KR101451117B1 - 형질감염된 세포의 대사적 선별을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 선별 마커 벡터 및 이들 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 안정한 유전자 발현 시스템을 구축하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 형질감염된 세포를 선별하기 위한 대사 선별 마커로서, 3-케토스테로이드 리덕타제와 같이, 진핵 세포 스테롤/콜레스테롤 생합성 경로에서 유용한 임의의 효소를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. 한 양태에서, 당해 방법은 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 세포를, 3-케토스테로이드 리덕타제 및 하나 이상의 이형성 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염시키는 단계 및 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하는 능력을 지니고/지니거나 화학적으로 한정되고/되거나 무혈청 배지에서 당해 세포중에 이형성 단백질을 생산하는 세포를 선별하는 단계를 포함한다.

콜레스테롤, 3-케토스테로이드 리덕타제, 무혈청 배지

Description

형질감염된 세포의 대사적 선별을 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for metabolic selection of transfected cells}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2005년 5월 18일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/681,969호를 35 U.S.C. ξ119(e)하에 우선권으로 주장하고 이는 본원에 참조로서 인용된다.

본 발명은 신규 선별 마커 벡터, 및 당해 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 안정한 유전자 발현 시스템을 생성하는 방법에 관한 것이다.

포유동물 세포 배양 기술의 발달은 생물학적 연구에 급격한 변화를 가져다 주었다. 세포 배양 시스템은, 인간 임상 시험이 매우 위험한 경우, 개발 초기 단계에서 신규 약물의 독성 또는 효능을 시험하기 위해 사용될 수 있고, 모노클론 항체와 같은 치료학적 응용을 위한 복잡한 인간 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있으며, 성체 및 배아 줄기 세포 배양 측면에서 세포 기반 치료를 위한 토대로서 사용될 수 있다. 추가로, 이형성 재조합 DNA를 배양 세포주에 도입하는 능력은 과학자에게 실험용 동물 시스템을 조작하기 위한 강력한 보조 도구를 제공한다.

최근에, 생분자를 발현함에 이어서 치료학적 생성물을 제조하기 위해 사용되는 세포주의 오염에 대한 규제 문제를 해결할 필요성이 보다 중요해졌다. 생물공학 산업은 잠재적인 동물 병원체 또는 발병 동물 단백질이 차후의 생물제제를 통해 인간 집단에 도입되지 않도록 보장하기 위해 대체로 시판되는 세포 배양용 FBS-보충 배지의 사용을 기피하고 있다. 무혈청 배지는 포유동물 세포, 특히 생물학적 생성물 보급에서 유전자 발현 및 단백질 정제용으로 사용되는 포유동물 세포를 배양하기 위한 표준 프로토콜이 되어가고 있다.

NS-0 마우스 골수종 세포주는 일반적으로 론자(Lonza)의 GS 유전자 발현 시스템(Lonza Group, Basel, Switzerland)과 같은 단백질 발현 시스템에 사용되고 있다. GS 유전자 발현 시스템은 NS-0 세포가 충분한 글루타민을 생산하지 못하여 외부에서 글루타민을 배양 배지에 첨가해주지 않으면 생존할 수 없다는 것을 활용한 것으로서 플라스미드 벡터를 사용한 세포 형질감염을 위한 마커로서 효소인 글루타민 신테타제(GS)를 사용하고 있다.

NS-0 세포는 또한 콜레스테롤 영양요구성이고, 이로써 세포주의 성장을 지지하기 위해 사용되는 배지에는 콜레스테롤 및 글루타민 모두가 보충되어야만 한다. 외인성 콜레스테롤을 수성 배지에 첨가하는 것은 복잡하고 시간 소모적인 과정인데 그 이유는 수성 용해도를 증가시키기 위해 지질이 사이클로덱스트린과 같은 당 잔기에 커플링되어야만 하기 때문이다. 추가로, 커플링 과정은 본래 불안정하여 콜레스테롤 보충된 성장 배지는 보관 수명이 매우 짧다. 추가로, 화학적으로 한정된 무혈청 배지(CD-SFM)를 태아 소 혈청 보충된 배지(FBS) 대신 사용하여 콜레스테롤 영양요구성 세포주를 배양하는 경우, 흔히 콜레스테롤 침전이 일어난다. 결국, 콜레스테롤은 중합체와의 고유 친화성으로 인해, PES와 같은 작은 공극 멸균 막을 통해 용이하게 여과될 수 없어 최종 여과된 배지내의 콜레스테롤의 양이 상당히 감소하게 된다. 추가로 이러한 문제 때문에 배치 마다 제조되는 콜레스테롤 보충 배지에는 일관성이 없다. 외인성 콜레스테롤을 필터에 통과시키지 않고 직접 배지에 첨가하게 되면 우발적 제제 및/또는 내독소와 같은 오염물을 도입시킬 가능성을 또한 증가시킨다.

NS-0 세포의 콜레스테롤 영양요구성에 기반이 되는 분자 기작은 최근에 동정되고 이의 특성이 규명되었다[문헌참조; European Collection of Cell Cultures-ECACC, No. 85110503, Deposited by Dr J Javis, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, 73B(3) Methods in Enzymology(1981)]. 세포주는 콜레스테롤의 내인성 합성 단계를 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자를 발현하지 않는다. 3-케토스테로이드 리덕타제(3-KSR)로 호칭되는 효소는 베타-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 큰 계열의 한 구성원으로서 특정 유전자에 의해 암호화되어 있다. 3-KSR 단백질은 자이모스테론을 콜레스테롤의 전구체인 자이모스테롤로 전환시키는 것을 촉매한다[문헌참조: Marijianovic et al., 17(9) MOL. ENDOCRINOL. 1715-25(2003)]

배양 프로토콜이 보다 효율적이고 수성 배지에서 성공적인 콜레스테롤 용해도에 덜 의존하도록 하기 위한 목적으로 다수의 상이한 방법이 NS-0 세포의 콜레스테롤 영양요구성을 해결하기 위해 제안되었다. 한가지 방법은 동물 유래 콜레스테 롤 대신에 식물 유래 또는 합성 지질을 사용하여 CD 배지를 보충하는 것이다[문헌참조: Gorfien et al., 16(5) BIOTECHNOL. PROG. 682-7(2000)]. 또 다른 방법은 NS-0 세포를 가공하여 3-KSR을 과발현시켜 효소적 결핍을 복구시키고 세포주가 외인성 콜레스테롤의 부가없이 배양될 수 있도록 하는 것이다[문헌참조: Seth et al., 121(2) J. BIOTECHNOL. 241-52(2006)]. 최종적으로, 연구자는 NS-0 세포에서 3-KSR 유전자 불활성에 대한 분자적 기초를 조사하고, 3-KSR 유전자의 전사적 억제를 경감시키는, 중요한 업스트림 조절 영역을 탈메틸화하여 유전자의 발현을 회복시키고자 하고 있다[문헌참조: Seth et al., 93(4) BIOTECHNOL. BIOENG. 820-27(2006)].

그럼에도 불구하고, 이형성 분자를 발현할 수 있는 화학적으로 한정된/무혈청 배지에서 발현 벡터로 형질감염시킴을 통해 안정한 세포주를 생성할 필요성이 생물공학 산업에서 여전히 크게 요구되고 있다. 더욱이, 문제점인 외부에서 콜레스테롤을 첨가할 필요 없이 화학적으로 한정된/무혈청 배지가 즉각적으로 사용가능한 것이 크게 요망되고 있다. 본 발명은 진핵 세포의 스테롤 또는 콜레스테롤 생합성 경로에서 효소를 암호화하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터를 제공하여 세포에게 생존 능력 및 화학적으로 한정되고/되거나 무혈청 배지상에서 배양될 수 있는 능력을 부여하는 것이다. 이러한 발현 벡터가 또한 이형성 단백질 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 당해 벡터는 화학적으로 한정되고/되거나 무혈청 배지에서 생산될 수 있는 이형성 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 형질전환된 세포를 선 별하는 대사적 선별 마커로서 유용하다.

요약

본 발명은 신규 대사 선별 마커 벡터 및 이들 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 안정한 유전자 발현 시스템을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체 및 이형성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명은 추가로 당해 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 또한, 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체를 포함하는 벡터; 및 임의로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 다수의 숙주 세포중 하나 이상; 화학적으로 한정된 무혈청 배지; 낮은 시딩(seeding) 및 낮은 클론 밀도에서 다수의 숙주 세포의 성장을 지지하는 성장 보충물; 및 키트를 사용하기 위한 하나 이상의 프로토콜 또는 지침서 중 하나 이상을 포함하는 키트를 포함한다.

본 발명은 추가로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 진핵 세포를, 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체 및 임의로, 이형성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계 및 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하는 능력을 갖는 세포를 선별하는 단 계를 포함하는, 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 세포를 선별하는 방법을 포함한다.

본 발명은 추가로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 진핵 세포를, 3-KSR과 같은 효소, 및 이형성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기된 바와 같은 벡터로 형질감염시키는 단계 및 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하는 능력을 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하고 이형성 단백질을 생산하는 능력을 갖는 세포를 수득하는 방법을 포함한다.

도 1A - 1J는 3-KSR 유전자의 생성물에 의해 부분적으로 매개되는, 진핵 세포 특히, 포유동물 스테롤 생합성을 위한 생화학적 경로를 도시한다.

도 2는 p3-KSR 발현 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.

도 3은 직렬(tandem)로 클로닝된 온전한 인간 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 함유하는 p3-KSR:mAbVL:mAbVH 발현 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.

도 4는 p3-KSR로 클로닝된 재조합 유전자 컨스트럭트(rec_유전자)의 한 예인 p3-KRS:rec_유전자의 플라스미드 맵을 도시한다.

도 5는 p3-KSR 발현 벡터의 다중 클로닝 영역에서 6개의 가능한 항체 유전자 카세트 발현 배향의 한 예를 제공하는 pBFKSR.1HUMAB를 도시한다.

본 발명은 다양할 수 있음으로 본원에 기재된 특정 방법 및 성분에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 기술은 단지 특정 양태를 기술할 목적으로 사용된 것이고 본 발명의 범위를 제한시키고자 한 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본원 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 명백하게 달리 기술하지 않는 이상 복수의 개념을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오타이드"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 언급하고 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다. 용어 "벡터"는 외래 또는 이형성 DNA의 수용체로서 재조합 DNA 실험에 사용되는 플라스미드인 "플라스미드" 또는 "플라스미드 클로닝 벡터"로서 언급되기도 하는 자가 복제 DNA 분자를 언급한다. 이형성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 증상 또는 질환을 치료하는데 유용하거나 시약으로서 유용한 임의의 단백질을 포함하는 것으로 의도된다.

달리 정의되지 않은 경우, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일하다. 특정 방법, 장치 및 물질이 기재되어 있지만, 당업자들에게 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있다.

본 발명은 효소가 결핍된 진핵 세포내 대사적 선별 유전자로서, 포유동물 스테롤 생합성 경로의 효소를 사용함에 의해 형질감염된 세포의 대사적 선별에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 당해 성질들을 갖는 진핵 세포는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 통상적으로 세포에 의해 생성되지 않는 또 다른 분자와 같은 이형성 분자의 생산에 유용하다. 특히, 본 발명은 외인성 콜레스테롤 또는 진핵 세포 콜레스테롤 생합성 경로에서 3-KSR의 다운스트림에 위치한 콜레스테롤의 임의의 전구체가 결핍된 배지에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 이형성 분자의 생산을 위해 3-KSR이 결핍된 진핵 세포주의 생성에서, 대사적 선별 유전자로서 3-케토스테로이드 리덕타제(3-KSR)를 사용한다. 3-KSR에 의해 부분적으로 매개되는 포유동물 스테롤 생합성을 위한 생화학적 경로를 제공하는 도 1을 참조한다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 효소가 예를 들어, 3-KSR인, 도 1에 제공된 바와 같은 포유동물 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 3-KSR과 같은 효소를 발현하기 위한 벡터, 3-KSR과 같은 효소가 결핍된 세포주 및 형질 감염 과정에 사용하기 위한 세포 배양 배지 및 성장 보충물 및 본 발명의 상업적 활용을 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 변이체 및 이형성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다. 더욱 구체적으로, 당해 벡터에서 효소는 3-케토스테로이드 리덕타제(3-KSR), 더욱 상세하게는 마우스 3-KSR을 포함한다. 3-KSR을 암호화하는 특정 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 1을 포함하고 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2를 포함한다.

상기된 바와 같은 벡터는 바람직하게, 재조합 DNA 발현 벡터이고, 이것은 임의로, 전사 단위체가 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 조절하에 있는 생성물 유전자에 대한 하나 이상의 제1 전사 단위체를 추가로 포함한다. 발현 벡터내 기타 단위체 및 요소들에 대한 세부적인 사항은 본원에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 추가로, 상기된 바와 같은 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 진핵 세포이고 이것은 당업자에게 공지되어 있으며 원생생물(Protoctista), 진균류, 동물계(Animalia) 및 식물계(Plantae)를 포함한다. 따라서, 진균류, 식물 및 포유동물 세포는 적당한 숙주 세포로서 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 숙주 세포는 바람직하게 콜레스테롤에 대해 영양요구성이다. 본 발명에 유용한 특정 숙주 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215 세포이고 더욱 상세하게는 NS-0 마우스 골수종 세포이다.

본 발명은 또한, 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체를 포함하는 벡터; 및 임의로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 다수의 숙주 세포; 화학적으로 한정된 무혈청 배지; 낮은 시딩 및 낮은 클론 밀도에서 다수의 숙주 세포의 성장을 지지하는 성장 보충물; 및 키트를 사용하기 위한 하나 이상의 프로토콜 또는 지침서 중 하나 이상을 포함하는 키트를 포함한다. 상기된 바와 같이, 효소는 바람직하게 3-KSR이고 더욱 바람직하게는, 마우스 3-KSR이며, 벡터는 예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 효소를 암호화하는 유용한 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 효소의 아미노산 서열을 암호화한다. 키트내 벡터는 바람직하게, 재조합 DNA 발현 벡터이고 이것은 임의로 전사 단위체가 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 조절하에 있는 생성물 유전자에 대한 하나 이상의 제1 전사 단위체를 추가로 포함한다.

키트내 숙주 세포는 바람직하게, 화학적으로 한정된 무혈청 배지 및/또는 화학적으로 한정된 배지상에서 성장하도록 적응된, NS-0, NS-1 및 CHO-215, 더욱 바람직하게는, NS-0 마우스 골수종 세포이다.

키트는 추가로 지방산 비함유 BSA, 재조합 인간 인터류킨-t(rhIL-6), 재조합 인간 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트 및 에탄올아민중 하나 이상을 포함하는 성장 보충물을 임의로 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게, 성장 보충물은 선별 배지에서 지방산 비함유 BSA 약 0.1% 내지 약 5%, rhIL-6 약 1ng/ml 내지 약 9ng/mL, 재조합 인간 인슐린 약 5mg/ml 내지 약 15mg/L, 나트륨 셀레나이트 약 5㎍/L 내지 약 8㎍/L, 나트륨 피루베이트 약 0.01g/L 내지 약 0.3g/L 및 에탄올아민 약 0.5mg/L 내지 약 3.5mg/L을 최종 농도로 선별 배지에 포함한다. 더욱 바람직하게, 성장 보충물은 지방산 비함유 BSA 약 1%, rhIL-6 약 5ng/ml, 재조합 인간 인슐린 약 10mg/L, 나트륨 셀레나이트 약 6.7㎍/L, 나트륨 피루베이트 약 0.11g/L 및 에탄올아민 약 2.0mg/L을 최종 농도로 선별 배지에 포함한다.

본 발명은 추가로, 지방산 비함유 BSA 약 0.1% 내지 약 5%, rhIL-6 약 1ng/ml 내지 약 9ng/mL, 재조합 인간 인슐린 약 5mg/ml 내지 약 15mg/L, 나트륨 셀레나이트 약 5㎍/L 내지 약 8㎍/L, 나트륨 피루베이트 약 0.01g/L 내지 약 0.3g/L 및 에탄올아민 약 0.5mg/L 내지 약 3.5mg/L을 최종 농도로 선별 배지에 포함하는 세포 배양 보충 조성물을 포함한다. 추가로, 본 발명은 또한 지방산 비함유 BSA 약 1%, rhIL-6 약 5ng/ml, 재조합 인간 인슐린 약 10mg/L, 나트륨 셀레나이트 약 6.7㎍/L, 나트륨 피루베이트 약 0.11g/L 및 에탄올아민 약 2.0mg/L을 최종 농도로 선별 배지에 포함하는 세포 배양 보충 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 진핵 세포를, 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체 및 임의로, 이형성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계 및 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하는 능력을 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 세포를 선별하는 방법을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215이고 바람직하게 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포이고 배지는 화학적으로 한정된 무혈청 배지 또는 화학적으로 한정된 배지이다. 당해 방법에 유용한 효소는 3-KSR을 포함한다.

본 발명은 추가로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 진핵 세포를, 3-KSR과 같은 효소, 및 이형성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기된 바와 같은 벡터로 형질감염시키는 단계 및 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하는 능력을 갖는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존하고 이형성 단백질을 생산하는 능력을 갖는 세포를 수득하는 방법을 포함한다. 상기된 바와 같이, 세포는 콜레스테롤에 대해 영양요구성이고 바람직하게는 NS-0, NS-1 및 CHO-215이며, 더욱 바람직하게는, 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된 배지에서 배양될 수 있는 NS-0 마우스 골수종 세포이다.

본 발명은 추가로, 콜레스테롤에 대해 영양요구성인 진핵 세포를, 진핵 세포의 스테롤 생합성 경로에서의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 생물학적으로 활성인 이의 단편 또는 생물학적으로 활성인 이의 변이체 및 임의로, 이형성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계 및 이형성 단백질을 생산하기 위한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기된 바와 같은 세포 배양 시스템에서 이형성 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 당해 방법은 당업자에게 공지된 추출, 분리 또는 정제 기술에 의해 세포 배양물로부터 이형성 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 당해 세포는 콜레스테롤에 대해 영양요구성이고 바람직하게는 NS-0, NS-1 및 CHO-215이며, 더욱 바람직하게는 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된 배지상에서 배양될 수 있는 NS-0 마우스 골수종 세포이다.

또한, 본 발명은 보다 상세하게는, 이형성 단백질을 생산하기 위한 조건하에서 콜레스테롤 부재하에 3-케토스테로이드 리덕타제 및 하나 이상의 이형성 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된 세포를 배양함을 포함하는 이형성 단백질을 발현시키는 보다 구체적인 방법을 포함하고, 여기서, 바람직한 세포 및 배지는 상기된 바와 같다.

I. 3-케토스테로이드 리덕타제

본 발명은 이형성 단백질의 생산을 위한 대사적 선별 유전자로서 임의의 진핵 세포 3-KSR을 사용한다. 한 양태에서, 마우스 3-KSR로서 하기와 같은 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 갖는 HSD3β5(NCBI 뉴클레오타이드 수탁 번호 L41519)로서도 공지된 3β-하이드록시스테로이드:NADP⁺3-옥시리덕타제가 사용된다:

서열번호 1은 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 특정 3-KSR을 암호화한다:

마우스 HSD3b5 아미노산 서열(서열번호 3):

추가로, 기타 기능성 효소는, 17β-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 7형(Hsd17b7), 3β-하이드록시-델타(5)-스테로이드 데하이드로게나제(Hsd3b5), 랫트 3β-Hsd III, 마우스 3β-Hsd Ⅳ, 마우스 3β-Hsd V 및 햄스터 3β-Hsd III를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자들에 의해 암호화되어 있고 이들은 전적으로 3-케토스테로이드 리덕타제로서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 구체적으로, 하이드록시스테로이드(17-베타) 데하이드로게나제 7로서도 공지된 서열번호 2를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 승인 번호 NCBI:BC011464)는 하기의 마우스 HSD17b7을 포함하고 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다:

서열번호 2는 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 특정 3-KSR을 암호화한다:

마우스 HSD17b7 아미노산 서열(서열번호 4):

또 다른 양태에서, 도 1에 도시된 바와 같은 포유동물 스테롤 생합성의 제1 및 제2 주기에서 하기의 전구체의 효소적 전환을 촉진하는 3-KSR과 같은 임의의 효소가 사용될 수 있다:

4-메틸-5α-콜레스타-3,8,24-트리엔-3β-올 →3-KSR →3-옥소-4α-메틸-5α-콜레스타-8,24-디엔 → 3KSR→3β-하이드록시-4α-메틸-5α-콜레스타-8,24-디엔(제1 주기)

5α-콜레스타-3,8,24-트리엔-3β-올 →3-KSR →3-옥소-5α-콜레스타-8,24-디엔 →3-KSR →델타-8,24-콜레스타디엔-3β-올(3β-하이드록시-5α-콜레스타-8,24-디엔; 자이모스테롤)(제2 주기)

본 발명에 사용될 수 있는 3-KSR의 또 다른 특정 예는 기타 마우스 3-KSR(수탁번호 NM_00295, NM 010476 및 BC_012715), 소(수탁번호 XM_591611), 인간(수탁번호 NM_016371)을 포함한다.

A. 3-KSR 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편 및 이의 변이체

본 발명은 임의의 3-KSR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 3-KSR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 본 발명의 범위는 본원에 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드; 엄중 조건(특히 높은 엄중 조건)하에 하이브리드화함에 의해 본원에 기재된 생물학적 물질 또는 기타 생물학적 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간 공급원)으로부터 수득되는 폴리뉴클레오타이드; 제공된 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 유전자; 제공된 폴리뉴클레오타이드 및 이들의 상응하는 유전자의 변이체, 특히 암호화된 유전자 생성물의 생물학적 활성(예를 들어, 유전자 생성물의 단백질 계열 및/또는 단백질 계열들로의 할당의 결과 및/또는 유전자 생성물내 존재하는 기능성 도메인의 동정 결과로서 제공된 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 유전자 생성물에 의한 생물학적 활성)을 보유하는 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 의해 및 본 발명의 범위 내에서 고려되는 기타 3-KSR 폴리뉴클레오타이드 조성물은 본 발명의 기재에 따라 제공되는 경우 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 달리 지적되지 않는 경우 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 구조를 제한하는 것으로서 의도되지 않는다.

3-KSR 폴리뉴클레오타이드는 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 3-KSR 폴리뉴클레오타이드는 고유 3-KSR DNA와 서열 유사성 또는 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이것은 연합된 5' 및 3' 비해독된 서열, 프로모터 및 인핸서 서열을 포함한다. 서열 유사성을 갖는 3-KSR 폴리뉴클레오타이드는 낮은 엄중 조건. 예를 들어, 50℃ 및 10XSSC(0.9M 식염수/0.09M 나트륨 시트레이트)에서 하이브리드화에 의해 검출될 수 있고 1XSSC로 50℃에서 세척되는 경우 결합된 채로 남아있다. 서열 상동성은 엄중 조건, 예를 들어, 50℃ 이상 및 0.1XSSC(9mM 식염수/0.9mM 나트륨 시트레이트)에서 하이브리드화에 의해 측정될 수 있다. 물론, 하이브리드화 방법 및 조건은 당업계에 널리 공지되어 있고 또 다른 모든 변법 및 조건이 추가의 3-KSR 폴리뉴클레오타이드를 동정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 3-KSR 폴리뉴클레오타이드는 또한 3-KSR 뉴클레오타이드 서열의 천연적으로 존재하는 변이체(예를 들어, 축퇴성 변이체, 대립형질 변이체)를 포함한다. 본 발명의 3-KSR 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 추정 변이체를 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화, 바람직하게는 엄중 조건하에서 하이브리드화시킴에 의해 동정된다. 예를 들어, 적당한 세척 조건을 사용하여, 본원에 기재된 3-KSR 폴리뉴클레오타이드의 변이체가 동정될 수 있는데, 여기서 대립형질 변이체는 선택된 폴리뉴클레오타이드 프로브에 비해 약 25 내지 30% 이하의 염기쌍(bp) 불일치를 나타낸다. 일반적으로, 대립형질 변이체는 약 15 내지 25%의 bp 불일치를 함유하고 적게는 단일 염기쌍 불일치뿐만 아니라 5 내지 15%, 또는 2 내지 5%, 또는 1 내지 2% 염기쌍 불일치를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 3-KSR 폴리뉴클레오타이드 서열에 상응하는 동족체를 포함하고, 여기서, 상동성 유전자의 공급원은 임의의 포유동물 종, 예를 들어, 양장류, 특히 인간; 설치류, 예를 들어, 랫트; 개, 고양이, 소, 양, 말, 효모, 선충류등일 수 있다. 포유동물 종, 예를 들어, 인간과 마우스간의 동족체는 일반적으로 유전자 또는 이의 일부와 뉴클레오타이드 서열간에 상당한 서열 유사성, 예를 들어, 75% 이상의 서열 상동성, 일반적으로 90% 이상, 보다 일반적으로 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 서열 유사성은 대형 3-KSR 서열의 서브세트일 수 있는, 보존된 모티프, 암호화 영역의 일부, 플랭킹 영역등과 같은 표준 서열을 기준으로 계산될 수 있다. 표준 서열은 보통 약 18개 이상의 연속되는 nt 길이, 보다 일반적으로는 약 30nt 이상의 길이일 수 있고 비교되는 온전한 3-KSR 서열로 신장될 수 있다. 서열 분석을 위한 알고리즘은 문헌[참조: Altschul, et al., 25 NUCLEIC ACIDS RES. 3389-3402(1997)]에 기재된 갭 BLAST와 같이 당업계에 공지되어 있다.

일반적으로, 본원에 기재된 3-KSR 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 적어도 약 65% 초과, 적어도 약 75% 초과, 적어도 약 85% 초과의 서열 상동성을 갖고 적어도 약 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 초과일 수 있고 이는 MPSRCH 프로그램(Accelrys, Inc., San Diego, CA)에서 수행되는 스미쓰-워터맨 상동성 조사 알고리즘(Smith-Waterman homology search algorithm)과 같은 통상적인 방법을 사용하여 결정된다. 예를 들어, 전체 DNA 서열 상동성은 하기의 조사 파라미터를 갖는 어핀 갭(affine gap) 조사를 사용하는 스미쓰-워터맨 상동성 조사 알고리즘에 의해 결정되는 바와 같이 65% 초과일 수 있다: 갭 개방 패널티, 12; 및 갭 신장 패널티, 1.

본 발명의 3-KSR 폴리뉴클레오타이드는 절단된 변형체 또는 이의 단편, 특히 콜레스테롤 비함유 배지상에 세포가 성장할 수 있도록 형질감염된 진핵 세포에서 작용하는 생물학적 활성 또는 복구가능한 3-KSR 유전자 생성물을 암호화하는 단편 뿐만 아니라 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. cDNA는 본래의 성숙 mRNA 종에서 발견되는 서열 요소들의 배열을 공유하는 모든 핵산을 포함하는데, 이때 서열 요소는 엑손 및 3' 및 5' 비암호화 영역이다. 통상적으로, mRNA 종은 연속적인 엑손들을 갖고 존재하는 경우 개재된 인트론은 핵 RNA 스플라이싱에 의해 제거되어 폴리펩타이드를 암호화하는 연속 개방 판독 프레임이 만들어진다. mRNA 종은 또한 엑손 및 인트론과 공존할 수 있는데, 여기서 인트론은 또 다른 스플라이싱에 의해 제거될 수 있다.

3-KSR 게놈 서열은 서열목록에 정의된 바와 같이 개시 코돈과 종료 코돈 사이에 일반적으로 본래의 염색체에 정상적으로 존재하는 인트론 모두를 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 추가로, 성숙한 mRNA에서 발견되는 5' 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 게놈 서열은 전사된 영역의 5' 및 3' 말단중 하나에 약 1kb 또는 그 이상의 플랭킹 게놈 DNA를 포함하는, 프로모터, 인핸서등과 같은 특정 전사 및 해독 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.

B. 3-KSR 폴리펩타이드, 이의 단편 및 이의 변이체

본 발명의 3-KSR 폴리펩타이드는 기재된 3-KSR 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편 및 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 기재된 3-KSR 폴리뉴클레오타이드와 서열에 있어서 동일하지 않은 핵산을 포함하는 변이체에 의해 암호화된 것들을 포함한다.

3-KSR 폴리펩타이드는 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 전장의 폴리펩타이드, 기재된 폴리뉴클레오타이드로 나타낸 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 일부 또는 단편 모두를 언급한다. 3-KSR 폴리펩타이드는 또한 천연에 존재하는 단백질 변이체를 포함하고 여기서, 당해 변이체는 천연에 존재하는 3-KSR 단백질과 상동성이거나 실질적으로 유사하고 천연에 존재하는 3-KSR 단백질과 동일하거나 상이한 종의 기원(예를 들어, 천연적으로 기재된 폴리펩타이드를 발현하는 인간, 마우스, 또는 몇몇 기타 종, 일반적으로는 포유동물 종)일 수 있다. 일반적으로, 변이체 3-KSR 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기된 파라미터를 사용하는 BLAST 2.0에 의해 측정되는 바와 같이, 본원에 기재된 3-KSR 폴리펩타이드와 약 80%이상, 보통 약 90% 이상, 보다 일반적으로는 약 95% 이상의 서열 상동성, 즉, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는다. 변이체 3-KSR 폴리펩타이드는 천연적으로 또는 비천연적으로 해독 후 변형될 수 있는데, 즉, 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 3-KSR 단백질의 임의의 예측되거나 실험적으로 특성 분석된 해독후 변형과는 상이한 해독후 변형 패턴을 갖는다.

본 발명은 또한 3-KSR 폴리펩타이드의 동족체(또는 이의 단편)을 포함하고 여기서, 동족체는 보통, 포유동물 종, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 랫트; 애완용 동물, 예를 들어, 말, 소, 개, 고양이; 및 인간과 같은 임의의 종으로부터 분리된다. 동족체는 본원에 기재된 특정 3-KSR 단백질에 대해 약 35% 이상, 일반적으로 약 40% 이상 및 보다 일반적으로 약 60% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있고 이때, 서열 상동성은 예를 들어, 상기한 바와 같은 파라미터와 함께 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 측정된다.

또한, 돌연변이체, 단편 및 융합체를 포함하는 폴리펩타이드 변이체가 본 발명의 범위 내에 있다. 돌연변이체는 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환 또는 비필수 아미노산을 제거하는 치환, 예를 들어, 당화 부위, 인산화 부위 또는 아세틸화 부위를 변형시키거나 기능에 필수적이지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의해 잘못된 폴딩을 최소화하기 위한 치환일 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 치환된 아미노산의 전체 하전, 소수성/친수성 및/또는 입체적 부피를 보존하는 치환이다. 변이체는 단백질의 특정 영역(예를 들어, 기능성 도메인 및/또는, 폴리펩타이드가 단백질 계열의 구성원인 영역, 컨센서스 서열과 연관된 영역)의 증진된 생물학적 활성을 보유하거나 갖도록 디자인될 수 있다. 3-KSR 변이체의 제조를 위한 아미노산 변형의 선택은 아미노산의 접근성(내부 대 외부)[문헌참조: Go et al, 15 INT. J. PEPTIDE PROTEIN RES. 211 (1980)], 변이 폴리펩타이드의 열 안정성[문헌참조: Querol et al., 9 PROT. ENG. 265(1996)], 목적하는 당화 부위[문헌참조: Olsen and Thomsen, 137 J. GEN. MICROBIOL. 579 (1991)], 목적하는 이황화 결합[문헌참조: Clarke et al., 32 BIOCHEM. 4322 (1993); and Wakarchuk et al., 7 PROTEIN ENG. 1379 (1994)], 목적하는 금속 결합 부위[문헌참조: Toma et al., 30 BIOCHEM. 97 (1991), and Haezerbrouck et al., 6 PROTEIN ENG. 643 (1993)], 및 프롤린 루프내에서의 목적하는 치환[문헌참조: Masui et al., 60 APPL. ENV. MICROBIOL. 3579 (1994)]을 기초로 할 수 있다. 시스테인-고갈된 뮤테인(mutein)은 미국 특허 제4,959,314호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

3-KSR 변이체는 또한 본원에 기재된 폴리펩타이드의 단편, 특히, 생물학적 활성 단편 및/또는 기능성 도메인에 상응하는 단편을 포함한다. 목적하는 단편은 전형적으로 길이에 있어서 약 10개 이상의 아미노산(aa) 내지 약 15개 이상의 아미노산, 일반적으로 약 50개 이상의 아미노산일 수 있고 300개의 아미노산 정도로 길이가 길 수 있지만 일반적으로 약 531개의 아미노산을 초과하지는 않고, 이때 당해 단편은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 동족체에 의해 암호화된 3-KSR 폴리펩타이드와 동일한 일련의 아미노산들을 갖는다. 유전자 코드는 상응하는 변이체를 구축하기 위해 적당한 코돈을 선별하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 단편들은 3-KSR 단백질의 특정 도메인 또는 에피토프를 함유하는 것들을 포함한다.

3-KSR의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드 변화를 핵산에 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 당해 변형은 예를 들어, 3-KSR의 아미노산 서열내에 잔기의 결실 및/또는 잔기의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환을 조합하여 정형의 3-KSR 컨스트럭트을 제조하지만, 단 최종 컨스트럭트은 목적하는 특성을 소유한다. 아미노산 변화는 또한 당화 부위 또는 아세틸화 및 인산화를 포함하는 기타 해독후 변형의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 3-KSR의 해독후 과정을 변경시킬 수 있다.

돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 3-KSR의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위해 유용한 방법은 문헌[참조: Cunningham and Wells, 244 SCIENCE 1081-85 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로서 호칭된다. 여기에서, 표적 잔기들의 잔기 또는 그룹(예를 들어, 하전된 잔기들, 예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu)이 동정되고 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 주기 위해 중성 또는 음성 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치는 추가로 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위를 위해 도입함에 의해 정교화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 특성은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 3-KSR 변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 수백개의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 길이에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단이 메티오닐 잔기를 지닌 3-KSR을 포함한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 3-KSR 단백질에서 상이한 잔기로 대체된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다.

3-KSR 단백질의 생물학적 성질의 상당한 변형은, (i) 병풍형(sheet) 또는 나선형(helical)과 같이, 치환 영역내 폴리펩타이드 골격의 구조, (ii) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성 또는 (iii) 측쇄(side-chain)의 부피를 유지하는데 있어서의 효과가 상당히 상이한 치환을 선별함에 의해 성취된다. 천연적으로 존재하는 잔기는 일반적인 측쇄 성질을 기준으로 하는 그룹으로 세분된다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존성 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 다른 부류로 대체하는 것이다. 보존성 치환은 동일 부류내의 아미노산들을 대체하는 것이다.

II. 3-KSR을 암호화하는 벡터

본 발명은 추가로 포유동물 스테롤 생합성의 생화학적 경로에서 임의의 효소, 예를 들어, 콜레스테롤 영양요구성인 세포에서 3-KSR과 같은 효소를 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 일반적으로, 임의의 원핵 세포 클로닝 벡터가 이러한 벡터의 구축을 위해 사용될 수 있다. 당해 벡터는 세균성 복제 기원을 포함할 수 있고 이는 E. coli의 숙주 균주에서 벡터를 증폭시키는데 유용하고 포유동물 세포의 형질감염 전에 당해 균주로부터 벡터 DNA가 분리된다. 세균성 복제 기원의 예는 Col E1, pUC, pBR322, 또는 E. coli의 비병원성 균주로부터 공급되는 기타의 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당해 벡터는 추가 로 E. coli 내에서 플라스미드를 높은 카피수로 증폭시키기 위한 선별 마커를 포함할 수 있다. 예시적인 선별 마커는 암피실린, 카베니실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 카나마이신, 젠타마이신, 설파에토아졸, 트리메토프림등과 같은 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 벡터내에 사용될 수 있는 추가의 선별 마커는 열 쇼크, 금속 무독화 및 기타 대사 과정을 기준으로 선별을 제공하는 유전자를 포함한다.

당해 벡터는 추가로 진핵 세포 프로모터를 포함하여 3-KSR 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 이것은 포유동물 티미딘 키나제(TK) 유전자 프로모터와 같은 최소 프로모터 또는 시미안 바이러스 40(SV40) 복제 기원 및 초기 프로모터 영역과 같은 더욱 강한 전사 카세트일 수 있다. 인트론 A 및/또는 B 서열이 존재하거나 부재인 사이토메갈로바이러스(CMV) 주요 즉시형 초기(MIE) 프로모터 영역 또는 인간 연장 인자-1 알파(EFα)와 같은 매우 강한 프로모터를 또한 사용하여 3-KSR 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 진핵 세포 전사 종결 서열 또는 폴리아데닐화 부위는 또한 3-KSR 유전자의 전사 및 시그날 폴리아데닐화를 정지시키기 위해 존재할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는 이론적으로 임의의 진핵 세포 유전자로부터 유래될 수 있지만, 일반적으로 사용되는 강한 폴리아데닐화 서열은 SV40 후기 폴리-A 및 소 성장 호르몬(BGH)폴리-A를 포함한다.

도 2에 도시된 바와 같이, 벡터의 한 양태(이 경우, p3-KSR로 명명됨)는 pUC 유래 세균성 복제 기원(ori) 및 항생제에 민감성인 이. 콜리 균주에서 앰피실린 또는 카베니실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자(bla)를 포함할 수 있다. 당해 벡터는 또한 사이토메갈로바이러스(CMV) 주요 즉시형 초기(MIE) 프로모터 및 인핸서를 포함하여 폴리링커 영역으로 클로닝된 이형성 재조합 서열의 발현을 구동시킬 수 있다. 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리 아데닐화 서열(SV40pA)은 이형성 재조합 서열과 3-KSR 유전자 둘 모두의 다운스트림에 위치하여 각 유전자로부터의 초기 mRNA를 효율적으로 폴리아데닐화시킬 수 있다. SV40 프로모터 및 복제 기원(SV40 ori)는 3-KSR 유전자의 바로 업스트림에 위치하여 이러한 선별 마커의 발현을 구동시킬 수 있다.

특징 양태에서, 3-KSR 유전자는 마우스 신장 cDNA 라이브러리로부터 증폭된 마우스 3-KSR cDNA를 직접 클로닝하여 벡터내로 삽입될 수 있다. 마우스 신장 cDNA 라이브러리로부터 3-KSR을 증폭시키기 위해 유전자 조작된 프라이머는 예를 들어, pUC-유래 벡터인 p3-KSR에 존재하는 PmlI 부위와 양립할 수 있는 PmlI 말단을 함유할 수 있고 이러한 부위는 SV40 ori와 SV40 폴리-A 사이 영역에 존재한다. 따라서, PmlI로 제한 절단된 3-KSR cDNA는 당해 유전자를 p3-KSR 골격의 PmlI 부위로 클로닝하는데 사용될 수 있다. 벡터내 유전자의 배향은 제한엔도뉴클레아제 분석(REN) 및 디데옥시-종결 DNA 서열 분석에 의해 결정될 수 있다.

이어서, 관심있는 하나 이상의 이형성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 또는 카세트는 예를 들어, 도 3, 4 또는 5에 보여지는 바와 같이 다중 클로닝 영역 또는 부위에서 3-KSR 유전자를 포함하는 벡터로 삽입된다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드 또는 카세트는 진핵 세포 또는 바람직하게 포유동물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 프로모터에 작동적으로 연결되거나 이의 제어하에 있다.

III. 3-KSR을 암호화하는 벡터를 사용한 세포의 형질감염

관심있는 이형성 단백질(및 선별 마커로서 3-KSR)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기천공, 리포펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 초음파, 형질감염, 형질도입, 형질전환 및 바이러스 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 성취될 수 있다[문헌참조: SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (3d ed. 2001)].

콜레스테롤 영양요구성이 3-KSR 활성과 같은 효소 활성에 기인하는 임의의 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포가 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 예시적 세포주는 NS-0(ECACC No. 85110503), NS-1 (ECACC No. 85011427) 및 CHO-215(문헌참조: Plemenitas et al., 265(28) J. Biol. Chem. 17012- 17 (1990))을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 처음에 콜레스테롤에 대해 영양요구성이 아니었지만 방사선 조사, 돌연변이 유발제 또는 재조합 유전자 녹아웃 기술에 의해, 17β-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 7형(Hsd17b7) 및 3β-하이드록시-델타(5)-스테로이드 데하이드로게나제(Hsd3b5)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 3-KSR 활성을 암호화하는 내인성 유전자를 불활성화시켜 콜레스테롤에 대해 영양요구성이 된 진핵 세포, 특히 포유동물 세포를 포함한다. 또 다른 양태에서, 표적화된 녹아웃 유전자는 전적으로 3-케토스테로이드 리덕타제로서 작용하는 것으로 공지된 랫트 3β-Hsd III, 마우스 3β-Hsd IV, 마우스 3β-Hsd V 및 햄스터 3β-Hsd III를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

3-KSR 선별 마커(및 관심있는 이형성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유하는 발현 벡터로 형질감염된 NS-0, NS-1, CHO-215 및 기타 콜레스테롤-영양요구성 세포주는 콜레스테롤 결핍 배지에서 증식되어야만 한다. 특정 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 하기의 비제한적인 목록의 스테롤 전구체를 함유하는 임의의 무혈청 및 콜레스테롤 비함유 배지에서 증식될 수 있다: 4-메틸-5α-콜레스타-3,8,24-트리엔-3β-올, 3-옥소-4α-메틸-5α-콜레스타-8,24-디엔, 5α-콜레스타-3,8,24-트리엔-3β-올 및/또는 3-옥소-5α-콜레스타-8.24-디엔. 이들 전구체는 콜레스테롤 생화학적 경로에서 3-KSR의 업스트림에서 작용한다.

규제 문제를 해결하기 위해, 숙주 세포(형질감염 전 또는 후)는 무혈청 배지, 단백질 비함유 배지, 화학적으로 한정된 배지, 또는 화학적으로 한정된/무혈청 배지를 포함하는 이의 배합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 배지에서 증식될 수 있다. 이러한 본 발명의 특정 측면은 동물 유래 단백질 및/또는 비공지된 기원의 단백질이 재조합 단백질 생성물을 인간 치료 또는 진단용으로 비적합하게하는 문제점을 해결한다. 적합한 증식 배지의 하나의 특정 양태는 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 단백질을 함유하지 않고 한정되지 않은 용해물 또는 가수분해물이 없는 것으로 확인된 화학적으로 한정된 무혈청 배지인 CD 하이브리도마 배지(InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)이다.

본 발명의 숙주 세포는 CD-SFM과 같은 적당한 증식 배지에 이미 적응된 것으로서 제공될 수 있다. 흔히, 세포는 형질감염 전에 당해 배지에 적응된다. 이 경우에, 세포는 동물 유래 성분이 없는 또 다른 화학적으로 한정되고 무혈청 배지인 HyQCDM4NS-0(Hyclone, Logan UT)에 적응될 수 있다. 후자의 시판되는 배지는 충분한 양의 콜레스테롤을 함유하여 콜레스테롤 영양요구성 세포주의 성장을 지지한다. 형질감염 후, 세포는 콜레스테롤이 없는 적합한 선별 배지에서 증식된다. 또한, 형질감염체는 공지된 기술을 사용하여 고도로 탈지되어 모세포의 성장을 지지하지 않는 것으로 밝혀진, 혈청이 보충된 통상의 배지를 사용하는 콜레스테롤 비함유 배지에서 배양한다.

형질감염 후, 세포는 전형적으로 낮은 밀도로 씨딩되어 안정한 형질전환체가 선별된다. 이와 관련하여, 임의의 적당한 선별 배지를 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 선별 배지는 2mM의 L-글루타민 또는 글루타맥스 및 1X NEAA(비필수 아미노산)(InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)가 보충된 CD 하이브리도마를 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 성장 보충물의 칵테일을 선별 배지에 첨가하여 형질감염 후의 성장 조건을 최적화시킬 수 있다. 성장 보충물은 형질감염 후, NS-0, NS-1, CHO-215 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적당한 세포주에 첨가될 수 있다. 특정 양태에서, 성장 보충물의 칵테일을 사용하여 NS-0 세포에 대한 형질감염 후 성장 조건을 최적화시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 성장 보충물은 혈청 알부민, 인터류킨-6, 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트 및 에탄올아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

소 혈청 알부민(BSA), 소 혈청 알부민 분획물 v, 및 전 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적당한 형청 알부민의 시판 변형체가 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 혈청 알부민은, 지질을 성장하는 세포에 제공할 수 있는 가능한 콜레스테롤-혈청 알부민을 제거하기 위해, 변형되지 않은 것 대신 지방산이 없을 수 있다. 지방산 비함유 BSA는 많은 회사에서 시판되고 있고 예를 들어, 제조원[Research Organics, Inc., Cleveland, OH]을 포함한다. 당해 성분의 최종 농도는 선별 배지에서 약 0.1% 내지 약 5%의 범위, 보다 구체적으로 약 0.2%, 약 0.5%, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0% 이상 내지 약 5.0% 이하의 범위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 혈청 알부민의 최종 농도는 선별 배지에서 약 1%일 수 있다.

성장 조건을 최적화시키는 사용될 수 있는 또 다른 성장 보충물은 인터류킨 6을 포함한다. 한 양태에서, 재조합 인간 IL-6(제조원: Promega Corp., Madison, WI)이 사용될 수 있다. IL-6의 최종 농도는 선별 배지에서 약 1 ng/mL 내지 약 9 ng/mL의 범위, 보다 구체적으로, 약 2 ng/mL, 약 3 ng/mL, 약 4 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL 이상, 약 9 ng/mL 이하를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, IL-6의 최종 농도는 선별 배지에서 약 5 ng/mL일 수 있다. rhIL-6와 같은 IL-6의 농도는 배치 마다 필요에 따라 사이토킨에 대해 제조업자의 보고된 EC50을 표적화하기 위해 조정될 수 있다.

성장 보충물의 칵테일은 추가로 인슐린, 구체적으로, 재조합 인간 인슐린 (제조원: RayBiotech, Inc., Norcross, GA)을 포함할 수 있다. 당해 성분의 최종 농도는 선별 배지에서 약 5 mg/L 내지 약 15 mg/L의 범위, 보다 구체적으로, 약 6 mg/L, 약 7 mg/L, 약 8 mg/L, 약 9 mg/L, 약 10 mg/L, 약 11 mg/L 이상, 약 15 mg/L 이하를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 인슐린의 최종 농도는 선별 배지에서 약 10 mg/L일 수 있다.

나트륨 셀레나이트는 또한 성장 조건을 최적화하는데 사용될 수 있다(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). 당해 보충물의 최종 농도는 선별 배지에서 약 5.0 μg/L 내지 약 8.0 μg/L의 범위, 보다 구체적으로 약 5.5 μg/L, 약 6.0 μg/L, 약 6.5 μg/L, 약 7.0 μg/L 이상, 약 8.0 μg/L 이하를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 나트륨 셀레나이트의 최종 농도는 선별 배지에서 약 6.7μg/L일 수 있다.

또 다른 양태에서, 나트륨 피루베이트가 성장 보충물(제조원: SAFC Biosciences, Inc., Lenexa, KA)로서 사용될 수 있다. 나트륨 피루베이트의 최종 농도는 선별 배지에서 약 0.01 g/L 내지 약 0.3 g/L의 범위, 보다 구체적으로, 약 0.05 g/L, 약 0.1 g/L, 약 0.15 g/L 이상, 약 0.3 g/L 이하를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 나트륨 피루베이트의 최종 농도는 선별 배지에서 약 0.11 g/L일 수 있다.

성장 보충물의 칵테일은 추가로 에탄올아민(제조원: Sigma- Aldrich® Co., St. Louis, MO)을 포함할 수 있다. 당해 보충물의 최종 농도는 약 0.5 mg/L 내지 약 3.5 mg/L의 범위, 보다 구체적으로, 약 1.0 mg/L, 약 1.5 mg/L, 약 2.0 mg/L, 약 2.5 mg/L 이상, 약 3.5 mg/L 이하를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 에탄올아민의 최종 농도는 선별 배지에서 약 2.0 mg/L일 수 있다.

특정 양태에서, 성장 보충물의 칵테일은 지방산 비함유 BSA (0.1%-5%), rhIL-6 (1 ng/mL-9 ng/mL), 재조합 인간 인슐린 (5 mg/L- 15 mg/L), 나트륨 셀레나이트 (5 μg/L-8 μg/L), 나트륨 피루베이트 (0.01 g/L-0.3 g/L) 및 에탄올아민 (0.5 mg/L-3.5 mg/L) (선별 배지에서 최종 농도)를 포함할 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, 성장 보충물의 칵테일은 지방산 비함유 BSA (l%-5%), rhIL-6 (0.5 μg/mL), 재조합 인간 인슐린 (10 mg/L), 나트륨 셀레나이트 (6.7 μg/L), 나트륨 피루베이트 (0.11 g/L) 및 에탄올아민(2 mg/L) (선별 배지에서 최종 농도)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 성장 보충물의 칵테일은 지방산 비함유 BSA (1%), rhIL-6 (0.5 ng/mL), 재조합 인간 인슐린 (10 mg/L), 나트륨 셀레나이트 (6.7 μg/L), 나트륨 피루베이트(0.11 g/L) 및 에탄올아민(2 mg/L)(선별 배지에서 최종 농도)를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 성장 보충물은 지방산 비함유 BSA, rhIL-6, 재조합 인간 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트, 에탄올아민을 포함할 수 있지만 어떠한 다른 성장 보충물은 포함하지 않을 수 있다. 추가의 양태에서, 성장 보충물은 지방산 비함유 BSA, rhIL-6, 재조합 인간 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트, 에탄올아민을 포함할 수 있지만 배양된 세포 성장에 전형적으로 사용되거나 포함되는 어떠한 다른 물질을 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 성장 보충물은 지방산 비함유 BSA, rhIL-6, 재조합 인간 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트, 에탄올아민을 포함할 수 있지만 혈청에서 전형적으로 발견되는 어떠한 다른 물질을 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 성장 보충물은 지방산 비함유 BSA, rhIL-6, 재조합 인간 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 나트륨 피루베이트, 에탄올아민 및 물을 포함한 상기된 성장 보충물 중 어느 하나를 재구성하는데 전형적으로 사용되는 임의의 물질을 포함할 수 있지만 그밖에 어떠한 다른 물질을 포함하지 않을 수 있다.

IV. 이형성 단백질을 제조하기 위한 키트

본 발명은 추가로 시판용 키트를 제공한다. 특정 양태에서, 키트는 벡터, 다수의 세포 및 성장 보충물을 포함할 수 있다. 당해 벡터는 벡터로 형질감염된 세포의 선별을 위해 유용한, 예를 들어, 3-KSR과 같은 포유동물 스테롤 생합성을 위한 생화학적 경로에서의 효소를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 키트의 사용자는 적당한 제한 효소(들)를 사용하여 표적 유전자를 벡터내로 클로닝할 수 있다. 특정 양태에서, 세포는 콜레스테롤에 대해 영양요구성이다. 한 양태에서, 키트에 제공된 세포는 미리 화학적으로 한정된 배지에서 성장하도록 적응될 수 있다. 또 다른 양태에서, 키트에 제공된 세포는 화학적으로 한정된 무혈청 배지에서 성장하도록 미리 적응될 수 있다. 규제 요건에 따라, 세포는 우발적인 제제가 없는 것으로 측정된 운영 세포 뱅크로부터 유래할 수 있다.

또 다른 양태에서, 키트는 NS-0, NS-1 및 CHO-215, 및 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포의 성장을 지지하는 본원에 기재된 바와 같은 성장 보충물을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 키트는 무혈청 배지, 단백질 비함유 배지, 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된/무혈청 배지를 포함하는 임의의 배합물에서 세포의 성장을 지지하는 성장 보충물을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 키트는 예를 들어, 형질감염 후 및 제한 희석 세포 클로닝(LDCC) 단계동안에, 매우 낮은 씨딩 밀도에서 CD-SFM NS-0 세포의 성장을 지지하는 본원에 기재된 바와 같은 성장 보충물을 포함할 수 있다.

추가로, 본 발명의 키트는 관심있는 임의의 이형성 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 세포, 세포주 및 세포 배양물에서 발현되는 이형성 단백질의 특성 및 공급원은 제한되지 않는다. 예를 들어, 플라스미드 p3-KSR은 단일 또는 2개 이상의 유전자의 발현을 위해 유전자 조작될 수 있다. 전자는 단일 쇄 호르몬과 같은 독립형 단백질의 발현에 적용될 수 있고 후자는 항체와 같은 이중 쇄 분자의 발현에 적용된다.

본 발명의 특정 양태에서, 재조합 항체 분자는 필수 유전자를 함유하는 벡터를 사용하여 발현될 수 있다[예를 들어, 도 3 참조]. 항체는 다중 성분들, 특히 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 복합 단백질이다. 한 양태에서, p3-KSR 벡터는 직렬로 클로닝된 인간 면역글로불린 G(IgG)에 대한 온전한 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하도록 유전자 조작될 수 있다. 당해 재조합 컨스트럭트로부터 단백질 발현은 세포 배양물로부터 분리되고 시판용을 위해 정제될 수 있는 모노클론 항체를 분비한다. 인간 모노클론 항체는 단일 항원에 특이적이고 특정 병원체, 기관 또는 종양을 표적화하는데 사용될 수 있기 때문에 인간 치료제로서 적용되기에 매우 적합하다.

추가의 기재 사항 없이, 당업자는 이전의 기재 사항을 바탕으로 본 발명을 완전하게 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 하기의 실시예는 단지 예시적인 것이고 어떠한 방식으로든지 나머지 기재된 사항을 제한하지 않는다.

실시예 1: 화학적으로 한정된 무혈청 배지에서 마우스 골수종 세포주 NS-0의 콜레스테롤 선별에 대한 입증

마우스 골수종 세포주 NS-0는 2개의 독립적인 화학적으로 한정된 무혈청 배지(CD-SFM) 제제에 적응시켜 당해 세포 환경 및 처음 시작시 설정된 SFM 조건에서 선별 마커로서 3-KSR의 적합성을 시험하였다. NS-0 세포는 CD-하이브리도마(Invitrogen®) 및 CDM-4-NS-0 (HyClone®)에 적응시켰다. CD-SFM-적응된 NS-0 세포주 각각에 대한 수탁 세포 뱅크(ACB)를 제조하였다. 성장 배지에서 콜레스테롤 보충에 대한 CD-SFM-NS-0 세포주의 의존성을 측정하기 위한 분석법을 설정하였다. 이들 분석법은 콜레스테롤 없이 배지에서 CD-SFM-NS-0 세포를 배양한지 72시간 후에, 10% 미만의 세포가 생존함을 보여주었다. CD-SFM에서 배양한지 5일 만큼의 적은 기간내에 트리판 블루 배척 분석법에 의해 어떠한 생존 세포도 검출될 수 없었다. 추가로, 콜레스테롤의 부재하에 당해 세포의 간헐적 성장 단계는 관찰되지 않았는데, 이것은 배양 배지에서 이러한 지질의 부재에 대한 민감성을 나타낸다.

실시예 2: 마우스 3-케토스테로이드 리덕타제(3-KSR)의 PCR 증폭 및 3-KSR의 발현 벡터로의 클로닝

무스 무스쿨루스(Mus musculus) 3β-하이드록시-델타(5)-스테로이드 데하이드로게나제(Hsd3b5)를 암호화하는 마우스 3-케토스테로이드 리덕타제(3-KSR)은 성체 수컷 BALB/c 신장으로부터 생성된 cDNA로 부터 증폭시켰다. 마우스 3-KSR Hsd3b5의 공개된 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭 후, 약 1.1kb의 명백한 밴드가 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출되었다. 당해 밴드를 분리하고 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (Invitrogen®)에 클로닝시키고 이어서 dhfr 대신에 pBVdhfr.l 배경으로 재클로닝하였다. 새로운 컨스트럭트를 pBFksr.1로 명명한다.

pBFfar.l에서 3-ksr의 1.1kb 암호화 영역은 DNA 서열분석에 의해 확인하였고 이의 개방 판독 프레임(orf)은 공개된 서열과 비교하였다. 측정된 서열은 NCBI 수탁 번호 A49573인 공개된 마우스 3-케토스테로이드 리덕타제와 100% 일치하였다.

실시예 3: 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지에서 NS-0 세포의 형질감염 및 선별

올바른 3-KSR orf를 함유하는 컨스트럭트 pBFksr.l을 NS-0 세포에 형질감염시키고 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지에서 선별한다. 배지는 하기의 성분으로 이루어진다: CD-하이브리도마(Invitrogen®), 글루타맥스 (2mM, Invitrogen®), NEAA (비필수 아미노산) (Ix, Invitrogen®), 지방산 비함유 BSA (1%, 칼바이오켐), 재조합 인간 IL-6 (5 ng/ml, Promega), ITS 액체 배지 보충물(Ix, Sigma- Aldrich). 초기 형질감염 및 선별은 하기와 같은 T-75 플라스크에서 "대량으로(in bulk)" 수행한다. 형질감염시킨 날에, NS-0 모 배양물은 트리판 블루 배척 방법을 사용하여 계수하여 생존 세포와 죽은 세포를 구별한다. 배양물은 90% 이상 생존해야만 한다. 각 형질감염에 대해, 약 1 x 10⁷의 세포가 요구된다. 플라스미드 형질감염에 추가로, 하나의 "모방" 형질감염(DNA 부재)을 수행하여 네가티브 대조군을 구축해야만 한다. 세포를 원심분리하고 세포 펠렛을 20ml의 무혈청 형질감염 배지에 재현탁시켜 세척하고 1회 더 원심분리한다. 각 형질감염에 대해, 1 x 10⁷ 개의 세포를 700 μL의 무혈청 형질감염 배지에 재현탁시킨다. DNA 용액은 100 μL의 증류 멸균수중에 40 μg의 정제된 선형화된 플라스미드를 재현탁시켜 제조한다. DNA는 임의의 DNA 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화시키고 일반적으로 당해 엔도뉴클레아제는 베타-락타마제 개방 판독 프레임(orf)에서 pBFksr.1을 1회 제한 절단하는 PvuI(프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 제한 엔도뉴클레아제 I)에 제한되지 않는다. 당해 전체 DNA 용액을 전기천공 큐벳에 첨가한다. 700 μL의 세포 현탁액을 큐벳의 DNA 용액에 첨가하고 피펫팅으로 약하게 혼합하여 기포의 생성을 피한다. 큐벳상에 캡을 올려놓고 큐벳을 전기천공 장치(유전자 펄서(Gene Pulser) II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) 또는 등가물)에 위치시킨다. 1회의 250 볼트, 400 μFd 펄스를 큐벳에 적용한다(625 V/cm의 필드 강도). 최적의 조건은 1번에 8밀리초 이하의 시간 상수 값을 제공해야만 한다. 당해 세포를 T-75 세포 배양 플라스크중의 12 mL의 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지에 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 및 90% 상대 습도에서 밤새 배양하였다.

pBFksr.l로 형질감염되고 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지에서 선별된 배양물은 대조군에 비해 3주 선별 후 통계적으로 상당한 수의 생존 세 포를 생산한다. 동일한 선별 조건에서 증식한 모방 형질감염된 NS-0 세포는 3주 선별 후 통계적으로 상당한 수의 생존 세포를 생산하지 않는다.

실시예 4: 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지중 NS-0 세포의 형질감염, 선별 및 당해 세포에서 모노클론 항체의 발현

포유동물 발현 벡터 pBFdhfr.l을 구축하고 이것은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)돌연변이 모 세포주 CHO-DG44에서 발현시키기 위해, 인간 항체 중쇄 및 경쇄 암호화 서열을 포함하는 포유동물 유전자의 클로닝을 위한 골격으로서 작용한다. 당해 벡터를 사용하여, 인간 IgGl 중쇄 불변 영역 발현 카세트를 다중 클로닝 부위(mcs)에 클로닝시켰고 이것은 인간 중쇄 가변 서열에 대한 수용체로서 작용한다. 당해 벡터는 pBFdhfr.1 :Hcassette로 지정하였다.

상응하는 경쇄 가변 서열은 먼저 pIEI-경쇄인 인간 경쇄 불변 영역 카세트를 함유하는 바쿨로바이러스 발현 벡터에 클로닝하였다. 이어서 전체 경쇄 암호화 서열을 pBFdhfr.1.에 클로닝하였다. 이중 발현 벡터를 구축하기 위해, 상보쇄상에 pCMV-MIE의 5' 말단 및 BGH-pA에 특이적인 프라이머를 사용하여 양 말단에 BglII REN 부위를 함유하는, pCMV-MIE-경쇄-BGH-pA를 함유하는 경쇄 카세트를 증폭시켰다. 이어서 당해 단편을 각각의 상응하는 pdhfr: 중쇄 컨스트럭트 중 유일한 BglII 부위에 클로닝하였다. 수득한 컨스트럭트인 pBFdhfr.1:humAb는 직렬로 클로닝된 완전한 인간 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 함유한다.

마우스 3-케토스테로이드 리덕타제 (3-KSR) 유전자를 분리하고 pCR-Blunt II-TOPO 벡터(Invitrogen®)에 클로닝하고 이어서 dhfr 대신에 pBFdhfr.1:humAb 컨스트럭트에 재클로닝하였다. 당해 신규 컨스트럭트인, 올바른 3-KSR orf를 함유하는 pBFksr.l:HUMAB로 NS-0 세포를 형질감염시키고 화학적으로 한정된 지방산 비함유 보충 선별 배지에서 선별하였다. 초기 형질감염 및 선별은 T-75 플라스크중에서 대량으로 수행한다. 형질감염 후, 세포를 선별 배지에서 직접 배양한다. pBFksr.l:HUMAB로 형질감염되는 즉시 콜레스테롤 비함유 배지에서 선별된 배양물은 대조군에 비해 3주 선별 후 통계적으로 상당한 수의 생존 세포를 생산한다. 동일한 선별 조건에서 증식한 모방 형질감염된 NS-0 세포는 3주 선별 후 통계적으로 상당한 수의 생존 세포를 생산하지 않는다.

형질감염된 세포의 선별 및 성장 즉시, 세포 부재 상등액을, 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 재조합 mAb에 대해 분석한다. 간략하게, pBFksr.1:HUMAB로 형질감염된 배양 상등액을 채취하고 원심분리하여 임의의 세포 및 파쇄물을 제거한다. 96웰 플레이트를, 9 μL 내지 6.3 mL의 인산 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 제형화된 염소 항-인간 Fab 람다 특이적 항체(Sigma-Aldrich® Co., St. Louis, MO) 용액으로 피복한다. 플레이트를 4℃에서 24시간 이상 및 2주 이하동안 항온처리한다. 분석하는 날에, 플레이트를 PBS/트윈 완충액(PBS중의 0.1% 트윈)으로 3회 세정한다. 인간 IgGl 람다 모노클론 항체 표준물(Sigma®)을 PBS/트윈중의 5 μg/mL로 희석하고 1:2의 비율에서 PBS/트윈중에 연속으로 희석하여 표준 농도 패널을 제조한다. 각 표준물을 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 미지의 항체 농도 샘플을 PBS/트윈중에서 1:2000으로 희석하고 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 당해 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리한다. 항온처리 후, 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척한다. 퍼옥시다제-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 항체(KPL, Inc., Gaithersburg, MD)를 PBS/트윈중에서 1:2000으로 희석하고 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 당해 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리한다. 항온처리 후, , 플레이트를 PBS/트윈으로 3회 세척한다. 3,3',5,5' 테트라메틸벤즈이딘(TMB) 기질(Sigma®)을 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 100 μL의 0.5M H₂SO₄ (Acros Organics, Geel, Belgium)를 첨가하여 약 1분 후 반응을 종료한다. 당해 플레이트는 ThermoMax 미세플레이트 판독기 또는 이의 상당물에서 450nm의 파장에서 판독한다. ELISA 결과는 재조합 mAb 생성물의 존재에 대해 양성임을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> BioFactura, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR METABOLIC SELECTION OF TRANSFECTED CELLS <130> BIOF-001/00WO <150> US 60/681,969 <151> 2005-05-18 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 1 atgcctggat ggagctgcct ggtgacagga gcaggagggt ttcttggcca gaggattgtc 60 cgaatgttgg tgcaggagga agagttgcag gagatcagag ccctgttcag gaccttcggt 120 cgaaaacatg aagaggaatt gtccaagctg cagacaaagg ccaaggtgag agtactgaag 180 ggagacattc tggatgccca atgcctgaag agagcctgcc agggcatgtc tgctgtcatc 240 cacaccgctg ctgctattga cccccgtggt gccgcttcca gacagaccat cctagatgtc 300 aatctgaaag gtactcagct cctactggat gcttgtgtgg aagccagtgt gccaacattc 360 atctacagca gctcagtgct tgtggctgga ccaaattcct acaaggagat catcctgaat 420 gcccatgagg aagagcatca tgaaagcaca tggcctaacc catacccata cagcaaaagg 480 atggctgaga aggcagtgct ggcaacaaat gggagactcc tgaaaaatgg tggcactttg 540 catacttgtg ccttaagact ccctttcatc tatggggaag aatgccaagt cacttcaacc 600 actgtgaaaa cagcactgaa gaacaacagc ataattaaga aaaatgccac attctccatc 660 gccaacccag tgtatgtggg caatgcagcc tgggctcaca ttctggctgc caggagccta 720 caggacccca agaagtcccc aagcatccaa ggacagttct attacatctc tgataacacc 780 cctcaccaaa gctatgatga tttaaattac accctgagca aggagtgggg cctctgcctt 840 gattctggct ggaggcttcc tctgtccctg ctttactggc ttgccttcct gctggaaact 900 gtgagcttcc tgctacgtcc agtttacaac tataggccac cctttacccg cctcttgatc 960 acagtgctaa atagcgtgtt taccatttcc tataagaaag ctcagcgcga tctaggctat 1020 cagccacttg tcagctggga ggaagccaag caaaaaacct cagagtggat tggaacacta 1080 gtgaagcagc acagggagac actacacaaa aagtcacagt ga 1122 <210> 2 <211> 1005 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 2 atgcggaagg tggttttgat caccggggcg agcagtggca ttgggctagc cctttgcggt 60 cgactgctgg cagaagacga tgacctccac ctgtgtttgg cgtgtaggaa cctgagcaaa 120 gcaagagctg ttcgagatac cctgctggcc tctcacccct ccgccgaagt cagcatcgtg 180 cagatggatg tcagcagcct gcagtcggtg gtccggggtg cagaggaagt caagcaaaag 240 tttcaaagat tagactactt atatctgaat gctggaatcc tgcctaatcc acaattcaac 300 ctcaaggcat ttttctgcgg catcttttca agaaatgtga ttcatatgtt caccacagcg 360 gaaggaattt tgacccagaa tgactcggtc actgccgacg ggttgcagga ggtgtttgaa 420 accaatctct ttggccactt tattctgatt cgggaactgg aaccacttct ctgccatgcg 480 gacaacccct ctcagctcat ctggacgtcc tctcgcaatg caaagaaggc taacttcagc 540 ctggaggaca tccagcactc caaaggcccg gaaccctaca gctcttccaa atatgctacc 600 gacctcctga atgtggcttt gaacaggaat ttcaaccaga agggtctgta ttccagtgtg 660 atgtgcccag gcgtcgtgat gaccaatatg acgtatggaa ttttgcctcc ctttatctgg 720 acgttgctcc tacccataat gtggctcctt cgcttttttg taaatgcgct cactgtgaca 780 ccgtacaacg gagcagaggc cctggtgtgg ctcttccacc aaaaaccgga gtctcttaat 840 cctctgacca aatacgcgag cgccacctcg ggatttggga ctaattacgt cacgggccaa 900 aagatggaca tagatgaaga cactgctgaa aaattctatg aggtcttact ggagctggaa 960 aagcgtgtca ggaccaccgt tcagaaatcg gatcacccga gctga 1005 <210> 3 <211> 373 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Met Pro Gly Trp Ser Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ile Val Arg Met Leu Val Gln Glu Glu Glu Leu Gln Glu Ile 20 25 30 Arg Ala Leu Phe Arg Thr Phe Gly Arg Lys His Glu Glu Glu Leu Ser 35 40 45 Lys Leu Gln Thr Lys Ala Lys Val Arg Val Leu Lys Gly Asp Ile Leu 50 55 60 Asp Ala Gln Cys Leu Lys Arg Ala Cys Gln Gly Met Ser Ala Val Ile 65 70 75 80 His Thr Ala Ala Ala Ile Asp Pro Arg Gly Ala Ala Ser Arg Gln Thr 85 90 95 Ile Leu Asp Val Asn Leu Lys Gly Thr Gln Leu Leu Leu Asp Ala Cys 100 105 110 Val Glu Ala Ser Val Pro Thr Phe Ile Tyr Ser Ser Ser Val Leu Val 115 120 125 Ala Gly Pro Asn Ser Tyr Lys Glu Ile Ile Leu Asn Ala His Glu Glu 130 135 140 Glu His His Glu Ser Thr Trp Pro Asn Pro Tyr Pro Tyr Ser Lys Arg 145 150 155 160 Met Ala Glu Lys Ala Val Leu Ala Thr Asn Gly Arg Leu Leu Lys Asn 165 170 175 Gly Gly Thr Leu His Thr Cys Ala Leu Arg Leu Pro Phe Ile Tyr Gly 180 185 190 Glu Glu Cys Gln Val Thr Ser Thr Thr Val Lys Thr Ala Leu Lys Asn 195 200 205 Asn Ser Ile Ile Lys Lys Asn Ala Thr Phe Ser Ile Ala Asn Pro Val 210 215 220 Tyr Val Gly Asn Ala Ala Trp Ala His Ile Leu Ala Ala Arg Ser Leu 225 230 235 240 Gln Asp Pro Lys Lys Ser Pro Ser Ile Gln Gly Gln Phe Tyr Tyr Ile 245 250 255 Ser Asp Asn Thr Pro His Gln Ser Tyr Asp Asp Leu Asn Tyr Thr Leu 260 265 270 Ser Lys Glu Trp Gly Leu Cys Leu Asp Ser Gly Trp Arg Leu Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Leu Tyr Trp Leu Ala Phe Leu Leu Glu Thr Val Ser Phe Leu 290 295 300 Leu Arg Pro Val Tyr Asn Tyr Arg Pro Pro Phe Thr Arg Leu Leu Ile 305 310 315 320 Thr Val Leu Asn Ser Val Phe Thr Ile Ser Tyr Lys Lys Ala Gln Arg 325 330 335 Asp Leu Gly Tyr Gln Pro Leu Val Ser Trp Glu Glu Ala Lys Gln Lys 340 345 350 Thr Ser Glu Trp Ile Gly Thr Leu Val Lys Gln His Arg Glu Thr Leu 355 360 365 His Lys Lys Ser Gln 370 <210> 4 <211> 334 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Met Arg Lys Val Val Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Gly Arg Leu Leu Ala Glu Asp Asp Asp Leu His Leu Cys 20 25 30 Leu Ala Cys Arg Asn Leu Ser Lys Ala Arg Ala Val Arg Asp Thr Leu 35 40 45 Leu Ala Ser His Pro Ser Ala Glu Val Ser Ile Val Gln Met Asp Val 50 55 60 Ser Ser Leu Gln Ser Val Val Arg Gly Ala Glu Glu Val Lys Gln Lys 65 70 75 80 Phe Gln Arg Leu Asp Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Gly Ile Leu Pro Asn 85 90 95 Pro Gln Phe Asn Leu Lys Ala Phe Phe Cys Gly Ile Phe Ser Arg Asn 100 105 110 Val Ile His Met Phe Thr Thr Ala Glu Gly Ile Leu Thr Gln Asn Asp 115 120 125 Ser Val Thr Ala Asp Gly Leu Gln Glu Val Phe Glu Thr Asn Leu Phe 130 135 140 Gly His Phe Ile Leu Ile Arg Glu Leu Glu Pro Leu Leu Cys His Ala 145 150 155 160 Asp Asn Pro Ser Gln Leu Ile Trp Thr Ser Ser Arg Asn Ala Lys Lys 165 170 175 Ala Asn Phe Ser Leu Glu Asp Ile Gln His Ser Lys Gly Pro Glu Pro 180 185 190 Tyr Ser Ser Ser Lys Tyr Ala Thr Asp Leu Leu Asn Val Ala Leu Asn 195 200 205 Arg Asn Phe Asn Gln Lys Gly Leu Tyr Ser Ser Val Met Cys Pro Gly 210 215 220 Val Val Met Thr Asn Met Thr Tyr Gly Ile Leu Pro Pro Phe Ile Trp 225 230 235 240 Thr Leu Leu Leu Pro Ile Met Trp Leu Leu Arg Phe Phe Val Asn Ala 245 250 255 Leu Thr Val Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Glu Ala Leu Val Trp Leu Phe 260 265 270 His Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asn Pro Leu Thr Lys Tyr Ala Ser Ala 275 280 285 Thr Ser Gly Phe Gly Thr Asn Tyr Val Thr Gly Gln Lys Met Asp Ile 290 295 300 Asp Glu Asp Thr Ala Glu Lys Phe Tyr Glu Val Leu Leu Glu Leu Glu 305 310 315 320 Lys Arg Val Arg Thr Thr Val Gln Lys Ser Asp His Pro Ser 325 330

Claims (53)

1. ⅰ) 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화한 폴리뉴클레오타이드; 및

   ⅱ) 이형성(heterologous) 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드;

   를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 있어서,

   상기 숙주 세포는 포유동물 세포이고 콜레스테롤 영양요구성을 지님을 특징으로 하는 숙주 세포.
2. 제 1항에 있어서, 상기 3-케토스테로이드 리덕타제는 마우스 3-케토스테로이드 리덕타제를 포함함을 특징으로 하는 숙주 세포.
3. 제 1항에 있어서, 상기 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2의 염기서열을 지니거나 서열번호: 4의 아미노산 서열을 암호화한 서열을 지님을 특징으로 하는 숙주 세포.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 발현 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터의 제어하의 전사 유니트 생성 유전자를 위한 첫 번째 전사 유니트를 더욱 포함함을 특징으로 하는 숙주 세포.
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
8. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
9. ⅰ) 이형성 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 삽입할 수 있는 다중 클로닝 부위를 지니고 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터;

   ⅱ) 콜레스테롤 영양요구성인 포유동물 숙주 세포;

   ⅲ) 화학적으로 한정된 무혈청(serum-free) 배지;

   ⅳ) 낮은 씨딩(seeding) 및 클론 밀도를 지닌 숙주 세포의 성장을 유지하는 성장 보충제; 및

   ⅴ) 키트를 사용하기 위한 적어도 하나 이상의 프로토콜;

   을 포함하는 키트.
10. 제 9항에 있어서, 상기 3-케토스테로이드 리덕타제는 마우스 3-케토스테로이드 리덕타제를 포함함을 특징으로 하는 키트.
11. 제 9항에 있어서, 상기 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2의 염기서열을 지니거나 서열번호: 4의 아미노산 서열을 암호화한 서열을 지님을 특징으로 하는 키트.
12. 삭제
13. 제 9항에 있어서, 상기 재조합 DNA 발현 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터의 제어하의 전사 유니트 생성 유전자를 위한 첫 번째 전사 유니트를 더욱 포함함을 특징으로 하는 키트.
14. 제 9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 키트.
15. 제 9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포임을 특징으로 하는 키트.
16. 제 9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 화학적으로 한정된 무혈청 배지에 적합함을 특징으로 하는 키트.
17. 제 9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 화학적으로 한정된 배지에 적합함을 특징으로 하는 키트.
18. 제 9항에 있어서, 상기 성장 보충제는 지방산 비함유 BSA, rhIL-6, 재조합 인간 인슐린, 소듐셀레나이트, 피루브산 나트륨 또는 에탄올아민에서 선택된 1종 이상을 포함함을 특징으로 하는 키트.
19. 제 9항에 있어서, 상기 성장 보충제는 0.1% 내지 5%의 지방산 비함유 BSA, 1ng/ml 내지 9ng/mL의 rhIL-6, 5mg/ml 내지 15mg/L의 재조합 인간 인슐린, 5㎍/L 내지 8㎍/L의 소듐셀레나이트, 0.01g/L 내지 0.3g/L의 피루브산 나트륨 및 0.5mg/L 내지 3.5mg/L의 에탄올아민을 화학적으로 한정된 무혈청 배지에 최종 농도로 포함함을 특징으로 하는 키트.
20. 제 9항에 있어서, 상기 성장 보충제는 1%의 지방산 비함유 BSA, 5ng/mL의 rhIL-6, 10mg/L의 재조합 인간 인슐린, 6.7㎍/L의 소듐셀레나이트, 0.11g/L의 피루브산 나트륨 및 2.0mg/L의 에탄올아민을 최종 농도로 포함함을 특징으로 하는 키트.
21. (a) 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화한 폴리뉴클레오타이드; 및

    (b) 적어도 하나의 이형성 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드;

    를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터로 콜레스테롤 영양요구성인 포유동물 숙주 세포를 트랜스펙트시키는 단계를 포함하는 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 능력을 지닌 콜레스테롤 영양요구성 세포를 조립하는 방법에 있어서,

    상기 트랜스펙트된 세포가 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 능력을 지니기 위해 3-케토스테로이드 리덕타제를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포임을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된 무혈청 배지임을 특징으로 하는 방법.
25. 콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 능력을 지니고 이형성 단백질을 발현할 수 있는 능력을 지닌 세포를 수득하는 방법에 있어서,

    제 1항의 벡터로 콜레스테롤 영양요구성인 포유동물 세포를 트랜스펙트시키는 단계; 및

    콜레스테롤 결핍 배지에서 생존할 수 있는 능력을 지닌 세포를 선별하는 단계로 이루어진 세포의 수득 방법
26. 제 25항에 있어서, 상기 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포임을 특징으로 하는 방법.
28. 제 25항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된 무혈청 배지임을 특징으로 하는 방법.
29. 콜레스테롤 영양요구성인 포유동물 세포를 제 1항의 발현 벡터로 트랜스펙트시키는 단계를 포함하는 이형성 단백질의 발현 방법에 있어서,

    상기 발현 벡터는 이형성 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함하고, 상기 이형성 단백질의 발현을 위한 조건하에 콜레스테롤 부재 배지 내에서 트랜스펙트된 세포를 배양시킴을 특징으로 하는 이형성 단백질의 발현 방법.
30. 제 29항에 있어서, 상기 세포는 NS-0, NS-1 및 CHO-215로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 세포는 NS-0 마우스 골수종 세포임을 특징으로 하는 방법.
32. 제 29항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 한정된 배지 또는 화학적으로 한정된 무혈청 배지임을 특징으로 하는 방법.
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