may be made without departing from the scope of the appended claims.

Claims (21)

세포배양용 고분자섬유 지지체의 제조방법이고,
집적판으로서 그리드 형상 금속메쉬판을 포함하는 전기방사장치를 이용하여 고분자용액을 전기방사함으로써 메쉬를 구성하는 금속선의 주변으로 고분자섬유를 집적하되, 상기 집적판을 지그재그 경로로 이송시켜 3차원 구조의 균일한 두께를 갖는 매트 형상으로 고분자섬유 지지체를 제조하는,
상기 지지체 내로 세포의 침윤·부착이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체의 제조방법.A method for producing a polymeric fibrous scaffold for cell culture,
The polymer fibers are accumulated on the periphery of the metal wire constituting the mesh by electrospinning the polymer solution using the electrospinning device including the grid-like metal mesh plate as the integrated plate, and the integrated plate is transferred through the zigzag path, A method for producing a polymer fiber support in a mat shape having a uniform thickness,
Wherein the support is capable of infiltrating and adhering cells into the support. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 21. &lt; / RTI &gt; 제 1 항에 있어서,
상기 제조된 고분자섬유 지지체는 100~999 nm의 직경을 가지는 고분자섬유 55~85 중량%와 1~1.5 ㎛의 직경을 가지는 고분자섬유 15~45 중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the polymeric fiber substrate comprises 55 to 85% by weight of a polymer fiber having a diameter of 100 to 999 nm and 15 to 45% by weight of a polymer fiber having a diameter of 1 to 1.5 탆. (Preparation method of microhybrid polymer fiber support). 제 1 항에 있어서,
상기 고분자섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 코팅된 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체의 제조방법.The method according to claim 1,
The polymer fibers may be selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate) (PHBV), polydioxanone (PDO), poly [ (L-lactide) -co- (caprolactone), poly (ester urethane) (PEUU), poly (L-lactide) At least one biocompatible polymer selected from the group consisting of polyvinyl alcohol (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline Or a copolymer thereof, or a mixture thereof, in the preparation of a nano-microhybridized polymeric fiber support for cell culture Law. 제 1 항에 있어서,
상기 지지체는 50~500 마이크로미터 균일한 두께를 갖는 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the support has a uniform thickness of 50 to 500 micrometers. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 8. &lt; / RTI &gt; 제 1 항에 있어서,
상기 고분자섬유 지지체의 제조시,
상기 고분자섬유를 집적한 후, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물을 처리하여 코팅하여 고분자섬유 지지체를 제조하는 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체의 제조방법.The method according to claim 1,
In the production of the polymer fiber support,
After the polymer fibers are integrated, one or more biocompatible polymers selected from the group consisting of chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen and cellulose, or copolymers thereof, or a mixture thereof is treated and coated to form a polymer fiber support Wherein the nanofibrous nanofibers are fabricated by a method comprising the steps of: 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되고, 지지체 내로 세포의 침윤·부착이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체.A nano-microhybrid polymer fiber support for cell culture, which is produced by the method according to any one of claims 1 to 5 and is capable of infiltrating / adhering cells into a support. 기판; 상기 기판 상에 형성된 고분자 코팅층; 및 상기 고분자 코팅층 상에 제6항에 따른 세포배양용 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체를 부착하여 형성된 세포배양용 지지체층을 포함하고, 상기 지지체층은, 상기 지지체 내로 세포의 침윤·부착이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포분석용 에세이칩.Board; A polymer coating layer formed on the substrate; And a cell culture support layer formed by adhering the nano-microhybrid polymer fiber support for cell culture according to claim 6 on the polymer coating layer, wherein the support layer is capable of infiltrating / adhering cells into the support Feature essay chip for cell analysis. 제 7 항에 있어서,
상기 고분자 코팅층은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 세포분석용 에세이칩.8. The method of claim 7,
The polymer coating layer may be formed of a material selected from the group consisting of polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethylmethacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), cellulose and silicone rubber Wherein the nano-microhybrid polymer scaffold is formed from at least one selected from the group consisting of: 제8항에 따른 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법으로서,
1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 이용하여 상기 세포배양용 지지체층에 상기 세포를 부착하여 배양하는 제1 단계; 및
상기 제1 단계를 거친 후, 상기 지지체층 내로 상기 배양된 세포의 침윤· 부착, 세포의 형태, 세포간 연결 또는 세포간 이동을 측정· 분석하는 제2 단계;를 포함하여 이루어지고,
상기 분석은 세포의 손상, 사멸, 증식, 활성 또는 세포간 상호작용을 분석하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. A cell analysis method using the nano-microhybrid polymer fiber support-based assay chip according to claim 8,
A first step of attaching and culturing the cells to the cell culture support layer using one or more kinds of cells or a culture solution of the cells; And
And a second step of measuring and analyzing the infiltration and adhesion of the cultured cells, the morphology of the cells, the intercellular junctions, or the intercellular movement of the cultured cells into the support layer after the first step,
Wherein said assay is for analyzing cell damage, death, proliferation, activity, or intercellular interactions. &Lt; Desc / Clms Page number 20 &gt; 제 9 항에 있어서,
상기 제1 단계는, 상기 지지체층에 형광염색제를 더 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 10. The method of claim 9,
The method of claim 1, wherein the first step comprises culturing the support layer by further injecting a fluorescent dye into the support layer, and culturing the nano-microhybrid polymer fiber support-based assay chip. 제 9 항에 있어서,
상기 제1 단계는, (a) 면역세포 또는 이를 포함하는 세포 배양액과 (b) 질환세포 또는 이를 포함하는 세포 배양액을 이용하여, 상기 세포배양용 지지체층에 상기 면역세포 및 질환세포를 동시에 부착·배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 10. The method of claim 9,
The first step includes the steps of: (a) immune cells or a cell culture fluid containing the same, and (b) a disease cell or a cell culture fluid containing the same, Wherein the nano-micro hybrid polymeric fiber support-based essence chip is used for culturing the cell. 제 11 항에 있어서,
상기 제1 단계는, 상기 지지체층에 면역세포의 활성화제 또는 질환세포의 치료제를 더 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 12. The method of claim 11,
The method of claim 1, wherein the first step further comprises culturing the support layer with an immune cell activator or therapeutic agent for disease cells. 제 11 항에 있어서,
상기 면역세포는 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 12. The method of claim 11,
Wherein the immune cells are at least one selected from the group consisting of macrophages, dendritic cells, NK cells, T cells, and B cells. 제 11 항에 있어서,
상기 질환세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 12. The method of claim 11,
Wherein the disease cell comprises a disease-induced cell. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 21. &lt; / RTI &gt; 제 11 항에 있어서,
상기 질환세포는 암세포인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 12. The method of claim 11,
Wherein the disease cell is a cancer cell. The method according to claim 1, wherein the disease cell is a cancer cell. 제 12 항에 있어서,
상기 질환세포는 암세포이고, 상기 질환세포의 치료제는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인 것을 특징으로 하는, 나노-마이크로 하이브리드 고분자섬유 지지체 기반 에세이칩을 이용한 세포분석방법. 13. The method of claim 12,
The disease cell is a cancer cell, and the therapeutic agent for the disease cell is at least one selected from the group consisting of doxorubicin, etoposide, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin, wherein the compound is at least one anticancer agent selected from the group consisting of teniposide, amsacrine, epirubicin, merbarone, and piroxantrone hydrochloride. Cell Analysis Method Using Polymer Fiber Supported Essay Chip. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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