KR101434412B1 - Method for selective detection of thrombin using conjugated fluorescent polyelectrolyte - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 피브리노젠의 상호작용을 이용한 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체의 제조 및 이를 이용한 수용액 상에서 트롬빈의 선택적 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이온성기를 가지는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 피브리노젠이 회합체를 형성하여 트롬빈의 농도에 따라 상기 고분자 화합물의 형광 색상이 변화하는 형광센서에 관한 것이다. The present invention relates to a method for preparing a water-soluble fluorescent conjugated conjugated polymer-fibrinogen conjugate using an interaction between a water-soluble fluorescent conjugated polymer having an ionic group and fibrinogen, and a method for selectively detecting thrombin in an aqueous solution using the same More particularly, the present invention relates to a fluorescence sensor in which a fluorescent color of the polymer is changed according to the concentration of thrombin by forming a complex with a water-soluble fluorescent conjugated polymer having an ionic group and fibrinogen.

Description

수용성 형광 공액화 고분자 화합물 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 검출방법 {Method for selective detection of thrombin using conjugated fluorescent polyelectrolyte}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for selectively detecting thrombin using conjugated fluorescent polyelectrolyte,

본 발명은 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 (fibrinogen) 회합체의 제조와 회합체에 존재하는 피브리노젠이 트롬빈과 특이적 상호작용하는 것을 이용하여 수용액 상에서 트롬빈을 선택적으로 형광 검출하는 방법에 관한 것이다.  The present invention relates to the preparation of a water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate having an ionic group and the selective interaction of fibrinogen present in the conjugate with thrombin, And a method for detecting the same.

현대 사회를 살아가면서 현대인들은 많은 질병에 노출되어 있다. 이로 인하여 다양한 질병에 대하여 신속 정확하게 분석할 필요가 있다. 이러한 분석에는 특정 질병에 선택성이 있는 물질을 이용한 바이오센서 물질이 사용되며, 센서의 일반적인 감지 신호는 전기, 저항, 전위차 등의 전기적 신호나 색채, 형광 등의 광학적 신호를 이용한다. 이중에서 색의 변화 및 형광의 변화는 육안으로 쉽게 판별이 가능하므로 특별한 장비가 없어도 측정이 용이한 방법 중 하나이다. Living in modern society, modern people are exposed to many diseases. This requires rapid and accurate analysis of various diseases. In this analysis, a biosensor material using a substance having selectivity for a specific disease is used. In general, a sensor signal is an electrical signal such as electricity, resistance, potential difference, or an optical signal such as color or fluorescence. Among these, changes in color and changes in fluorescence can be easily detected by the naked eye, which is one of the easiest methods to measure without special equipment.

상기와 같은 색채 및 형광색의 변화를 나타내는 광센서로는 일반적으로 저분자 물질이 많이 이용되고 있으며, 측정대상물질도 이온뿐만 아니라 분자와 같은 다양한 화학종을 감지할 수 있다. 특히 최근에는 색채 및 형광의 변화를 나타내는 센서로서 공액화 고분자의 사용이 두드러지고 있다. In general, a low-molecular material is widely used as an optical sensor that exhibits the above-described change in color and fluorescence color, and the measurement target material can detect various chemical species such as molecules as well as ions. Recently, the use of a conjugated polymer as a sensor showing changes in color and fluorescence has become prominent.

공액화 고분자는 화학신호를 측정 가능한 전기 또는 광신호로 변환이 가능하고, 특히 피측정물과 상호작용에 대한 응답으로 신호를 발현할 때 감도가 증가한다는 (증폭현상) 장점을 가지고 있어 금속이온 및 음이온 감지, 폭발물 (방향족 나이트로 화합물) 감지 등의 센서재료로 널리 사용되고 있다 (D. T. McQuade, A.E. Pullen, T. M. Swager, Chem. Rev. 100, 2537, 2000). 또한, 수용성 공액화 고분자는 공액화 고분자의 감도 증가의 장점과 물에 녹는다는 특징을 이용하여 저분자량의 바이오물질, 단백질, DNA 등에 대한 센서재료로 널리 사용되고 있다 (C. Li, M. Numata, M. Yu, S. Wang, S. Shinkai, Angew. Chem. Int. Ed. 42, 4803, 2003; I. -B. Kim, J. N. Wilson, U. H. F. Bunz, Chem. Commun. 10, 1273, 2005; B. S. Gaylord, A. J. Heeger, G. C. Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10954, 2002). 수용성 공액화 고분자는 우리 몸의 구성 요소와 같은 유기물로 이루어져 미래의 궁극적인 응용에 있어서 높이 평가 받고 있으며, 특히 기존의 유기 공액화 고분자의 형광을 이용한 높은 감응성을 갖는 바이오센서의 개발로 이어졌고, 이는 세포 이미지화 (living cell imaging)등의 첨단생명공학 기술의 응용으로 이어지고 있다. 수용성 공액화 고분자 역시 지용성 공액화 고분자와 동일한 p-오비탈 중첩을 갖고 있어 유사한 형광 특성을 보이며, 지용성 고분자와 함께 사용하여 다층 유기전자소자 개발에 응응할 수 있고, 물에서의 형광을 이용하여 바이오센서, 약물전달 시스템 등 바이오와 접목하여 여러 의학 분야에 응용할 수 있다.Conjugated polymers have the advantage of being able to convert chemical signals into measurable electrical or optical signals and, in particular, to increase sensitivity (amplification) when signaling in response to interaction with the analyte, (McGuade, AE Pullen, TM Swager, Chem. Rev. 100, 2537, 2000), which are widely used as sensor materials for sensing anions and detecting explosives (aromatic nitro compounds). In addition, water-soluble conjugated polymers are widely used as sensor materials for low molecular weight biomaterials, proteins, and DNA using the advantages of increasing sensitivity of conjugated polymers and dissolving in water (C. Li, M. Numata, JN Wilson, UHF Bunz, Chem. Commun., 10, 1273, 2005. BS, JW Wilson, U.S.A. Wang, S. Shinkai, Angew. Gaylord, AJ Heeger, GC Bazan, Proc Natl Acad Sci USA 99, 10954, 2002). The water-soluble conjugated polymer is composed of organic materials such as the constituents of the body, and thus has been appreciated in the ultimate application of the future. In particular, the development of a biosensor having high sensitivity using the fluorescence of the existing organic conjugated polymer has been developed. And application of advanced biotechnology such as living cell imaging. The water-soluble conjugated polymer also has the same p-orbital superposition as the liposoluble conjugated polymer and exhibits similar fluorescence characteristics. It can be used in conjunction with the liposoluble polymer to respond to the development of multi-layer organic electronic devices, , Drug delivery system, etc., and can be applied to various medical fields.

그 중 단백질을 감지하는 센서물질의 개발은 현재 많은 관심을 끌고 있으며, 특히 센서물질의 색이나 형광색 변화에 의한 단백질의 감지는 그 감지 신호의 민감도 때문에 널리 사용되고 있다. 단백질 중에서도 효소 단백질인 트롬빈 (thrombin)의 감지는 환경적, 생리적으로 중요한 요소가 되고 있다. 트롬빈은 혈액 응고에 관계되는 단백질 분해효소로, 혈장 속에서는 프로트롬빈으로 존재한다. 출혈 시에 혈소판이 파괴되어 트롬보플라스틴(thromboplastin)이 혈장 중에 나오면 혈액의 칼슘이온의 존재 하에 활성화되어 트롬빈이 된다. 이 트롬빈은 혈액 응고의 본질인 혈액 속의 가용성 피브리노젠을 가수분해하여 불용성인 피브린 (fibrin)으로 변화시키는 반응을 촉매한다. 또한 트롬빈은 피브리노젠에 대한 기질 특이성이 매우 높아 피브리노젠 내 4개의 펩타이드 결합을 절단하는데, 그 위치가 아르지닌과 글리신 잔기 사이이며, 최적 pH는 중성 또는 약알칼리성 부근이다. 이 피브린은 그물모양으로 얽히고 그 속에 혈구를 가둔 채 시간이 지날수록 점점 작아진다. 혈구의 덩어리를 혈병이라 하고, 스며 나온 투명한 액체를 혈청이라 한다. 혈액응고는 생명을 유지하는데 필수 불가결한 것으로, 만일 혈액에 이 작용이 없으면 개체는 작은 출혈에도 혈액이 응고되지 못하여 결국 과다출혈에 의해 사망에 이르게 된다. 만약 인체 내에서 혈액이 응고된다면 혈액 순환이 이루어지지 않게 되고, 이에 따라서 인체 내 간에서 합성되는 헤파린이 트롬빈의 생성을 억제하거나, 혈액 내 또는 혈관내피세포에 존재하는 다양한 항응고인자들에 의하여 혈액응고를 방지한다.Among them, the development of a sensor material which senses a protein is attracting much attention, and in particular, the detection of a protein due to a change in color or fluorescence of a sensor material is widely used because of sensitivity of the detection signal. Among the proteins, the detection of thrombin, an enzyme protein, has become an important environmental and physiological factor. Thrombin is a proteolytic enzyme involved in blood clotting, and is present in the plasma as prothrombin. When bleeding occurs, platelets are broken down and thromboplastin is released into plasma, which is activated in the presence of calcium ions in the blood, resulting in thrombin. This thrombin catalyzes the reaction of converting the soluble fibrinogen in the blood, which is the essence of blood coagulation, to hydrolysis into insoluble fibrin. In addition, thrombin is highly substrate specific for fibrinogen and cleaves four peptide bonds in fibrinogen, which is located between arginine and glycine residues, with optimal pH near neutral or weakly alkaline. This fibrin is entangled in a net shape, and with blood cells in it, it gets smaller as time goes by. A lump of blood cells is called a blood clot, and a transparent liquid that seeps out is called a serum. Blood coagulation is indispensable for maintaining life, and if there is no effect on the blood, the individual will not be able to coagulate even in small bleeding, eventually leading to death due to excessive bleeding. If the blood coagulates in the body, the blood circulation is not made. Accordingly, the heparin synthesized in the human liver suppresses the production of thrombin, or the blood is circulating in the blood or various endothelial cells Prevent clotting.

상기와 같은 단백질의 특성으로 색변화에 의한 컬러센서를 이용하여 단백질을 감지하려는 노력이 저분자와 고분자 물질을 사용하여 다양하게 시도되었다. 이들은 수용액 상태에서 양전하나 음전하의 이온성질을 갖고 반대 전하의 단백질이 접근할 때 회합을 통해 색이나 형광색의 변화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (S. W. Thomas III, G. D. Joly, T. M. Swager, Chem. Rev. 107, 1339, 2007).With the characteristics of the above-mentioned proteins, efforts to detect proteins using a color sensor by color change have been variously attempted using low molecular weight and high molecular weight materials. They are known to have a positive or negative charge ionic property in an aqueous solution and induce a change in color or fluorescence color through association when the opposite charge protein approaches (SW Thomas III, GD Joly, TM Swager, Chem. , 1339, 2007).

이제까지 연구된 대부분의 트롬빈 감지 방법은 색이나 형광색의 변화가 아닌 형광의 증가 및 감소의 형태로 측정한 것이 많다. 이러한 경우 매우 적은 농도 차이를 쉽게 구별할 수 없기 때문에 민감도 및 선택성의 문제를 갖는다. 또한, 트롬빈을 인지하는 리간드를 고분자 내에 도입하기 위한 합성 방법은 복잡하기 때문에 트롬빈 감지를 위한 단순화된 방법을 본 발명에서 제시하고자 한다. Most of the thrombin detection methods studied so far have been measured in the form of increasing or decreasing fluorescence, not changes in color or fluorescence. In this case, there is a problem of sensitivity and selectivity because very small concentration differences can not be easily distinguished. Also, because the synthetic method for introducing thrombin-recognizing ligand into the polymer is complex, a simplified method for thrombin detection is proposed in the present invention.

본 발명은 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 피브리노젠으로 이루어진 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for producing a water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen complex comprising a water-soluble fluorescent conjugated polymer compound having an ionic group and fibrinogen.

또한, 본 발명은 화학 및 바이오센서로서 넓은 응용이 가능한 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물을 이용하여, 고분자-피브리노젠의 회합체를 형성시키고, 이를 이용하여 트롬빈을 선택적으로 형광 검출하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.The present invention also relates to a method for forming a complex of polymer-fibrinogen by using a water-soluble fluorescent conjugated polymer compound having an ionic group capable of wide application as a chemical and biosensor, It is another purpose to provide a method.

본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 하기 화학식 1 또는 2의 중합단위를 가지는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물에 상호작용을 갖는 피브리노젠을 반응시켜, 정전기적인 상호작용 및 소수성 상호작용을 통하여 형성된 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법을 제공한다. According to a preferred embodiment of the present invention, a water-soluble fluorescent conjugated polymer having a polymerized unit represented by the following formula (1) or (2) is reacted with a fibrinogen having an interaction to form a water- Provided is a method for detecting selective fluorescence of thrombin using a conjugated polymer-fibrinogen conjugate.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112012090047681-pat00001
Figure 112012090047681-pat00001

[화학식 2](2)

Figure 112012090047681-pat00002
Figure 112012090047681-pat00002

(상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며 말단에 술폰산염 또는 트리(C1-C7)알킬암모늄염으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6-C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.)(Wherein R 1 and R 2 may be the same or different and are a straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a sulfonic acid salt or a tri (C 1 -C 7) alkylammonium salt at the terminal thereof; Ar A, b, c and d are mole ratios, a and c are 0.1, and b and d are 0.9.

또한, 상기 R1 및 R2의 알킬기의 말단은 서로 독립적으로 술폰산염, 트라이메틸암모늄염, 에틸다이메틸암모늄염, 다이에틸메틸암모늄염 또는 트라이에틸암모늄염으로 치환되고, 상기 Ar은 페닐렌인 것을 특징으로 한다.The terminal of the alkyl group of R 1 and R 2 is independently a sulfonate, a trimethylammonium salt, an ethyldimethylammonium salt, a diethylmethylammonium salt or a triethylammonium salt, and Ar is phenylene .

또한, 상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 수평균 분자량(Mn)이 3,000 내지 100,000인 것을 특징으로 한다.Further, the water-soluble fluorescent conjugated polymer compound has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 to 100,000.

본 발명의 다른 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체가 회합을 통하여 형광색 변화를 일으키는 트롬빈의 선택적 형광 검출방법을 제공한다.According to another preferred embodiment of the present invention, there is provided a selective fluorescence detection method of thrombin in which the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate causes fluorescent color change through association.

또한, 상기 트롬빈의 선택적 형광 검출방법은 형광광도계를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 한다.In addition, the selective fluorescence detection method of thrombin is characterized in that it is measured using a fluorescence photometer.

본 발명에 따른 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 바탕으로 하는 감지 시스템은 트롬빈에 대한 인지물질로 사용할 수 있다. 피브리노젠의 경우 7.1의 등전점을 가지고 있어 중성 상태에서 양전하를 갖기 때문에, 음이온성 수용성 형광 공액화 고분자와 정전기적 결합을 통하여 회합체가 형성될 수 있다. 양이온성 고분자의 경우, 고분자의 주쇄의 소수성기와 피브리노젠의 소수성 결합을 통하여 회합체가 형성된다. 하지만, 어느 경우나 피브리노젠의 농도가 매우 낮아서 고분자의 형광색 변화를 유도할 수는 없다. 여기에 추가적으로 첨가하는 타겟 물질인 트롬빈은 회합체를 이루고 있는 피브리노젠을 분해하여 불용성 피브린을 형성하기 때문에 비로소 형광색을 장파장(녹색 또는 적색)으로 변화시킴에 따라 효율적인 형광 화학/바이오 센서로서 트롬빈을 감지할 수 있다. The detection system based on the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate having an ionic group according to the present invention can be used as a cognitive substance for thrombin. Since fibrinogen has an isoelectric point of 7.1 and has a positive charge in the neutral state, a conjugate can be formed through electrostatic bonding with an anionic water-soluble fluorescent conjugated polymer. In the case of a cationic polymer, a complex is formed through the hydrophobic bonding of the hydrophobic group of the main chain of the polymer and the fibrinogen. However, in either case, the concentration of fibrinogen is so low that it can not induce a change in the fluorescence of the polymer. Thrombin, which is a target substance to be added additionally, decomposes fibrinogen constituting the complex to form insoluble fibrin. Therefore, as fluorescence is changed into a long wavelength (green or red), effective thrombin as a fluorescent chemical / biosensor Can be detected.

지금까지 기술한 본 발명의 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체는 화학센서 재료, 바이오센서 재료 등 다양한 기술 분야에 응용이 가능하며, 특히 상호 물질간 공유결합이 아닌 피브리노젠과는 정전기적인 상호 작용 또는 소수성 상호작용을 이용한 센서 기능에 부합되는 응답성, 선택성을 갖고 있다.The water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate of the present invention described above can be applied to various technical fields such as chemical sensor materials, biosensor materials, and the like. Especially, the fibrinogen, which is not a covalent bond between mutual substances, And has responsiveness and selectivity in accordance with the sensor function using hydrophobic interactions or hydrophobic interactions.

본 발명은 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물과 피브리노젠의 상호작용을 이용한 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체의 제조 및 이를 이용한 수용액 상에서 트롬빈의 선택적 형광 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-피브리노젠 회합체를 형성하여 트롬빈의 농도에 따라 상기 고분자 화합물의 형광 색상이 변화하는 형광센서에 관한 것이다. The present invention relates to a process for preparing a water-soluble fluorescent conjugated conjugated polymer-fibrinogen complex using an interaction between a water-soluble fluorescent conjugated polymer compound having an ionic group and fibrinogen, and a method for detecting selective fluorescence of thrombin in an aqueous solution thereof, More particularly, the present invention relates to a fluorescence sensor in which the fluorescence color of the polymer is changed according to the concentration of thrombin by forming a water-soluble fluorescent conjugated conjugated polymer-fibrinogen conjugate having an ionic group.

본 발명에 사용한 상기 이온성기를 갖는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 하기 화학식 1 및 2에서 선택되는 중합단위를 가지고 있다.The water-soluble fluorescent conjugated polymer compound having an ionic group used in the present invention has a polymerized unit selected from the following formulas (1) and (2).

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112012090047681-pat00003
Figure 112012090047681-pat00003

[화학식 2](2)

Figure 112012090047681-pat00004
Figure 112012090047681-pat00004

(상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며 말단에 술폰산염 또는 트리(C1-C7)알킬암모늄염으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6-C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.)(Wherein R 1 and R 2 may be the same or different and are a straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a sulfonic acid salt or a tri (C 1 -C 7) alkylammonium salt at the terminal thereof; Ar A, b, c and d are mole ratios, a and c are 0.1, and b and d are 0.9.

상기 R1 및 R2의 알킬기의 말단은 서로 독립적으로 구체적으로 술폰산염, 트라이메틸암모늄염, 에틸다이메틸암모늄염, 다이에틸메틸암모늄염, 트라이에틸암모늄염으로부터 선택되거나 조합하여 선택하는 것을 포함한다. 또한 R1 및 R2의 알킬기는 서로 독립적으로 메틸, 에틸, i-프로필, n-프로필, i-부틸, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸 또는 n-헥실로부터 선택되어지며, 상기 Ar은 2가의 페닐렌이다. 상기 수용성 형광 공액화 고분자의 분자량은 원칙적으로 제한이 없으나, 수평균 분자량(Mn)으로 3,000 내지 100,000이 바람직하고, 그 용도에 요구되는 특성에 따라 그 범위를 적절히 조절하여 사용할 수 있다.The terminals of the alkyl groups of R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of a sulfonate, a trimethylammonium salt, an ethyldimethylammonium salt, a diethylmethylammonium salt and a triethylammonium salt. The alkyl groups of R 1 and R 2 are independently selected from methyl, ethyl, i-propyl, n-propyl, i-butyl, n-butyl, t- butyl, n-pentyl, And Ar is divalent phenylene. Although the molecular weight of the water-soluble fluorescent conjugated polymer is not limited in principle, it is preferably 3,000 to 100,000 as the number average molecular weight (Mn), and the range can be appropriately adjusted depending on the properties required for its application.

상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 벤조싸이아다이아졸 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸을 에너지 받개로 사용하고 페닐렌을 에너지 주개로 사용하여 회합에 따라 형광색의 변화가 다르게 나타나는 특징을 갖는다. 본 발명에서 사용한 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 본 발명자에 의하여 출원된 대한민국 특허 출원번호 10-2008-0103701에 기재되어 있고, 에너지 주개와 받개의 종류와 비율을 달리하여 회합에 의한 형광의 변화가 나타나는 특징을 가진다. The water-soluble fluorescent conjugated polymer compound represented by the above formula (1) or (2) can be prepared by using a benzothiazole or bisthienylbenzothiazole as an energy receiver and using phenylene as an energy source to change the fluorescence Have different characteristics. The water-soluble fluorescent conjugated polymeric compound used in the present invention is described in Korean Patent Application No. 10-2008-0103701 filed by the present inventor, and the fluorescence of the fluorescent fluorescent conjugated polymer compound .

상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 수용액 상태에서는 고분자 화합물 내에 90%를 차지하는 큰 에너지 밴드갭을 갖는 페닐렌 구조의 단파장 형광(청색)만이 나타나는 반면, 고체 상태로 회합이 일어나면 10%를 차지하는 작은 에너지 밴드갭을 갖는 벤조싸이아다이아졸 혹은 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸로 엑시톤의 이동이 활발해져 장파장 형광(녹색 또는 적색)이 나타난다.The water-soluble fluorescent conjugated polymer compound exhibits only short-wavelength fluorescence (blue) of phenylene structure having a large energy band gap occupying 90% in the polymer compound in an aqueous solution state, whereas a small energy band A long wavelength fluorescence (green or red) appears because the migration of the benzothiadiazole having a gap or the bisthienylbenzothiadiazole exciton becomes active.

상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 또는 이를 구성 성분으로 하는 화학센서는 트롬빈을 검출하는데 유용하다. 상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 피브리노젠과 상호작용을 하여 회합체를 형성한다. 그리고 상기의 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체에 트롬빈을 첨가하면 수용성의 피브리노젠을 구성하는 아미노산 중 아르지닌과 글리신 잔기 사이에서 효소분해거동이 유발되어 불용성의 피브린으로의 변화한다. 따라서 트롬빈 첨가로 인하여 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체가 불용성의 고분자-피브린 회합체로 변화가 일어나고, 이에 따라 수용액에서 고분자의 용해도가 감소되어 단파장 형광을 나타내었던 고분자가 장파장 형광을 발현하게 되며, 이를 트롬빈 감지 신호로 사용할 수 있다.
The water-soluble fluorescent conjugated polymer compound or a chemical sensor comprising the same is useful for detecting thrombin. The water-soluble fluorescent conjugated polymer compound interacts with fibrinogen to form a complex. When thrombin is added to the above water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen complex, enzymatic degradation behavior between arginine and glycine residue in the amino acid constituting the water-soluble fibrinogen is induced and changes to insoluble fibrin. As a result, the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate was changed into an insoluble polymer-fibrin aggregate due to the addition of thrombin. As a result, the polymer exhibiting short-wavelength fluorescence exhibited long wavelength fluorescence , Which can be used as a thrombin sensing signal.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 하지만 본 실시예에서 사용한 고분자 화합물에 국한된 것은 아니며, 엑시톤 이동에 의하여 수용액 상태의 형광색과 회합체 상태에서의 형광색이 서로 다른 광학적 성질을 갖는 에너지 주개와 받개가 같은 분자쇄 내에 존재하는 고분자 화합물이면 가능하다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the polymer compound used in the present embodiment, but may be a polymer compound in which the fluorescent color of the aqueous solution and the fluorescent color of the conjugate state are different from each other due to the exciton migration, Do.

[제조예] 수용성 형광 공액화 고분자 화합물의 제조 [Preparation Example] Preparation of water-soluble fluorescent conjugated high-molecular compound

[제조예 1] 화학식 1의 벤조싸이아다이아졸계 고분자 화합물 (R[Preparation Example 1] Synthesis of benzothiazole-based polymer (R 1One =R= R 22 =4-술포네이토부틸, Ar=1,4-페닐렌)의 제조= 4-sulfonatobutyl, Ar = 1,4-phenylene)

4,7-다이브로모-2,1,3-벤조싸이아다이아졸 26.5 mg (0.090 mmol)과 1,4-다이브로모-2,5-비스(4-술포네이토부톡시)벤젠소디움염 474.4 mg (0.812 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 297.7 mg (0.902 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 6 mL의 DMF와 9 mL의 2M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 90 ℃에서 48시간동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 500 mL의 부피비가 10:40:50인 메탄올/아세톤/에테르 혼합 용액에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 3차 증류수에 녹인 후 삼투막을 이용한 여과로 분자량이 12,400이상인 화학식 1의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석 한 결과 a는 10%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다. A mixture of 26.5 mg (0.090 mmol) of 4,7-dibromo-2,1,3-benzothiadiazole and 474.4 mg of 1,4-dibromo-2,5-bis (4-sulfonato butoxy) benzenesodium salt (0.007 mmol) of tetrakis (triphenylphosphine) palladium catalyst, 297.7 mg (0.902 mmol) of 1,4-benzene diboronic acid bis (pinacol) ester, Of DMF and 9 mL of a 2M Na 2 CO 3 mixed solution and refluxed at 90 ° C for 48 hours. After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and poured into a methanol / acetone / ether mixed solution having a volume ratio of 500: 10: 40: 50 to precipitate crystals. The solid obtained by filtration was dissolved in tertiary distilled water and filtered through an osmotic membrane to obtain a polymer of Formula 1 having a molecular weight of 12,400 or more. As a result of elemental analysis, a was found to account for 10% of the mole fraction.

1H NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1~7.3(2H, 방향족), 7.2~6.7(2H, 방향족), 3.9(4H, 알킬기), 2.8(4H, 알킬기), 1.7~1.3(7.8H, 알킬기) ppm.
 1 H NMR (300 MHz, D 2 O) δ = 8.1 ~ 7.3 (2H, aromatic), 7.2 ~ 6.7 (2H, aromatic), 3.9 (4H, alkyl), 2.8 (4H, alkyl), 1.7 ~ 1.3 (7.8 H, alkyl group) ppm.

[제조예 2] 화학식 1의 벤조싸이아다이아졸계 고분자 화합물 (R[Preparation Example 2] Synthesis of benzothiadiazole-based polymer (R 1One =R= R 22 =3-N,N,N-트라이메틸암모니움프로필. Ar=1,4-페닐렌)의 제조 = 3-N, N, N-trimethylammonium propyl. Ar = 1,4-phenylene)

4,7-다이브로모-2,1,3-벤조싸이아다이아졸 26.5 mg (0.090 mmol)과 1,4-비스(3-브로모프로폭시)-2,5-다이브로모벤젠 414 mg (0.812 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 356.2 mg (1.08 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 9 mL의 톨루엔과 4.5 ml의 2M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 90 ℃에서 48시간동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 200 ml의 메탄올에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하고 얻어진 고체를 아세톤 200 ml에 수세한 후 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 THF 10 ml에 녹인 후 -78 ℃로 냉각시킨 후 트라이메틸아민 4 ml를 천천히 넣어주었다. 반응용액의 온도를 상온으로 승온시킨 후 6시간동안 교반한 후 아세톤 200 ml에 부어 석출하였다. 석출된 고체를 3차 증류수에 녹인 후 삼투막을 이용한 여과로 분자량이 12,400이상인 화학식 1의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석 한 결과 a는 10%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다. A mixture of 26.5 mg (0.090 mmol) of 4,7-dibromo-2,1,3-benzothiadiazole and 414 mg (0.812 mmol) of 1,4-bis (3-bromopropoxy) 356.2 mg (1.08 mmol) of 1,4-benzene diboronic acid bis (pinacol) ester and 3.5 mg (0.003 mmol) of tetrakis (triphenylphosphine) palladium catalyst were dissolved in 9 mL of toluene And 4.5 ml of a mixed solution of 2M Na 2 CO 3 and refluxed at 90 ° C for 48 hours. After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and poured into 200 ml of methanol to precipitate crystals. The precipitate was filtered, and the obtained solid was washed with 200 ml of acetone and then filtered. The solid obtained by filtration was dissolved in 10 ml of THF, cooled to -78 ° C, and 4 ml of trimethylamine was slowly added thereto. The temperature of the reaction solution was raised to room temperature, stirred for 6 hours, and then poured into 200 ml of acetone to precipitate. The precipitated solid was dissolved in tertiary distilled water and filtered through an osmotic membrane to obtain a polymer of Formula 1 having a molecular weight of 12,400 or more. As a result of elemental analysis, a was found to account for 10% of the mole fraction.

1H NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1~7.3(2H, 방향족), 7.2~6.7(2H, 방향족), 4.1(4H, 알킬기), 3.8~3.2(6H, 알킬기), 2.9(4H, 알킬기), 1.7(4H, 알킬기) ppm.
 1 H NMR (300 MHz, D 2 O) δ = 8.1 ~ 7.3 (2H, aromatic), 7.2 ~ 6.7 (2H, aromatic), 4.1 (4H, alkyl), 3.8 ~ 3.2 (6H, alkyl), 2.9 (4H , Alkyl group), 1.7 (4H, alkyl group) ppm.

[제조예 3] 화학식 2의 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계 고분자 화합물 (R[Preparation Example 3] A bisthienylbenzothiazole-based polymer (R 1One =R= R 22 =4-술포네이토부틸, Ar=1,4-페닐렌)의 제조= 4-sulfonatobutyl, Ar = 1,4-phenylene)

4,7-비스(5-브로모싸이오펜-2-일)벤조-2,1,3-싸이아다이아졸 21.6 mg (0.057 mmol)과 1,4-다이브로모-2,5-비스(4-술포네이토부톡시)벤젠소디움염 300.0 mg (0.514 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 188.0 mg (0.571 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 8 mL의 DMF와 12 mL의 2M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 100 ℃에서 48시간동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 500 ml의 부피비가 10:40:50인 메탄올/아세톤/에테르 혼합 용액에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 3차 증류수에 녹인 후 삼투막을 이용한 여과로 분자량이 12,400이상인 화학식 2의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석 한 결과 c는 8%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다. 21.6 mg (0.057 mmol) of 4,7-bis (5-bromothiophen-2-yl) benzo-2,1,3-thiadiazole and 1,4-dibromo-2,5- (Triphenylphosphine) palladium catalyst (300 mg, 0.514 mmol), 188.0 mg (0.571 mmol) of 1,4-benzene diboronic acid bis (pinacol) ester, and 3.5 mg (0.003 mmol) were dissolved in a mixed solution of 8 mL of DMF in which moisture was removed and 12 mL of 2M Na 2 CO 3 and refluxed at 100 ° C for 48 hours. After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and poured into a mixed solvent of methanol / acetone / ether having a volume ratio of 500: 10: 40: 50 to precipitate crystals. The solid obtained by filtration was dissolved in tertiary distilled water and filtered through an osmotic membrane to obtain a polymer of formula (2) having a molecular weight of 12,400 or more. As a result of elemental analysis, c was found to account for 8% of the mole fraction.

1H NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1~7.3(3.1H, 방향족), 7.2~6.7(2H, 방향족), 4.0(2.8H, 알킬기), 3.0(3H, 알킬기), 2.0~1.5(5H, 알킬기) ppm.
 1 H NMR (300 MHz, D 2 O) δ = 8.1 ~ 7.3 (3.1H, aromatic), 7.2 ~ 6.7 (2H, aromatic), 4.0 (2.8H, alkyl), 3.0 (3H, alkyl), 2.0 ~ 1.5 (5H, alkyl group) ppm.

[제조예 4] 화학식 2의 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계 고분자 화합물 (R[Preparation Example 4] A bisthienylbenzothiazole-based polymer (R 1One =R= R 22 =3-N,N,N-트라이메틸암모니움프로필, Ar=1,4-페닐렌)의 제조 = 3-N, N, N-trimethylammonium propyl, Ar = 1,4-phenylene)

4,7-비스[5-(4,4,5,5,-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로레인-2-일)싸이오펜-2-일]벤조-2,1,3-싸이아다이아졸 41.2 mg (0.090 mmol)과 1,4-비스(3-브로모프로폭시)-2,5-다이브로모벤젠 414 mg (0.812 mmol)과 1,4-벤젠다이보론산비스(피나콜)에스터 356.2 mg (1.08 mmol), 그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 촉매 3.5 mg (0.003 mmol)을 습기가 제거된 9 mL의 톨루엔과 4.5 ml의 2M Na2CO3 혼합용액에 용해시키고 100 ℃에서 48시간동안 환류하였다. 반응 후 상온으로 냉각하고 200 ml의 메탄올에 부어 결정을 석출시킨 다음 석출물을 여과하고 얻어진 고체를 아세톤 200 ml에 수세한 후 여과하였다. 여과하여 얻어진 고체를 THF 10 ml에 녹인 후 -78 ℃로 냉각시킨 후 트라이메틸아민 4 ml를 천천히 넣어주었다. 반응용액의 온도를 상온으로 승온시킨 후 6시간동안 교반한 후 아세톤 200 ml에 부어 석출하였다. 석출된 고체를 3차 증류수에 녹인 후 삼투막을 이용한 여과로 분자량이 12,400이상인 화학식 2의 고분자를 얻었다. 이를 원소분석 한 결과 c는 10%의 몰분율을 차지하는 것을 알 수 있었다.4,7-bis [5- (4,4,5,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane-2-yl) thiophen- (419 mg, 0.090 mmol), 1,4-bis (3-bromopropoxy) -2,5-dibromobenzene 414 mg (0.812 mmol) and 1,4- benzene diboronic acid bis (3.58 mg, 1.08 mmol) and 3.5 mg (0.003 mmol) of tetrakis (triphenylphosphine) palladium catalyst were dissolved in a mixed solution of 9 mL of dehumidified toluene and 4.5 mL of 2M Na 2 CO 3 0.0 > 100 C < / RTI > for 48 hours. After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and poured into 200 ml of methanol to precipitate crystals. The precipitate was filtered, and the obtained solid was washed with 200 ml of acetone and then filtered. The solid obtained by filtration was dissolved in 10 ml of THF, cooled to -78 ° C, and 4 ml of trimethylamine was slowly added thereto. The temperature of the reaction solution was raised to room temperature, stirred for 6 hours, and then poured into 200 ml of acetone to precipitate. The precipitated solid was dissolved in tertiary distilled water and filtered through an osmotic membrane to obtain a polymer of Formula 2 having a molecular weight of 12,400 or more. As a result of elemental analysis, it was found that c occupies 10% mole fraction.

1H NMR(300 MHz, D2O) δ=8.1~7.3(3.1H, 방향족), 7.2~6.7(2H, 방향족), 4.0(2.8H, 알킬기), 3.7~3.2(4.7H, 알킬기), 3.0(3H, 알킬기), 2.0(3.1H, 알킬기) ppm.
 1 H NMR (300 MHz, D 2 O)? = 8.1-7.3 (3.1H, aromatic), 7.2-6.7 (2H, aromatic), 4.0 (2.8H, alkyl group), 3.7-3.2 3.0 (3H, alkyl group), 2.0 (3.1H, alkyl group) ppm.

[실시예] 트롬빈 센서로 성능 평가[Example] Performance evaluation with thrombin sensor

[실시예 1] 벤조싸이아다이아졸 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸을 포함하고 양이온성을 띄는 고분자 화합물을 이용한 트롬빈의 검출[Example 1] Detection of thrombin using a polymer compound having a benzothiadiazole or bisthienylbenzothiadiazole and having a cationic property

제조예 2와 제조예 4에서 제조된 벤조싸이아다이아졸계 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계을 포함하고 양이온성을 띄는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-피브리노젠 회합체의 트롬빈에 대한 화학적 검출 능력을 확인하기 위하여, 상기 고분자 화합물의 농도범위를 각각 증류수에 녹여 0에서 1.0×10-5 몰농도, 피브리노젠의 농도범위를 0에서 5.0×10-5 몰농도로 정했으며, 가장 좋기로는 고분자 농도범위는 5.0×10-5에서 5.0×10-4 몰농도, 피브리노젠 농도범위는 5.0×10-8에서 5.0×10-7 몰농도이다. The chemical detection ability of thrombin of the water-soluble fluorescent conjugated polymeric compound-fibrinogen conjugate containing the benzothiazole-based or bisthienylbenzothiadiazole-based system produced in Production Example 2 and Production Example 4 The concentration range of the polymer compound was dissolved in distilled water and the concentration range of 0 to 1.0 × 10 -5 mol and the concentration of fibrinogen was set at 0 to 5.0 × 10 -5 molar concentration, The polymer concentration range is 5.0 × 10 -5 to 5.0 × 10 -4 molar concentration, and the fibrinogen concentration range is 5.0 × 10 -8 to 5.0 × 10 -7 molar concentration.

최적의 고분자와 피브리노젠의 농도범위를 확인 후, 피브리노젠의 농도가 1.0×10-7 몰농도일 때 트롬빈을 3.3×10-7 몰농도 첨가 시, 트롬빈을 넣지 않았을 때와 비교하여 제조예 2의 화합물을 이용한 고분자-피브리노젠 회합체는 416 nm의 청색형광이 2.59배 증가하고, 530 nm의 녹색형광이 3.8×10-5배 증가하였으며, 제조예 4의 화합물을 이용한 고분자-피브리노젠 회합체는 417 nm의 청색형광이 2.6배 증가하고, 612 nm의 적색형광이 6.5×10-5배 증가하였다. 즉, 고분자에 회합되어 있던 피브리노젠을 구성하고 있는 아미노산 중 아르지닌과 글리신 잔기 부분이 첨가되는 트롬빈에 의하여 절단되면서 불용성의 피브린으로 변하여 고분자-피브린 회합체가 형성되고, 이 회합체의 물에 대한 용해성이 상대적으로 낮아져 장파장으로 형광색이 변화하는 것을 확인하였다. 트롬빈의 농도가 증가할수록 단파장 형광 (청색)에서 장파장 형광 (녹색 또는 적색)으로 형광색의 변화가 나타났으며, 이는 육안으로도 식별이 가능하였다.
After confirming the concentration range of the optimum polymer and fibrinogen, when the concentration of fibrinogen was 1.0 × 10 -7 molar concentration, when thrombin was added at 3.3 × 10 -7 molar concentration, The polymer-fibrinogen conjugate using the compound of Example 2 showed 2.59-fold increase in blue fluorescence at 416 nm and 3.8 -10 -5- fold increase in green fluorescence at 530 nm. The brinogen complex increased the blue fluorescence of 417 nm by 2.6 times and the red fluorescence of 612 nm by 6.5 × 10 -5 times. That is, the arginine and the glycine residue in the amino acid constituting the fibrinogen associated with the polymer are transformed into insoluble fibrin by truncation by thrombin to which the glycine residue is added to form a polymer-fibrin assembly, The solubility was relatively lowered and the fluorescent color was changed to a long wavelength. As the concentration of thrombin increased, the change in fluorescence from short wavelength fluorescence (blue) to long wavelength fluorescence (green or red) appeared, which could be visually recognized.

상기의 트롬빈의 검출을 위한 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체들의 고분자-피브린 회합체로의 변화에 따른 형광색의 변화는 고분자의 농도를 1.0×10-4 몰로 피브리노젠의 농도를 3.3×10-7 몰농도로 유지하고 트롬빈의 농도를 0에서 3.3×10-7 몰농도로 조절하여 제조예 2와 제조예 4를 이용한 고분자-피브리노젠 회합체의 형광색의 변화를 측정한 결과, 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체와 반응할 수 있는 트롬빈의 농도가 많이 설정될수록 단파장 형광에서 장파장 형광으로의 변화가 나타났다.
The change in fluorescence color due to the change of the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen complexes to the polymer-fibrin associates for the detection of the thrombin was 1.0 × 10 -4 mol / mol and the concentration of fibrinogen was 3.3 × maintained at 10-7 molar concentration, and the concentration of thrombin at 0 3.3 × 10 -7 mol polymer with Preparation example 2 and Preparation example 4 to adjust the concentration-P brie nojen times a result of measuring the change in fluorescence of the copolymer, water-soluble Changes in short wavelength fluorescence to long wavelength fluorescence were observed as the concentration of thrombin capable of reacting with the conjugated polymer - fibrinogen complex increased.

[실시예 2] 벤조싸이아다이아졸 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸을 포함하고 음이온성을 띄는 고분자 화합물을 이용한 트롬빈의 검출[Example 2] Detection of thrombin using a polymer compound having an anionic property including a benzothiadiazole or a bisthienylbenzothiadiazole

제조예 1과 제조예 3에서 제조된 벤조싸이아다이아졸계 또는 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계을 포함하고 음이온성을 띄는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-피브리노젠 회합체의 트롬빈에 대한 화학적 검출 능력을 확인하기 위하여, 상기 고분자 화합물의 농도범위를 각각 증류수에 녹여 0에서 1.0×10-5 몰농도, 피브리노젠의 농도범위를 0에서 5.0×10-5 몰농도로 정했으며, 가장 좋기로는 고분자 농도범위는 5.0×10-5에서 5.0×10-4 몰농도, 피브리노젠 농도범위는 5.0×10-8에서 5.0×10-7 몰농도이다.The chemical detection ability of thrombin of a water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate containing an anion-containing benzothiazole-based or bisthienylbenzothiadiazole-based system prepared in Preparation Example 1 and Preparation Example 3 The concentration range of the polymer compound was dissolved in distilled water and the concentration range of 0 to 1.0 × 10 -5 mol and the concentration of fibrinogen was set at 0 to 5.0 × 10 -5 molar concentration, The polymer concentration range is 5.0 × 10 -5 to 5.0 × 10 -4 molar concentration, and the fibrinogen concentration range is 5.0 × 10 -8 to 5.0 × 10 -7 molar concentration.

최적의 고분자와 피브리노젠의 농도범위를 확인 후, 피브리노젠의 농도가 1.0×10-7몰농도 일 때, 트롬빈의 3.3×10-7 몰농도 첨가 시, 트롬빈을 넣지 않았을 때와 비교하여 제조예 1 화합물을 이용한 고분자-피브리노젠 회합체는 417 nm의 청색형광이 2.6배 증가하고, 530 nm의 녹색형광이 2.8×10-5배 증가하였으며 제조예 3의 화합물을 이용한 고분자-피브리노젠 회합체는 417 nm의 청색형광이 3.1배 증가하고, 623 nm의 적색형광이 3.7×10-5배 증가하였다. 즉, 고분자에 회합되어 있던 피브리노젠이 트롬빈의 첨가에 의하여 불용성의 피브린으로 변하게 되고 트롬빈의 농도가 증가할수록 단파장 형광(청색)에서 장파장 형광(녹색 또는 적색)으로 형광색의 변화가 나타났으며, 이는 육안으로도 식별이 가능하였다.
After confirming the concentration range of the optimum polymer and fibrinogen, when the concentration of fibrinogen was 1.0 × 10 -7 mol, the addition of thrombin at a concentration of 3.3 × 10 -7 mol, The polymer-fibrinogen conjugate using the compound of Preparation Example 1 exhibited a 2.6-fold increase in blue fluorescence at 417 nm and a 2.8 × 10 -5- fold increase in green fluorescence at 530 nm. The polymer-fibrinogen complex using the compound of Preparation Example 3 In the case of the non-aggregate, the blue fluorescence at 417 nm increased 3.1 times and the red fluorescence at 623 nm increased 3.7 × 10 -5 times. That is, the fibrinogen associated with the polymer changed into insoluble fibrin due to the addition of thrombin. As the concentration of thrombin increased, fluorescence changed from short-wavelength fluorescence (blue) to long-wavelength fluorescence (green or red) This could be identified with the naked eye.

상기의 트롬빈의 검출을 위한 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠의 고분자-피브린으로의 변화에 따른 형광색의 변화는 고분자의 농도를 1.0×10-4 몰농도로 피브리노젠의 농도를 1.0×10-7몰농도로 유지하고 트롬빈의 농도를 0에서 3.3×10-7 몰농도로 조절하여 제조예 1과 제조예 3을 이용한 고분자-피브리노젠 회합체의 형광색의 변화를 측정한 결과, 음이온성 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체와 반응할 수 있는 트롬빈의 농도가 많이 설정될수록 단파장 형광에서 장파장 형광으로의 변화가 나타났다.
The change in fluorescence color due to the change of the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen to the polymer-fibrin for the detection of thrombin was determined by measuring the concentration of the polymer at 1.0 × 10 -4 molar concentration and the concentration of fibrinogen at 1.0 × 10 4 -7 molar concentration, and the concentration of thrombin was adjusted from 0 to 3.3 × 10 -7 molar, the change in fluorescence color of the polymer-fibrinogen conjugate using Preparation Example 1 and Preparation Example 3 was measured. As a result, As the concentration of thrombin capable of reacting with the water - soluble fluorescent conjugated polymer - fibrinogen complex increased, the change from short wavelength fluorescence to long wavelength fluorescence appeared.

[비교예] 다른 분해 효소에 대한 감지 성능 평가[Comparative Example] Evaluation of detection performance for other degrading enzymes

본 발명의 트롬빈 검출의 선택성을 확인하기 위하여 트롬빈 사용 대신 같은 몰농도의 펩신, 트립신, 그리고 글루코오스 산화 효소를 사용하였다. 제조예 1, 제조예 2, 제조예 3 및 제조예 4에서 제조된 비스싸이에닐벤조싸이아다이아졸계 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-피브리노젠 회합체를 제조하고, 펩신, 트립신 또는 글루코오스 산화 효소를 첨가하여 형광을 관찰하였다. 상기 수용성 형광 공액화 고분자에 피브리노젠을 용해시켜 회합체를 제조한 후, 펩신, 트립신 또는 글루코오스 산화 효소를 첨가하여 배양하였다. 그 결과 펩신, 트립신 또는 글루코오스 산화 효소를 이용한 수용성 형광 공액화 고분자 화합물-피브리노젠 417 nm의 청색형광은 각각 2.21, 2.04 및 2.34배 증가하였으며, 633 nm의 적색형광은 변화가 없어 펩신, 트립신과 글루코오스 산화 효소의 농도의 증가에 따른 청색형광에서 적색형광으로의 색변화가 나타나지 않았다.
To confirm the selectivity of thrombin detection of the present invention, pepsin, trypsin and glucose oxidase of the same molar concentration were used instead of using thrombin. The biscyanenylbenzothiazole-based water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate prepared in Preparation Example 1, Preparation Example 2, Preparation Example 3 and Preparation Example 4 was prepared, and pepsin, trypsin or glucose oxidase And fluorescence was observed. The fibrinogen was dissolved in the water-soluble fluorescent conjugated polymer to prepare a conjugate, followed by the addition of pepsin, trypsin or glucose oxidase. As a result, blue fluorescence of 417 nm of water soluble fluorescent conjugated polymer with pepsin, trypsin or glucose oxidase was increased by 2.21, 2.04 and 2.34 times, respectively. Red fluorescence of 633 nm was not changed and pepsin, trypsin There was no color change from blue fluorescence to red fluorescence with increasing concentration of glucose oxidase.

이상의 결과로 보아 제조된 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체는 트롬빈의 존재와 농도에 따라 형광색의 변화가 나타나는, 트롬빈에 대하여 선택적인 화학/바이오센서로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다. From the above results, it was confirmed that the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate prepared according to the present invention can be used as a selective chemistry / biosensor for thrombin, which exhibits a change in fluorescence color depending on the presence and concentration of thrombin.

Claims (6)

하기 화학식 1 또는 2의 중합단위를 가지는 수용성 형광 공액화 고분자 화합물 5.0×10-5 내지 5.0×10-4 몰 농도에 상호작용을 갖는 피브리노젠 5.0×10-8 내지 5.0×10-7 몰 농도를 반응시켜, 정전기적인 상호작용 및 소수성 상호작용을 통하여 형성된 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체가 회합을 통하여 형광색 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법.
[화학식 1]
Figure 112014037582903-pat00005

[화학식 2]
Figure 112014037582903-pat00006

(상기 화학식 1 내지 2에서, R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며 말단에 술폰산염 또는 트리(C1-C7)알킬암모늄염으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1 내지 C6의 알킬기이고; Ar은 (C6-C20)아릴렌이고; a, b, c 및 d는 몰분율로, a 및 c는 0.1이고, b 및 d는 0.9이다.)To the water-soluble fluorescent ball liquefied polymer compound 5.0 × 10 -5 to 5.0 × 10 -4 with a molar concentration in blood interaction debris nojen 5.0 × 10 -8 to 5.0 × 10 -7 mol concentration having a polymerization unit of the formula (I) or (II) Wherein the water-soluble fluorescent conjugated conjugated polymer-fibrinogen conjugate formed through electrostatic interaction and hydrophobic interaction causes a change in fluorescence color through association with the water-soluble fluorescent conjugated polymer-fibrinogen conjugate, Selective fluorescence detection method using thrombin.
[Chemical Formula 1]
Figure 112014037582903-pat00005

(2)
Figure 112014037582903-pat00006

(Wherein R 1 and R 2 may be the same or different and are a straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms substituted with a sulfonic acid salt or a tri (C 1 -C 7) alkylammonium salt at the terminal thereof; Ar A, b, c and d are mole ratios, a and c are 0.1, and b and d are 0.9. 청구항 1에 있어서,
상기 R1 및 R2의 알킬기의 말단은 서로 독립적으로 술폰산염, 트라이메틸암모늄염, 에틸다이메틸암모늄염, 다이에틸메틸암모늄염 또는 트라이에틸암모늄염으로 치환되는 것을 특징으로 하는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법.
The method according to claim 1,
Wherein the ends of the alkyl groups of R 1 and R 2 are independently of each other substituted with a sulfonic acid salt, a trimethylammonium salt, an ethyldimethylammonium salt, a diethylmethylammonium salt or a triethylammonium salt. Selective Fluorescence Detection Method of Thrombin Using.
청구항 1에 있어서,
상기 Ar은 페닐렌인 것을 특징으로 하는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법.
The method according to claim 1,
Wherein Ar is phenylene. A method for detecting selective fluorescence of thrombin using the water-soluble fluorescent conjugated conjugated polymer-fibrinogen conjugate.
청구항 1에 있어서,
상기 수용성 형광 공액화 고분자 화합물은 수평균 분자량(Mn)이 3,000 내지 100,000인 것을 특징으로 하는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법.
The method according to claim 1,
Wherein the water-soluble fluorescent conjugated polymer compound has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 to 100,000.
삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 트롬빈의 선택적 형광 검출방법은 형광광도계를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 수용성 형광 공액화 고분자-피브리노젠 회합체를 이용한 트롬빈의 선택적 형광 검출방법.The method according to claim 1,
Wherein the method for detecting selective fluorescence of thrombin is measured using a fluorescence photometer. 2. The method of claim 1, wherein the selective fluorescence detection of thrombin is performed using a fluorescence spectrophotometer.
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KR20120025226A (en) * 2010-09-07 2012-03-15 인천대학교 산학협력단 A kit for detecting target comprising thrombin marker

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