JP6689487B2 - エンドキシラナーゼ変異体、バイオマス分解用酵素組成物及び糖液の製造方法 - Google Patents
エンドキシラナーゼ変異体、バイオマス分解用酵素組成物及び糖液の製造方法 Download PDFInfo
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Description
[1] 糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列の位置35、位置44、位置62、位置63、位置101、及び位置102に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。
[2] 配列番号1のアミノ酸配列の位置35、及び/又は位置62に相当する位置のアミノ酸残基が、システインに置換されている[1]のエンドキシラナーゼ変異体。
[3] 配列番号1のアミノ酸配列の位置44、及び/又は位置63に相当する位置のアミノ酸残基が、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、[1]又は[2]のエンドキシラナーゼ変異体。
[4] 配列番号1のアミノ酸配列の位置101、及び/又は位置102に相当する位置のアミノ酸残基が、プロリン、及びアスパラギンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、[1]〜[3]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
[5] さらに、配列番号1のアミノ酸配列の位置61、位置65、及び位置66に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されている、[1]〜[4]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
[6] 配列番号1のアミノ酸配列の位置35、位置44、位置61、位置62、位置63、位置65、位置66、位置101、及び位置102に相当する位置のアミノ酸残基が全て置換されている、[1]〜[5]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
[7] 糸状菌由来のエンドキシラナーゼが、アクレモニウム・セルロリチカス(Acremonium cellulolyticus)に由来する、[1]〜[6]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
[8] 以下の(a)から(c)のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつエンドキシラナーゼ活性を有する、[1]〜[7]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体:
(a)配列番号3,4,5,6,7,8,9,10又は45で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3,4,5,6,7,8,9,10又は45で示されるアミノ酸配列において、位置35、位置44、位置61、位置62、位置63、位置65、位置66、位置101、及び位置102における置換されたアミノ酸は変異せず、1から数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列;あるいは
(c)配列番号3,4,5,6,7,8,9,10又は45で示されるアミノ酸配列において、位置35、位置44、位置61、位置62、位置63、位置65、位置66、位置101、及び位置102における置換されたアミノ酸は変異せず、該アミノ酸を除いて、配列番号3,4,5,6,7,8,9,10又は45で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
[9] [1]〜[8]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNA。
[10] [9]のDNAを含む、発現ベクター。
[11] [10]の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
[12] [11]の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞により生産されたエンドキシラナーゼ変異体を得る工程を含む、エンドキシラナーゼ変異体の製造方法。
[13] [1]〜[8]のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物。
[14] 前記酵素組成物が、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼからなる群から選択される1または2種以上の酵素をさらに含む、[13]のバイオマス分解用酵素組成物。
[15] [13]又は[14]のバイオマス分解用酵素組成物を、バイオマスに添加することを含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
(1)エンドキシラナーゼ変異体
本発明において「エンドキシラナーゼ」とは、β−1,4結合したキシロース主鎖に作用することでヘミセルロースを加水分解する活性(エンドキシラナーゼ活性)を有する酵素であり、EC番号3.3.1.8に分類される酵素である。エンドキシラナーゼは、ファミリー10(GH10)とファミリー11(GH11)の2種に分類されるが、本発明のエンドキシラナーゼは、ファミリー11(GH11)に分類される酵素であり、β−ジェリーロール構造を保有する。「エンドキシラナーゼ活性」の測定は、β−1,4結合したD-キシロースを基質として、好ましくは、試薬として販売されているバーチウッドキシラン(Birchwood xylan)を基質として使用して行うことができる。基質であるキシランが分解されたか否かは、反応後の反応液に含まれる還元糖量を測定することで確認することができる。還元糖量は、ジニトロサリチル酸法(DNS法)を使用することで測定することができ、Baileyら“Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity”J.Biotechnol.23,257−270に記載の方法が好ましく使用できる。活性を測定する条件は、前述した方法で、エンドキシラナーゼの活性を測定できれば特に限定はされない。活性測定のための、好ましい温度条件としては20℃〜90℃の範囲、好ましくは、40℃〜75℃の範囲、pHは4〜9の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH5〜7、反応時間は、1秒から600分であることが好ましく、最も好ましくは1分から60分である。また活性測定時に基質として使用するキシランは、0.1重量%〜10重量%の範囲が好ましく、最も好ましくは0.5重量%〜2重量%の範囲である。
位置35:システイン;
位置44:ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはヒスチジン;
位置62:システイン;
位置63:ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはロイシン;
位置101:プロリン、又はアスパラギン、好ましくはプロリン;
位置102:プロリン、又はアスパラギン、好ましくはアスパラギン。
位置61:グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはメチオニン;
位置65:プロリン;
位置66:グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはグリシン。
位置35にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号3のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号3のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置62にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号5のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号5のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置35および位置62の両方の位置にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号9のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号9のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置44にヒスチジンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号4のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置63にロイシンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号6のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号6のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置101にプロリンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号7のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号7のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
位置102にアスパラギンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号8のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる(配列番号8のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない);
特に好ましいエンドキシラナーゼ変異体は、前述した位置35、位置44、位置62、位置63、位置101及び位置102の6つの置換の全てを含むエンドキシラナーゼ変異体又はその一部である。
(2)エンドキシラナーゼ変異体の製造方法
本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、例えば前記(1)で述べたエンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列をコードするDNAを調製し、これを発現ベクターに連結し、発現ベクターを宿主に導入し、異種あるいは同種タンパク質として生産し、単離および精製することで製造することができる。アミノ酸配列をコードするコドン使用頻度は、エンドキシラナーゼが由来とする糸状菌、例えばAcremonium cellulolyticus(アクレモニウム・セルロリチカス)と同じものでもあってもよいし、宿主のコドン使用頻度に合わせて変更してもよい。
位置35にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号34の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置62にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号36の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置35および位置62の両方の位置にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号40の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置44にヒスチジンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号35の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置63にロイシンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号37の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置101にプロリンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号38の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない);
位置102にアスパラギンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAであり、配列番号39の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる(当該DNAは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない)。
上記塩基配列において、1〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列。例えば、配列番号1に表される塩基配列において、1〜100個の塩基、好ましくは1〜50個の塩基、より好ましくは1〜10個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列;
上記塩基配列と80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列。塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、BLAST等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる;
上記塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、2〜6×SSC(1×SSCの組成:0.15M NaCl,0.015M クエン酸ナトリウム,pH7.0)及び0.1〜0.5%SDSを含有する溶液中42〜55℃にてハイブリダイズを行い、0.1〜0.2×SSC及び0.1〜0.5%SDSを含有する溶液中55〜65℃にて洗浄を行う条件をいう。
(3)エンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物
本発明のバイオマス酵素組成物は、少なくとも本発明のエンドキシラナーゼ変異体を、バイオマスを加水分解するための有効成分として含み、バイオマスを分解する用途に使用される酵素組成物である。ここで、バイオマスとは、生物系の植物体のことを指し、草本系植物、木質系植物、藻類、海草類、製糖作物、資源作物、穀物、などが例示される。これらのバイオマスは、いずれも、2糖以上の多糖類を含んでおり、本発明のバイオマス分解用酵素組成物による多糖類の加水分解を行うことができる。特に好ましく使用できるのは、セルロース含有バイオマスである。セルロース含有バイオマスは、セルロース成分を含む生物資源である。具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲藁、麦藁などの草本系バイオマス、あるいは樹木、廃建材などの木質系バイオマス、さらに藻類、海草、など水生環境由来のバイオマスのことを指す。こうしたセルロース系バイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース(以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。)の他に芳香族高分子であるリグニン等を含有している。
(参考例1)タンパク質濃度の測定
本発明で使用したエンドキシラナーゼおよびエンドキシラナーゼ変異体のタンパク質濃度は、BCA法にて測定した。エンドキシラナーゼ又はエンドキシラナーゼ変異体を含む溶液25μLを200μLのBCA試薬と混合し、37℃で30分反応させることで発色させた。タンパク質濃度は、牛血清アルブミンを標準品として、570nmの吸光度を測定、比色定量することで決定した。
(参考例2)トリコデルマ由来セルラーゼの調製
トリコデルマ由来セルラーゼは以下の方法で調製した。
[前培養]
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるよう蒸留水に添加し、100mLを500mLバッフル付き三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ121℃で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80をそれぞれ0.01%(w/vol)添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイATCC66589(ATCCより分譲)を1×105個/mLになるように植菌し、28℃、72時間、180rpmで振とう培養し、前培養とした(振とう装置:TAITEC社製 BIO−SHAKER BR−40LF)。
[本培養]
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、セルロース(アビセル)10%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるよう蒸留水に添加し、2.5Lを5L容撹拌ジャー(ABLE社製 DPC−2A)容器に張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ121℃で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80をそれぞれ0.1%添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイPC3−7を250mL接種した。その後、28℃、87時間、300rpm、通気量1vvmにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過(ミリポア社製 ステリカップ−GV 材質:PVDF)した。この前述条件で調製した培養液に対し、βグルコシダーゼ(Novozyme188)をタンパク質重量比として、1/100量添加し、これをトリコデルマ由来セルラーゼとして、以下、実施例に使用した。
(比較例1)アクレモニウム・セルロリチカス(Acremonium cellulolyticus)から単離された野生型エンドキシラナーゼ(配列番号1のアミノ酸配列を有する)のクローニング
配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型エンドキシラナーゼをコードするDNAは、アクレモニウム・セルロリチカス(Acremonium cellulolyticus)CF株よりRT−PCRで単離し、pET11a(Novagen)のNdeI部位、BamHI部位に、野生型エンドキシラナーゼよりシグナルペプチド領域を除去したタンパク質をコードする、配列番号33の塩基配列を有するDNAのクローニングを実施した。pET11aのNdeI部位の塩基配列CATATGにおける、“ATG”は、メチオニンコドンとして翻訳開始点として使用し、3’末端にはストップコドン“TAG”を含んでいる。
(実施例1)位置35、位置44、位置62、位置63、位置101、位置102のいずれか1つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAの作製と大腸菌による組換え発現
実施例として、位置35、位置44、位置62、位置63、位置101、位置102のいずれか1つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAの作製を以下手順にて実施した。
実施例1にて作製した、位置35に変異を導入したエンドキシラナーゼ変異体(配列番号3)をコードするDNAを含むpET11に対して、さらに、位置62に変異を導入するプライマー対(配列番号18および配列番号19)を使用して、位置35と位置62においてそれぞれシステインへの2つの置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNA(配列番号40)を作製した。本変異導入に使用したプライマー対は表2に示す2種である。作製したエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAの塩基配列を配列番号9に示す。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAは比較例1の手順に準じてpET11aにクローニングした。次いで、当該エンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAを含むpET11aを用いて、比較例1の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、実施例2のエンドキシラナーゼ変異体(配列番号9)を得た。
比較例として位置61、位置65、位置66のいずれか1つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体を作製した。野生型エンドキシラナーゼの塩基配列(配列番号2)を含むpET11aを鋳型として、表3に記載のプライマー対(Fw:フォワードプライマー、Rv:リバースプライマー)を使用して、PCRを行うことで、各エンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAを作製した。PCRにはPrimeSTAR MaxDNA Polymerase kit(タカラバイオ株式会社)を用いた。使用したプライマー対と得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAの塩基配列を配列番号42、配列番号43、配列番号44、に示す(表3)。またそれぞれのエンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号11、配列番号12、配列番号13に示す(開始メチオニンを除く)。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAは比較例1の手順に準じてpET11aにクローニングした。次いで、当該エンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAを含むpET11aは、比較例1の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、比較例2の変異体を得た。
実施例2にて作製した、位置35と位置62においてそれぞれシステインへの2つの置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNA(配列番号40)を含むpET11に対して、さらに、位置44、位置63、位置101、位置102、位置61、位置65、位置66に変異を導入するプライマー対を使用して、各位置に置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAを作製した。本変異導入に使用したプライマー対は表4に示す9種である。作製したエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAの塩基配列を配列番号41に示す。また当該エンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号10に示す。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAは比較例1の手順に準じてpET11aにクローニングした。次いで、エンドキシラナーゼ変異体をコードするDNAを含むpET11aは、比較例1の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、実施例3のエンドキシラナーゼ変異体(配列番号10)を得た。
エンドキシラナーゼ活性は、1%のバーチウッドキシラン(シグマアルドリッチ社)を基質として使用して、測定を行った。エンドキシラナーゼによるバーチウッドキシランが加水分解され、生成した還元糖の量は、ジニトロサリチル酸法(DNS)法でキシロースを標品として使用して測定した。反応は、各種エンドキシラナーゼ変異体(実施例1、実施例2、実施例3)および野生型エンドキシラナーゼ(比較例1)、エンドキシラナーゼ変異体(比較例2)を1mg/mLとなるよう添加し、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃の各温度において、10分間保温することでバーチウッドキシランの分解を実施した。タンパク質濃度は参考例1に準じて濃度測定を行い調整した。反応後、還元糖量を測定するためDNS溶液を0.75mL添加することで開始し、5分煮沸することで反応を停止した。反応停止後の反応液は、540nmの吸光度を測定することで還元糖量を測定した。1unitのエンドキシラナーゼ活性は、50℃・1分間において、1μmolのキシロースをバーチウッドキシランより生成するために必要な酵素量と定義しユニット数を算出した。また、算出した各ユニット値を元に、特に野生型(比較例1)における55℃の活性値を基準(100%)として相対的な活性値を表5にまとめた。
サトウキビ搾汁後の残渣であるバガスを原料にして、オリゴ糖液製造を試みた。エンドキシラナーゼとしては、比較例1の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例3のエンドキシラナーゼ変異体を使用した。前処理として、バイオマス重量が30%(w/w)となるように1N苛性ソーダ水溶液中で6日間浸漬処理した。前処理物を0.5gずつ2mLチューブに秤量し、バイオマスの終濃度が10%(w/w)となるように加水後、希釈硫酸を用いてpH5に調整した。pHを調整した本組成物に、野生型エンドキシラナーゼもしくはエンドキシラナーゼ変異体を0.05mg/g−BM添加し、サーモブロック回転器(日伸理化製 SN−48BN)を用いて50℃で24時間反応させた。反応後の上清における糖組成を表6に示す。野生型エンドキシラナーゼと比較して、エンドキシラナーゼ変異体の方がキシロオリゴ糖であるキシロビオースを多く得ることができた。
実施例5において、酵素としてエンドキシラナーゼ変異体に加えてトリコデルマ由来セルラーゼ(参考例2)を用いて糖液の製造を試みた。実施例5と同様の方法でpH調整まで行った組成物に対して、トリコデルマ由来セルラーゼをタンパク質量で10mg/g−BMおよびエンドキシラナーゼ変異体(実施例3)を0.05mg/g−BM添加し、サーモブロック回転器(日伸理化製 SN−48BN)を用いて50℃で48時間反応させた。比較として、トリコデルマ由来セルラーゼのみを添加して反応させた。反応後の上清における糖組成を表7に示す。トリコデルマ由来セルラーゼだけのものと比較して、エンドキシラナーゼ変異体を加えた方が糖収量を向上させることができた。
実施例5にて得られた反応後の上清500μlを、VIVASPIN500(PES、分画分子量10,000)(ザルトリウス社)を用いて限外濾過し、比較例1の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例3のエンドキシラナーゼ変異体を回収した。回収した比較例1の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例3のエンドキシラナーゼ変異体と、キシラン分解時の濃度(2.5mg/l)に希釈した比較例1の野生型エンドキシラナーゼ、実施例3のエンドキシラナーゼ変異体のエンドキシラナーゼ活性を測定した。エンドキシラナーゼ活性は、回収エンドキシラナーゼもしくは希釈エンドキシラナーゼを反応液の1/10量添加した点、反応温度を50℃で行った点以外は、実施例4と同様に行った。希釈した比較例1の野生型エンドキシラナーゼ、実施例3のエンドキシラナーゼ変異体の活性値をそれぞれ基準(100%)として、回収した比較例1の野生型エンドキシラナーゼ、実施例3のエンドキシラナーゼ変異体の相対的な活性値を残存活性とした。表8に回収後の残存活性を示す。エンドキシラナーゼ変異体ではキシラン分解後も活性が高く残っており、キシラン分解に有意に再利用出来ることが確認できた。
野生型エンドキシラナーゼからN末端の34アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを除くアミノ酸配列(配列番号2)をコードする塩基配列(配列番号33)を含むpET11aを鋳型(比較例1)として、配列番号51と配列番号53のプライマー対を使用してPCRを行うことで、配列番号54、配列番号47、配列番号55を順にコードするDNAを作製した。
実施例8で得られた各種培養液の上清のエンドキシラナーゼの活性測定を行った。活性測定は、各種培養液の上清を0.25mg/mLとなるよう添加し、50℃、60℃、70℃の各温度で反応を行う以外は、実施例4と同様に行った。算出した各ユニット値を元に、特に野生型における50℃の活性値を基準(100%)として相対的な活性値を表11にまとめた。キシラナーゼ変異体を含む上清は高温条件下においても高い活性を保持していた。また、酵母にて発現させた酵素は、実施例4にて大腸菌より発現された場合と比較して、高い耐熱性が認められた。
Claims (11)
- 糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列の位置35、位置44、位置62、位置63、位置61、位置65、及び位置66に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれシステイン、ヒスチジン、システイン、ロイシン、メチオニン、プロリン、及びグリシンに全て置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。
- 配列番号1のアミノ酸配列の位置101、及び/又は位置102に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれプロリン、及びアスパラギンに置換されている、請求項1に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
- 糸状菌由来のエンドキシラナーゼが、アクレモニウム・セルロリチカス(Acremonium cellulolyticus)に由来する、請求項1又は2に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
- 配列番号10又は45で示されるアミノ酸配列からなるエンドキシラナーゼ変異体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のエンドキシラナーゼ変異体をコードするDNA。
- 請求項5に記載のDNAを含む、発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
- 請求項7に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞により生産されたエンドキシラナーゼ変異体を得る工程を含む、エンドキシラナーゼ変異体の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のエンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物。
- 前記酵素組成物が、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼからなる群から選択される1または2種以上の酵素をさらに含む、請求項9に記載のバイオマス分解用酵素組成物。
- 請求項9又は請求項10に記載のバイオマス分解用酵素組成物を、バイオマスに添加することを含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
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