KR101439950B1 - 백색 부후균 유래의 고온 안정성을 갖는 재조합 아라비난나제 효소의 고생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백색 부후균 유래의 고온 안정성을 갖는 재조합 아라비난나제 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환 효모에서 생산된 아라비난나제와 자일라나아제를 동시에 바이오매스에 처리하면 두 효소의 상승 작용에 의해 바이오매스 분해 효율이 증가하므로, 본 발명의 아라비난나제는 사료 첨가제, 종이 제조용 첨가제, 세제 첨가제 및 바이오 에너지 생산 위한 바이오매스 전처리용 첨가제 등에 첨가되는 보조효소로서 산업적 이용 가치가 클 것으로 기대된다.

Description

백색 부후균 유래의 고온 안정성을 갖는 재조합 아라비난나제 효소의 고생산 방법 {Method for high production of recombinant thermostable arabinanase from Phanerochaete chrysosporium}

본 발명은 백색 부후균 유래의 고온 안정성을 갖는 재조합 아라비난나제 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 (arabinanase) 단백질, 상기 단백질 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 아라비난나제 단백질을 생산하는 숙주세포, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 아라비난나제를 대량 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 아라비난나제 단백질, 상기 아라비난나제 단백질을 유효성분으로 포함하는 아라비난 (arabinan) 분해 증진용 조성물, 상기 아라비난나제 단백질을 아라비난에 처리하여 아라비노오스 (arabinose)를 생산하는 방법 및 상기 아라비난나제 단백질에 대한 항체에 관한 것이다.

5탄당인 아라비노오스는 아라비노자일란 (arabinoxylan), 아라비노갈락탄 (arabinogalactan) 및 아라비난 (arabinan)과 같은 헤미셀룰로오스 공급원에서 발견되며, 자일로오스 다음으로 가장 풍부한 헤미셀룰로오스 당으로 여겨진다. 아라비노오스는 양조장에서 소모되는 곡물 및 밀기울 각각의 전체 건조 바이오매스 중 8 및 9 퍼센트를 차지한다 (Scheller and Ulvskov, Annu Rev Plant Biol 61:263-289 (2010)). 완전한 분해에 의해 헤미셀룰로오스 물질로부터 아라비노오스 당을 방출시키기 위해서는, 상이한 히드롤라아제들이 필요하다. 엔도- 및 엑소- 유형을 포함하는 α-L-아라비난나제 (EC 3.2.1.99)는 주쇄 (main chain) 아라비난의 백본 (backbone)을 절단하여 아라비노오스 또는 짧은 아라비노-올리고당을 방출하며, α-L-아라비노퓨라노시다아제 (EC 3.2.1.55)는 측기 (side group) 비-환원성 α-L-아라비노퓨라노시드 잔기에 작용한다 (Shallom and Shoham, Curr Opin Microbiol 6 (3):219-228 (2003)). 탄수화물 활성 효소 데이터베이스에 등재된 분류에 따르면 (http://www.cazy.org/), 아라비난나제는 글리코시다아제 패밀리 43에 속한다. 아라비난나제의 3차원 결정 구조 분석은 효소의 2차 구조가 5개의 날개를 가진 β-프로펠러형 폴딩 (folding)으로 이루어져 있다는 것을 보여주었다. 아라비난나제의 다중-서열 정렬은 촉매 도메인 내에서 3개의 보존된 블록 (block)을 보여준다. 블록 I 및 II는 일반적인 염기 및 산인 Asp 잔기인 반면, 블록 III의 Glu는 활성 부위의 pK _a 모듈러이다. 기질-결합 잔기들은 또한 상기 패밀리에서 고도로 보존된다는 것이 발견되었다 (Alhassid et al ., Biochem J 422 (1):73-82 (2009)).

최근, 헤미셀룰로오스계 당의 이용은 리그노셀룰로오스계 재료의 연료 에탄올 및 다른 부가가치적 발효 제품으로의 효율적인 변환을 위해 필수적이다. 따라서, 자일라나아제 및 아라비난나제를 포함하는 헤미셀룰로오스-분해 효소들은 다양한 전처리된 농업 및 임업 잔여물들을 발효가능한 당으로 당화시키는데 있어서 매우 좋은 전망을 갖는다. 예를 들어, 전체 아라비노오스의 약 90%가 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum)의 아라비난 가수분해 (arabinanolytic) 효소에 의해 사탕무 펄프로부터 방출된다. 그리고 상기 당은 일부 미생물에 의해 에탄올 또는 2,3-부탄디올과 같은 유기 화합물 생산에 이용될 수 있다. 게다가, 아라비난 가수분해 효소들은 또한 와인 풍미 개선, 펄프 처리, 쥬스 정화 (clarification), 중요한 의약품의 생산과 같은 여러 가지 다른 생물공학적 적용성을 갖는다 (Sakamoto et al ., Appl Microbiol Biotechnol 93 (3):1087-1096 (2012)).

백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)은 복합 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 분해 효소들을 분비하여 식물 세포벽을 완전하게 분해하는 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 리그니나아제 및 셀룰라아제에 대해서는 수많은 연구들이 보고되어 있지만, 자일라나아제를 제외한 상기 균의 헤미셀룰라아제 시스템에 대해서 알려진 것은 제한적이다. 결과적으로, 아라비난나제의 특성 및 기능은 아직 규명되지 않았다. 백색 부후균 게놈 서열은 적어도 엔도-아라비나아제로 추정되는 서열을 나타낸다. 게다가, 추정 엔도-아라비난나제에 해당하는 단백질은 백색 부후균을 리그노셀룰로오스계 바이오매스를 사용하여 또는 자일란-보충 배지에서 배양할 경우 세포외 단백질 매트릭스에서 발견된다 (Adav et al ., J Proteomics 75 (5):1493-1504 (2012)). 본 연구의 목적은 백색 부후균 유래의 추정 엔도-아라비난나제 (PcARA)를 클로닝하고, 발현시키고, 특성을 규명하는 것이며, 바이오매스 분해시 재조합 자일라나아제와의 상승 작용 또한 조사되었다.

한편, 한국등록특허 제1183114호에는 '백색 부후균 유래 베타-글루코시다아제 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0128498호에는 '신규한 알파-엘-아라비노퓨라노시데이즈 및 그 효소를 이용한 반섬유소 아라비난으로부터 아라비노스의 제조 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 백색 부후균 유래의 고온 안정성을 갖는 재조합 아라비난나제 효소의 고생산 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) BKM-F-1767의 cDNA 유전자 라이브러리로부터 아라비난나제 (arabinanase) 추정 유전자를 분리하여 아라비난나제 유전자를 포함하는 효모 형질전환용 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 효모에서 발현된 재조합 단백질이 60℃ 이상의 고온에서 안정적으로 아라비난나제 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 아라비난나제를 생산하는 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 아라비난나제를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 아라비난나제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질을 유효성분으로 포함하는 아라비난 또는 아라비노자일란 분해 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 아라비난에 처리하여 아라비노오스 (arabinose)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 백색 부후균 유래의 아라비난나제 유전자가 형질전환된 효모에서 생산된 아라비난나제와 자일라나아제를 동시에 바이오매스에 처리하면, 두 효소의 상승 작용에 의해 바이오매스 분해 효율이 증가된다. 따라서 본 발명의 아라비난나제는 사료 첨가제, 종이 제조용 첨가제, 세제 첨가제 및 바이오 에너지 생산 위한 바이오매스 전처리용 첨가제 등의 산업적 효소로서 이용 가치가 클 것으로 기대된다.

도 1은 ClustalW2를 이용한 백색 부후균 (P. chrysosporium) 엔도-아라비난나제 (PcARA) 및 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum)(BAD89094), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)(AAA32682), 아스퍼질러스 아쿨레아투스 (A. aculeatus)(AAG27441) 및 셀비브리오 자포니쿠스 (Cellvibrio japonicus) (CAA71485) 유래의 다른 ARA의 추론된 아미노산 정렬을 나타낸다. 일치 아미노산은 검은색 문자로 기재했다. 아라비난나제의 보존된 촉매 잔기 Asp33, Asp151 및 Glu203 보존성 촉매 잔기는 역삼각형으로 나타냈다. GH43 아라비난나제에서 기질 인식에 필수적인 보존성 잔기는 원으로 표시했다. N-글리코실화 부위 (Asn-Xaa-Ser/Thr)는 박스로 표시했다.
도 2는 정제된 재조합 아라비난나제 (rPcARA)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 레인 M: 분자량 마커, 레인 1: 정제된 rPcARA. rPcARA의 분자량은 33 kDa인 것으로 추정된다.
도 3은 재조합 아라비난나제 (rPcARA) 활성에 대한 온도 (A) 및 pH (B)의 영향을 나타낸다.
도 4는 재조합 아라비난나제 (rPcARA) 활성에 대한 금속 이온의 영향을 나타낸다. 효소 활성은 5 mM의 각 이온의 존재 하에 분석되었다.
도 5는 재조합 아라비난나제 (rPcARA)에 의한 반응 산물의 박층 크로마토그래피 (TLC) 분석을 나타낸다. 반응은 60℃에서 10분 동안 수행한 후, 100℃에서 5분 동안 배양했다. 레인 1: 아라비노오스, 레인 2: 아라비노비오스, 레인 3: 아라비노트리오스, 레인 4: 아라비노펜타오스, 레인 5: 아라비노헥사오스, 레인 6: 탈분지화된 아라비난, 레인 7: rPcARA에 의한 탈분지화된 아라비난 가수분해 산물, 레인 8: 아라비노올리고머 혼합물.
도 6은 (A) 상용 아라비노자일란 및 (B) NaOH-전처리 보릿짚에 대해 rPcARA 및 rPcXynC의 조합을 이용한 가수분해에 따른 가용성 당 생산을 나타낸다. 대조구: 효소 반응이 없는 바이오매스, 1: rPcARA와 반응시킨 바이오매스, 2: rPcXynC와 반응시킨 바이오매스, 3: rPcARA 및 rPcXynC 혼합물과 반응시킨 바이오매스. 아라비노자일란의 가수분해 반응은 0.3 및 0.5 유닛 (unit)의 rPcARA 및 rPcXyn을 각각 이용하여 1 mg의 물질을 포함하는 pH 5의 50 mM 소듐 아세테이트 400 ㎕에서 60℃로 10분 동안 수행되었다. 100 mg의 NaOH-전처리 보릿짚은 pH 5의 50 mM 소듐 아세테이트 5 ml에서 10 유닛의 각 효소와 함께 16시간 동안 60℃로 반응시켰다. 총 가용성 당은 DNSA 방법으로 측정했다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 (arabinanase) 단백질을 제공한다. 상기 백색 부후균은 바람직하게는 파네로캐테 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium) BKM-F-1767 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 아라비난나제 단백질의 범위는 백색 부후균으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 아라비난나제 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 아라비난나제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 아라비난나제 단백질 코딩 유전자는 939개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 19개 잔기의 예측 신호 펩티드를 포함하는 총 312개의 아미노산을 암호화하고 있다.

또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pPICZA, pPICZαA, pPICZC 또는 pPICZαC 벡터를 예로 들 수 있으나, 해당 숙주에서 아라비난나제 단백질의 발현에 적합한 벡터라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효모 발현 벡터는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로

(a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산 서열;

(b) 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열; 및

(c) 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 아라비난나제를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 상기 AOXI (alcohol oxydase I) 프로모터는 피키아 파스토리스에서 유래하는 프로모터로서 메탄올의 존재하에서 형질전환체의 단백질 발현 효율을 극대화시키는 역할을 수행한다. 메탄올 자화를 통해 성장하는 피키아 파스토리스는 메탄올을 분해하기 위해 알코올 옥시다아제 (alcohol oxydase)를 균주 자체 중량 대비 30%까지 생산하는데, 이 효소의 생산을 위한 프로모터가 AOXI (Gene bank 등록번호: U96967)이며, 메탄올에 의해 발현이 크게 유도되는 특성을 가지고 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 피키아 파스토리스 유래의 AOXI 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기 AOXI 프로모터는 Invitrogen에서 상업적으로 판매하고 있는 pPICZA, pPICZαA, pPICZC 및 pPICZαC 벡터에 포함되어 있다.

본 발명에서 사용된 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Scccharomyces cerevisiae) 유래의 α-분비 인자 (Genbank 등록번호: NP_015137)를 일부 또는 전부 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 a-분비 인자는 목적 단백질을 세포 외부로 분비시키는 역할을 수행한다.

본 발명에서 사용된 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 아라비난나제를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 1번에서 19번까지의 분비 신호 서열을 포함하지 않는 아미노산 서열, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열 중 20번에서 312번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 또는 효모 유래의 프로모터 (예를 들면, 피키아 파스토리스의 AOXI 프로모터)가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포가 효모인 경우에 AOXI 프로모터를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 일반적으로 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pPICZ 시리즈, pPICZα 시리즈, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 바람직하게는 pPICZC 또는 pPICZαC 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 아라비난나제를 생산하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 한세뉼라 폴리모파 (Hansenula polymorpha), 야로위아 (Yarrowia), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus), 클루이베로마이세스 위커라미 (K. wickeramii), 클루이베로마이세스 왈티 (K. waltii), 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus)와 같은 효모일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Top10, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 다양한 슈도모나스 종 균주 또는 효모 등의 균주가 있다. 본 발명에서 클로닝을 위한 숙주세포로는 E. coli Top10, 발현을 위한 숙주 세포로는 효모 피키아 파스토리스를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 형질전환 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al ., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al ., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al ., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은

(a) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 아라비난나제의 발현을 유도한 후 분리 정제하는 단계를 포함하는 재조합 아라비난나제 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 효모일 수 있으며, 상기 효모는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환된 효모의 배양은 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 AOXI 프로모터에 의해 조절된다. 따라서 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양 배지에서 배양하여 재조합 아라비난나제의 분비를 유도할 수 있다. 재조합 아라비난나제를 생산하기 위해 배지 내에 포함되는 메탄올의 농도는 바람직하게는 배지 중량 대비 0.1~1%일 수 있으며, 배양 중 추가로 메탄올을 첨가하는 것이 가능하다.

본 발명의 피키아 파스토리스로부터 분비된 재조합 아라비난나제는 통상의 분리 정제 방법을 통해 최종 생산될 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 아라비난나제 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아라비난나제 단백질의 최적 활성 온도 및 pH는 각각 55~65℃, pH 4.8~5.2, 바람직하게는 60℃, pH 5.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아라비난나제 단백질은 65℃ 이상의 고온에서도 80% 이상의 높은 활성을 나타내며, 60℃에서 최대 활성을 나타내므로 고온 안정성 효소라고 할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아라비난나제 단백질은 헤미셀룰로오스 유래의 아라비난 (arabinan), 바람직하게는 탈분지화 아라비난 (debranched arabinan), 사탕무 아라비난 (sugar beet arabinan), 아라비노자일란 (arabinoxylan), 자작나무 자일란 또는 p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA), 더욱 바람직하게는 탈분지화된 아라비난, 사탕무 아라비난 또는 아라비노자일란에 기질 특이성을 갖는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질을 유효성분으로 포함하는 아라비난 (arabinan) 또는 아라비노자일란 (arabinoxylan) 분해 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 추가로 자일라나아제를 포함할 수 있는데, 아라비난나제와 자일라나아제는 상승 작용에 의해 아라비노자일란을 효율적으로 분해할 수 있다.

본 발명의 아라비난나제 단백질을 유효성분으로 포함하는 아라비난 또는 아라비노자일란 분해 증진용 조성물은 사료 첨가제, 세제 첨가제, 헤미셀룰로오스 당화용 첨가제, 펄프제지 가공 및 생산용 첨가제, 자일리톨 생산용 첨가제, 삼베나 린넨 섬유 연화용 첨가제, 식품 가공용 첨가제, 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 전처리용 첨가제로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 아라비난에 처리하여 아라비노오스 (arabinose)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아라비난나제 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주, 플라스미드 및 배지 배양

백색 부후균인 P. chrysosporium BKM-F-1767은 한국 생명공학연구원 유전자은행에서 입수하였고, Tien에 의해 기재된 것과 같은 배지에서 유지하였다 (Meth . Enzymol., 161, 238-249 (1988)). 대장균 (Escherichia coli) Top10은 일반적인 클로닝을 위해서는 50 ㎍/ml 앰피실린을 포함하고 IPTG 및 X-Gal이 첨가된 LB 아가 배지에서 배양했고, 발현 벡터로 구축된 PcARA 유전자를 위해서는 25 ㎍/ml의 제오신 (zeocin)을 포함하는 저염 LB 배지에서 배양했다. 이종성 (heterologous) 발현 숙주 GS115 (his4)는 Invitrogen으로부터 공급받았다. 원 배양액 (stock culture)은 YPD 아가 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로오스 및 1.5% 아가) 상에서 30℃로 밤새 배양하여 제조했다. 재조합 엔도-아라비난나제 발현은 1% 메탄올을 포함하는 YP 배지 (1% 효모 추출물 및 2% 펩톤)에 재조합 피키아 파스토리스를 접종하여 수행했다.

pGEM-T Easy Vector (Promega)는 유전자 서열분석을 위해 PcARA 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 산물로 연결되었다. 벡터 pPICZC 및 pPICZαC (Invitrogen)는 피키아 파스토리스에서의 발현을 위해 이용되었다. 두 벡터에서 삽입물의 발현은 메탄올-유도성 AOX1 프로모터에 의해 제어된다. pPICZα는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-분비 인자를 갖는데 반해, pPICZ는 분비 신호를 포함하지 않는다.

2. 전체 cDNA 합성

총 mRNA는 Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 백색 부후균으로부터 추출했다. 총 cDNA는 SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit를 이용하여 제조사 (Clontech)의 권장 사항에 따라 합성하였다.

3. 재조합 플라스미드의 구축 및 형질전환

추정 PcARA의 뉴클레오티드 서열은 Wymelenberg에 의해 예측된 DOE Joint Genome Institute 웹사이트 (http://genome.jgi-psf.org/Phchr1/Phchr1.home.html)의 백색 부후균 유전체 데이터베이스에서 얻었다. 상기 서열은 프라이머를 고안하기 위해 사용되었다. 신호 펩티드를 포함하는 PcARA의 cDNA는 정방향 프라이머 (5'-CTCGAGATGTGGACCTCCATCGTTT-3': 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 (5'-TACGTACACGACAATTGGCCACCCA-3': 서열번호 4)를 이용한 PCR로 증폭했다. PCR 증폭은 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 94℃에서 1분, 30회 반복의 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 조건으로 수행되었다. PCR 산물은 Taq DNA 중합효소를 이용하여 72℃에서 30분 동안 A-테일을 형성했고, pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였다. 목적한 크기의 PCR 산물을 보유한 형질전환체는 상기 언급된 특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 스크리닝했다. 3개의 재조합 플라스미드를 무작위로 분리하고 서열을 분석했다. PcARA 유전자는 XhoI 및 SnaBI를 이용해 절단하였고, 이어서 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리한 후 정제했다. 정제된 PcARA 유전자는 pPICZC 벡터에 삽입하였고, 결과물로 PICZC-PcARA를 얻었다. PcARA α cDNA의 PCR 증폭은 pPICZαC로의 클로닝을 위해 정방향 프라이머 (5'-ATCGATGCAGCCAAACCCAGGGAGA-3': 서열번호 5) 및 역방향 프라이머 (5'-TCTAGAACGACAATTGGCCACCCAG-3': 서열번호 6)를 이용하여 수행하였다. 정방향 프라이머는 증폭된 영역 내에 백색 부후균 PcARA분비 신호를 포함하지 않는데, 이는 사카로마이세스 세레비지애의 분비 서열이 pPICZαC에 존재하기 때문이다. 사용된 PCR 조건은 PcARA cDNA에 대해 상기 기재된 것과 동일했다. 결과물로 수득한 PCR 산물인 PcARA α는 pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였고, ClaI 및 XbaI를 이용해 절단한 후 아가로스 겔 상에서 정제하고, pPICZαC에 삽입하여 결과물로 pPICZαC-PcARA α를 얻었다. 대장균으로의 형질전환 및 플라스미드 DNA의 분리 후, 삽입물의 존재는 PCR 및 제한 효소 절단 후 아가로스-겔 전기영동에 의해 측정되었다. 서열 분석은 pPICZC-PcARA 및 pPICZαC-PcARA α에 대해 제조사의 지시에 따라 AOX1 정방향 프라이머 (5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3': 서열번호 7) 및 역방향 프라이머 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3': 서열번호 8)를 이용하여 수행되었다.

효모 균주를 형질전환하기 위해, 10 ㎍의 플라스미드는 PmeI을 이용하여 직선화하였고, 제조사 (Bio-Rad)에서 제시한 전기천공법을 이용하여 피키아 파스토리스에 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 콜로니가 관찰될 때까지 (2 내지 3일), 100 ㎍/ml 제오신 (zeocin) 및 1 M 솔비톨을 포함하는 YPD 아가 플레이트 상에서 30℃로 배양하여 선별하였다. 재조합 피키아 파스토리스는 상기에 제시된 것과 같은 AOX1 프라이머를 이용한 PCR로 확인하였다.

4. 재조합 PcARA ( rPcARA )의 발현 및 생산

20개의 양성 피키아 파스토리스 (P. pastoris) 형질전환체의 rPcARA 분비 능력은 Vasu 등의 문헌에 기재된 바와 같이 닷 블럿 (dot blot) 분석으로 정량했다 (Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, vol 824. Methods in Molecular Biology, 3rd edn. Humana Press, New York, pp 433-450 (2012)). 최대 분비 피키아 파스토리스 형질전환체는 5 ml의 YPD 배지에서 30℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양했다. 이어서, 5 ml의 배양액을 1% 글리세롤을 포함하는 50 ml의 새로운 YP 배지에 옮겨 30℃ 및 150 rpm의 교반 배양기에서 밤새 배양하였다. 세포 펠렛은 2000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 수집하였고, 세포 펠렛을 10 ml YP 배지에 다시 현탁시켰다. 이어서, 흡광도 1에 도달할 때까지 현탁액을 90ml의 신선한 YP 배지에 서서히 첨가했다. 최종적으로, 새로운 YP 배지를 첨가하여 최종 부피를 100 ml로 만들었다. rPcARA를 유도하기 위해, 1 ml의 100% 메탄올이 25℃에서 배양 7일 동안 최종 농도 1%까지 매 24시간마다 첨가되었다. 1 ml의 배양액을 매 24시간마다 수집하였고, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 효소 활성을 측정했다.

5. 효소 정제

rPcARA를 정제하기 위해, 배양 2일째에 세포가 없는 상층액을 2,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과했다. 전체 90 ml의 여과된 상층액은 10 ml의 10×결합 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl, 및 20 mM 이미다졸; pH 7.4)와 혼합했다. 혼합물은 AKTA 고속 단백질 액체 크로마토그래피 정제 시스템을 이용하여 Ni^{2 +} His-태그 컬럼 (Histrap-GE Healthcare)에 적용했다. 단백질은 용출 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸; pH 7.4)를 이용하여 용출시켰고, 15 ml 코니컬 튜브에 수집했다. 정제된 효소를 포함하는 모든 분획은 염 및 이미다졸을 제거하기 위해 4℃에서 셀룰로오스 투석 튜빙 막 (sigma)을 이용하여 증류수로 밤새 투석했다. 정제된 rPcARA의 분자량은 Sambrook 등의 문헌에 기재된 표준 절차에 따라 SDS-PAGE로 측정했다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor, New York (2003)).

6. 효소 분석

아라비난나제 활성은 DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid)를 이용하여 탈분지화된 아라비난 (Megazyme)으로부터의 환원당 말단의 생산을 측정함으로써 분석했다. 1% 탈분지화된 아라비난이 포함된 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 100 ㎕를 50℃에서 200 ㎕의 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7)와 혼합했다. 반응은 100 ㎕의 상층액을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 10분 동안 반응시켜 시작했다. 방출된 환원당의 양은 TCC-240A UV 분광계 (Shimadzu)를 이용하여 540 nm 파장에서 측정했다. 표준 곡선은 L-아라비노오스를 기질로 사용하여 작성했고, 흡광도는 방출된 환원당의 몰 (mole)로 변환했다. 1 유닛 (unit)의 아라비난나제 활성은 분 당 1μmol의 아라비노오스의 방출로 정의된다.

7. 아라비난나제 활성에 대한 pH , 온도 및 금속 이온의 영향

rPcARA에 대한 pH의 영향은 pH 3.0 내지 6.0 (50 mM 소듐 아세테이트 이용) 및 pH 7.0 내지 8.0 (50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 이용)의 다양한 pH 값에서 50℃에서의 효소 활성에 대한 분석으로 결정되었다. 최적 온도는 최적 pH에서 30 내지 80℃ 범위에서 조사했다.

rPcARA 활성에 대한 금속 이온들 (Mn^{2 +}, K⁺, Ca^{2 +}, Co^{2 +}, Fe^{2 +}, Fe^{3 +}, Cu^{2 +}, Mg^{2 +}, Zn²⁺ 및 Ni^{2 +})의 영향은 효소의 특징을 더 분석하기 위해 조사되었다. rPcARA는 최적 pH 및 온도에서 5 mM의 각 금속 이온의 존재 하에 시험되었다. 잔류 활성은 금속이 없는 반응에서의 효소 활성과 비교되었다.

8. 탈분지화된 아라비난 가수분해의 기질 특이성 및 박층 크로마토그래피 분석

rPcARA의 기질 특이성은 사탕무 아라비난, 밀 아라비노자일란 (Megazyme), 자작나무 자일란 및 p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (Sigma)를 이용하여 조사했다. 사탕무 아라비난, 밀 아라비노자일란 및 자작나무 자일란의 가수분해 반응은 탈분지화 아라비난 분석 과정과 유사하게 수행한 반면, p-니트로페닐 α-L-아라비노퓨라노시드 분해는 37℃, pH 5에서 10분 동안 수행하고, 방출된 4-니트로페놀은 분광계를 이용하여 410nm 파장에서 측정했다.

탈분지화된 아라비난의 가수분해 산물은 클로로포름/아세트산/H₂O (6:7:1)을 이동상으로 이용한 박층 크로마토그래피 (TLC)로 분석하였다. 반응 산물은 1 mg/ml의 오르시놀 (orcinol)을 포함하는 황산/에탄올 (5:95, v/v)을 분사한 후, 110℃에서 5분 동안 베이킹 (baking)하여 가시화되었다. L-아라비노오스, 1,5-α-L-아라비노비오스, 1,5-α-L-아라비노트리오스, 1,5-α-L-아라비노펜타오스, 1,5-α-L-아라비노오스헥사오스 (Megazyme)가 표준물질로 사용되었다.

9. 자일라나아제와의 상승적 작용

rPcARA 및 자일라나아제 C (rPcXynC)에 의한 아라비노자일란 및 NaOH-전처리 보리의 분해를 시험했다. 보릿짚은 5 kg/cm²의 가압 하에 50 리터 용기에서 3M 수산화나트륨을 이용하여 150℃로 60분 동안 처리했다. 샘플은 동일한 부피의 물로 3회 세척했다. 고체상 (solid phase)은 추가의 연구를 위해 수집했다. 0.3 및 0.5 유닛의 정제된 rPcARA 및 rPcXynC의 혼합물은 각각 1 mg 아라비난이 포함된 50 mM 소듐 아세테이트 400 ㎕ (pH 5)에서 60℃로 10분 동안 반응시켰다. rPcARA 및 rPcXynC 혼합물을 이용하여 바이오매스 분해를 조사하기 위해, 100 mg의 NaOH-전처리 보릿짚을 각각의 정제된 효소 10 유닛과 반응시켰다. 반응은 5 ml의 50 mM 소듐 아세테이트 (pH 5)와 60℃에서 16시간 동안 수행되었다. 가수분해는 효소를 불활성화시키기 위해 10분 동안 가열하여 종결시켰다. 방출된 전체 당은 상기 기재된 DNSA 방법을 이용하여 추정했다.

실시예 1. PcARA 의 클로닝 및 서열 분석

백색 부후균 균주 RP78의 추정 엔도-아라비난나제의 예상 뉴클레오티드 서열이 구축된 전체 cDNA로부터의 유전자 증폭을 위한 프라이머 고안을 위해 주형으로 사용되었다. PCR 앰플리콘은 백색 부후균 RP78의 예측된 ARA 유전자의 예상 크기와 완벽하게 일치했으며, 따라서 PcARA로 명명했다. 상기 cDNA 산물의 뉴클레오티드 서열은 312개의 아미노산을 코딩하는 939개의 뉴클레오티드를 갖는다. 본 발명의 PcARA의 전장 cDNA 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 기탁되었다 (등록번호 JQ838072).

웹사이트 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 상에서 이용가능한 신호 펩티드 검출 도구를 이용하여 19개의 아미노산을 포함하는 분비 펩티드를 동정했다. PcARA는 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum)(41%), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)(40%), 아스퍼질러스 아큘레아투스 (A. aculeatus)(42%), 바실러스 써모데니트리피칸스 (Bacillus thermodenitrificans)(40%) 및 셀비브리오 자포니쿠스 (Cellvibrio japonicus)(35%) 유래의 다른 ARA과 눈에 띄는 수준의 동일성을 나타냈다. 도 1에 나타난 것처럼, Asp34, Asp151 및 Glu203의 아미노산 잔기 3개가 ARA 사이에서 보존되어 있다. 이들 아미노산은 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 43에서 아라비난나제의 촉매 기능에 관여한다 (Pons et al ., Proteins 54 (3):424-432 (2004)). 게다가, GH43 아라비난나제의 기질 인식에 필수적인 9개의 보존된 잔기가 PcARA에서 발견되었다 (Alhassid et al ., Biochem J 422 (1):73-82 (2009)). PcARA의 중요한 아미노산 잔기들이 높은 보존성을 나타내는데도 불구하고, 다른 ARA들과의 낮은 유사성은 PcARA가 글리코시드 히드롤라아제 패밀리 43에서 신규한 아라비난나제 구성원임을 시사한다. 균류 탄수화물 결합 도메인은 발견되지 않았으며, 1개의 잠재적인 N-글리코실화 부위 (Asn-Ser-Thr)가 PcARA 서열에서 동정되었다.

실시예 2. rPcARA 의 발현 및 정제

메틸영양체 (methylotrophic) 효모 피키아 파스토리스는 기본적인 실험실 연구 및 산업용 목적 두 가지 모두에 대해 mg에서 g 수준 양의 단백질을 발현하기 위한 유용한 시스템이다. 피키아 파스토리스는 분비 신호 서열 인식에 낮은 수준의 특이성을 필요로 하며, 따라서 많은 재조합 단백질이 본래의 분비 신호 펩티드를 사용하여 피키아 파스토리스에서 발현될 수 있다. 게다가, 피키아 파스토리스의 글리코실화 시스템은 사카로마이세스 세레비지애와 같은 다른 이종성 (heterologous) 발현 시스템의 글리코실화 시스템보다 덜 효율적이어서 본래 재조합 단백질 또는 덜 하이퍼글리코실화 (hyperglycosylate)된 형태의 단백질을 분비한다 (Daly et al., J. Mol . Recognit ., 18, (2005)). 본 발명에서, 본 발명자는 백색 부후균 PcARA 자체의 내재적 분비 신호 및 α-인자 분비 신호 두 가지를 이용하여 피키아 파스토리스 GS115 균주에서 rPcARA를 발현시켰다. 효소 분석 및 웨스턴 블럿 분석에 의한 결과는 재조합 피키아 파스토리스 균주들이 내재적 분비 신호를 이용하여 구축되었을 때, 유도 배지 내에 rPcARA를 생산하지 않는다는 것을 보여주었다 (데이터 미제시).

효소 분석은 피키아 파스토리스에 의한 rPcARA의 생산이 유도 1일 후에 이루어지는 것을 나타낸다. 효소 축적은 4일째까지 극적으로 증가했으며, 최대 1,660 U/l에 도달했다. rPcARA는 세포가 없는 상층액으로부터 정제했고, 이의 생화학적 특성이 연구되었다. 그 결과는 rPcARA가 탈분지화된 아라비난에 대해 204 U/mg의 특이적 활성을 갖고, K_m 및 V_max 값은 각각 4.3 mg/ml 및 400 U/mg이라는 것을 나타냈다. 다른 ARA들과 비교하면, rPcARA는 더 높은 특이적 활성을 나타낸다. 예를 들어, 페니실리움 크리소게눔 (P. chrysogenum), 칼디셀룰로시럽터 사카롤리티쿠스 (C. saccharolyticus) 유래의 아라비난나제들은 각각 18.8 및 12 U/mg의 특이적 활성을 갖는다 (Sakamoto et al ., Appl Microbiol Biotechnol 93 (3):1087-1096 (2012)). 정제된 rPcARA의 분자량은 SDS-PAGE로 측정했다. 그 결과는 33 kDa 부근의 단일 밴드를 나타냈다 (도 2). 그 크기는 rPcARA 서열에 존재하는 아미노산의 수로 계산한 이론적 분자량 33.9 kDa에 매우 가깝다.

실시예 3. rPcARA 활성에 대한 온도, pH 및 금속 이온의 영향

온도의 영향을 측정하기 위해, 0.3 U의 정제된 rPcARA를 상기 기재된 것처럼 탈분지화된 아라비난과 반응시켰다. 효소 분석은 rPcARA가 60℃에서 최고 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다 (도 3A). 효소 활성은 반응 온도가 60℃를 초과할 때 급격히 감소했고, 80℃에서는 대부분의 활성을 잃었다. rPcARA의 최적 온도는 rPcARA가 열안정성 효소라는 것을 나타낸다.

동일한 양의 정제된 효소가 또한 rPcARA 활성에 대한 최적 pH를 연구하는데 이용되었다. rPcARA는 pH 5.0에서 최대 활성에 도달했고, pH 5.0 미만 또는 pH 6.0 초과시에 급격히 감소했다 (도 3B).

본 발명의 결과는 시험한 대부분의 금속 이온들이 rPcARA 활성에 대해 저해 효과를 갖는다는 것을 보여주었다 (도 4). Cu^{2 +}는 rPcARA 활성을 강력하게 저해했으며, Zn^{2 +} 및 Ca^{2 +}는 rPcARA 활성을 대조구에 비해 50% 미만으로 감소시켰다.

실시예 4. rPcARA 의 기질 특이성 및 작용 방식

rPcARA의 아라비난나제 활성은 탈분지화된 아라비난, 사탕무 아라비난, 아라비노자일란 및 자작나무 자일란에 대해 시험했다. 그 결과는 rPcARA가 탈분지화된 아라비난에 대해서는 높은 활성을 나타내지만, 사탕무 아라비난 및 아라비노자일란에 대해서는 특이적 활성이 낮고, 자작나무 자일란은 가수분해하지 못하는 것으로 나타났다 (표 1).

백색 부후균 유래의 엔도-1,5-α-L-아라비난나제의 기질 특이적 활성

기질	특이적 활성 (U/mg)
탈분지화된 아라비난	204±12
사탕무 아라비난	13.7±1.2
아라비노자일란	4.4±0.2
자작나무 자일란	ND
p-니트로페닐 α-L-아라비노퓨라노시드	ND

ND: 검출되지 않음

rPcARA에 의한 탈분지화된 아라비난의 가수분해 산물은 TLC에 의해 가시화되었다. 도 5에 나타난 것처럼, rPcARA는 아라비노오스, 아라비노비오스 및 아라비노트리오스 당을 방출한다. 이러한 결과는 rPcARA가 아라비노비오스 및 아라비노트리오스를 주요한 최종 산물로 생성하는 엔도-아라비난나제라는 것을 나타낸다.

실시예 5. 자일라나아제와의 상승 작용

본 발명자는 선행기술에서 백색 부후균 유래의 재조합 자일라나아제 C의 발현 및 특성 규명을 보고했다. 상기 효소는 rPcARA와 매우 유사하게 각각 pH 5.0 및 70℃의 최적 pH 및 온도를 갖는다 (Huy et al ., J Biosci Bioeng 111 (6):654-657 (2011)). 본 발명에서, 본 발명자는 상용 밀 아라비노자일란 및 NaOH-전처리 보릿짚의 분해에 대한 두 효소들의 상승적 작용을 조사했다. 밀 아라비노자일란은 37%의 아라비노오스 및 61%의 자일로오스로 이루어지는데, 이에 따라 본 발명에서는 rPcARA 및 rPcXynC 비율이 3:5인 혼합물을 밀 아라비노자일란의 분해에 이용했다. rPcXynC 및 rPcARA를 밀 아라비노자일란 분해에 각각 이용했을 때, rPcXynC는 0.66 mg의 당을 방출한 반면, rPcARA는 사용된 총 1 mg의 기질에서 단지 0.01 mg의 당을 생성했다. 그러나, 3:5 비율의 rPcARA 및 rPcXynC는 당 생성을 0.72 mg까지 증가시켰다 (도 6A). 두 효소의 조합은 아라비노자일란 분해에 대한 효율 증가를 나타냈다. 이는 두 효소가 서로 보완하여, 결과적으로 특이적 활성을 향상시킨다는 것을 증명한다.

선행 연구에서 5 kg/cm²의 압력 하에서 3M 수산화나트륨을 이용하여 150℃로 60분 동안 전처리하는 것이 수산화나트륨을 이용한 보릿짚의 최적 전처리 과정이라는 것을 증명했다 (데이터 미공개). NaOH-전처리 보릿짚에서 리그닌의 함량은 22.7%에서 11.79%로 감소했고, 글루코오스는 40.07%에서 61.5%로 증가했으며, 헤미셀룰로오스 당은 19.34%로 동일했다.

NaOH-전처리 보릿짚의 분해 효율은 도 6B에 나타냈다. rPcARA에 의한 효소 가수분해는 1.023 mg으로 나타난 반면, rPcXynC에 의해서는 8.729 mg가 생성되었다. rPcARA 및 rPcXynC의 조합은 당 생성을 9.376 mg까지 증가시켰다. 보릿짚의 분해에 대한 자일라나아제의 역할이 증명되었으며, rPcARA 및 rPcXynC의 상승 작용은 당 생산 수율을 개선했다.

보릿짚 당화에 대한 자일라나아제 및 아라비난나제의 상승 작용은 아직 연구된 바가 없다. 본 연구는 rPcARA 및 rPcXynC의 상승적 작용이 헤미셀룰로오스에 총 9.37%의 가용성 당이 존재하도록 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 효소들은 상기 재료의 당화 과정에 효율적이며, 효소에 의한 다른 리그노셀룰로오스 바이오매스 당화를 위한 잠재적 후보 물질이 될 수 있다.

백색 부후균에 의한 바이오매스 당화 과정은 더 긴 반응 시간을 소비하고, 다른 미생물에 유해한 물질들을 분비할 수도 있다. 결과적으로, 발효를 위한 탄소 공급원으로서 상기 백색 부후균에 의한 바이오매스 당화 산물을 이용한다면 중화 및 분리와 같은 다른 처리 과정도 필요로 할 수 있다 (Wan and Li, Biotechnol Adv 30 (6):1447-1457 (2012)). 따라서, 본 발명에서 분리된 효소들은 균류 당화를 대체할 수 있는 훌륭한 잠재성을 갖는다.

본 발명은 rPcARA의 특성 및 적용과 바이오매스 당화에서 rPcARA 및 rPcXynC의 상승 작용을 최초로 보고한다. rPcARA는 대부분의 보고된 다른 아라비난나제에 비해 선형 α-1,5-l-아라비난 물질에 대해 높은 특이적 활성을 보여준다. 나아가, rPcARA는 높은 온도에서 최대 활성을 나타내, 그것이 열 안정성 효소라는 것을 제시한다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY NBM Co., Ltd <120> Method for high production of recombinant thermostable arabinanase from Phanerochaete chrysosporium <130> PN13025 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 939 <212> DNA <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 1 atgtggacct ccatcgtttt ccttgcacta gttgctatgg ccgtcatggc cgttgcgcag 60 ccaaacccag gaagagtgac tggtgatatc tctgtacatg accctaccat gtgcagagac 120 gacgccggaa cttacttcat cttcgctacc gggactggta taccgataca cacctcgacg 180 gataggatta gctggacggt gatcgggtca gtgtggcctg atggtgcccc gacggagacg 240 aaccagttca ccggaacgac caatggggat ctatgggcac cggactgcac atataaagac 300 ggcacgttct acctatatta cgctgcttct acattcggct cccagaactc gggcatattc 360 ttcgcaacct ccccctcggg tcttcctggg tcttggaccg accacggtct tgtgacgtcg 420 actaaggccg gtgatagcta caatgccatt gacccgaatt tactcctcga tggtagcaac 480 tggatcctct cgttaggatc gttctggaca ggcatcaaag aaatggcatt aagcccatct 540 accggcaagc cgagcagctc aagcgtgaca tctcttgcgc agcgcactgc aaataatggc 600 gcaatcgagg catcggttat ctggaagcaa ggaaactttt actatctgtt caccagctgg 660 gataattgct gccaaggcct gaacagcaca tataatatca gggtcggtcg ctcttcgagt 720 gcgaagggac cgtttgtcga ccaaaacggc gtagcgctga caaatggcgg aggcaccctt 780 gtgctcggga cacatggatc ggttgttggt ccaggcgggc aagatcttat gtcggacgtc 840 gacggcacga ttttagtcta ccattattac actgcaacaa cgagcttgct tggtatcaat 900 cgccttgact tctcaactgg gtggccaatt gtcgtgtaa 939 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 2 Met Trp Thr Ser Ile Val Phe Leu Ala Leu Val Ala Met Ala Val Met 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Pro Asn Pro Gly Arg Val Thr Gly Asp Ile Ser Val 20 25 30 His Asp Pro Thr Met Cys Arg Asp Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Ile Phe 35 40 45 Ala Thr Gly Thr Gly Ile Pro Ile His Thr Ser Thr Asp Arg Ile Ser 50 55 60 Trp Thr Val Ile Gly Ser Val Trp Pro Asp Gly Ala Pro Thr Glu Thr 65 70 75 80 Asn Gln Phe Thr Gly Thr Thr Asn Gly Asp Leu Trp Ala Pro Asp Cys 85 90 95 Thr Tyr Lys Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Tyr Tyr Ala Ala Ser Thr Phe 100 105 110 Gly Ser Gln Asn Ser Gly Ile Phe Phe Ala Thr Ser Pro Ser Gly Leu 115 120 125 Pro Gly Ser Trp Thr Asp His Gly Leu Val Thr Ser Thr Lys Ala Gly 130 135 140 Asp Ser Tyr Asn Ala Ile Asp Pro Asn Leu Leu Leu Asp Gly Ser Asn 145 150 155 160 Trp Ile Leu Ser Leu Gly Ser Phe Trp Thr Gly Ile Lys Glu Met Ala 165 170 175 Leu Ser Pro Ser Thr Gly Lys Pro Ser Ser Ser Ser Val Thr Ser Leu 180 185 190 Ala Gln Arg Thr Ala Asn Asn Gly Ala Ile Glu Ala Ser Val Ile Trp 195 200 205 Lys Gln Gly Asn Phe Tyr Tyr Leu Phe Thr Ser Trp Asp Asn Cys Cys 210 215 220 Gln Gly Leu Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Arg Val Gly Arg Ser Ser Ser 225 230 235 240 Ala Lys Gly Pro Phe Val Asp Gln Asn Gly Val Ala Leu Thr Asn Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Leu Val Leu Gly Thr His Gly Ser Val Val Gly Pro Gly 260 265 270 Gly Gln Asp Leu Met Ser Asp Val Asp Gly Thr Ile Leu Val Tyr His 275 280 285 Tyr Tyr Thr Ala Thr Thr Ser Leu Leu Gly Ile Asn Arg Leu Asp Phe 290 295 300 Ser Thr Gly Trp Pro Ile Val Val 305 310 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctcgagatgt ggacctccat cgttt 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tacgtacacg acaattggcc accca 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 atcgatgcag ccaaacccag ggaga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tctagaacga caattggcca cccag 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (18)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 (arabinanase) 단백질.
2. 제1항의 백색 부후균 (Phanerochaete chrysosporium) 유래의 아라비난나제 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 효모 발현 벡터는 5'에서 3' 방향으로
   (a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI (alcohol oxydase I) 프로모터를 코딩하는 핵산 서열;
   (b) 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열; 및
   (c) 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 아라비난나제를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환되어 아라비난나제를 생산하는 숙주세포.
7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 아라비난나제를 생산하는 숙주세포.
8. 제7항에 있어서, 상기 효모는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 아라비난나제를 생산하는 숙주세포.
9. (a) 제3항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 아라비난나제의 발현을 유도한 후 분리 정제하는 단계를 포함하는 재조합 아라비난나제 단백질의 대량 생산 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 재조합 아라비난나제 단백질의 대량 생산 방법.
11. 제9항의 방법에 의해 생산된 재조합 아라비난나제 단백질.
12. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 55~65℃, pH 4.8~5.2에서 최적 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 아라비난나제 단백질.
13. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 탈분지화된 아라비난 (debranched arabinan), 사탕무 아라비난 (sugar beet arabinan) 또는 아라비노자일란 (arabinoxylan)에 기질 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아라비난나제 단백질.
14. 제1항 또는 제11항의 아라비난나제 단백질을 유효성분으로 포함하는 아라비난 (arabinan) 또는 아라비노자일란 (arabinoxylan) 분해 증진용 조성물.
15. 제14항에 있어서, 자일라나아제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아라비난 또는 아라비노자일란 분해 증진용 조성물.
16. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 사료 첨가제, 세제 첨가제, 헤미셀룰로오스 당화용 첨가제, 펄프제지 가공 및 생산용 첨가제, 자일리톨 생산용 첨가제, 삼베나 린넨 섬유 연화용 첨가제, 식품 가공용 첨가제 또는 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 전처리용 첨가제로 이용되는 것을 특징으로 하는 아라비난 또는 아라비노자일란 분해 증진용 조성물.
17. 제1항 또는 제11항의 아라비난나제 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 아라비난에 처리하여 아라비노오스 (arabinose)를 생산하는 방법.
18. 제1항 또는 제11항의 단백질에 대한 항체.

Images