BRPI0609808A2 - vetor , célula hospedeira, kit, composição dos suplementos de cultura celular, e, métodos para selecionar células que possam sobreviver em meio sem colesterol, para se obter células que tenham a capacidade de sobreviver em um meio desprovido de colesterol e produzir uma proteìna heteróloga, e para expressar uma proteìna heteróloga - Google Patents
vetor , célula hospedeira, kit, composição dos suplementos de cultura celular, e, métodos para selecionar células que possam sobreviver em meio sem colesterol, para se obter células que tenham a capacidade de sobreviver em um meio desprovido de colesterol e produzir uma proteìna heteróloga, e para expressar uma proteìna heteróloga Download PDFInfo
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Abstract
VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, KIT, COMPOSIçãO DOS SUPLEMENTOS DE CULTURA CELULAR, E, MéTODOS PARA SELECIONAR CéLULAS QUE POSSAM SOBREVIVER EM MEIO SEM COLESTEROL, PARA SE OBTER CéLULAS QUE TENHAM A CAPACIDADE DE SOBREVIVER EM UM MEIO DESPROVIDO DE COLESTEROL E PRODUZIR UMA PROTEìNA HETERóLOGA, E PARA EXPRESSAR UMA PROTEìNA HETERóLOGA. A presente invenção diz respeito a novos vetores marcadores de seleção, e a métodos para usar estes vetores para gerar sistemas estáveis de expressão de genes nas células eucarióticas. Mais especificamente, a presente invenção fornece composições e métodos que utilizam qualquer enzima útil na via biossintética eucariótica de esterol/colesterol, tal como uma 3- cetosteróide redutase, como um marcador de seleção metabólica para selecionar células transfectadas. Em uma forma de realização, o método compreende transfectar células que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor codificando a 3-cetosteróide redutase e pelo menos uma proteína heteróloga, e selecionar células que tenham a capacidade de sobreviver em meio carente de colesterol e/ou de produzir a proteína heteróloga nestas células em meios quimicamente definidos e/ou livres de soro.
Description
"VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, KIT, COMPOSIÇÃO DOS SUPLEMENTOS DE CULTURA CELULAR, E, MÉTODOS PARA SELECIONAR CÉLULAS QUE POSSAM SOBREVIVER EM MEIO SEM COLESTEROL, PARA SE OBTER CÉLULAS QUE TENHAM A CAPACIDADE DE SOBREVIVER EM UM MEIO DESPROVIDO DE COLESTEROL E PRODUZIR UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA, E PARA EXPRESSAR UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA"
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119 do Pedido Provisório U.S. Ser. n° 60/681.969, depositado em 18 de maio de 2005, o qual é inteiramente aqui incorporado como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a novos vetores marcadores de seleção, e a métodos para usar estes vetores para gerar sistemas estáveis de expressão de genes nas células eucarióticas.
FUNDAMENTOS O desenvolvimento de técnicas de cultura de células de mamíferos tem revolucionado a pesquisa biológica. Os sistemas de cultura celular podem ser usados para testar novos medicamentos quanto à toxicidade ou à eficácia em um estágio prematuro em desenvolvimento, quando os testes clínicos humanos sejam de alto risco; para produzir proteínas humanas complexas para aplicações terapêuticas, tais como os anticorpos monoclonais; e quando uma plataforma para a terapêutica com base celular no contexto das culturas de células tronco adultas e embriônicas. Além disso, a capacidade de introduzir DNA recombinante heterólogo nas linhagens celulares cultivadas dá aos cientistas uma ferramenta adjunta poderosa para manipular sistemas de animais para experimentação.
Recentemente, a necessidade de se tratar de questões reguladoras acerca da contaminação das linhagens celulares usadas para expressar biomoléculas e, subseqüentemente, para fabricar produtos terapêuticos, tem se tornado mais crítica. A indústria da biotecnologia como um todo está se movimentando para longe do uso dos meios suplementados pelo FBS quanto à cultura celular comercial a fim de garantir que os patógenos potenciais de animais ou as proteínas de animais causadoras de doenças, não sejam introduzidas na população humana através de biológicos futuros. Os meios livres de soro estão se tornando o protocolo padrão para se cultivar células de mamíferos, especialmente aqueles usados para expressão de genes e purificação protéica dentro das canalizações dos produtos biológicos.
A linhagem celular do mieloma de camundongos NS-O é comumente usada nos sistemas de expressão protéica, tais como o Sistema de Expressão de Genes de GS do Lonza (Lonza Group, Basel, Suíça). O Sistema de Expressão de Genes de GS explora a incapacidade das células NS-O de produzirem suficiente glutamina para sobreviverem sem adicionar-se glutamina exógena ao meio de crescimento, mediante o uso da enzima glutamina sintetase (GS) como um marcador para a transfecção celular com um vetor plasmídeo.
As células NS-O são também auxótrofos do colesterol, resultando em uma situação em que os meios usados para suportar o crescimento da linhagem celular devem ser suplementados tanto com colesterol quanto com a glutamina. A adição do colesterol exógeno ao meio aquoso é um processo complicado e demorado porque o lipídeo deve ser acoplado aos componentes de açúcar, tais como as ciclodextrinas, a fim de aumentar a solubilidade aquosa. Além disso, o processo de acoplamento é inerentemente instável, resultando em meio de crescimento suplementado pelo colesterol com uma vida de prateleira muito curta. Além disso, quando os meios livres de soro quimicamente definidos, (CD-SFM) são usados no lugar dos meios suplementados pelo soro bovino fetal (FBS), para a cultura das linhagens das células auxotróficas de colesterol, a precipitação do colesterol ocorre freqüentemente. Finalmente, o colesterol não pode ser facilmente filtrado através de membranas de esterilização de poros pequenos, tais como PES, por causa da sua inerente afinidade a tais polímeros, assim reduzindo significativamente a quantidade de colesterol no meio final filtrado. Esta questão ainda contribui para inconsistências nas preparações de batelada para batelada dos meios suplementados pelo colesterol. Além do colesterol exógeno diretamente ao meio sem passar através de um filtro, também aumenta a possibilidade de introduzir contaminantes, tais como agentes estranhos e/ou endotoxinas.
O mecanismo molecular subjacente à auxotrofia do colesterol das células NS-O foi recentemente identificado e caracterizado (European Collection of Cell Cultures - ECACC, n° 85110503, depositado pelo Dr. J. Jarvis, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, 73B(3) Methods in Enzymology (1981). A linhagem celular não expressa o gene codificando para uma enzima que catalise uma etapa na biossíntese endógena do colesterol. Uma enzima denominada 3-cetosteróide redutase (3-KSR), um membro de uma grande família de desidrogenases beta-hidroxiesteróides, é codificada pelo gene específico. A proteína de 3-KSR catalisa a conversão da zimosterona em zimosterol, um precursor do colesterol. Marijanovic et al., 17(9) Mol Endocrinol. 1715-1725 (2003).
Várias técnicas diferentes têm sido propostas para tratar da auxotrofia do colesterol das células NS-O com o objetivo de tornar o protocolo da cultura mais eficiente e menos dependente da solubilidade do colesterol bem sucedida nos meios aquosos. Uma abordagem tem sido usar lipídeos derivados de plantas ou sintéticos, ao invés de colesterol derivado de animais, para suplementar os meios CD. Gorfien et ai., 16(5) Biotechnol. Prog. 682-687 (2000).Outra abordagem tem sido construir células NS-O para sobrexpressar 3-KSR, dessa forma invertendo a deficiência enzimática e possibilitando que as linhagens celulares sejam cultivadas sem a adição do colesterol exógeno. Seth et ai, 121(2) J.Biotechnol. 241-252 (2006). Finalmente, os pesquisadores estão pesquisando a base molecular para a inatividade do gene de 3-KSR nas células NS-O e tentando restaurar a expressão do gene pela desmetilação de uma região reguladora de montante crítica, o qual deve abrandar a repressão transcricional do gene de 3-KSR. Seth et ai, 93(4) Biotechnol. Bioeng. 820-827 (2006).
Não obstante, permanece uma grande necessidade na indústria de biotecnologia de gerar linhagens celulares estáveis através da transfecção com vetores de expressão em meios quimicamente definidos/livres de soro, as quais sejam capazes de expressar moléculas heterólogas. Além disso, é altamente desejável que os meios quimicamente definidos/livres de soro sejam utilizáveis fora da prateleira sem necessidade da adição problemática de colesterol exógeno. A presente invenção fornece um vetor de expressão contendo um gene ou polinucleotídeo codificando uma enzima na via biossintética do esterol ou do colesterol de uma célula eucariótica que comunique a capacidade da célula de sobreviver e ser cultivada em meios quimicamente definidos e/ou livres de soro. Quando este vetor de expressão também compreende um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína heteróloga, polipeptídeo ou peptídeo, este vetor é útil como um marcador de seleção metabólica para selecionar as células transfectadas que contenham o gene codificando a proteína heteróloga que possa ser produzida em meios quimicamente definidos e/ou livres de soro.
SUMÁRIO
A presente invenção diz respeito a novos vetores marcadores de seleção metabólica, e a métodos para usar estes vetores para gerar sistemas de expressão de genes estáveis em células eucarióticas.
A presente invenção inclui um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma enzima na via biossintética de esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo e um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo heterólogo. A presente invenção ainda inclui uma célula hospedeira transformada com o vetor.
A presente invenção também inclui um kit compreendendo:
um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo; e opcionalmente um ou mais dentre: uma pluralidade de células hospedeiras que sejam auxotróficas quanto ao colesterol; meios quimicamente definidos, livres de soro; suplementos de crescimento que suportem o crescimento da pluralidade de células hospedeiras em baixa semeadura e densidades clonais; e pelo menos um protocolo ou instruções escritas para utilizar o kit.
A presente invenção adicionalmente inclui um método para selecionar células que possam sobreviverem meio sem colesterol, compreendendo: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifique uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar células que tenham a capacidade de sobreviver em meio carente de colesterol.
A presente invenção ainda compreende um método para se obter células que tenham a capacidade de sobreviver em um meio carente de colesterol e produzir uma proteína heteróloga compreendendo: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor como aqui descrito contendo uma enzima, tal como uma 3-KSR, e pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar as células que tenham a capacidade de sobreviver em meio carente de colesterol.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As Figuras IA a IJ apresentam a via bioquímica para a biossíntese do esterol eucariótico e, especificamente, de mamífero, a qual seja parcialmente mediada pelo produto do gene de 3-KSR.
A Figura 2 apresenta o mapa de plasmídeo do vetor de expressão p3-KSR.
A Figura 3 apresenta o mapa de plasmídeo do vetor de expressão p3-KSRimAbVL:mAbVH carregando genes de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos completos clonados em tandem.
A Figura 4 apresenta o mapa de plasmídeo de p3-KRS:rec_gene, um exemplo de uma construção de genes recombinantes (rec_gene) clonado em p3-KSR.
A Figura 5 apresenta pBFKSR. 1HUMAB, que fornece um exemplo de 6 possíveis orientações de expressão de cassete de genes de anticorpos na região de clonagem múltipla do vetor de expressão de p3-KSR.
DESCRIÇÃO DETALHADA
E entendido que a presente invenção não está limitada aos métodos e componentes particulares, etc., aqui descritos, quando estes possam variar. E entendido também que a terminologia aqui empregada é usada para os fins de descrever formas de realização particulares apenas, e não deve limitar o escopo da presente invenção. Deve ser observado que, como usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referência no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "um polinucleotídeo" é uma referência a um ou mais polinucleotídeos e inclui seus equivalentes conhecidos daqueles habilitados na técnica, e assim por diante. O termo "vetor" é uma referência a uma molécula de DNA auto-replicativa, que também é aqui referida como um "plasmídeo" ou um "vetor de clonagem de plasmídeo", que é um plasmídeo usado em experiências recombinantes de DNA como um aceptor do DNA estranho ou heterólogo. A proteína, o polipeptídeo ou o peptídeo heterólogos incluem qualquer proteína que seja útil para tratar de condições ou doenças, ou como reagentes.
A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendidos por uma pessoa de habilidade normal na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos, dispositivos e materiais específicos são descritos, não obstante quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou nos testes da presente invenção.
A presente invenção fornece composições e métodos úteis para seleção metabólica de células transfectadas mediante a utilização de uma enzima da via da biossíntese do esterol de mamíferos, como um gene de seleção metabólica nas células eucarióticas que sejam deficientes na enzima. As células eucarióticas com estas propriedades são úteis para a produção de uma molécula heteróloga, tal como um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína ou outra molécula que não seja normalmente produzida pela célula. Especificamente, a presente invenção utiliza a 3-cetosteróide redutase (3-KSR) como um gene de seleção metabólica na geração de linhagens de células eucarióticas que sejam deficientes na 3-KSR quanto à produção de uma molécula heteróloga tal como um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína em meio que careça do colesterol exógeno ou quaisquer precursores do colesterol a jusante da 3-KSR na via biossintética do colesterol eucariótico. Ver a Figura 1, que apresenta a via bioquímica para a biossíntese do esterol de mamífero que seja parcialmente mediada pela 3-KSR.
Mais especificamente, a presente invenção fornece polinucleotídeos e polipeptídeos que codificam uma enzima na via da biossíntese do esterol de mamíferos, conforme mostrado na Figura 1,onde tal enzima, por exemplo, é a 3-KSR, vetores para expressar a enzima, tal como a 3-KSR, linhagens celulares que são deficientes na enzima, tal como a 3-KSR, meios de cultura celular e suplementos de crescimento para uso no processo de transfecção, e kits para exploração comercial da presente invenção.
A presente invenção inclui um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo, e um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo heterólogo. A enzima neste vetor mais especificamente compreende uma 3-cetosteróide redutase (3-KSR), e mais especificamente uma 3-KSR de murino. Polinucleotídeos representativos específicos que codificam uma 3-KSR compreendem a SEQ ID NO: 1, a qual codifica a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 e compreende a SEQ ID NO: 2 que codifica a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4.
O vetor, conforme descrito acima, é preferivelmente um vetor de expressão de DNA recombinante, o qual opcionalmente ainda compreende pelo menos uma primeira unidade de transcrição para um gene do produto, unidade de transcrição esta que se acha sob o controle do promotor do citomegalovírus humano. Detalhes de outras unidades e elementos no vetor de expressão são descritos em detalhes neste relatório.
A presente invenção ainda inclui uma célula hospedeiro transformada com o vetor, como descrito acima. A célula hospedeira é uma célula eucariótica, a qual é conhecida das pessoas habilitadas na técnica como incluindo a Protoctista, a Fungi, a Animalia e a Plantae. Portanto, pretende-se que as células de fungos, de plantas e de mamíferos sejam abrangidas pela presente invenção como células hospedeiras apropriadas. A célula hospedeira preferivelmente é auxotrófica quanto ao colesterol. Células hospedeiras específicas que são úteis na presente invenção são a NS-0, a NS-I e a CHO- 215, e mais especificamente uma célula do mieloma de camundongo NS-0.
A presente invenção também inclui um kit contendo: um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo; e, opcionalmente, um ou mais dentre: uma pluralidade de células hospedeiras que sejam auxotróficas quanto ao colesterol; meios livre de soro quimicamente definidos; suplementos de crescimento que suportem o crescimento da pluralidade de células hospedeiras em baixa semeadura e densidades clonais; e pelo menos um protocolo ou instruções escritas para se utilizar o kit. Como observado acima, a enzima é de preferência uma 3-KSR e, mais preferível, uma 3-KSR murina com o vetor contendo, por exemplo, polinucleotídeos úteis codificando a enzima compreendendo as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Estes polinucleotídeos codificam a seqüência de aminoácidos das enzimas compreendendo as SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. O vetor no kit é preferivelmente um vetor de expressão de DNA recombinante, o qual opcionalmente ainda compreende pelo menos uma primeira unidade de transcrição para um gene do produto cuja unidade de transcrição esteja sob o controle do promotor do citomegalovírus humano.
As células hospedeiras no kit são preferivelmente NS-0, NS-I e CHO-215 e, mais preferível, uma célula de mieloma de camundongo NS-0, a qual seja adaptada para crescer em meio livre de soro quimicamente definido e/ou em meio quimicamente definido.
O kit ainda pode, opcionalmente, conter suplementos de crescimento que compreendam pelo menos um dentre BSA livre de ácido graxo, interleucina-t humana recombinante (rhIL-6), insulina humana recombinante, selenito de sódio , pimvato de sódio, e etanolamina. Mais preferível, os suplementos de crescimento compreendem concentrações finais no meio de seleção de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 1 ng/ml a cerca de 9 ng/ml de rhIL-6, cerca de 5 mg/ml a cerca de 15 mg/litro de insulina humana recombinante, cerca de 5 μg/litro a cerca de 8 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,01 g/litro a cerca de 0,3 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 0,5 mg/litro a cerca de 3,5 mg/litro de etanolamina. Mais preferivelmente, os suplementos de crescimento compreendem concentrações finais no meio de seleção de cerca de 1 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 5 ng/ml de rhIL-6, cerca de 10 mg/ml de insulina humana recombinante, cerca de 6,7 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,11 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 2,0 mg/litro de etanolamina.
A invenção ainda inclui uma composição de suplementos de cultura celular compreendendo concentrações finais no meio de seleção de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 1 ng/ml a cerca de 9 ng/ml de rhIL-6, cerca de 5 mg/ml a cerca de 15 mg/litro de insulina humana recombinante, cerca de 5 μg/litro a cerca de 8 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,01 g/litro a cerca de 0,3 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 0,5 mg/litro a cerca de 3,5 mg/litro de etanolamina. Adicionalmente, a invenção também inclui uma composição de suplementos de cultura celular compreendendo as concentrações finais no meio de seleção de cerca de 1 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 5 ng/ml de rhIL-6, cerca de 10 mg/litro de insulina humana recombinante, cerca de 6,7 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,11 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 2,0 mg/litro de etanolamina.
A presente invenção adicionalmente inclui um método para selecionar células que possam sobreviver em meio sem colesterol, compreendendo: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifique uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar células que tenham a capacidade de sobreviver em meio carente de colesterol. Preferivelmente as células hospedeiras são NS-O5 NS-I e CHO-215 e, preferivelmente, as células são células de mieloma de camundongo NS-O e o meio é quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido. A enzima útil neste método compreende uma 3-KSR.
A presente invenção ainda compreende um método para se obter células que tenham a capacidade de sobreviver em um meio carente de colesterol e produzir uma proteína heteróloga compreendendo: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor como aqui descrito contendo uma enzima, tal como uma 3-KSR, e pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar as células que tenham a capacidade de sobreviver em meio carente de colesterol. Como anteriormente descrito, as células são auxotróficas quanto ao colesterol, e preferivelmente são NS-0, NS-I e CHO-215, e mais preferível são células de mieloma de camundongo NS-0, as quais podem ser cultivadas em um meio que seja quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
A presente invenção ainda inclui um método para produzir uma proteína heteróloga no sistema de culturas celulares aqui descrito, compreendendo: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifique uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo; e pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e cultivar as células sob condições para produzir a proteína heteróloga. O método ainda compreende obter a proteína heteróloga da cultura celular mediante técnicas de isolamento, separação ou purificação conhecidas das pessoas habilitadas na técnica. As células são auxotróficas quanto ao colesterol e, preferivelmente, são NS-O, NS-I e CHO-215 e, mais preferível, são células de mieloma de camundongo NS-O que podem ser cultivadas em meio que seja quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
A presente invenção ainda inclui mais especificamente um método para expressar uma proteína heteróloga compreendendo cultivar uma célula transfectada com um vetor compreendendo uma seqüência codificando a 3-cetosteróide redutase e pelo menos uma proteína heteróloga na ausência de colesterol, sob condições para produzir a proteína heteróloga em que as células preferidas e o meio sejam descritos acima. I. 3-CETOSTERÓIDES REDUTASES
A presente invenção utiliza qualquer 3-KSR eucariótica como um gene de seleção metabólica para a produção de proteínas heterólogas. Em uma forma de realização, uma 3-KSR de murino pode ser usada, especificamente a 3p-hidroxiesteróide:NADP+3-oxirredutase, também conhecida como HSD3P5 (Número de Acesso da NCBI L41519) com uma seqüência de nucleotídeos como segue (SEQ ID NO: 1):
ATGCCfGGAT GGAGCTGCCT GGTffiaLCAQGA GCAGGAGGGT TTCTTGGCCA GAGGSiTTGTC CGAATGTTGG TGCAGGAGGA AGAGTTGCAG GAGATCAGAG CCCTGTTCAG GACCTTCGGT CGftAAACATG AAGAGGAATT GTCCAAGCTG CAGACÂAAGG CCAAGGTGAG AGTACTGAAG GGAGACATTC TGGATGCCCA ATGCCTGAAG AGAGCCTGCC AGGGCATGTC TGCTGTCATC CACACCGCTG CTGCTATTGA CCCCCGTGGT GCCGCTTCCA GACAGACCAT CCTAGATGTC AATCTGAAAG GTACTCAGCT CCTACTGGAT GCTTGTGTGG AAGCCAGTGT GCCAACATTC ATCTACAGCA GCTCAGTGCT TGTGGCTGGA CCAAATTCCT ACAAGGAGAT CATCCTGAAT GCCCATGAGG AAGAGCATCA TGAftAGCACA TGGCCTAACC CATACCCATA CAGCAAAAGG ATGGCTGAGA AGGCAGTGCT GGCAACAAAT GGGAGACTCC TGAAAAATGG TGGCACTTTG CATACTTGTG CCTTAAGACT CCCTTTCATC TATGGGGAAG AATGCCAAGT CACTTCAACC ACTGTGAAAA CAGCACTGAA GAACAACAGC ATAATTAAGA AAAATGCCAC ATTCTCCATC GCCAACCCAG TGTATGTGGG CAATGCAGCC TGGGCTCACA TTCTGGCTGC CAGGAGCCTA CAGGACCCCA AGAAGTCCCC AAGCATCCAA GGACAGTTCT ATTACATCTC TGATAACACC CCTCACCAAA GCTATGATGA TTTAAATTAC ACCCTGAGCA AGGAGTGGGG CCTCTGCCTT GATTCTGGCT GGAGGCTTCC TCTGTCCCTG ÇTTTACTGGC TTGCCTTCCT GCTGGAAACT GTGAGCTTCC TGCTACGfCC AGTTTACAÃC TATAGGCCAC CCTTTACCCG CCTCTTGATC ACAGTGCTAA ATAGCGTGTT TACCATTTCC TATAAGAAAG CTCAGCGCGA TCTAGGCTAT CAGCCACTTG TCAGCTGGGA GOiAGCCAAG CAAAAAACCT CAGAGTGGAT TGGAACACTA GTGAAGCAGC ACAGGGAGAC ACTACAC AAA AAGTCACAGT GA A SEQ ID NO: 1 codifica uma e-KSR específica que tem a seqüência de aminoácidos como segue: Seqüência de aminoácidos HSD3b5 de murinos (SEQ ID NO: 3):
MPGW SCI^VT GAGGFLGQRIVRMLVQEEELQE GMS AVTBTAAàlDPRGAASÍ^! III}VNlJ^ FVCT&g&M^XIiAARSI^ IiE^SITUIAWYtTfRPPETrRLLITVIi^ KSQ*
Adicionalmente, outras enzimas funcionais são codificadas por 5 genes que incluem, sem limitar, a desidrogenase 17P-hidroxiesteróide tipo 7 ÇHsdl7b7), a desidrogenase 3p-hidróxi-delta(5)-esteróide (Hsd3b5), Sfi-Hsd III de
rato, Sfi-Hsd IV de camundongo, Sfi-Hsd V de camundongo e Sfi-Hsd III de hamster, que são conhecidos como funcionando exclusivamente como 3-cetosteróides redutases. Especificamente, um polinucleotídeo 10 compreendendo a SEQ ID NO: 2, também conhecido como desidrogenase 7 (17-beta) hidroxiesteróide (n° de Acesso de Nucleotídeo NCBI: BCOl 1464), a qual contém a seguinte seqüência de nucleotídeos HSD17b7 de murinos, que é como segue:
ATGCGGAAGG IrGGTTTTOAT CACCGGGGCG AGCAGTGGCA TTGGGCTAGC CCTTTGCGGT CGACTGCTGG CAGAAGACGA TGACCTCCAC CTGTGTTTGG CGTGTAGGAA CCTGAGCAAA GCAAGAGCTG TTCGAGATAC CCTGCTGGCC TCTCACCCCT CCGCCGAAGT CAGCATCGTG CAGATGGATG TCAGCAGCCT GCAGTÇGGTG GTCCGGGGTG CAGAGGAAGT CAAGCAAAAG TTTCAAAGAT TAGACTACTT ATATCTGAAT GCTGGAATCC TGCCTAATCC ACAATTCAAC CTCAAGGCAT TTTTCTGCGG CATCTTTTCA AGAAATGTGA TTCATATGTT CACCACAGCG GAAGGAATTT TGACCCAGAA TGftCTCGGTC ACTGCCGACG GGTTGCAiCSGA GGTGTTTGAA ACCAATCTCT TTGGCCACTT TATTCTGATT CGGGAACTGG AACCACTTCT CTGCCATGCG GACAACCCCT CTCAGCTCAT CTGGACGTCC TCTCGCAATG CAAAGAAGGC TAACTTCAGC CTGGAGGACA TCCAGCACTC CAAAGGCCCG GAACCCTACA GCTCTTCCAA ATATGCTACC GACCTCCTGA ATGTGGCTTT GAACAGGAAT TTCAACCAGA AGGGTCTGTA TTCCAGTGTG ATGTGCCCAG GCGTCGTGAT GACCAATATG ACGTATGGAA TTTTGCCTCC CTTTATCTGG ACGTTGCTCC TACCCATAAT GTGGCTCCTT CGCTTTTTTG TAAATGCGCT CACTGTGACA CCGTACAACG GAGCAGAGGC CCTGGTGTGG CTCTTCCACC AAÁAACCGGA GTCTCTTAAT CCTCTGACCA AATACGCGAG CGCCACCTCG GGATTTGGGA CTAATTACGT CACGGGCCAA AAGATGGACA TAGATGAAGA CACTGCTGAA AAATTCTATG AGGTCTTACT GGAGCTGGAA AAGCGTGTCA GGACCACCGT TCAGAftATCG GATCACCCGA GCTGA
A SEQ ID NO: 2 codifica uma 3-KSR específica que tem a seqüência de aminoácidos como segue:
Seqüência de aminoácidos HSD17b7 de murinos (SEQ ID NO: 4):
MRKWLI OXSASSGIGLMmitIED
^I^PIO^HADKPSQLlOTSSimAKKFSlLED
KM3 IDEDTAEKFYFVIaLELEKRVRTTVQKSDHPS
Em outra forma de realização, qualquer enzima, por exemplo a 3-KSR, que facilite a conversão enzimática dos seguintes precursores no primeiro e segundo ciclos da biossíntese de esterol de mamíferos, como apresentado na Figura 1, pode ser usada:
4-metil-5a-colesta-3,8,24-trieno-3β-οΐ 3-KSR 3-oxo-4a-metil-5a-colesta-8,24-dieno -> 3-KSR —>· 3p-hidróxi-4a-metil-5a-colesta-8,24-dieno (1° ciclo) 5a-colesta-3,8,24-trieno-3p-ol —>· 3-KSR 3-oxo-5a-colesta-
8,24-dieno 3-KSR -» delta-8,24-colestadieno-3p-ol (3p-hidróxi-5ot-colesta-8,24-dieno; zimosterol) (22 ciclo).
Outros exemplos específicos de 3-KSRs que podem ser usados na presente invenção incluem outras 3-KSRs murinas (n~ de Acesso 15 NM 00295, NM 010476 e BC_0127), bovina (n2 de Acesso XM_591611), humana (n2 de Acesso NM_016371).
A. Polinucleotídeos de 3-KSR, Seus Fragmentos e Variantes
A presente invenção diz respeito a polinucleotídeos que codificam qualquer 3-KSR. O escopo da invenção em relação aos polinucleotídeos que codificam 3-KSR inclui, sem limitar, polinucleotídeos que tenham uma seqüência apresentada em qualquer uma das seqüências de polinucleotídeos aqui fornecidas; os polinucleotídeos obtidos dos materiais biológicos aqui descritos ou de outras fontes (por exemplo as fontes murinas ou humanas) mediante hibridização sob condições estringentes (particularmente condições de alta estringência); genes correspondentes aos polinucleotídeos fornecidos; variantes dos polinucleotídeos fornecidos e seus genes correspondentes, particularmente aquelas variantes que retenham uma atividade biológicas do produto de genes codificados (por exemplo, uma atividade biológica atribuída a um produto de genes correspondente aos polinucleotídeos fornecidos como um resultado da atribuição do produto de genes a uma família de proteínas e/ou a famílias de proteínas, e/ou da identificação de um domínio funcional presente no produto de genes). Outras composições de polinucleotídeos de 3-KSR consideradas pelo escopo e dentro do escopo da presente invenção, serão prontamente evidentes a uma pessoa de habilidade normal na técnica, quando fornecidas com a presente descrição. Como aqui usados, os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico" não intentam ser limitativos quanto ao comprimento ou estrutura do polinucleotídeo, a menos que especificamente indicado.
Os polinucleotídeos de 3-KSR podem compreender uma seqüência apresentada em qualquer uma das seqüências de polinucleotídeos aqui fornecidas. Os polinucleotídeos de 3-KSR da presente invenção também incluem polinucleotídeos tendo similaridade de seqüência ou identidade de seqüência com DNA de 3-KSR nativo. Isto inclui as seqüências não transladadas de 5' e 3' associadas, promotor e seqüências intensificadoras. Os polinucleotídeos de 3-KSR tendo similaridade de seqüência podem ser detectados por hibridização sob condições de baixa estringência, por exemplo a 50 0C e IOXSSC (solução salina 0,9 M/citrato de sódio 0,09 M) e permanecerem ligados quando submetidos a lavagem em 55 0C em 1XSSC. A identidade de seqüência pode ser determinada por hibridização sob condições estringentes, por exemplo em 50 0C ou acima, e 0,IXSSC (solução salina 9 mM/citrato de sódio 0,9 mM). Naturalmente, os métodos e condições de hibridização são bem conhecidos na técnica e todos os métodos e condições alternativos podem ser usados para identificar polinucleotídeos de 3-KSR adicionais.
Os polinucleotídeos de 3-KSR da presente invenção também incluem variantes de ocorrência natural das seqüências de nucleotídeos de 3-KSR (por exemplo, variantes degeneradas, variantes alélicas, etc.). As variantes dos polinucleotídeos de 3-KSR da presente invenção são identificadas pela hibridização das variantes putativas com as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas, preferivelmente pela hibridização sob condições estringentes. Por exemplo, mediante o uso apropriado das condições de lavagem, as variantes dos polinucleotídeos de 3-KSR aqui descritas podem ser identificadas quando a variante alélica apresente no máximo cerca de 25 a 30 % de ligações imperfeitas de pares de base (pb) em relação à sonda de polinucleotídeo selecionada. Em geral, as variantes alélicas contêm cerca de 15 a 25 % de ligações imperfeitas de pb, e podem conter mesmo tão pouco quanto 5 a 15 %, ou 2 a 5 %, ou 1 a 2 % de ligações imperfeitas de pb, assim como uma única ligação imperfeita de pares de base.
A presente invenção também inclui homólogos correspondentes às seqüências de polinucleotídeos de 3-KSR aqui fornecidas, em que a fonte de genes homólogos pode ser qualquer espécie de mamífero, por exemplo, a espécie primata, particularmente seres humanos; roedores, tais como ratos; caninos, felinos, bovinos, ovinos, eqüinos, levedura, nematóides etc. Entre as espécies de mamíferos, por exemplo seres humanos e camundongos, os homólogos geralmente têm substancial similaridade de seqüência ao gene ou à sua porção, por exemplo pelo menos 75 % de identidade de seqüência, usualmente pelo menos 90 %, mais usualmente pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % entre as seqüências de nucleotídeos. A similaridade de seqüência pode ser calculada com base em uma seqüência de referência, a qual pode ser um subconjunto de uma seqüência de 3-KSR maior, por exemplo como um motivo conservado, parte de região codificadora, região de ílanqueio, etc. Uma seqüência de referência será usualmente de pelo menos cerca de 18 nt contíguos de comprimento, mais usualmente de pelo menos cerca de 30 nt de comprimento, e pode estender-se até a seqüência de 3-KSR completa que esteja sendo comparada. Os algoritmos para a análise de seqüência são conhecidos na técnica, tal como o BLAST afastado, descrito em Altschul, et al., 25 Nucleic Acids Res. 3389- 3402 (1997).
Em geral, as variantes dos polinucleotídeos de 3-KSR aqui descritos têm uma identidade de seqüência maior do que pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, e podem ser mais elevadas do que pelo menos cerca de 90 %, 95 %, 96 %, 98 %, 99 % ou mais, como determinado com o uso de métodos convencionais tais como o algoritmo de pesquisa da homologia de Smith-Waterman, como implementado no programa MPSRCH (Accelrys, Inc., San Diego, CA). Por exemplo,a identidade de seqüência de DNA global pode ser mais elevada do que 65 %, conforme determinado pelo algoritmo de pesquisa da homologia de Smith-Waterman com o uso de uma pesquisa de intervalo afim com os seguintes parâmetros de pesquisa: penalidade aberta de descontinuidade, 12; e penalidade de extensão aberta, 1.
Os polinucleotídeos de 3-KSR da presente invenção podem ser cDNAs ou DNAs genômicos, bem como suas versões truncadas ou fragmentos, particularmente fragmentos que codifiquem um produto de genes de 3-KSR biologicamente ativo ou resgatável, que seja funcional nas células eucarióticas dentro das quais ele seja transfectado para permitir que as células cresçam nos meios livres de colesterol. Os cDNAs incluem todos os ácidos nucléicos que compartilham da disposição dos elementos da seqüência encontrados nas espécies de nRNA maduras nativas, em que os elementos da seqüência sejam éxons e regiões não codificadoras de 3' e 5'. Normalmente, as espécies de mRNA têm éxons contíguos, com os íntrons intervenientes, quando presentes, sendo removidos por recomposição nuclear de RNA, para criar uma matriz de leitura aberta contínua codificando um polipeptídeo. As espécies de mRNA podem também existir tanto com éxons quanto com íntrons, onde os íntrons possam ser removidos por recomposição alternativa.
Uma seqüência genômica de 3-KSR pode compreender o ácido nucléico presente entre o códon de iniciação e o códon de parada, como definido nas seqüências listadas, incluindo todos os íntrons que estejam normalmente presentes em um cromossoma nativo. Ela pode ainda incluir as regiões não transladadas de 5' e 3' encontradas no mRNA maduro. A seqüência genômica pode ainda incluir seqüências reguladoras específicas transcricionais e translacionais, tais como promotoras, intensificadoras etc., incluindo cerca de 1 kb, mas possivelmente mais, do DNA genômico de flanqueio ou na extremidade 5' ou na 3' da região transcrita. B. Polipeptídeos de 3-KSR, Seus Fragmentos e Variantes
Os polinucleotídeos de 3-KSR da presente invenção incluem aqueles codificados pelos polinucleotídeos de 3-KSR apresentados, seus fragmentos e variantes, incluindo, por exemplo, ácidos nucléicos que, em virtude da degenerescência do código genético, não sejam idênticos na seqüência aos polinucleotídeos de 3-KSR apresentados.
Um polipeptídeo de 3-KSR refere-se tanto ao polipeptídeo de comprimento completo codificado pelo polinucleotídeo indicado, ao polipeptídeo codificado pelo gene representado pelo polinucleotídeo apresentado, bem como às suas porções ou fragmentos. Os polinucleotídeos de 3-KSR também incluem variantes das proteínas de ocorrência natural, quando tais variantes sejam homólogas ou substancialmente similares às proteínas de 3-KSR de ocorrência natural, e podem ser de uma origem da mesma espécie ou de espécie diferente das proteínas de 3-KSR de ocorrência natural (por exemplo, humanas, murinas, ou de alguma outra espécie que expresse naturalmente o polipeptídeo indicado, usualmente uma espécie de mamíferos). Em geral, os polipeptídeos de 3-KSR variantes têm uma seqüência que possui pelo menos cerca de 80 %, usualmente pelo menos cerca de 90 %, e mais usualmente pelo menos cerca de 95 % de identidade de seqüência, ou mais elevada, isto é, de 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de seqüência, com um polinucleotídeo de 3-KSR aqui descrito, medido, por exemplo, pelo BLAST 2.0 com o uso dos parâmetros descritos acima. Os polinucleotídeos de 3-KSR variantes podem ser modificados naturalmente ou não naturalmente de forme pós-translacional, isto é, o polipeptídeo tem um padrão de modificação pós-translacional que difere de qualquer modificação de pós-translação prevista ou experimentalmente caracterizada da proteína de 3-KSR de ocorrência natural.
A presente invenção também inclui homólogos dos polipeptídeos de 3-KSR (ou seus fragmentos) em que os homólogos são isolados de qualquer espécie, usualmente espécie de mamíferos, por exemplo roedores, tais como camundongos e ratos; animais domésticos, por exemplo cavalo, vaca, cão, gato; e seres humanos. Os homólogos podem ter pelo menos cerca de 35 %, usualmente pelo menos cerca de 40 % e, mais usualmente, pelo menos cerca de 60 % de identidade de seqüência de aminoácidos a uma proteína de 3-KSR particular aqui descrita, em que a identidade de seqüência é determinada com o uso do algoritmo BLAST 2.0, por exemplo com os parâmetros descritos acima.
Acham-se também dentro do escopo da presente invenção as variantes de polipeptídeos, incluindo mutantes, fragmentos e fusões. Os mutantes podem incluir substituições, adições ou deleções de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservativas ou substituições para eliminar aminoácidos não essenciais, tal como para alterar um sítio de glicosilação, um sítio de fosforilação ou um sítio de acetilação, ou para minimizar a duplicação inadequada pela substituição ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína que não sejam necessários para a função. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas que preservam a mudança geral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, e/ou a massa estérica do aminoácido substituído. As variantes podem ser designadas de modo a reterem ou terem atividade biológica intensificada de uma região particular da proteína (por exemplo, um domínio funcional e/ou, quando o polipeptídeo seja um membro de uma família de proteínas, uma região associada com uma seqüência de consenso). A seleção das alterações dos aminoácidos para a produção das variantes de 3-KSR podem basear-se na acessibilidade (interior versus exterior) do aminoácido [ver, por exemplo, Go et al., 15 Int. J. Peptide Protein Res. 211 (1980)], na termoestabilidade do polipeptídeo variante [ver, por exemplo, Querol et ai., 9 Prot. Eng. 265 (1996)], nos sítios de glicosilação desejados [ver, por exemplo, Olsen e Thomsen, 137 J. Gen. Microbiol. 579 (1991)], nas pontes dissulfeto desejadas [ver, por exemplo, Clarke et ai., 32 Biochem. 4322 (1993); e Wakarchuk et ai., 7 Protein Eng. 1379 (1994)], nos sítios de metal desejados [ver, por exemplo, Toma et al., 30 Biochem. 97 (1991), e Haezerbrouck et al., 6 Protein Eng. 643 (1993)], e nas substituições desejadas dentro dos laços da prolina [ver, por exemplo, Masui et al., 60 Appl. Env. Microbiol. 3579 (1994)]. As muteínas exauridas de cisteína podem ser produzidas como apresentado na Patente U.S. 4.959.314.
As variantes de 3-KSR também incluem fragmentos dos polipeptídeos aqui apresentados, em particular fragmentos biologicamente ativos e/ou fragmentos correspondentes a domínios funcionais. Os fragmentos de interesse tipicamente serão de pelo menos cerca de 10 aminoácidos (aa) a pelo menos cerca de 15 aa de comprimento, usualmente de pelo menos cerca de 50 aa de comprimento, e podem ser tão longos quanto de 300 aa de comprimento ou mais longos, mas usualmente não excederão de cerca de 531 aa de comprimento, quando o fragmento venha a ter um alongamento de aminoácidos que seja idêntico a um polinucleotídeo de 3-KSR codificado por um polinucleotídeo tendo uma seqüência de qualquer uma das seqüências de polinucleotídeos aqui fornecidas, ou um seu homólogo. O código genético pode ser usado para selecionar os códons apropriados para construir as variantes correspondentes. Em particular, os fragmentos incluirão aqueles que contenham os domínios ou epítopos específicos da proteína de 3-KSR.
As variantes das seqüências de aminoácidos de 3-KSR podem ser preparadas pela introdução de mudanças apropriadas de nucleotídeos no aminoácido, ou por síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições dos resíduos dentro das seqüências de aminoácidos de 3-KSR. Qualquer combinação da deleção, inserção e substituição é feita para se chegar na construção formal da 3-KSR, contanto que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar os processos pós- translacionais da 3-KSR, tal como mudar o número ou a posição dos sítios de glicosilação ou outras modificações pós-translacionais, incluindo a acetilação e a fosforilação.
Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões da 3-KSR que sejam localizações preferidas para a mutagênese, é denominado "mutagênese de varredura de alanina", como descrito por Cunningham e Wells, 244 Science 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo resíduos carregados tais como arg, asp, his, Iys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferível alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Essas localizações dos aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições são então refinadas pela introdução ainda de outras variantes nos, ou para os, sítios de substituição. Assim sendo, embora o sítio para introduzir-se uma variação de seqüência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, a varredura ou a mutagênese aleatória de ala é conduzida no códon ou região alvos, e as variantes de 3-KSR expressas são provadas quanto à atividade desejada. As inserções de aminoácidos incluem as fusões de terminal amino e/ou carboxila variando no comprimento de um resíduo aos polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como as inserções entre seqüências de um único ou de múltiplos resíduos de aminoácido. Exemplos de inserções terminais incluem uma 3-KSR com um resíduo N-terminal de metionila.
Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína de 3-KSR substituído por um resíduo diferente.
Modificações substanciais nas propriedades biológicas da proteína de 3-KSR são realizadas pela seleção de substituições que difiram significativamente em seu efeito em manter (i) a estrutura da cadeia principal polipeptídica na área da substituição, por exemplo como uma lâmina ou conformação helicoidal, (ii) a carga ou a hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (iii) a massa da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofobicidade: norleucina, met, ala, vai, leu, ila;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) acídico: asp, glu;
(4) básico: asn, gin, his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservativas se vincularão trocando-se um membro destas classes por um de outra classe. As substituições conservativas envolvem a troca doso aminoácidos dentro da mesma classe.
II. VETORES CODIFICANDO 3-KSR
A presente invenção ainda fornece vetores para expressar qualquer enzima na via bioquímica para a biossíntese do esterol de mamíferos, tal como a enzima 3-KSR nas células auxotróficas quanto ao colesterol. Geralmente, qualquer vetor de clonagem procariótico pode ser usado para a construção do vetor. O vetor pode compreender uma origem de replicação bacteriana, que seja útil para a propagação do vetor em uma cepa hospedeira de E. coli, da qual o DNA do vetor seja isolado antes da transfecção das células de mamíferos. Exemplos de origens de replicação bacterianas incluem, porém sem limitar, Col El, pUC, pBR322, ou outras originadas de cepas de E. coli não patogênicas. O vetor pode ainda compreender um marcador de seleção para expansão em alto número de cópias do plasmídeo em E. coli. Marcadores de seleção exemplares incluem os genes que conferem resistência a antibióticos tais como a ampicilina, carbenicilina, tetraciclina, cloranfenicol, canamicina, gentamicina, sulfaetoazol, trimetoprim, e outros. Marcadores de seleção adicionais que podem ser usados nos vetores da presente invenção incluem os genes que conferem seleção com base no choque térmico, na destoxificação de metais, e outros processos metabólicos.
O vetor pode ainda compreender um promotor eucariótico para conduzir a expressão do gene de 3-KSR. Este pode ser um promotor mínimo, tal como o promotor dos genes da timidina quinase (TK) de mamíferos, ou um cassete de transcrição mais forte, tal como a origem de replicação do Vírus Símio 40 (SV40) e a região promotora anterior. Promotores muito fortes, tais como a região promotora Prematura Imediata Principal (MIE) do Citomegalovírus (CMV), com ou sem o íntron A e/ou as seqüências B, ou o Fator-I Alfa de Alongamento (EFa) humano, podem também ser usados para conduzir a expressão do gene de 3-KSR. Uma seqüência de terminação transcricional eucariótica, ou sítio de poliadenilação, pode também estar presente para interromper a transcrição e a poliadenilação de sinal do gene de 3-KSR. O sítio de poliadenilação pode teoricamente ser derivado de qualquer gene eucariótico, mas as seqüências de poliadenilação fortes comumente usadas incluem a poli-A tardia de SV40 e a poli-A do Hormônio de Crescimento Bovino (BGH).
Como apresentado na Figura 2, uma forma de realização de um vetor (neste caso denominado p3-KSR), pode compreender uma origem de replicação (ori) bacteriana derivada de pUC e um gene de beta-lactamase (bla) que confere resistência à ampicilina ou à carbenicilina nas cepas de E. coli sensíveis a estes antibióticos. O vetor pode também conter o promotor e intensificador Prematuros Imediatos Principais (MIE) do Citomegalovírus (CMV) para conduzir a expressão das seqüências recombinantes heterólogas clonadas na região poli-ligadora. A seqüência de poliadenilação do Vírus Símio 40 (SV40) (SV40 pA) pode ser localizada a jusante tanto das seqüências recombinantes heterólogas quanto do gene de 3-KSR, para eficientemente poliadenilar os mRNAs nascentes de cada gene. O promotor de SV40 e a origem de replicação (SV40 ori) podem ser localizados imediatamente a montante do gene de 3-KSR para conduzir a expressão deste marcador de seleção.
Em uma forma de realização específica, o gene de 3-KSR pode ser introduzido em um vetor por clonagem direta do cDNA de 3-KSR murino amplificado de uma biblioteca de cDNA de rins de camundongos. Os iniciadores engendrados para amplificar a 3-KSR de uma biblioteca de cDNA de rins de camundongo podem conter, por exemplo, as extremidades Pm1I, as quais são compatíveis com o sítio PmlI presente no vetor derivado de pUC, o p3-KSR, e cujo sítio está presente na região entre SV40 ori e SV40 poli-A. Assim, um cDNA de 3-KSR restrito com pM1I pode ser usado para clonar este gene no sítio pMlI da cadeia principal de p3-KSR. A orientação do gene no vetor pode ser determinada pela análise da endonuclease de restrição (REN) e seqüenciamento do DNA de terminação didesóxi.
Um polinucleotídeo ou gene ou um cassete codificando pelo menos um polipeptídeo heterólogo de interesse, é então introduzido no vetor compreendendo o gene de 3-KSR em uma região ou sítio de clonagem múltipla como mostrado, por exemplo, nas Figuras 3, 4 ou 5. Os polinucleotídeos ou cassetes introduzidos acham-se sob o controle, ou operavelmente ligados, a um promotor que possibilite a expressão em uma célula eucariótica ou preferivelmente uma célula hospedeira de mamífero.
III. TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS COM OS VETORES CODIFICANDO 3-KSR
A introdução dos vetores de polinucleotídeos codificando proteínas heterólogas de interesse (e 3-KSR como um marcador de seleção) nas células hospedeiras, pode ser realizada com o uso de práticas bem conhecidas na técnica, incluindo, porém sem limitar, a eletroporação, a lipofecção, a precipitação com fosfato de cálcio, a precipitação com polietileno glicol, sonicação, transfecção, transdução, transformação e infecção viral. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3- edição. 2001).
Qualquer célula eucariótica, preferivelmente de mamífero, cuja auxotrofia de colesterol seja atribuível à atividade enzimática, tal como a atividade da 3-KSR, pode ser usada para a transfecção. Linhagens celulares exemplares podem incluir, porém sem limitar, NS-O (ECACC n° 85110503), NS-I (ECACC n2 85011427) e CHO-215 [Plemenitas et al., 265(28) J. Biol Chem. 17012-17017(1990)].
A presente invenção também inclui células eucarióticas e, especificamente, células de mamíferos, que não são de início auxotróficas quanto ao colesterol, mas são tornadas assim mediante o uso de radiação, agentes mutagênicos ou técnicas de recombinação de silenciamento de genes para inativar os genes endógenos que codificam para as atividades da 3-KSR, incluindo, porém sem limitar, a desidrogenase tipo 7 17P-hidroesteróide (HsdUbT) e a desidrogenase 3P-hidróxi-delta(5)-esteróide (Hsd3b5). Em ainda outra forma de realização, o gene de silenciamento alvejado pode incluir, sem limitar, 3β-Ηδά III de ratos, 3fi-Hsd IV de camundongos, 3Ç>-Hsd V de camundongos e 3β-Hsd III de hamster, que são conhecidos para funcionarem exclusivamente como 3-cetosteróides redutases.
NS-0, NS-1, CHO-215, e outras linhagens celulares auxotróficas quanto ao colesterol que sejam transfectadas com um vetor de expressão que contenha o marcador de seleção de 3-KSR (e um polinucleotídeo codificando uma proteína heteróloga de interesse), devem ser cultivadas em meio desprovido de colesterol. Em certas outras formas de realização, as células hospedeiras podem ser cultivadas em qualquer meio livre de soro e livre de colesterol que contenha a seguintes lista não exaustiva de precursores do esterol: 4-metil-5αa-colesta-3,8,24-trien-3β-ol, 3-oxo-4α- metil-5α-colesta-8,24-dieno, 5α-colesta-3,8,24-trien-3β-ol e/ou 3-oxo-5α- colesta-8,24-dieno. Estes precursores atuam a montante de 3-KSR na via bioquímica do colesterol.
Para tratar dos assuntos reguladores, as células hospedeiras (antes ou após a transfecção) podem ser cultivadas em qualquer meio adequado, incluindo, porém sem limitar, os meios livres de soro, os meios livres de proteína, os meios quimicamente definidos, ou qualquer combinação destes, incluindo os meios quimicamente definidos/livres de soro. Este aspecto particular da presente invenção trata das questões de que as proteínas derivadas de animais e/ou as proteínas de origem desconhecida podem tornar os produtos protéicos recombinantes inadequados para uso terapêutico ou diagnóstico humano. Uma modalidade específica de um meio de crescimento adequado é o Meio de Hibridoma CD (Invitrogen® Corp., Carlsbad, CA), um meio livre de soro quimicamente definido que não contém nenhuma proteína de origem animal, de plantas ou sintética e tenha sido confirmado ser livre de lisados ou hidrolisados indefinidos
As células hospedeiras da presente invenção podem ser fornecidas como já adaptadas a um meio de crescimento apropriado, tal como o CD-SFM. Freqüentemente, as células são adaptadas a tais meios antes da transfecção. Nesse caso, as células podem ser adaptadas a HyQ® CDM4NS-0 (Hyclone®, Logan, UT), que é outro meio livre de soro quimicamente definido, que é desprovido de componentes de origem animal. Este último meio comercialmente disponível inclui suficientes quantidades de colesterol para suportar o crescimento das linhagens celulares auxotróficas ao colesterol. Após a transfecção, as células são cultivadas em um meio de seleção adequado sem colesterol. Alternativamente, os transfectantes são cultivados em meio livre de colesterol com o uso de meios clássicos suplementados com soro, que tenham sido extensivamente deslipidados com o uso de técnicas conhecidas e observadas não suportarem o cultivo de células precursoras.
Em seguida à transfecção, as células são tipicamente semeadas em baixas densidades para seleção quanto aos transformantes estáveis. A este respeito, qualquer meio de seleção apropriado pode ser usado. Em uma forma de realização, o meio de seleção pode compreender o Hibridoma CD suplementado com 2 mM de L-Glutamina ou Glutamax e IX de NEAA (aminoácidos não essenciais) (Invitrogen® Corp., Carlsbad, CA).
Em certas formas de realização, um coquetel de suplementos de crescimento pode ser adicionado ao meio de seleção para otimizar as condições de crescimento após a transfecção. Os suplementos de crescimento podem ser adicionados após a transfecção a qualquer linhagem celular apropriada, incluindo, porém sem limitar, as células NS-0, NS-1, CHO-215. Em uma forma de realização específica, o coquetel dos suplementos de crescimento podem ser usados para otimizar as condições de cultivo após a transfecção quanto as células NS-0. Em uma forma de realização, os suplementos de crescimento podem compreender, porém sem limitar, a albumina sérica, a interleucina-6, a insulina, o selenito de sódio, o piruvato de sódio, e a etanolamina.
Qualquer versão apropriada comercialmente disponível da albumina sérica pode ser usada, incluindo, porém sem limitar, a albumina de soro bovino (Β SA), a fração ν da albumina de soro bovino, e a albumina de soro humano completa. Em certas formas de realização, a albumina sérica pode ser livre de ácido graxo, ao invés de não modificada, de modo a remover possíveis complexos de albumina sérica de colesterol que possa fornecer lipídeo às células em cultivo. O BSA livre de ácidos graxos acha-se disponível de numerosas companhias, incluindo, por exemplo, a Research Organics, Inc., Cleveland, OH. A concentração final deste componente pode incluir, porém sem limitar, uma faixa de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % no meio de seleção, mas especificamente cerca de 0,2 %, cerca de 0,5 %, cerca de 1,0 %, cerca de 1,5 %, cerca de 2,0 % ou mais, até cerca de 5,0 %. Em uma forma de realização específica, a concentração final da albumina sérica pode ser de cerca de 1 % no meio de seleção.
Outro suplemento de crescimento que pode ser usado para otimizar as condições do cultivo inclui a interleucina-6. Em uma forma de realização, a IL-6 humana recombinante pode ser usada (Promega Corp., Madison, WI). A concentração final da IL-6 pode incluir, porém sem limitar, uma faixa de cerca de 1 ng/ml a cerca de 9 ng/ml no meio de seleção, mais especificamente cerca de 2 ng/ml, cerca de 3 ng/ml, cerca de 4 ng/ml, cerca de 5 ng/ml, cerca de 6 ng/ml ou mais, até cerca de 9 ng/ml. Em uma forma de realização específica, a concentração final da IL-6 pode ser de cerca de 5 ng/ml no meio de seleção. As concentrações da IL-6, tais como a rhIL-6, podem ser ajustadas de batelada para batelada, conforme necessário, até alcançar a EC50 relatada pelo fabricante para a citocina.
O coquetel de suplementos de crescimento pode ainda incluir insulina, especificamente insulina humana recombinante (RayBiotech, Inc., Norcross, GA). A concentração final deste componente pode incluir, porém sem limitar, uma faixa de 5 mg/litro a cerca de 15 mg/litro no meio de seleção, mais especificamente cerca de 6 mg/litro, cerca de 7 mg/litro, cerca de 8 mg/litro, cerca de 9 mg/litro, cerca de 10 mg/litro, cerca de 11 mg/litro ou mais, até cerca de 15 mg/litro. Em uma forma de realização específica, a concentração final da insulina pode ser de cerca de 10 mg/litro no meio de seleção.
O selenito de sódio pode também ser usado para otimizar as condições de cultivo (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). A concentração final deste suplemento pode incluir, porém sem limitar, uma faixa de cerca de 5,0 μg/litro a cerca de 8,0 μg/litro no meio de seleção, mais especificamente cerca de 5,5 μg/litro, cerca de 6,0 μg/litro, cerca de 6,5 μg/litro, cerca de 7,0 μg/litro, ou mais, até cerca de 8,0 μg/litro,. Em uma forma de realização específica, a concentração final do selenito de sódio pode ser de cerca de 6,7 μg/litro no meio de seleção.
Em outras formas de realização, o piruvato de sódio pode ser usado como um suplemento de crescimento (SAFC Biosciences, Inc., Lenexa, ΚΑ). A concentração final do piruvato de sódio pode incluir, porém sem limitar, uma faixa de cerca de 0,01 g/litro a cerca de 0,3 g/litro no meio de seleção, mais especificamente cerca de 0,05 g/1, cerca de 0,1 g/litro, cerca de 0,15 g/litro ou mais, até cerca de 0,3 g/litro. Em uma forma de realização específica, a concentração final do piruvato de sódio pode ser de cerca de 0,11 g/litro no meio de seleção.
O coquetel dos suplementos de crescimentos pode ainda incluir a etanolamina (Sigma-Aldrich® Co., St. Louis, MO). A concentração final deste suplemento pode incluir, sem limitar, uma faixa de cerca de 0,5 mg/litro a cerca de 3,5 mg/litro, mais especificamente cerca de 1,0 mg/litro, cerca de 1,5 mg/litro, cerca de 2,0 mg/litro, cerca de 2.5 mg/litro, ou mais, até cerca de 3,5 mg/litro. Em uma forma de realização específica, a concentração final da etanolamina pode ser de cerca de 2,0 mg/litro no meio de seleção.
Em uma forma de realização específica, o coquetel dos suplementos de crescimento podem compreender BSA livre de ácido graxo (0,1 % a 5 %), rhIL-6 (1 ng/ml a 9 ng/ml), insulina humana recombinante (5 mg/litro a 15 mg/litro), selenito de sódio (5 μ^ΐίΐτο a 8 μg/litro), piruvato de sódio (0,01 g/litro a 0,3 g/litro), e etanolamina (0,5 mg/litro a 3,5 mg/litro) (concentrações finais no meio de seleção). Em outra forma de realização específica, o coquetel dos suplementos de crescimento pode compreender BSA livre de ácido graxo (1 % a 5 %), rhIL-6 (0,5 μg/ml), insulina humana recombinante (10 mg/litro), selenito de sódio (6,7 μg/litro), piruvato de sódio (0,11 g/litro), e etanolamina (2 mg/litro) (concentrações finais no meio de seleção). Em ainda outra forma de realização, o coquetel dos suplementos de crescimento pode compreender BSA livre de ácido graxo (1 %), rhIL-6 (0,5 ng/ml), insulina humana recombinante (10 mg/litro), selenito de sódio (6,7 μg/litro), piruvato de sódio (0,11 g/litro), e etanolamina (2 mg/litro) (concentrações finais no meio de seleção).
Em outra forma de realização, os suplementos de crescimento podem compreender BSA livre de ácido graxo, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito de sódio, piruvato de sódio, etanolamina, e nenhum outro suplemento de crescimento. Em uma outra forma de realização, os suplementos de crescimento podem compreender BSA livre de ácido graxo, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito de sódio, piruvato de sódio, etanolamina, e nenhuma outra substância tipicamente envolvida ou usada no crescimento das células cultivadas. Em uma forma de realização alternativa, os suplementos de crescimento podem compreender BSA livre de ácido graxo, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito de sódio, piruvato de sódio, etanolamina, e nenhuma outra substância tipicamente encontrada no soro. Em ainda outra forma de realização, os suplementos de crescimento podem compreender BSA livre de ácido graxo, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito de sódio, piruvato de sódio, etanolamina, qualquer substância tipicamente usada para reconstituir qualquer dos suplementos de crescimento citados, incluindo água, e nenhuma outra substância, qualquer que seja. IV. KITS PARA PRODUZIR PROTEÍNAS HETERÓLOGAS
A presente invenção ainda fornece kits para venda comercial. Em certas formas de realização, o kit pode compreender um vetor, uma pluralidade de células, e suplementos de crescimento. O vetor pode compreender uma seqüência codificando uma enzima na via bioquímica para a biossíntese do esterol de mamífero, tal como, por exemplo, a 3-KSR, útil para a seleção das células transfectadas com o vetor. Os usuários do kit podem clonar um gene alvo no vetor usando enzima(s) de restrição apropriada(s). Em certas formas de realização, as células são auxotróficas quanto ao colesterol. Em uma forma de realização, as células fornecidas no kit podem já ser adaptadas para cultivo em meios quimicamente definidos. Em outra forma de realização, as células fornecidas no kit podem já estar adaptadas ao cultivo em meios quimicamente definidos, livres de soro. Em atenção às exigências reguladoras, as células podem ser derivadas de um banco de células de trabalho que deve ser determinado como sendo livre de agentes estranhos.
Em outra forma de realização, o kit pode compreender suplementos de crescimento, como descrito neste relatório, que suportem o crescimento das células, incluindo, porém sem limitar, as células NS-O, NS-I e CHO-215. Em certas formas de realização, o kit pode compreender suplementos de crescimento que suportem o crescimento de células em meios livres de soro, meios livres de proteína, meios quimicamente definidos ou qualquer combinação destes, incluindo os meios quimicamente definidos/livres de soro. Em uma forma de realização específica, o kit pode compreender suplementos de crescimento, como aqui descrito, que suportem o crescimento de células CD-SFM NS-O em baixas densidades de semeadura, por exemplo durante a pós-transfecção e a fase de clonagem celular de diluição limitativa (LDCC).
Além disso, os kits da presente invenção podem ser usados para expressar qualquer proteína heteróloga de interesse. De fato, a natureza e a fonte da proteína heteróloga expressa nas células, nas linhagens celulares, e nas culturas celulares da presente invenção, não são limitadas. Por exemplo, a p3-KSR plasmídica pode ser engendrada quanto à expressão de um único gene, ou pelo menos dois. No primeiro caso é aplicável para expressão de proteínas isoladas, tais como um hormônio de cadeia única, e no último caso destina-se à expressão de uma molécula de cadeia dupla, tal como um anticorpo.
Em uma forma de realização específica da presente invenção, uma molécula de anticorpo recombinante pode ser expressa com o uso do vetor contendo os genes necessários. Ver, por exemplo, a Figura 3. Os anticorpos são proteínas complexas compostas de componentes múltiplos, especificamente duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Em uma forma de realização, o vetor p3-KSR pode ser engendrado para incluir genes completos de cadeias pesadas e leves para a Imunoglobulina G (IgG) humana clonada em tandem. A expressão protéica desta construção recombinante resulta na secreção de um anticorpo monoclonal que pode subseqüentemente ser isolado da cultura celular e purificado para uso comercial. Os anticorpos monoclonais humanos são bem adequados para serem aplicados como terapêutica humana, porque eles são específicos a um antígeno único e podem ser usados para patógenos, órgãos ou tumores específicos alvos.
Sem elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa habilitada na técnica, com o uso da descrição precedente, possa utilizar a presente invenção em uma amplitude mais integral. Os seguintes exemplos são ilustrativos apenas, e não limitativos do restante do relatório descritivo, sob qualquer hipótese.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: DEMONSTRAÇÃO DA SELEÇÃO DE COLESTEROL DA LINHAGEM CELULAR DE MIELOMA MURINO NS-O EM MEIO LIVRE DE SORO QUIMICAMENTE DEFINIDO
A linhagem celular de mieloma murino NS-O foi adaptada a duas formulações de meio livre de soro quimicamente definido (CD-SFM) independentes para testar a adequabilidade da 3-KSR como um marcador de seleção neste ambiente celular, e nas condições do SFM a partir do começo. As células NS-O foram adaptadas ao Hibridoma CD (Invitrogen®) e CDM-4- NS-O (HyClone®). Bancos de células de acesso (ACB) foram gerados para cada uma das linhagens de células NS-O adaptadas a CD-SFM. Um ensaio foi estabelecido para determinar a dependência das linhagens de células CD- SFM-NS-O sobre a suplementação do colesterol no meio de cultivo. Estes ensaios mostraram que 72 horas após o cultivo das células CD-SFM-NS-O em meio sem colesterol, menos que 10 % das células permanecem vivas. Em tão poucos quanto 5 dias em seguida ao cultivo em CD-SFM, nenhuma célula viva pode ser detectada pela análise de exclusão de Azul Tripan. Além disso, uma fase de cultivo intermitente destas células na ausência de colesterol não foi observada, revelando a sensibilidade à falta deste lipídeo no meio de cultura.
EXEMPLO 2: AMPLIFICAÇÃO DE PCR DE UMA 3-CETOSTERÓIDE REDUTASE (3-KSR) DE MURINOS E CLONAGEM DE UMA 3-KSR EM UM VETOR DE EXPRESSÃO
Um gene da 3-cetosteróide redutase (3-KSR) de murinos codificando para a 3P-hidróxi-delta(5)-esteróide desidrogenase (Hsd3b5) de Mus musculus foi amplificado dos cDNAs gerados dos rins de BALB/c machos adultos. Após a amplificação da PCR usando oligonucleotídeos específicos para a seqüência publicada do Hsd3b5 de 3-KSR de murinos, uma faixa distinta de cerca de 1,1 kb foi detectada por eletroforese em gel de agarose. Esta faixa foi isolada e clonada no vetor pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen®), e subseqüentemente reclonado no ambiente de pBYdhfrA, no lugar de dhfr. A nova construção é denominada de pBksr. 1. A região codificadora de 1,1 kb de3-ksr em pBF&sr.l foi confirmada por seqüenciamento de DNA5 e sua matriz de leitura aberta (orf) foi comparada com a seqüência publicada. A seqüência determinada combinou 100 % com a 3-cetosteróide redutase de murinos publicada, com o número de acesso A49573 da NCBI.
EXEMPLO 3: TRANSFECÇÃO E SELEÇÃO DAS CÉLULAS NS-O EM MEIO DE SELEÇÃO SUPLEMENTADO LIVRE DE ÁCIDO GRAXO QUIMICAMENTE DEFINIDO
Uma construção pBFfcsr. 1 contendo uma orf de 2-KSR correta é transfectada nas células NS-O e selecionada em meio de seleção suplementado livre de ácido graxo quimicamente definido. O meio consiste no seguinte: Hibridoma CD (Invitrogen®), Glutamax (2mM, Invitrogen®), NEAA (aminoácidos não essenciais) (lx, Invitrogen®), BSA livre de ácido graxo (1 %, Calbiochem), IL-6 recombinante humana (5 ng/ml, Promega), Suplemento de Meios Líquidos ITS (1x, Sigma-Aldrich). A transfecção e a seleção iniciais são realizadas "em massa" em frascos T-75, como segue. No dia da transfecção, a cultura precursora de NSO é contada com o uso do método de exclusão de azul de Tripan para diferenciar entre as células vivas e as mortas. A cultura deve ser pelo menos 90 % viável. Para cada transfecção, cerca de 1 x107 células são necessárias. Além das transfecções de plasmídeos, uma transfecção "simulada" (sem DNA) deve ser realizada para estabelecer um controle negativo. As células são centrifugadas e lavadas pela re- suspensão da pelota celular em 20 ml de meio de transfecção livre de soro e centrifugando-se uma vez mais. Para cada transfecção, 1 χ 10 células são colocadas em suspensão em 700 μl de meio de transfecção livre de soro. A solução de DNA é preparada pela re-suspensão de 40 μg do DNA plasmídeo linearizado purificado em 100 μl de água estéril destilada. A linearização do DNA é obtida com qualquer endonuclease de restrição do DNA, comumente, porém não restrito, a PvwI (endonuclease I de restrição de Proteus vulgaris), a qual restringe pBFksr.1 uma vez, na matriz de leitura aberta (orf) de beta- lactamase. Esta solução de DNA inteira é adicionada a uma cubeta de eletroporação. Os 700 μl de suspensão celular são adicionados à solução de DNA na cubeta e misturados suavemente mediante pipetagem, evitando-se a criação de bolhas. A tampa é colocada sobre a cubeta e a cubeta é colocada no aparelho de eletroporação [Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) ou equivalente]. Um único pulso de 250 volts, 400 μFd, é liberado à cubeta (intensidade do campo de 625 V/cm). As condições ótimas devem dar um valor constante de tempo não superior a 8 milissegundos. As células são adicionadas a 12 ml de meio de seleção suplementado livre de ácido graxo quimicamente definido em um frasco de cultura celular T-75 e deixadas incubarem-se a 37°C, 5 % de CO2, 90 % de umidade relativa durante a noite.
A cultura transfectada com pBFfar. 1 e selecionada em meio de seleção suplementado livre de ácido graxo quimicamente definido produz números estatisticamente significativos de células vivas após uma seleção de 3 semanas relativa aos controles. As células simuladas NS-O transfectadas cultivadas nas mesmas condições seletivas não produzem números estatisticamente significativos de células vivas após uma seleção de 3 semanas.
EXEMPLO 4: TRANSFECÇÃO, SELEÇÃO E EXPRESSÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL EM CÉLULAS NS-O EM MEIO DE SELEÇÃO SUPLEMENTADO LIVRE DE ÁCIDO GRAXO QUIMICAMENTE DEFINIDO.
O vetor de expressão pBF dhfr. 1 de mamífero foi construído e serve como a cadeia principal para a clonagem de genes de mamíferos, incluindo as seqüências codificadores de cadeia pesada e leve de anticorpos humanos, para expressão na linhagem celular CHO-DG44 precursora mutante da diidrofolato redutase (dhfr). Com o uso deste vetor, um cassete de expressão de região constante de cadeia pesada de IgGl humano foi clonado no sítio de clonagem múltipla (mcs), e serve como aceptor para as seqüências variáveis de cadeia pesada humana. Este vetor foi designado pBF dhfr. 1 :Hcassete.
As seqüências variáveis de cadeia leve correspondentes foram primeiro clonadas em um vetor de expressão de baculovírus contendo um cassete de região constante de cadeia leve humano, pIEI-leve. A seqüência codificadora de cadeia leve inteira foi subseqüentemente clonada em pBF dhfr. 1. Para construir um vetor de expressão dual, iniciadores específicos à extremidade 5' de pCMV-MIE e à BGH-pA no filamento complementar, foram usados para amplificar um cassete de cadeia leve contendo pCMV- MIE-cadeia Ieve-BGHpA, que continham sítios BglII REN em ambas as extremidades. Este fragmento foi subseqüentemente clonado no sítio BglII único em cada construção correspondente de pdhfr:Heavy_Chain. A construção resultante, pBF<i/z/r. 1 :humAb contém genes de cadeia leve e pesada de anticorpos humanos completos clonados em tandem.
O gene de 3-cetosteróide redutases (3-KSR) de murinos é isolado e clonado no vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen®), e subseqüentemente reclonado na construção de pBF dhfr. 1 :humAb, no lugar de dhfr. Esta nova construção, yBYdhfrA :HUMAB, contendo uma orf de 3-KSR correta, é transfectada nas células NS-O e selecionada em meio de seleção suplementado livre de ácido graxo quimicamente definido. A transfecção e seleção iniciais são realizadas "em massa" em frascos T-75. Em seguida à transfecção, as células são cultivadas diretamente no meio de seleção. A cultura transfectada com pBF&sr. 1 :HUMAB e imediatamente selecionada em meio livre de colesterol produz números estatisticamente significativos ode células vivas após seleção de 3 semanas em relação aos controles. As células simuladas NS-O transfectadas nas mesmas condições seletivas não produzem números estatisticamente significativos de células vivas após uma seleção de 3 semanas. Após a seleção e o crescimento das células transfectadas, os sobrenadantes livres de células são ensaiados quanto a mAb recombinante pelo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Resumidamente, os sobrenadantes das culturas transfectadas com pBFfor. 1 :HUMAB são amostrados e centrifugados para remover quaisquer células e detritos. Placas de noventa e seis reservatórios são revestidas com uma solução de anticorpo específico lambda Fab anti-humano de cabra (Sigma-Aldrich® Co., St. Louis, MO) formulada pela adição de 9 μl a 6,3 ml de solução salina tamponada de fosfato (PBS). As placas são incubadas por pelo menos 24 horas e não mais do que 2 semanas a 4 °C. No dia do ensaio, as placas são lavadas por 3 vezes com tampão de PBS/tween (0,1 % de tween em PBS). Um padrão de anticorpo monoclonal lambda de IgGl humano (Sigma®) é diluído a 5 μg/ml em PBS/tween e diluído em série em PBS/tween em uma relação de 1:2 para gerar um painel de concentração padrão. Cada padrão é adicionado à placa de 96 reservatórios em 100 μl por reservatório. As amostras de concentração de anticorpo desconhecido são diluídas a 1:2000 em PBS/tween e adicionadas à placa de 96 reservatórios a 100 μl por reservatório. A placa é incubada por 1 hora na temperatura ambiente. Após a incubação, a placa é lavada por 3 vezes com PBS/tween. Um anticorpo ode IgG Fc anti-humano de cabra rotulado de peroxidase (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) é diluído a 1:2000 em PBS/tween e adicionado à placa de 96 reservatórios a 100 μΐ por reservatório. A placa é incubada por 1 hora na temperatura ambiente. Após a incubação, a placa é lavada por 3 vezes com PBS/tween. Um substrato de 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma®) é adicionado à placa de 96 reservatórios em 100 μl por reservatório. A reação é interrompida após aproximadamente 1 minuto, com a adição de 100 μΐ de H2SO4 0,5 M (Acros Organics, Geel, Bélgica). A placa é lida em um comprimento de onda de 450 nm em uma leitora de microplacas ThermoMax ou equivalente. Os resultados do ELISA mostram-se positivos quanto à presença do produto de mAb recombinante. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS
<110> BioFactura, Inc.
<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA SELEÇÃO METABÓLICA DE CÉLULAS TRANSFECTADAS
<130> BIOF-OOl/OOWO
<150> US 60/681.969
<151> 18/05/2005
<160> 4
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 1122
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 1
atgcctggat ggagctgcct ggtçacagga gcaggagggt ttcttggccs gãggattgte 60 egaatgttgg tgcaggagga agagttgcag gagatcagãg eeetgttcag gaçettcggfc 120 cgaáascâtg asgsggaatt gtogaagçtg cagacaaagg ccaaggtgag agtactgaag 180 ggagacattc tgg&tgccca atgcctgaag agagcctgcs agggcatgtc tgctgtcatc 240 cacaccgctg ctgctattga cccccgtggt gecgcttcca gacagaccat cctagatgtC 300 aatctgaaag gtactcagct cctactggat gcttgtgtgg aegccagfcgt gccascattc 360 atctacagca gctcagtgct tgtggctgga ccaaatfccct acaaggagat catcctgaat 420 geccatgagg asgagcatca tgaaagcaca tggcctaacc catacccata cagcaa&açg 480 atggetgaga aggcagtgct ggcaacaaat gggagaetcc tgaaaaatgg tggcaçtttg 540 catacttgfeg cctteagâct ccctttcatc tatggggaag aatgccaagt cacttcaacc 600 áctgtgaasa Gagesctgaa gaacaacagc ataattaaga aaaatgccac attctccatc 660 gcsaacccag tgtafegtggg caatgcagcc tgggctcaca ttetggctgc caggagecta 720 caggacccca agaagtccce ââgcatccaa ggacagttct attacatctc tgataacacc 780 ecfccaceaas getafcgatga tttaaattac accctgâgca aggagtgggg cctctçcctt 840 gattctggct ggaggcttcc tctgtccctg ctttactggc ttgccttcct gctggaaset 300 gtgagcttcc tgctacgtcc agtttacaac tatsggccaç cctttacccg ectcttgatc 360 acsgtgctaa atagcgtgtt tsccafcttcc tatsagsaag ctcagcgcga tctaggctat 1020 cãCfccactfcg tcagctggga ggaagccaéu cââaaâacct eagagtggat tgeaacacta 1080 gtgaagcagc acagggagac actacacaaa aagtcacagt ga 1122
<210> 2 <211> 1005 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 2 atgcggaagg tggttfctgât caceggggcg ageagtggca tfcgggctagc cctttgcggt 60 cgaetgctçg cagaagaega tgacctccac ctgtgtttgg cgtgtaggaa cctgagcâaa 120 gcaagagctg ttcgagatac cctgctggcc tctcacccct ccgccgaagt cageatcgtg ieo cagatggatg tcagcagcct gcagteggfcg çtceggggtg cagaggaagt caagcaaaag 240 tttcaaagat tagactactt atatcfcgaat gctggaatcc tgectastcc acaattcaac 300 efecaaggcat ttttctgcgg çatcttttca âgaaatgtga ttcatatgtt caccacagçg 360 çaaggaattt tgacccãgaa tgactcggtc actgccgaçg ggttgçagga ggtgtttgaa 420 accâatctct ttggeeactt tattctgatt cgggaactçg aãccacttct ctgccatgcg 480 çacaacccçt ctcagctcat ctggacgtcc tctcgcaetg eaaagaaggc taacttcagc 540 ctggaggaca tccagcactc csâsggcccg gaaccçtaca gctcttccaa atatgctacc ©00 çaectectga atgtggcfctt gaacaggaat ttcaaccsga agggtctgta ttccagtgtg 660 atgtgcccag geçtcgtgat gâccaatatg acgtatggaa ttttgcctcc ctttátctgg 720 aegttgctce tscccataat gtggctcctt cgcttttttg taaatgcgct. cactctgaca 780 ccgtacaacg gãgcãgâggc cctggtgtgg ctcttccacc aaaaaccgga gtctctfcaat 840 ectctgaccâ aatacgcgag cgccacctcg ggatttggga ctaattacgt cacgggceaa 900 aagatgcaca tagàtçaaga cactgctgaa aaattctatg aggtettact ggagctggaa 960 aagcgtgtca ggaçcaeegt teagaaateg gatcacccga gctga 1005
<210> 3
<211> 373
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
Met Pro Sly Trp Ser Cys Leu Val Thr Giy Ala Gly Gly Phe Leu Giy 1 5 10 15
Gln. Arg Ile Val Arg Met Leu Val Gln Glu Glu Glu Leu Gln Glm Ile m 25 30
Arg Als Leu Phe Arg Thr Phe Gly Arg Lys His Gla Glu Glu Lea Ser 35 40 45
Lys Leu Gln Thr Lys Ale Lys Val Arg Val Ley Lys Gly Asp Ile Leu 50 55 60
Asp Ala GIn Cyg Leu Lys Arg Ala Cys Gln Gly Met Ser Ala Vgl II® 65 70 75 80
His £hr Ala Ala Als Ile Ass Pro Arg Gly Ala Ala Sar Acg Glo Thr 85 90 95
Ile Leo Asp Val Asn Leu Lys Gly Thr Gln Leu Lea Leu Rsp Alá Cys 100 105 110
Val Glu Ala Ser Val Pro Thr Fhe Ile lTyr Ser Ser Ser Val Leu Val 115 120 125
Ala Gly Pro Asn Ser Tyr Lys Glu Ile Ile Leu Asn Hla His Glu Glu 130 135 140
Glu His His Glu Ser Thr Trp Pro Asn Fro Tyr Pro Tyr Ser Lys Arg 145 150 155 160
Met Ala Glu Lys Ala. Val Len Ala Thr Asn Gly Arg Leu Len Lys Asn 165 170 175
Gly Gly Thr Leu His Thr Cys Ala Leu Arg Lea Pro Phe Ile Tyr Gly 180 185 190
Glu Glu Cys Gln Val Thr Ser Thr Thr Val Lys Thr Ala Leu Lys Asra 195 200 205
Asn Ser Xle Ile Lys .l»ys Asn Ala TJir Phe Ser lie Ala Asr. Pro VaJ 210 215 220
Tyr Val Gly Asn Ala Ala Trp Ala His Ile Leu Ala Ala. Axg Ser Leu 225 230 235 240
Qln Asp Pro Lys Lys Ser Fro Ssr Ile Gln Gly Gln Phe Tyr Tyr Ile 245 250 255
Ser Asp Asn Tbr Fro Kls Gln Ser Tyr Asp Asp Leu Asn Tyt Thr Leu 260 265 270
Ser Lys Glu Trp Gly Leu Cys Lsu Asp Ser Gly Trp Arg Leu Pro Leu 275 280 285
Ser Leu teu Tyr frp Leu Ala Phe Leu Leu Glu Thr Val Ser Phe Leu ZSO 235 300 Leu Arg Prq Val Tyr Asii Tyr Arg Prq I3Jro Pbe Thr Arg Leu Leu Ile 305 310 315 320
Thr VaI Iteu Asn Ser Val Phe Thr lie Ser Tyt Lys L-ys Ala Gln Arg 325 330 335
Asp Leu Giy Tyr Gla Pro Leu Val Ser Trp Glu Glti Ala Lys Gln LyS 340 345 350
Tfír Ser Glm Trp Ile Gly Ths leu Val Lys Gln Bis Arg Glu Thr Leu 355 360 355
His Lys Lys Ser Gin 370
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> Mus sp.
<4 00> 4
Met Arg Lvs Val Val Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Lêü 15 10 lã
Ala Leu Cya (51 y Arg Leu Leu Ala Glu Asp Asp Asp Leu His Leu Cys 20 25 30
Leu Ala Cys ftrg Asn Leu Ser Lys Ala Arg Ala Val Asg Asp Thr Leu 35 W 45
Leu Ala. Ser His Pro Ser Ala Glu Val Ser Ile Val Gln Hêt Asp Val 50 55 60
Ser Ser Lea Gln Ser Val Val Arg Gly Ala Glu Glu Val Lys Gln Lys 65 70 75 80
Phe Gln Arg Lea Asp tyr Leu Tyr Leu Asa Ala Gly Ile Leu Pro Asfi 85 90 95
Pro Gln Phe Asn Leu Â,ys Ala Fhe Fhe Cys Gly Ile Fhe Ser Arg Asn 100 105 110
Val Ile His Met Phe Thr Thr Ala Glu Gly Ile Leu Thr Glft Asfi Assj 115 120 125 Ser Vsl Ihr Ala Asp Gly Leu Gln GIu VaI Fhe Glu Thr Asn Lea Phe 130 135 140
Gly Eis Pfae Ile Leia 11« Arg Glu Leu Glu Pro Le« í»eu Cys Hia Ala 145 150 255 160
Asp Asn Pro Ser Glft Lett Ile Trp Ilir Ser Ser Arg Asn Ala Lys Lys 165 170 175
Ala Asn Phe Sex Leu Glu Asp Ile Glrt His Ses Lys Gly Pro Glu Pro 180 1B5 ISO
Tyr Sei Ser Sex Lys Tyr Ala Thx Asp Leu Lea ,Asn Val Ala Leu Asa ISS 200 205
Arg Asn Phe Asn Gln Lys Gly Leu Tyr Ser Ser Vai Díet Cys Fro Gly 210 215 220
Val Val Mst Thr Asn Met Trhr Tyr Oly Ile Leu Pró Pró Phe Ile Trp 225 230 235 240
Thr Leu Leu Leu Pro Ile Met Trp Leu Lea Arg Phe Phe Val Asn Ala 245 250 2S5
Lena Thr Val Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Glu Ala Leu Val Trp Leu Fhe
260 265 270
Bis Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asn Pro Leu Thr Lys Tyr Ala Ser Ala 275 2B0 285
Thr Ser Gly Phe Gly Thr Asn Tyr Val Thr Gly Gln Lys Mefc Asp Iie 290 295 300
Asp Glu Asp Thr Ala Glu Lys fhe fyr Glu Val Leu Leu Giu Leu Glo 305 310 315 320
Lys Arg Val Arg Thr Thr Val Gln Lys Ser Asp His Pro Sêx 325 330
Claims (53)
1. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificando uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo e um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo heterólogo.
2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida enzima compreende uma 3-cetosteróide redutase.
3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida 3-cetosteróide redutase compreende uma 3-cetosteróide redutase de murinos.
4. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codificando a referida enzima compreende a SEQ ID NO: 1.
5. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codificando a referida enzima compreende a SEQ ID NO: 2.
6. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica a seqüência de aminoácidos da referida enzima compreendendo a SEQ ID NO: 3.
7. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica a seqüência de aminoácidos da referida enzima compreendendo a SEQ ID NO: 4.
8. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vetor de expressão de DNA recombinante.
9. Vetor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão de DNA recombinante ainda compreende pelo menos uma primeira unidade de transcrição quanto a um gene do produto cuja unidade de transcrição esteja sob o controle do promotor de citomegalovírus humano.
10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor como definido na reivindicação 9.
11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é uma célula eucariótica.
12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é auxotrófica quanto ao colesterol.
13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo de NS-0, NS-I e CHO-215.
14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de ser uma célula de mieloma de camundongo NS-0.
15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: um vetor compreendendo contendo um polinucleotídeo que codifica uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo; e opcionalmente um ou mais dentre: uma pluralidade de células hospedeiras que são auxotróficas quanto ao colesterol; meios livres de soro, quimicamente definidos; suplementos de crescimento que suportam o crescimento da referida pluralidade de células hospedeiras em baixa semeadura e densidades clonais; e pelo menos um protocolo para utilizar o referido kit.
16. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida enzima compreende uma 3-cetosteróide redutase.
17. Kit de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida 3-cetosteróide redutase compreende uma 3-cetosteróide redutase de murinos.
18. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codificando a referida enzima compreende a SEQ ID NO: 1.
19. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codificando a referida enzima compreende a SEQ ID NO: 2.
20. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica a seqüência de aminoácidos da referida enzima compreendendo a SEQ ID NO: 3.
21. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo codifica a seqüência de aminoácidos da referida enzima compreendendo a SEQ ID NO: 4.
22. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a -21, caracterizado pelo fato de que o referido vetor é um vetor de expressão de DNA recombinante.
23. Kit de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão de DNA recombinante ainda compreende pelo menos uma primeira unidade de transcrição para um gene do produto, unidade de transcrição esta que se acha sob o controle do promotor de citomegalovírus humano.
24. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo de NS-O5NS-I eCHO-215.
25. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é uma célula de mieloma de camundongo NS-0.
26. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as referidas células hospedeiras são adaptadas ao meio livre de soro quimicamente definido.
27. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as referidas células hospedeiras são adaptadas ao meio quimicamente definido.
28. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos suplementos de crescimento compreendem pelo menos um dentre BSA livre de ácido graxo, rhIL-6, insulina humana recombinante, selenito de sódio, piruvato de sódio e etanolamina.
29. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos suplementos de crescimento compreendem concentrações finais no meio de seleção de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 1 ng/ml a cerca de 9 ng/ml de rhIL-6, cerca de 5 mg/ml a cerca de 15 mg/litro de insulina humana recombinante, cerca de 5 μg/litro a cerca de 8 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,01 g/litro a cerca de 0,3 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 0,5 mg/litro a cerca de 3,5 mg/litro de etanolamina.
30. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os referidos suplementos de crescimento compreendem concentrações finais no meio de seleção de cerca de 1 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 5 ng/ml de rhIL-6, cerca de 10 mg/ml de insulina humana recombinante, cerca de 6,7 μg/litro de selenito de sódio, cerca de -0,11 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 2,0 mg/litro de etanolamina.
31. Composição dos suplementos de cultura celular, caracterizada pelo fato de que compreende concentrações finais no meio de seleção de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 1 ng/ml a cerca de 9 ng/ml de rhIL-6, cerca de 5 mg/ml a cerca de 15 mg/litro de insulina humana recombinante, cerca de 5 μg/litro a cerca de 8 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,01 g/litro a cerca de 0,3 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 0,5 mg/litro a cerca de 3,5 mg/litro de etanolamina.
32. Composição dos suplementos de cultura celular, caracterizada pelo fato de que compreende concentrações finais no meio de seleção de cerca de 1 % de BSA livre de ácido graxo, cerca de 5 ng/ml de rhIL-6, cerca de 10 mg/ml de insulina humana recombinante, cerca de 6,7 μg/litro de selenito de sódio, cerca de 0,11 g/litro de piruvato de sódio, e cerca de 2,0 mg/litro de etanolamina.
33. Método para selecionar células que possam sobreviver em meio sem colesterol, caracterizado pelo fato de que compreende: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifique uma enzima na via biossintética do esterol de uma célula eucariótica, um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou uma variante biologicamente ativa do mesmo e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar células que tenham a capacidade de sobreviver em meio desprovido de colesterol.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as referidas células são selecionadas do grupo consistindo de NS-0, NS-I e CHO-215.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as referidas células são células de mieloma de camundongo NS-0.
36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido meio é quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
37. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a referida enzima compreende uma 3-cetosteróide redutase.
38. Método para se obter células que tenham a capacidade de sobreviver em um meio desprovido de colesterol e produzir uma proteína heteróloga, caracterizado pelo fato de que compreende: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol, com um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e selecionar as células que tenham a capacidade de sobreviver em meio desprovido de colesterol.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que as referidas células são auxotróficas quanto ao colesterol.
40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que as referidas células são selecionadas do grupo consistindo em NS-0, NS-I e CHO-215.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que as referidas células são células de mieloma de camundongo NS-0.
42. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o referido meio é quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
43. Método para produzir uma proteína heteróloga, caracterizado pelo fato de que compreende: transfectar células eucarióticas que sejam auxotróficas quanto ao colesterol, com um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e pelo menos um polinucleotídeo que codifique uma proteína heteróloga; e cultivar as células sob condições para produzir a proteína heteróloga.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as referidas células são auxotróflcas quanto ao colesterol.
45. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as referidas células são selecionadas do grupo consistindo em NS-0, NS-I eCHO-215.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as referidas células são células de mieloma de camundongo NS-0.
47. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o referido meio é quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
48. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que ainda compreende obter a proteína heteróloga da cultura celular.
49. Método para expressar uma proteína heteróloga, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula transfectada com um vetor compreendendo uma seqüência codificando a 3-cetosteróide redutase e pelo menos uma proteína heteróloga na ausência de colesterol, sob condições para produzir a proteína heteróloga.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as referidas células são auxotróficas quanto ao colesterol.
51. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as referidas células são selecionadas do grupo consistindo de NS-0, NS-I eCHO-215.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que as referidas células são células de mieloma de camundongo NS-0.
53. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o referido meio é quimicamente definido e livre de soro ou quimicamente definido.
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