KR101394344B1 - Atbrn gene modulating flowering time of plant and uses thereof - Google Patents

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KR101394344B1 KR1020130015905A KR20130015905A KR101394344B1 KR 101394344 B1 KR101394344 B1 KR 101394344B1 KR 1020130015905 A KR1020130015905 A KR 1020130015905A KR 20130015905 A KR20130015905 A KR 20130015905A KR 101394344 B1 KR101394344 B1 KR 101394344B1
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최상봉
김형세
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명지대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to: a method of modulating the flowering time of a plant body including a step of adjusting the expression of AtBRN genes by transforming a recombinant vector including a gene encoding AtBRN (arabidopsis thaliana bruno RNA-binding protein) protein derived from Arabidopsis thaliana on plant cells; a production method of the transformant plant body with the modulated flowering time by the method; the transformant plant body with the modulated flowering time produced by the production method; and a composition for modulating the flowing time of the plant body containing seeds and the recombinant vector as effective components.

Description

식물체의 개화시기를 조절하는 AtBRN 유전자 및 이의 용도{AtBRN gene modulating flowering time of plant and uses thereof}[0001] The AtBRN gene which regulates flowering time of a plant and the use thereof [0002]

본 발명은 식물의 개화시기를 조절하는 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA binding protein) 유전자 및 그 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 개화시기가 조절된 형질전환 식물체 및 종자 및 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 개화시기 조절용 조성물에 관한 것이다. The invention AtBRN (Arabidopsis thaliana Bruno RNA binding protein) of the Arabidopsis thaliana derived to control the flowering time of a plant gene, and relates to its use, by more specifically to transform a recombinant vector containing the gene into a plant cell AtBRN A method for regulating the flowering time of a plant including a step for controlling the expression of a gene, a method for producing a transgenic plant in which the flowering time is controlled by the method, a transgenic plant having regulated flowering time, Seed and a composition for regulating flowering time of a plant containing the recombinant vector as an active ingredient.

mRNA의 수송, 안정성 및 번역을 포함하는 전사 후 조절은 식물의 생장과 발달에 중요한 역할을 하며, 이들 과정의 대부분은 RNA 결합 단백질(RNA binding protein; RBP)에 의해 직접 또는 간접적으로 이루어진다. KH- 및 RNA 인지 모티프(RRM)-형태의 RNA 결합 단백질들은 식물체의 개화에 관련되어 있다고 알려져 있다. 예를 들어 개화시기 조절 단백질 A(FCA), FPA 및 FLK(Flowering Locus K)는 개화 활성자로서 작용한다. FCA는 선택적 스플라이싱(splicing) 및 RNA-매개된 FLC 염색질 사일런싱에 의한 자가조절을 하여 자동적으로 개화를 촉진시키는데, 이것은 FLC 발현의 억제에 의한 것이다. Transcriptional regulation, including mRNA transport, stability and translation, plays an important role in plant growth and development, and most of these processes are directly or indirectly mediated by RNA binding proteins (RBPs). The KH- and RNA-sensing motif (RRM) -like RNA binding proteins are known to be involved in plant flowering. For example, Flowering Time Regulating Protein A (FCA), FPA and FLK (Flowering Locus K) act as flowering activators. FCA promotes flowering automatically by selective regulation by selective splicing and RNA-mediated FLC chromatin silencing, which is due to inhibition of FLC expression.

AtBRN1 또는 AtBRN2는 이전에 AtBRUL-1 또는 AtBRUl-2로 보고되었으며, 이것은 브루노 단백질로 RNA 결합 단백질-패밀리에 속한다. 브루노 단백질은 초파리에서 처음 보고되었으며, RNA 인지 모티프를 포함하는 RNA 결합 단백질로 다양한 종류의 생물에서 선택적 스플라이싱, mRNA의 번역 억제와 이동을 조절하며 Elav (Embryonic lethal abnormal visual system phenotype) 단백질과 유사한 구조를 갖는다. 초파리에서 브루노 단백질은 초기 배 발생을 조절하는 주요인자 중 하나인 Oskar 단백질의 발현을 조절하며, Oskar mRNA의 3' UTR에 존재하는 브루노 반응 인자(Bruno response element; BRE)에 결합하여 mRNA의 번역을 억제한다. 이러한 번역 억제 인자로서는 브루노 이외에도 이와 유사한 CUG-BP(CUG-Binding protein)가 대표적이며 이들 단백질의 번역 억제 메커니즘 규명 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 목적 RNA의 번역 억제 단계에서 브루노 단백질은 합성 개시인자인 eIF4E와 결합하여 eIF4E-eIF4G 복합체의 형성을 방해함으로써 궁극적으로 40S 리보솜 형성을 억제한다. 이 때 브루노 단백질은 브루노-CUP-eIF4E 결합체로서 작용하는 것이 최근에 밝혀졌으며, 애기장대의 브루노 유전자 상동체(homolog)는 FCA, AtBRN1 및 AtBRN2이 존재한다. AtBRN1 or AtBRN2 has previously been reported as AtBRUL-1 or AtBRUI-2 , which belongs to the RNA binding protein-family with Bruno proteins. Bruno protein was first reported in Drosophila, an RNA-binding protein containing RNA-motif motif, which selectively splices in a variety of organisms, regulates mRNA translation inhibition and migration, and is similar to the Elav (embryonic lethal abnormal visual system phenotype) protein Structure. In Drosophila, Bruno protein controls the expression of Oskar protein, one of the key factors controlling early embryogenesis, and binds to the Bruno response element (BRE) present in the 3 'UTR of Oskar mRNA, . In addition to Bruno, similar CUG-BP (CUG-Binding protein) is a typical example of such a translational inhibitory factor, and studies on the mechanism of translation inhibition of these proteins have been actively conducted recently. In the step of inhibiting translation of the target RNA, Bruno protein binds to eIF4E, a synthesis initiator, and inhibits formation of eIF4E-eIF4G complex, ultimately inhibiting 40S ribosomal formation. At this time, it has recently been discovered that Bruno protein functions as a Bruno-CUP-eIF4E complex, and Bruneo genomic homologues of Arabidopsis are FCA, AtBRN1 and AtBRN2 .

본 발명에서는 애기장대 유래의 브루노 유전자 BRN1/BRN2가 개화시기에 미치는 영향에 대해서 과발현 식물체 또는 이중 변이체를 가지고 확인한 결과, 과발현 식물체에서 개화시기가 지연되었고, 이중 변이체(atbrn1 atbrn 2-3)에서 개화시기가 촉진되는 것을 관찰하였다. 또한, 유전학적인 실험을 통하여 AtBRN의 목적 RNA가 SOC1 mRNA임을 밝혔으며, 극조기 개화 표현형을 보이는 SOC1 101-D와 BRN1 또는 BRN2 과발현체를 교배한 결과 SOC1 101-D의 극조기 개화의 표현형을 억제하는 것을 확인함으로써, AtBRN 유전자에 의해 개화시기가 조절됨을 밝혔다. In the present invention, the effect of the BRN1 / BRN2 gene derived from Arabidopsis thaliana BRN1 / BRN2 on the flowering time was confirmed by overexpressing plants or double mutants. As a result, the flowering time was delayed in the overexpressing plants and the flowering in the mutant ( atbrn1 atbrn 2-3 ) The time was observed to be promoted. Genetic experiments revealed that the target RNA of AtBRN was SOC1 mRNA, and showed a very early flowering phenotype It was confirmed that crossing of SOC1 101-D with BRN1 or BRN2 overexpression suppresses the phenotype of SOC1 101-D extreme early flowering, thereby revealing that the flowering time is regulated by AtBRN gene.

한국공개특허 제2011-0007874호에는 '식물체의 개화 억제를 유도하는 AtJmj4 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0637341호에는 '식물의 개화시기 조절 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 AtBRN 단백질이 특정 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관해서는 밝혀진 바가 없다. Korean Patent Publication No. 2011-0007874 discloses ' AtJmj4 gene which induces inhibition of flowering of plants and its use', and Korean Patent No. 0637341 discloses a method for controlling the flowering time of a plant, However, the method of controlling the flowering time of a plant by regulating the expression of a specific gene of AtBRN protein as in the present invention and the plant therefrom have not been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA binding protein) 유전자의 발현이 조절된 식물체를 이용하여, AtBRN 유전자가 식물체의 개화시기에 관여하며, 이는 AtBRN 단백질이 목적 RNA인 SOC1의 3' UTR에 결합하여 SOC1의 번역을 억제함으로써 식물체의 개화시기를 조절한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The AtBRN gene is involved in the flowering time of a plant by using a plant in which the expression of AtBRN ( Arabidopsis thaliana Bruno RNA binding protein) gene is regulated, by ensuring that control the flowering time of a plant by combining the 3 'UTR of SOC1 inhibit translation of SOC1 and completed the present invention.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention provides a step of transforming a recombinant vector containing a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana into plant cells to regulate the expression of the AtBRN gene Thereby controlling the flowering time of the plant.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for regulating the expression of AtBRN gene in plants by transforming plant cells with a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana, The present invention provides a method of preparing transgenic plants with controlled timing.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 개화시기가 조절된 형질전환 식물체를 제공한다. In addition, the present invention provides a transgenic plant having regulated flowering time, which is produced by the above production method.

또한, 본 발명은 상기 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 종자를 제공한다. In addition, the present invention provides a seed of a transgenic plant in which the flowering time is regulated.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 개화시기가 조절된 형질전환 식물체를 제공한다. The present invention also provides a transgenic plant having a regulated flowering time and transformed with a recombinant vector containing a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana .

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 개화시기 조절용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for regulating flowering time of a plant containing, as an active ingredient, a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana .

본 발명은 AtRBN 단백질이 목적 RNA인 AtSOC1 mRNA의 3'UTR에 결합하여 AtSOC1의 활성을 조절함으로써, 식물체의 개화시기를 조절한다는 것을 규명하였다. 본 발명의 유전자를 이용하여 식물의 개화시기가 조절된 식물체를 창출할 수 있으며 또한, 향후 원예작물의 개화시기를 촉진시켜 꽃과 종자 생산을 단기간 내에 생산함으로써 생산량을 증대시킬 수 있다. The present invention demonstrates that the AtRBN protein binds to the 3 'UTR of AtSOC1 mRNA as a target RNA and controls the activity of AtSOC1 to regulate the flowering time of the plant. By using the gene of the present invention, plants having regulated flowering time can be created. In addition, the flowering time of horticultural crops can be promoted in the future, and production of flowers and seeds can be shortened to thereby increase production.

도 1은 브루노 단백질 발현을 분석한 것을 나타낸다. (a)는 AtBRN1 또는 AtBRN2의 단백질 구조를 나타내는 것으로, 각 단백질은 3개의 RNA 인지 모티프(RRM)을 포함하고 있으며, (b)는 야생형 식물체의 AtBRN1 또는 AtBRN2의 발현을 나타내며, (c)는 생장 단계별로 AtBRN1 또는 AtBRN2 mRNA의 시간적 발현 양상을 나타내며, (d)는 AtBRN1 또는 AtBRN2를 암호화하는 유전자의 게놈(genome) DNA 구조, T-DNA 삽입부위(좌)를 보여주며, atbrn1/atbrn2-3 이중 변이체의 RT-PCR(우) 및 유전자형 분석을 나타내며, 유전자형 및 RT-PCR에 사용된 프라이머는 T-DNA 삽입부위(좌)가 표시된 도 아래부분에 표시하였다.
도 2는 AtBRN1 또는 AtBRN2가 개화시기 조절에 관련되었음을 나타낸다. (a)는 애기장대에 AtBRN1 또는 AtBRN2이 과발현 또는 변이체 식물에서의 개화 표현형을 나타내는 것으로, 애기장대를 장일, 단일 및 춘화처리 8주 후의 단일조건에서 재배하였으며, 개화시기는 로제트(rosette)잎의 수를 계수하여 측정하였으며(* P < 0.05; Student's t-test), (b)는 애기장대에서 개화시기 관련 유전자의 발현 양상을 나타낸다.
도 3은 개화시기에 관련된 유전자가 과발현된 식물체에 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2를 교배시킨 후 개화시기에 대한 효과를 나타낸 것이다. (a)는 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2와 교배된 식물체의 로제트 잎의 수를 계수하여 나타낸 그래프이며(* P < 0.05; Student's t-test), (b)는 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2와 교배된 식물체의 표현형을 나타낸 사진이다(바, 1 cm).
도 4는 극조기 개화 표현형을 가진 SOC1 101-D 식물체에 35S:: AtBRN1 또는 35S::AtBRN2를 교배시킨 후 개화시기에 대한 효과를 나타낸 것이다. (a)는 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S:: AtBRN2 / SOC1 101-D 식물체 및 SOC1 101-D 식물체의 개화시기를 비교한 것이며(* P < 0.05; Student's t-test), (b)는 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S::AtBRN2/SOC1 101-D 식물체에서 과발현 형질전환체의 발현량을 나타낸다.
도 5는 식물체 내 및 시험관 내에서 AtBRN1 또는 AtBRN2가 SOC1 mRNA의 3' UTR(untranslated region)에 결합하는 것을 나타낸다. (a)는 AtBRN1 또는 AtBRN2 및 SOC1 전장 RNA를 사용하여 이스트 3-하이브리드 실험을 나타낸 것이며, (b)는 바이오틴이 표지된 2'-O-메틸 SOC1 3' UTR RNA 및 GST-AtBRN1 또는 GST-AtBRN2 단백질을 이용한 EMSA를 나타낸 것이며, (c)의 AtBRN2-RNA 복합체는 애기장대 추출물로부터 항-AtBRN2 펩타이드 항체로 면역침강시킨 것으로, RT-PCR을 수행한 후 값을 나타낸 것이며, (d)는 35S:: GFP , 35S:: AtBRN1 : GFP 또는 35S:: AtBRN2 : GFP가 발현된 형질전환된 애기장대 뿌리 세포에서의 GFP의 위치를 나타낸 것이다(바, 5㎛).
도 6은 식물체 내에서 AtBRN1 또는 AtBRN2가 SOC1 mRNA의 3' UTR에 결합하는 것을 나타낸다. AtBRN1 또는 AtBRN2은 특이적으로 식물체 내에서 SOC1 3' UTR에 결합한다. 35S::AtBRN1:GFP 또는 35S::AtBRN2:GFP, 35S::AtBRN1:NLS:GFP/35S::SOC1 (-UTR) 또는 35S::AtBRN2:NLS:GFP/35S::SOC1 (-UTR) 및 35S::AtBRN1:NLS:GFP/35S::SOC1 (+UTR) 또는 35S::AtBRN2:NLS:GFP/35S::SOC1 (+UTR)을 발현시킨 원형질체에서 GFP의 위치를 나타낸 것이다(바, 100㎛).
도 7은 SOC1의 전사체의 3' UTR 염기서열의 위치에 따른 효과를 나타낸다. (a)의 회색 상자는 EMSA를 위한 합성된 바이오틴이 표지된 2'-O-메틸 RNA (49 nt)를 나타내며, 굵은 문자는 브루노 반응인자(BRE) 염기서열을 나타내며, RNA 면역침강 실험(RIP)을 위해 사용된 프라이머의 위치는 화살표로 나타냈으며, (b)는 GFP-SOC1 I, GFP-SOC1 II, GFP-SOC1 III 또는 GFP-SOC1 IV의 구조물을 35S::AtBRN1(좌) 또는 35S::AtBRN2(우) 식물세포에 감염시키거나 비감염된 원형질체로부터 단백질을 추출한 후, GFP 항체를 사용하여 GFP가 붙은 단백질을 검출하였으며, 항-Lhca2S를 로딩 대조구로 사용하였다.
도 8은 AtBRN1 또는 AtBRN2가 SOC1의 mRNA의 3' UTR에 결합하여 SOC1의 활성을 억제하는 것을 나타낸다. (a)는 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S::AtBRN2/SOC1 101-D의 교배된 식물과 35S::AtBRN1/35S::SOC1 (-UTR) 또는 35S::AtBRN2/35S::SOC1 (-UTR)의 교배된 식물 사이의 표현형을 비교한 것을 나타내며(바, 1 cm), (b)는 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S::AtBRN2/SOC1 101-D의 교배된 식물과 35S::AtBRN1/35S::SOC1 (-UTR) 또는 35S::AtBRN2/35S::SOC1 (-UTR)의 교배된 식물의 로제트 잎 수를 비교한 그래프를 나타내며(* P < 0.05; Student's t-test), (c)는 야생형 식물체 및 교배된 식물체에서의 SOC1 RNA 및 단백질 발현 양상을 나타내며, (d)는 GFP-SOC1 I, GFP-SOC1 II, GFP-SOC1 III 또는 GFP-SOC1 IV의 구축물로 감염된 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2의 잎 원형질체로부터 얻어진 밴드의 강도를 그래프로 나타낸 것이다. Figure 1 shows the analysis of Bruno protein expression. (a) represents the protein structure of AtBRN1 or AtBRN2, wherein each protein contains three RNA motifs (RRM), (b) represents the expression of AtBRN1 or AtBRN2 of a wild-type plant, (c) (D) shows the genomic DNA structure and T-DNA insertion site (left) of the gene coding for AtBRN1 or AtBRN2, and atbrn1 / atbrn2-3 duplexes, showing the temporal expression pattern of AtBRN1 or AtBRN2 mRNA RT-PCR (right) and genotypic analysis of the mutants. The primers used for genotyping and RT-PCR are shown in the lower part of the figure where the T-DNA insertion site (left) is indicated.
Figure 2 shows that AtBRN1 or AtBRN2 is involved in regulation of flowering time. (a) shows the expression pattern of AtBRN1 or AtBRN2 in the Arabidopsis overexpressing or mutant plants. The Arabidopsis was grown under the single condition of long-day, single and 8 weeks after the treatment of the vernalization, (* P <0.05;Student's t-test), and (b) represents the expression pattern of flowering-related genes in Arabidopsis thaliana.
FIG. 3 shows the effect of flowering time after flowering 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 on a plant overexpressing the gene related to flowering time. (a) is a 35S :: AtBRN 1 or 35S :: graph showing by counting the number of rosette leaves of a plant AtBRN2 with a mating (* P <0.05;Student's t-test), (b) is a 35S :: AtBRN1 or 35S :: A photograph showing the phenotype of the plant crossed with AtBRN2 (bar, 1 cm).
FIG. 4 shows the effect of flowering time of 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 on SOC1 101-D plants having a very early flowering phenotype. (a) is a comparison of flowering times of 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D and SOC1 101-D plants (* P <0.05;Student's t-test) b) shows the expression amount of the overexpressed transformant in 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D plants.
FIG. 5 shows that AtBRN1 or AtBRN2 binds to the 3 'UTR (untranslated region) of SOC1 mRNA in plants and in vitro. (a) shows a yeast three-hybrid experiment using AtBRN1 or AtBRN2 and SOC1 full-length RNA, (b) shows the biotin-labeled 2'-O-methyl SOC1 3 'UTR RNA and GST-AtBRN1 or GST-AtBRN2 (C) shows the value after RT-PCR after immune precipitation with anti-AtBRN2 peptide antibody from Arabidopsis extract. (D) shows the value of 35S: : GFP , 35S :: AtBRN1 : GFP Or 35S :: AtBRN2 : GFP -expressing Arabidopsis root cells (bar, 5 탆).
Figure 6 shows that AtBRN1 or AtBRN2 binds to the 3 'UTR of SOC1 mRNA in plants. AtBRN1 or AtBRN2 specifically binds to SOC1 3 'UTR in plants. 35S :: AtBRN1 :: GFP or 35S :: AtBRN2 :: GFP, 35S :: AtBRN1 :: NLS :: GFP / 35S :: SOC1 (-UTR) or 35S :: AtBRN2 :: NLS :: GFP / 35S :: SOC1 The position of GFP in the protoplast expressing 35S :: AtBRN1: NLS: GFP / 35S :: SOC1 (+ UTR) or 35S :: AtBRN2: NLS: GFP / 35S :: SOC1 (+ UTR) Mu m).
FIG. 7 shows the effect of the position of the 3 'UTR nucleotide sequence of the transcript of SOC1 . The gray boxes in (a) represent synthesized biotin-labeled 2'-O-methyl RNA (49 nt) for EMSA, the bold letters indicate the Bruno Reaction Factor (BRE) (B) shows the structure of GFP-SOCl I, GFP-SOCl II, GFP-SOCl III or GFP- SOCl IV as 35S :: AtBRNl (left) or 35S: : Proteins were extracted from AtBRN2 (right) plant cells or uninfected protoplasts. GFP antibodies were used to detect GFP-tagged proteins and anti-Lhca2S was used as a loading control.
Figure 8 shows that AtBRN1 or AtBRN2 is bound to 3 'UTR of the mRNA SOC1 inhibit the activity of SOC1. (a) shows the crossed plants of 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D and 35S :: AtBRN1 / 35S :: SOC1 (-UTR) or 35S :: AtBRN2 / 35S :: shows a comparison of the phenotype between the crossed plants of SOC1 (-UTR) (bar, 1 cm), (b) is a 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D of the mating (* P &lt;0.05;Student's&lt; (R) &gt; comparison between the plants and 35S :: AtBRN1 / 35S :: SOC1 (-UTR) or 35S :: AtBRN2 / 35S :: SOC1 SOC1 I, GFP-SOC1III, GFP-SOCIIII, or GFP-SOCIIII in the wild-type and crossed plants, and (d) The graph shows the intensity of bands obtained from leaf protoplasts of 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 infected with the construct.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for regulating the expression of AtBRN gene by transforming plant cells with a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana The method comprising the steps of:

본 발명에 따른 AtBRN 단백질의 범위는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. The range of the AtBRN protein according to the present invention includes the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 and the functional equivalent of the protein. Refers to an amino acid sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% amino acid sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids. More preferably 95% or more homologous homologous to a protein having substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

또한, 본 발명에 따른 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1(At4g03110) 또는 서열번호 2(At1g03457)의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the gene encoding the AtBRN protein according to the present invention may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (At4g03110) or SEQ ID NO: 2 (At1g03457), but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 개화를 지연시킬 수 있는 방법으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자를 과발현시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 지연시킬 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 극조기 개화 표현형을 가진 SOC1 101-D 식물세포에 형질전환시켜 식물체의 개화시기를 야생형 식물과 유사하게 회복시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a method according to an embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising the gene of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is transformed into a plant cell by overexpressing the AtBRN gene in a method capable of delaying the flowering of the plant, The flowering time of the plant may be delayed and the flowering time of the plant may be restored to similar to the wild-type plant by transforming the recombinant vector into SOC1101 -D plant cells having a very early flowering phenotype, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 개화를 촉진시킬 수 있는 방법으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 유전자의 발현을 저해시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the flowering time of a plant can be promoted by inhibiting the expression of the genes of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 by a method capable of promoting flowering of the plant, It does not.

본 발명의 상기 "유전자 발현 조절"은 식물체 내의 BRN 유전자의 발현을 증가 시키거나 또는 감소시키는 것을 말한다. The "gene expression control" of the present invention refers to increasing or decreasing the expression of the BRN gene in plants.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term "vector" is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector ". The term "expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of a plant expression vector is a Ti-plasmid vector that is capable of transferring a so-called T-region into a plant cell when it is present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences to plant cells or protoplasts in which new plants capable of properly inserting hybrid DNA into the plant's genome can be produced have. A particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and U.S. Patent No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into the plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as Kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, Resistant genes, but are not limited thereto.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the plant expression vector of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.The term "promoter " refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selectivity.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the plant expression vectors of the present invention, conventional terminators can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium and the terminator of the Octopine gene of Tumefaciens, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.

상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워크 모자이크 바이러스 (FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. By "gene overexpression" is meant that the gene is expressed at a level that is expressed in a wild-type plant. As a method of introducing the gene into a plant, there is a method of transforming a plant using an expression vector containing the gene under the control of a promoter. The above promoter is not particularly limited as long as it can overexpress an insertion gene in a plant. Examples of such promoters include, but are not limited to, 35S RNA and 19S RNA promoters of CaMV; A full-length transcriptional promoter derived from Peak Work Mosaic Virus (FMV) and a coat protein promoter of TMV.

식물체에서 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 상기 "유전자의 발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것뿐만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다. As a method for suppressing the expression of a gene in a plant, various methods known in the art can be used. The expression " suppression of gene expression "includes inhibition of gene transcription and inhibition of translation into proteins. Also included are those in which the expression of the gene is not only completely stopped but also the expression is reduced.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다. Transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. The method is based on the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373) 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), the use of various plant elements (such as, for example, Shillito et al., 1985, Bio / Technol.3: 1099-1102) (DNA or RNA-coated) particle impact method (Klein et al., 1987, Nature 327: 70), infiltration of plants or Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer by transformation of mature pollen or micro- Virus infection (EP 0 301 316), and the like. A preferred method according to the present invention comprises Agrobacterium mediated DNA delivery. Particularly preferred is the use of so-called binary vector techniques as described in EPA 120 516 and U.S. Pat. No. 4,940,838.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다."Plant cell" used for transformation of a plant may be any plant cell. Plant cells are cultured cells, cultured tissues, cultivated or whole plants. "Plant tissue" refers to a tissue of differentiated or undifferentiated plant, including but not limited to roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used for culture, protoplasts, shoots and callus tissue. The plant tissue may be in planta or may be in an organ culture, tissue culture or cell culture.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 본 발명의 AtBRN1 또는 AtBRN2 단백질은 AtSOC1(Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1) mRNA의 3' UTR에 결합하여 SOC1의 활성을 조절하여 식물체의 개화시기를 조절할 수 있으며, 예를 들면 SOC1의 활성을 억제하여 식물체의 개화시기를 지연시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In addition, in the method according to one embodiment of the present invention, the AtBRN1 or AtBRN2 protein of the present invention is at least one of AtSOC1 ( Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1). It is possible to regulate the flowering time of plants by regulating the activity of SOC1 by binding to the 3 'UTR of mRNA. For example, it is possible to delay the flowering time of plants by inhibiting SOC1 activity, It does not.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 이스트 3-하이브리드, EMSA, RNA 면역침전 및 원형질체를 이용한 일시적인 형질도입 실험을 통해, AtBRN가 SOC1 mRNA의 3' UTR에 결합하여 mRNA의 감쇠에 관여하며, 이것은 SOC1 3' UTR의 말단 부위에 의해 매개되는 것으로, SOC1의 활성 억제는 3’UTR에 의존적으로 일어나며 이를 통해 애기장대의 개화시기가 조절될 수 있다. AtBRNs 단백질이 AtSOC1 mRNA의 3' UTR에 결합하기 위한 AtSOC1 mRNA 3'UTR의 길이는 바람직하게는 75bp 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 228bp 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 457bp 이상이다. In a method according to one embodiment of the present invention, through transient transduction experiments using yeast 3-hybrid, EMSA, RNA immunoprecipitation and protoplasts, AtBRN binds to the 3 'UTR of SOC1 mRNA and participates in attenuation of mRNA, This is mediated by the terminal region of the SOC1 3 'UTR, and the inhibition of the SOC1 activity is dependent on the 3' UTR, thereby regulating the flowering time of the Arabidopsis. The length of the AtSOC1 mRNA 3'UTR for binding the AtBRNs protein to the 3 'UTR of the AtSOC1 mRNA may preferably be greater than or equal to 75 bp, more preferably greater than or equal to 228 bp, and most preferably greater than or equal to 457 bp.

본 발명은 또한, 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for regulating the expression of the AtBRN gene by transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein ( ATBRN ) derived from Arabidopsis thaliana, The present invention provides a method of preparing transgenic plants with controlled timing.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 AtBRN 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN2 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the AtBRN protein may be AtBRN1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or AtBRN2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

본 발명의 일구현 예에 따른 제조 방법에서, AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1(At4g03110) 또는 서열번호 2(At1g03457)의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the production method according to one embodiment of the present invention, the gene encoding the AtBRN protein may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (At4g03110) or SEQ ID NO: 2 (At1g03457), but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 개화를 지연시킬 수 있는 방법으로, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자를 과발현시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 지연시킬 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 극조기 개화 표현형을 가진 SOC1 101-D 식물세포에 형질전환시켜 식물체의 개화시기를 야생형 식물과 유사하게 회복시킬 수 있다. In a method according to one embodiment of the present invention, a recombinant vector comprising a gene encoding the AtBRN protein is transfected into a plant cell by overexpressing the AtBRN gene, thereby delaying the flowering of the plant. The flowering time can be delayed, and the recombination vector can be transformed into SOC1101 -D plant cells having a very early flowering phenotype, so that the flowering time of the plant can be restored to similar to wild type plants.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 개화를 촉진시킬 수 있는 방법으로, AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 저해시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 촉진시킬 수 있다.In the method according to the embodiment of the present invention, as a way to promote the flowering of a plant, to a recombinant vector comprising a gene encoding a protein is transformed into a plant cell AtBRN AtBRN It inhibits the expression of the gene and promotes the flowering time of the plant rather than the wild type.

본 발명의 일구현 예에 따른 제조 방법에서, 식물체의 개화시기를 조절하기 위해, AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 기능상실 돌연변이체는 바람직하게는 AtBRN1 유전자에 T-DNA를 삽입하거나 또는 AtBRN2 유전자에 T-DNA를 삽입한 단일 변이체일 수 있으나, 가장 바람직하게는 AtBRN1 및 AtBRN2 유전자 모두 기능을 상실한 이중 돌연변이체이다. In the production method according to one embodiment of the present invention, in order to control the flowering time of plants, AtBRN1 or The method for producing the disfunctional mutant by inserting the T-DNA into the AtBRN2 gene may be a general method known in the art. The loss of function mutants are preferably, but can be a single variant, insert the T-DNA in the insertion or AtBRN2 gene to T-DNA in AtBRN1 gene, and most preferably is a double mutant has lost the ability both AtBRN1 and AtBRN2 gene .

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 개화시기가 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. The present invention also provides a transgenic plant and a seed thereof regulated at flowering time, which are produced by the above production method.

또한 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물이 될 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다. The plants to which the method according to the present invention can be applied may be dicotyledonous or monocotyledonous plants, preferably dicotyledonous plants. Examples of dicotyledonous plants include, but are not limited to, Arabidopsis thaliana, eggplant, cigarette, red pepper, tomato, burdock, ciliaceae, lettuce, bellflower, spinach, modern sweet potato, celery, carrot, parsley, parsley, cabbage, cabbage, Watermelon, melon, cucumber pumpkin, pak, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean and pea. The plants are preferably Arabidopsis thaliana .

또한, 본 발명은, 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 개화시기가 조절된 형질전환 식물체를 제공한다. The present invention also provides a transgenic plant transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein (ATBRN) derived from Arabidopsis thaliana to regulate the flowering time.

또한, 본 발명은, 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 개화시기 조절용 조성물을 제공한다.Further, the present invention relates to Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) protein as an active ingredient. The present invention also provides a composition for controlling the flowering time of a plant.

본 발명의 식물체의 개화시기 조절용 조성물은 유효 성분으로서 본 발명의 애기장대 유래의 BRN 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 개화시기를 조절할 수 있는데, 예를 들면, 상기 유전자의 발현을 증가시켜 개화시기를 지연시키거나 상기 유전자의 발현을 억제시켜 개화시기를 촉진할 수 있다.
The composition for controlling flowering time of a plant according to the present invention comprises a recombinant vector containing a gene encoding a BRN protein derived from the Arabidopsis thaliana of the present invention as an active ingredient and the flowering time of the plant can be regulated by transforming the gene into a plant For example, the expression of the gene may be increased to delay the flowering time, or the expression of the gene may be suppressed to promote the flowering time.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and methods

1. 식물 재료 및 생장 조건1. Plant material and growth condition

애기장대 생태형 Col-0 종자를 MS(Murashige 및 Skoog) 배지(1x MS, 1% 수크로스 및 0.8 % 한천, pH 5.7) 또는 토양에 파종한 후 22℃, 장일(LD, 16h 광-120 μmol photons m-2sec-1/8h 암) 또는 단일(SD, 8h 광/16h 암) 조건 상태로 재배하였다. T-DNA 삽입 변이체 대립유전자; atbrn1(Salk_041205), atbrn2-1 (Salk_135530), atbrn2-2 (Salk_054409), atbrn2-3 (Sail_549_D06) 및 과발현 형질전환 라인; 35S::FT (Kardailsky et al., 1999, Science 286: 1962-1965), SOC1 101-D (Lee et al., 2000, Genes Dev 14: 2366-2376), 35S::AGL24 (Yu et al., 2002, Pro Natl Acad Sci 99: 16336-16341) 및 35S::AP1 (Mandel & Yanofsky etl al., 1995, Nature 377: 522-524)을 본 발명에서 사용하였으며, Col-0를 백그라운드로 사용하였다. 형질전환체의 선별을 위해, 50 ㎍/ml 카나마이신(Duchefa), 50 ㎍/ml 하이그로마이신(Duchefa), 또는 50 ㎍/ml 바스타(Duchefa)를 MS 배지에 첨가하여 사용하였다. 종자들은 토사층 사이에 두고, 암실에서 4℃에 3일 동안 처리한 후 생육상으로 옮겨주었다.
Arabidopsis colonies Col-0 seeds were inoculated on MS (Murashige and Skoog) medium (1x MS, 1% sucrose and 0.8% agar, pH 5.7) m 2 sec -1 / 8h arm) or single (SD, 8h light / 16h arm) condition. T-DNA insertion mutant allele; atbrn1 (Salk_041205), atbrn2-1 (Salk_135530), atbrn2-2 (Salk_054409), atbrn2-3 (Sail_549_D06) and over-expression transfection lines; 35S :: FT (Kardailsky et al., 1999, Science 286: 1962-1965), SOC1 101-D (Lee et al., 2000, Genes Dev 14: 2366-2376), 35S :: AGL24 (Yu et al. , 2002, Pro Natl Acad Sci 99: 16336-16341) and 35S :: AP1 (Mandel & Yanofsky et al., 1995, Nature 377: 522-524) were used in the present invention and Col-0 was used in the background . For selection of transformants, 50 μg / ml kanamycin (Duchefa), 50 μg / ml hygromycin (Duchefa), or 50 μg / ml Bacillus (Duchefa) were added to MS medium. The seeds were placed between the soil layers and treated in a dark room at 4 ° C for 3 days And then transferred to the growth phase.

2. 개화 시기 측정2. Measuring flowering time

개화시기의 측정은 개화시기의 로제트 잎을 계수하여 측정하였으며, 통계 분석을 위해 30-50개의 식물체를 측정하여 평균값을 구하였다.
The flowering time was measured by counting rosette leaves at flowering time, and 30-50 plants were measured for statistical analysis.

3. 플라스미드 구조물3. Plasmid structure

35S::AtBRN 구조물을 위해, AtBRN1(At4g03110) 또는 AtBRN2(At1g03457) 유전자 전체를 암호화하는 염기서열을 얻기 위해 두 유전자의 cDNA 클론을 주형으로 한 PCR를 수행하였다. cDNA 클론 pda 06133 (RIKEN, 일본) 및 U60225 (ABRC, 오하이오 주립 대학, 미국)는 각각 일본의 RIKEN과 미국의 ABRC로부터 얻었다. PCR을 위한 프라이머는 AtBRN1의 경우 AtBRN1F(서열번호 6) 및 AtBRN1R(서열번호 7)를 사용하였으며, AtBRN2의 경우 AtBRN2F(서열번호 8) 및 AtBRN2R(서열번호 9)을 사용하였다(표 1). 얻어진 DNA 단편들(1,326 및 1,290 bp)은 NcoI 및 XbaI 제한효소를 처리하여 자른 후, pRTL2 벡터의 35S 이중 프로모터 아래 부분에 클로닝하였다(Restrepo et al., 1990, Plant Cell 2: 987-998). 마지막으로, DNA 삽입은 PstI 으로 자른 후에 pCAMBIA3301(캠비아, 캔버라, 호주)에 클로닝하여 35S::AtBRN1 또는 35S:: AtBRN2를 생성하였다. For the 35S :: AtBRN structure, PCR was performed using cDNA clones of both genes as templates, in order to obtain a nucleotide sequence encoding the entire AtBRN1 (At4g03110) or AtBRN2 (At1g03457) gene. cDNA clones pda 06133 (RIKEN, Japan) and U60225 (ABRC, Ohio State University, USA) were obtained from RIKEN in Japan and ABRC in the US, respectively. Primer for PCR was used as in the case of AtBRN1 AtBRN1F (SEQ ID NO: 6) and AtBRN1R (SEQ ID NO: 7), was used for AtBRN2 AtBRN2F (SEQ ID NO: 8) and AtBRN2R (SEQ ID NO: 9) (Table 1). The resulting DNA fragments (1,326 and 1,290 bp) were cloned by treatment with Nco I and Xba I restriction enzymes and then cloned into the 35S double promoter portion of the pRTL2 vector (Restrepo et al., 1990, Plant Cell 2: 987-998 ). Finally, DNA inserts were cut into Pst I and then cloned into pCAMBIA3301 (Cambia, Canberra, Australia) to generate 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 .

P AtBRNs :: GUS 구조물을 위해, AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자의 번역이 시작되는 부위로부터 3.8kb 또는 2.0kb의 프로모터 부위를 제노믹 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. PCR을 위한 프라이머는 AtBRN1의 경우 ProAtBRN1F(서열번호 10) 및 ProAtBRN1R(서열번호 11)을 사용하였으며, AtBRN2의 경우 ProAtBRN2(서열번호 12) 및 AtBRN2R(서열번호 13)을 사용하였다(표 1). 증폭된 DNA 단편들은 EcoR1 및 NcoI의 제한효소로 자른 후에 pCambia 2201에 클로닝하여 P atBRN1 ::GUS 또는 P AtBRN2 ::GUS를 생성하였다. For the P AtBRNs :: GUS construct, a 3.8 kb or 2.0 kb promoter region was amplified by PCR using genomic DNA as a template from the site where translation of the AtBRN1 or AtBRN2 gene was initiated. Primer for PCR was used for AtBRN1 ProAtBRN1F (SEQ ID NO: 10) and ProAtBRN1R was used (SEQ ID NO: 11), in the case of AtBRN2 ProAtBRN2 (SEQ ID NO: 12) and AtBRN2R (SEQ ID NO: 13) (Table 1). The amplified DNA fragments were generated P atBRN1 :: GUS :: GUS or P AtBRN2 cloned in pCambia 2201 after cutting with restriction enzymes of Eco R1 and Nco I.

35S::GFP:AtBRN 구조물을 얻기 위해, AtBRN1 또는 AtBRN2의 cDNA를 주형으로 각 유전자의 CDS(Coding Sequence) 부분을 PCR로 증폭하였다. PCR을 위한 프라이머는 AtBRN1의 경우 407F(서열번호 14) 및 105R(서열번호 15)을 사용하였으며, AtBRN2의 경우 408F(서열번호 16) 및 106R(서열번호 17)을 사용하였다(표 1). 증폭된 DNA는 pK7WGF2(Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci 7: 193-195)로 클로닝하여, 35S::GFP:AtBRN1 또는 35S::GFP:AtBRN2를 생성하였다. In order to obtain 35S :: GFP: AtBRN structure, CDS (Coding Sequence) portion of each gene was amplified by PCR using AtBRN1 or AtBRN2 cDNA as a template. Primer for PCR was used for AtBRN1 407F (SEQ ID NO: 14), and 105R were used (SEQ ID NO: 15), in the case of AtBRN2 408F (SEQ ID NO: 16) and 106R (SEQ ID NO: 17) (Table 1). The amplified DNA was cloned into pK7WGF2 (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci 7: 193-195) to generate 35S :: GFP: AtBRN1 or 35S :: GFP: AtBRN2 .

이스트 3 하이브리드(yeast 3 hybrid) 분석을 위해서, 하이브리드 RNA(MS2-SOC1) 및 융합단백질(VP16 AD-AD-AtBRNs) 플라스미드로 pRH5' 및 pYESTrp3 벡터(Invitrogen)를 사용하여 만들었다. 전장 SOC1 cDNA(1,293 bp, 서열번호 5)는 5' UTR 및 3' UTR을 포함하는 것으로, 126F(서열번호 18) 및 126R(서열번호 19) 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭하였으며, 그 후 pRH5' 벡터의 AatII 및 SmaI 사이트로 클로닝한 결과 pMS2-SOC1이 생성되었다. 클로닝을 위해 제한효소 염기서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 프라이머는 AtBRN1의 경우 124F(서열번호 20) 및 124R(서열번호 21), AtBRN2의 경우 125F(서열번호 22) 및 125R(서열번호 23)을 사용하였다. 증폭된 DNA 단편들은 AtBRN1을 위해서는 EcoR1 및 NotI의 제한효소로 처리하여 자르고, AtBRN2를 위해서는 HindIII 및 NotI의 제한효소로 처리하여 자른 후에 pYESTrp3 벡터로 클로닝한 결과 pVP16-AtBRN1 또는 pVP16-AtBRN2가 생성되었다. Was constructed using the pRH5 'and pYESTrp3 vectors (Invitrogen) as hybrid RNA (MS2-SOC1) and fusion protein (VP16 AD-AD-AtBRNs) plasmids for yeast 3 hybrid analysis. The full-length SOC1 cDNA (1,293 bp, SEQ ID NO: 5) contained 5 'UTR and 3' UTR and was amplified by RT-PCR using primers 126F (SEQ ID NO: 18) and 126R (SEQ ID NO: 19) Cloning into Aat II and Sma I sites of pRH5 'vector resulted in pMS2-SOC1. PCR was performed using primers containing restriction enzyme sequences for cloning. PCR primers were 124F (SEQ ID NO: 20) and 124R (SEQ ID NO: 21) for AtBRN1 , 125F (SEQ ID NO: 22) and 125R (SEQ ID NO: 23) for AtBRN2. The amplified DNA fragments to the AtBRN1 cut by treatment with restriction enzymes Eco R1 and Not I, to the AtBRN2 After a cloned into pYESTrp3 vector after cutting by treatment with restriction enzymes Hin dIII and Not I pVP16-AtBRN1 or pVP16-AtBRN2 .

EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 위해, GST-AtBRN1 또는 GST-AtBRN2 융합 단백질을 위한 플라스미드를 구축하였다. 이를 위해, AtBRN1 또는 AtBRN2의 cDNA를 주형으로 PCR로 증폭시켰다. PCR 프라이머는 AtBRN1의 경우 231F(서열번호 24) 및 231R(서열번호 25), AtBRN2의 경우 232F(서열번호 26) 및 232R(서열번호 27)를 사용하였다(표 1). 증폭된 DNA는 각각 pGEX-5X-1(GE healthcare) 벡터의 BamHI 과 NotI의 제한효소 부위를 이용하여 클로닝하였다. For electrophoretic mobility shift assay (EMSA), a plasmid was constructed for the GST-AtBRN1 or GST-AtBRN2 fusion protein. For this, cDNA of AtBRN1 or AtBRN2 was amplified by PCR as a template. PCR primers used were 231F (SEQ ID NO: 24) and 231R (SEQ ID NO: 25) for AtBRN1 , 232F (SEQ ID NO: 26) and 232R (SEQ ID NO: 27) for AtBRN2 (Table 1). The amplified DNA was cloned using restriction enzymes of Bam HI and Not I of pGEX-5X-1 (GE healthcare) vector, respectively.

일시적인 원형질체 분석을 위해서, SOC1의 4가지 형태의 DNA 단편들을 PCR로 부터 증폭하였으며, 이것은 브루노 반응인자(Bruno response element;BRE) 염기서열을 포함하는 것과 포함하지 않는 것으로 이루어졌다(예를 들어 GFP-SOC1 I(-BRE), GFP-SOC1 II(-BRE), GFP-SOC1 III(-BRE) 또는 GFP-SOC1 IV(+BRE)). DNA 단편들은 cDNA 클론을 주형으로 PCR로 증폭되었다. PCR을 위한 프라이머는 GFP-SOC1 I의 경우 445F(서열번호 28) 및 242R(서열번호 29), GFP-SOC1 II의 경우 242F(서열번호 30) 및 446R(서열번호 31), GFP-SOC1 III의 경우 242F(서열번호 30) 및 447R(서열번호 32), GFP-SOC1 IV의 경우 242F(서열번호 30) 및 448R(서열번호 33)을 사용하였다(표 1). 이들 4가지 형태의 DNA 단편들을 p2FGW7(Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci 7: 193-195) 벡터내로 클로닝하여 35S::GFP-SOC1 I, 35S::GFP-SOC1 II, 35S::GFP-SOC1 III 및 35S::GFP-SOC1 IV의 구조물을 생성하였다.For transient protoplast analysis, four types of DNA fragments of SOC1 were amplified from PCR, which did not include those containing the Bruno response element (BRE) nucleotide sequence (for example, GFP- SOCl I (-BRE), GFP-SOCl II (-BRE), GFP-SOCl III (-BRE) or GFP-SOCl IV (+ BRE). DNA fragments were amplified by PCR using cDNA clones as template. The primers for PCR were 445F (SEQ ID NO: 28) and 242R (SEQ ID NO: 29) for GFP-SOC1 I, 242F (SEQ ID NO: 30) and 446R (SEQ ID NO: 31) for GFP- (SEQ ID NO: 30) and 447R (SEQ ID NO: 32) for GFP-SOC1IV, and 242F (SEQ ID NO: 30) and 448R (SEQ ID NO: 33) for GFP-SOC1IV (Table 1). These four types of DNA fragments were cloned into the vector p2FGW7 (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci 7: 193-195) to generate 35S :: GFP- SOC1I, 35S :: GFP-SOC1II , 35S :: GFP -SOC1 III and 35S :: GFP-SOC1 IV.

본 발명에서 사용한 올리고머(oligomers)The oligomers used in the present invention, AtBRN1FAtBRN1F ccatggATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG(서열번호 6) ccatggATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG (SEQ ID NO: 6) AtBRN1RAtBRN1R tctagaTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG(서열번호 7) tctagaTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG (SEQ ID NO: 7) AtBRN2FAtBRN2F ccatggATGGCGGAGGAGACGATG(서열번호 8) ccatggATGGCGGAGGAGACGATG (SEQ ID NO: 8) AtBRN2RAtBRN2R tctagaTTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG(서열번호 9) tctagaTTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG (SEQ ID NO: 9) ProAtBRN1FProAtBRN1F ttggaattcGTTTGTTACATTTTCTATTGTTCGTTTCT(서열번호 10) ttggaattcGTTTGTTACATTTTCTATTGTTCGTTTCT (SEQ ID NO: 10) ProAtBRN1RProAtBRN1R tttccatggCGTCTCCTCCGCCATTATTTC(서열번호 11) tttccatggCGTCTCCTCCGCCATTATTTC (SEQ ID NO: 11) ProAtBRN2FProAtBRN2F gaattcATTATTTTAGATTTTCATAATGTTCTTCTATATGATTGTGG(서열번호 12) gaattcATTATTTTAGATTTTCATAATGTTCTTCTATATGATTGTGG (SEQ ID NO: 12) ProAtBRN2RProAtBRN2R ccatggTACAGGCTTTTTCTTCCTGAATATTTATTTATTTAC(서열번호 13) ccatggTACAGGCTTTTTCTTCCTGAATATTTATTTATTTAC (SEQ ID NO: 13) 407F407F caccATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG(서열번호 14) caccATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG (SEQ ID NO: 14) 105R105R TCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG(서열번호 15) TCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG (SEQ ID NO: 15) 408F408F caccATGGCGGAGGAGACGATG(서열번호 16) caccATGGCGGAGGAGACGATG (SEQ ID NO: 16) 106R106R TTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG(서열번호 17) TTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG (SEQ ID NO: 17) 126F126F gacgtcAAAAGAAAATATATATGGTTTCACAAACACCATTAC(서열번호 18) gacgtcAAAAGAAAATATATATGGTTTCACAAACACCATTAC (SEQ ID NO: 18) 126R126R cccgggGAGGGAAGAAAGCTAAATTGATACATGAAAAC(서열번호 19) cccgggGAGGGAAGAAAGCTAAATTGATACATGAAAAC (SEQ ID NO: 19) 124F124F gaattccaATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG(서열번호 20) gaattccaATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG (SEQ ID NO: 20) 124R124R gcggccgcTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG(서열번호 21) gcggccgcTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG (SEQ ID NO: 21) 125F125F aagcttATGGCGGAGGAGACGATGGAG(서열번호 22) aagcttATGGCGGAGGAGACGATGGAG (SEQ ID NO: 22) 125R125R gcggccgcTTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG(서열번호 23) gcggccgcTTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG (SEQ ID NO: 23) 231F231F ggatcccaATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG(서열번호 24) ggatcccaATGGCGGAAGCGAAGGAGGAG (SEQ ID NO: 24) 231R231R gcggccgcTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGGTTG(서열번호 25) gcggccgcTCAGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGGTTG (SEQ ID NO: 25) 232F232F ggatcctaATGGCGGAGGAGACGATG(서열번호 26) ggatcctaATGGCGGAGGAGACGATG (SEQ ID NO: 26) 232R232R gcggccgcTTACGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG(서열번호 27) gt; 445F445F CACCATTATCTTTCTCCAAGAAATAAAGAAAAGAAAATATATATGG(서열번호 28) CACCATTATCTTTCTCCAAGAAATAAAGAAAAGAAAATATATATGG (SEQ ID NO: 28) 242R242R TCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAACCCAATG(서열번호 29) TCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAACCCAATG (SEQ ID NO: 29) 242F242F caccATGGTGAGGGGCAAAACTCAGATG(서열번호 30) caccATGGTGAGGGGCAAAACTCAGATG (SEQ ID NO: 30) 446R446R TGTCCTTATACACTCTCAGTACTGCTAAACCTG(서열번호 31) TGTCCTTATACACTCTCAGTACTGCTAAACCTG (SEQ ID NO: 31) 447R447R TAAAGAAGTGACTGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAG(서열번호 32) TAAAGAAGTGACTGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAG (SEQ ID NO: 32) 448R448R AAAACATAATCAAAATTACATTCTAGAGAGGCAAGTGTAAG(서열번호 33) AAAACATAATCAAAATTACATTCTAGAGAGGCAAGTGTAAG (SEQ ID NO: 33) 233R233R GAGGGAAGAAAGCTAAATTGATACATG(서열번호 34) GAGGGAAGAAAGCTAAATTGATACATG (SEQ ID NO: 34) 407R407R gaccttccgcttcttcttgggGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG(서열번호 35) gaccttccgcttcttcttgggGGAGATTAAGGAAGGATTACTACTCGG (SEQ ID NO: 35) 408R408R gaccttccgcttcttcttgggCGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG(서열번호 36) gaccttccgcttcttcttgggCGAGTTTAATAAACCGTTAAATAACGGG (SEQ ID NO: 36) 101F101F GTTAGCCTGAGCAACCAAAAG(서열번호 37) GTTAGCCTGAGCAACCAAAAG (SEQ ID NO: 37) 101R101R TCCGAAACATATGTCGGAATC(서열번호 38) TCCGAAACATATGTCGGAATC (SEQ ID NO: 38) 390F390F TGTGGTTTCTTGGGTTTGAAG(서열번호 39) TGTGGTTTCTTGGGTTTGAAG (SEQ ID NO: 39) 390R390R TAACGACGAGCCCAGATTTAG(서열번호 40) TAACGACGAGCCCAGATTTAG (SEQ ID NO: 40) LBb 1.3LBb 1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC(서열번호 41) ATTTTGCCGATTTCGGAAC (SEQ ID NO: 41) LB3LB3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC(서열번호 42) TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC (SEQ ID NO: 42) Tubulin-377FTubulin-377F TGGCATCAACTTTCATTGGA(서열번호 43) TGGCATCAACTTTCATTGGA (SEQ ID NO: 43) Tubulin-377RTubulin-377R ATGTTGCTCTCCGCTTCTGT(서열번호 44) ATGTTGCTCTCCGCTTCTGT (SEQ ID NO: 44) SOC1-78FSOC1-78F CTGAGGCATACTAAGGATCG(서열번호 45) CTGAGGCATACTAAGGATCG (SEQ ID NO: 45) SOC1-78RSOC1-78R GAACAAGGTAACCCAATGAA(서열번호 46) GAACAAGGTAACCCAATGAA (SEQ ID NO: 46) SOC1-422FSOC1-422F ATAGGAACATGCTCAATCGAGGAGCTG(서열번호 47) ATAGGAACATGCTCAATCGAGGAGCTG (SEQ ID NO: 47) SOC1-422RSOC1-422R TTTCTTGAAGAACAAGGTAACCCAATG(서열번호 48) TTTCTTGAAGAACAAGGTAACCCAATG (SEQ ID NO: 48) FCA-425FFCA-425F AGCAACCAAACCAAAATTTACCAC(서열번호 49) AGCAACCAAACCAAAATTTACCAC (SEQ ID NO: 49) FCA-425RFCA-425R CGGGTATATGTGTCCGAGCATAAT(서열번호 50) CGGGTATATGTGTCCGAGCATAAT (SEQ ID NO: 50) AP1-427FAP1-427F GCACATCCGCACTAGAAAAAACCAAC(서열번호 51) GCACATCCGCACTAGAAAAAACCAAC (SEQ ID NO: 51) AP1-427RAP1-427R CTTCTTGATACAGACCACCCATGT(서열번호 52) CTTCTTGATACAGACCACCCATGT (SEQ ID NO: 52) AGL24-429FAGL24-429F GTCTGAAAAGAAGGGCGAGTGTGT(서열번호 53) GTCTGAAAAGAAGGGCGAGTGTGT (SEQ ID NO: 53) AGL24-429RAGL24-429R CAGATTCATTCCCAAGATGGAAGC(서열번호 54) CAGATTCATTCCCAAGATGGAAGC (SEQ ID NO: 54) FD-433FFD-433F GCTCATGCCTTCAACACCTCTTTC(서열번호 55) GCTCATGCCTTCAACACCTCTTTC (SEQ ID NO: 55) FD-433RFD-433R CAATCCCCAAAAGAGAAACAAGGA(서열번호 56) CAATCCCCAAAAGAGAAACAAGGA (SEQ ID NO: 56) LD-434FLD-434F TGCTGGTGCTGCCACAACCT(서열번호 57) TGCTGGTGCTGCCACAACCT (SEQ ID NO: 57) LD-434RLD-434R TGATGCCATTGCATTGAACCAA(서열번호 58) TGATGCCATTGCATTGAACCAA (SEQ ID NO: 58) FY-435FFY-435F GGCCAGCAGCAAGGGTATCA(서열번호 59) GGCCAGCAGCAAGGGTATCA (SEQ ID NO: 59) FY-435RFY-435R GGCTGCTGCTGCTGTTGGAA(서열번호 60) GGCTGCTGCTGCTGTTGGAA (SEQ ID NO: 60) LFY-436FLFY-436F AGAGCTGAACGGAGACGATT(서열번호 61) AGAGCTGAACGGAGACGATT (SEQ ID NO: 61) LFY-436RLFY-436R GCATCAAGAGCGTGATGAGT(서열번호 62) GCATCAAGAGCGTGATGAGT (SEQ ID NO: 62)

4.RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 및 GUS 염색에 의한 RNA 발현 분석4. RNA expression analysis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and GUS staining

조직화학적 GUS 염색 및 RT-PCR(Kim et al., 2010, Plant J. 64: 524-535)과 실시간 정량적 RT-PCR(Abbasi et al., 2010, Plant J. 64: 960-976)을 수행하였다. qRT-PCR을 위해서, 첫 번째 가닥 cDNA 합성은 식물체로부터 총 RNA 5 ug을 사용하여 수행하였다. 정량을 위해서 Bio-Rad iQ5 실시간 PCR 검색 시스템(Evagreen 2X 실시간 PCR Pre-Mix, 솔젠트, 한국)을 사용하였으며, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 튜불린(tubulin)은 각 유전자의 발현량을 표준화하기 위해서 사용되었다. qRT-PCR 실험은 두 개의 독립적인 생물학적 시료를 사용하였고, 3번의 기술적인 반복 실험을 수행하였다. 유전자 발현에서 배수의 변화는 2-△△CT 방법으로 계산하였다(Livak & Schmittgen, 2001, Methods 25: 402-408). 실시간 PCR을 위한 프라이머는 표 1(서열번호 43-서열번호 62)에 나타내었다. We performed real-time quantitative RT-PCR (Abbasi et al., 2010, Plant J. 64: 960-976) and histochemical GUS staining and RT-PCR Respectively. For qRT-PCR, first strand cDNA synthesis was performed using 5 ug of total RNA from plants. For quantification, Bio-Rad iQ5 real-time PCR detection system (Evagreen 2X real-time PCR Pre-Mix, Solgent, Korea) was used and performed according to the manufacturer's instructions. Tubulin was used to normalize the expression level of each gene. Two independent biological samples were used for the qRT-PCR experiment and three technical repeat experiments were performed. The change in drainage in gene expression was calculated using the 2 - ΔΔΔCT method (Livak & Schmittgen, 2001, Methods 25: 402-408). Primers for real-time PCR are shown in Table 1 (SEQ ID NO: 43-SEQ ID NO: 62).

5. 이스트 3-하이브리드, EMSA 및 RNA 면역침강 분석을 이용한 RNA-단백질 상호작용 검출 5. RNA-protein interaction detection using yeast 3-hybrid, EMSA and RNA immunoprecipitation assays

이스트 3-하이브리드 분석은 RNA-단백질 하이브리드 헌터 키트(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 간단하게, 이스트 L40-ura3 형질전환주는 하이브리드 RNA(pMS2:SOC1-R) 및 하이브리드 단백질(pVP16:AtBRNs) 벡터를 가지고 있으며, 이것은 유라실 및 트립토판이 결핍된 합성 배지 플레이트에서 선발되고, 더 나아가 X-gal을 포함하는 플레이트에서 β-갈락토시데이즈 발현을 위해 분석되었으며, 히스티딘 결핍 선택 배지에서 생장하였다. 공동-형질전환주는 pVP16:AtBRNs 및 pRH5'(MS2 단독)를 가지고 있는 것을 음성 대조구로 사용하였다. EMSA는 합성 바이오틴-표지된 2'-O-메틸 RNA(49nt)을 포함하는 SOC1 mRNA의 BRE 염기서열, GST-AtBRN 융합 단백질 및 라이트시프트 케미루미노센트 엠사 키트(LightShift Chemiluminescent EMSA kit, Thermo Scientific)를 사용하여 수행하였다. GST-AtBRN 융합 단백질은 글루타치온 세파로오스 CL-4B 컬럼(Glutahione Sepharose CL-4B 컬럼, GE Healthcare)를 사용하여 유도 및 정제 되었으며, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. RNA-단백질 결합 반응은 5X 결합 버퍼(10 mg BSA, 250 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM EDT A, 5 mM DTT, 1% Nonidet P-40, 50% 글리세롤 및 100 mM Tris - HCl, pH 7.6)를 상온에서 20분간 배양함으로써 수행하였다. 비특이적 RNA 단백질 상호작용을 최소화하기 위해서, 폴리(A) (300 ng/㎕) 경쟁자를 사용하였다. 복합체는 TBE 버퍼(45 mM Tris-borate, pH8.0, 1.0mM EDTA)에서 8% 폴리아크릴아미도 겔에 녹였다. 그리고, Amersham Hybond TM-N+(GE Healthcare) 위로 일렉트로블랏터(electroblotter)를 이용하여 이동시켰다. 맴브레인을 블록시키고, 스트렙트아비딘-호스래디쉬-퍼록시다아제(streptavidin-horseradis-peroxidase) 항체(1:300)로 배양하고, 세척한 후 제조사의 프로토콜에 따라 현상되었다. Yeast 3-hybrid analysis was performed using an RNA-protein hybrid Hunter kit (Invitrogen). Briefly, the yeast L40-ura3 transgenes have hybrid RNA (pMS2: SOC1-R) and hybrid protein (pVP16: AtBRNs) vectors, which are selected from synthetic media plates lacking yularis and tryptophan, -gal, and grown in histidine-deficient selective medium. &lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt; The co-transgenic mice carrying pVP16: AtBRNs and pRH5 '(MS2 alone) were used as negative control. EMSA is a fusion protein comprising the BRE nucleotide sequence of SOC1 mRNA comprising synthetic biotin-labeled 2'-O-methyl RNA (49 nt), GST-AtBRN fusion protein and LightShift Chemiluminescent EMSA kit (Thermo Scientific) . The GST-AtBRN fusion protein was derivatized and purified using a Glutathione Sepharose CL-4B column (Glutahione Sepharose CL-4B column, GE Healthcare) and performed according to the manufacturer's instructions. The RNA-protein binding reaction was carried out in 5X binding buffer (10 mg BSA, 250 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 1% Nonidet P-40, 50% glycerol and 100 mM Tris- ) For 20 minutes at room temperature. To minimize nonspecific RNA protein interaction, poly (A) (300 ng / mu l) competitor was used. The complex was dissolved in 8% polyacrylamidogel in TBE buffer (45 mM Tris-borate, pH 8.0, 1.0 mM EDTA). And transferred using an electroblotter on top of Amersham Hybond TM-N + (GE Healthcare). The membranes were blocked and incubated with streptavidin-horseradis-peroxidase antibody (1: 300), washed and developed according to the manufacturer's protocol.

RNA 면역침강(RIP)을 수행하였다(Peritz et al., 2006, Nat Protoc 1: 577-580). 간단하게, 애기장대 묘 추출은 면역침강 버퍼(100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 1 mM DTT, 및 0.5% Nonidet P-40)를 사용하여 준비하였으며, 3 ㎍/ml 다클론 항-AtBRBN2 또는 비 면역 토끼-IgG로 4℃에서 밤새 배양하였다. RNA-단백질 면역복합체는 단백질 A-A아가로스 비드(Sigma)에 의해 침강되었고, RT-PCR을 수행하였다. AtBRN2 항체는 특이적 합성 펩타이드(CQQSKNPLFNGLLNS)를 사용하여 토끼에서 생산하였으며, AtBRN2 펩타이드 친화적 레진(펩트론, 한국)를 사용하여 정제하였다. RNA immunoprecipitation (RIP) was performed (Peritz et al., 2006, Nat Protoc 1: 577-580). Briefly, Arabidopsis thaliana was prepared using immunoprecipitation buffer (100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 1 mM DTT, and 0.5% Nonidet P-40) AtBRBN2 or non-immunized rabbit-IgG overnight at 4 ° C. The RNA-protein immunoconjugate was precipitated by protein A-A agarose beads (Sigma) and RT-PCR was performed. The AtBRN2 antibody was produced in rabbits using a specific synthetic peptide (CQQSKNPLFNGLLNS) and purified using AtBRN2 peptide-affinity resin (Peptron, Korea).

6. 단백질 발현 분석6. Protein Expression Analysis

총 가용성 단백질은 애기장대에서 추출버퍼(125 mM Tris-HCl, pH 8.8/1% SDS/10% 글리세롤/50μM 단백질분해효소 저해제 혼합물(Protease Inhibitor Cocktail, Sigma)를 사용하여 추출하였다. 단백질은 12% 소듐 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis;PAGE)를 이용하여 분리하였고, 일렉트로블랏터(electroblotter)를 사용하여 PVDF 맴브레인(Q-biogene)으로 이동시켰다. 필터는 1시간 동안 0.1% 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 6%의 탈지 분유(Bio-RAD)로 블록한 후, 항-SOC1(1:200 펩트론), 항-GUS, 항-GFP, 항-Lhca2(1:5,000, Abcam) 또는 항-액틴(1:5,000, Sigma) 항체를 포함하는 블로킹 버퍼에서 2시간 동안 배양하였다. 블랏은 TBS에 0.1%의 Tween 20을 포함하는 버퍼로 15분간 3회 세척하였으며, 항-토끼 및 항-마우스 항체(Sigma)가 결합된 호스래디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase)를 1:10,000으로 블로킹 버퍼로 희석하고, 그것을 첨가한 후 1시간 동안 배양하였다. 블랏은 세척 후 루미놀/인핸서(Luminol/Enhancer) 용액(Thermo Scientific)을 사용하여 현상하였다. SOC1 항체는 토끼에서 만들었으며, 특정 합성 펩타이드(RHTKDRVSTKPVSEEN)로, SOC1 펩타이드 친화성 레진(펩트론)을 이용하여 정제하였다. Total soluble proteins were extracted from Arabidopsis using extraction buffer (125 mM Tris-HCl, pH 8.8 / 1% SDS / 10% glycerol / 50 μM Protease Inhibitor Cocktail, Sigma) Were separated using sodium dodecyl sulfate (SDS) -Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and transferred to a PVDF membrane (Q-biogene) using an electroblotter The filters were blocked with 6% defatted milk powder (Bio-RAD) containing 0.1% Tween 20 for 1 hour followed by anti-SOC1 (1: 200 peptone), anti-GUS, anti- The cells were incubated for 2 hours in blocking buffer containing anti-Lhca2 (1: 5,000, Abcam) or anti-actin (1: 5,000, Sigma) antibody for 15 min in TBS containing 0.1% Washed three times, and the horseradish peroxidase conjugated with anti-rabbit and anti-mouse antibody (Sigma) The horseradish peroxidase was diluted 1: 10,000 with blocking buffer, and it was added and incubated for 1 hour. After washing, the blot was developed using a Luminol / Enhancer solution (Thermo Scientific). Was made in rabbits and purified with a specific synthetic peptide (RHTKDRVSTKPVSEEN) using SOC1 peptide affinity resin (peptone).

7. 일시적인 형질도입검정(transient assay)7. Transient assay (transient assay)

4주된 35S:AtBRN1 또는 35S:AtBRN2 과발현 식물체의 엽육조직에서 원형질체를 분리하였다. 원형질체에 GFP-SOC1 I, GFP-SOC1 II, GFP-SOC1 III 또는 GFP-SOC1 IV 의 구조물을 일시적으로 감염시킨 후 12시간 동안 배양한 후 GFP의 강도를 측정하였다. Protoplasts were isolated from the leaf tissues of 4 weeks old 35S: AtBRN1 or 35S: AtBRN2 overexpressing plants. GFP-SOC1 I, GFP-SOC1 II, GFP-SOC1 III, or GFP-SOC1 IV constructs were transiently transfected with the protoplasts and cultured for 12 hours.

8. 8. 공초점Confocal 레이저 주사 현미경 관찰( Laser scanning microscope observation ( ConfocalConfocal laserlaser scanningscanning microscopymicroscopy ))

GFP 융합 구조물을 발현시킨 애기장대의 뿌리 세포를 레이저 주사 공초점 현미경(FV1000SPD, Olympus)으로 검사하였다. 식물 조직 안에서 GFP 신호는 아르곤(argon) 레이저의 488 nm 라인의 여기(excitation) 및 522 nm의 방출(emision)로 측정하였다.
The Arabidopsis root cells expressing the GFP fusion constructs were examined with a laser scanning confocal microscope (FV1000SPD, Olympus). GFP signals in plant tissues were measured by excitation of a 488 nm line of an argon laser and emission at 522 nm.

실시예Example 1.  One. AtBRN1AtBRN1 및  And AtBRN2AtBRN2 의 유전자 발현은 개화시기에 도달할수록 The gene expression of the 발현양이The amount of expression 감소된다Be reduced . .

애기장대에 존재하는 브루노 단백질 중 AtBRN1 또는 AtBRN2는 RNA 결합 단백질로, N-말단에 2개의 RNA 인지 모티프 도메인과 C-말단에 1개의 RNA 인지 모티프 도메인을 가지고 있다(도 1a). AtBRN1 또는 AtBRN2의 기능 분석을 위해, AtBRN1 또는 AtBRN2의 유전자 발현을 qRT-PCR(도 1b) 및 GUS 조직화학적인 염색으로 살펴보았다. qRT-PCR로 살펴본 유전자 발현의 결과, AtBRN1은 실리크, 줄기, 카울린 잎에서 유전자의 발현이 높았으며, AtBRN2는 실리크, 줄기, 꽃에서 유전자의 발현이 높게 나타났으며, 전체적으로 AtBRN2가 AtBRN1에 비해 낮게 발현되는 것으로 나타났다(도 1b). P AtBRN1 ::GUS 또는 P AtBRN2 ::GUS 형질전환체에서 GUS 항체를 이용한 면역블랏 분석에서 GUS 발현은 발아 후(DAG) 7일에 가장 높게 나타났으며, 식물체의 개화 시기에 도달할수록 점차적으로 발현량이 감소하였는데(도 1c), 이는 AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자들이 개화에 음성적으로 관련된 것으로 분석된다.
Among the Bruno proteins present in Arabidopsis, AtBRN1 or AtBRN2 is an RNA binding protein having two RNA-bearing motif domains at the N-terminus and one RNA-recognizing motif domain at the C-terminus (Fig. For functional analysis of AtBRN1 or AtBRN2 , gene expression of AtBRN1 or AtBRN2 was examined by qRT-PCR (Fig. 1B) and GUS histochemical staining. As a result of qRT-PCR, AtBRN1 gene expression was high in silica, stem, and cowlin leaves. AtBRN2 gene expression was high in silk , stem and flower, and AtBRN2 was expressed in AtBRN1 (Fig. 1B). In immunoblot analysis using GUS antibody in P AtBRN1 :: GUS or P AtBRN2 :: GUS transformants, GUS expression was highest at 7 days after germination (DAG) and gradually increased as the plant flowering time was reached (Fig. 1c), which suggests that AtBRN1 or AtBRN2 genes are negatively associated with flowering.

실시예 2. 야생형 식물과 비교해서 Example 2. Compared to wild type plants 35S::AtBRN135S :: AtBRN1 또는  or 35S::AtBRN235S :: AtBRN2 과발현 식물체는 개화시기가 지연되는 반면  Overexpressed plants are delayed in flowering time atbrn1atbrn1 // atbrn2atbrn2 -3-3 이중  double 변이체는The mutant 개화시기가 촉진된다. The flowering time is accelerated.

AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자의 기능 분석을 위해, 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2 과발현 식물체를 생성하였다. 또한, AtBRN1의 변이체 atbrn1 및 AtBRN2의 변이체 atbrn2-2 또는 arbrn2-3를 동정하였다. 단일 유전자의 발현이 억제된 T-DNA 변이체에서는 표현형의 변화가 보이지 않았다. AtBRN1 또는 AtBRN2의 이중 변이체인 atbrn1/atbrn2-3를 만들었다(도 1d). 35S::AtBRN1, 35S::AtBRN2 및 atbrn1/atbrn2-3 이중 변이체는 야생형의 식물과 비교해서 개화시기를 제외하고 표현형의 차이가 나타나지 않았다. 장일(LD) 조건 또는 단일(SD) 조건에서 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2의 과발현 식물체에서는 개화시기가 지연되는 반면에 atbrn1/atbrn2-3 이중 변이체 식물체에서는 개화시기가 촉진되는 표현형을 보여주었다(도 2a). 더불어, 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2 과발현 식물체에 춘화처리 후 단일(SD) 조건하에서도 여전히 개화시기가 지연되는 표현형을 나타내었다. 그렇지만, atbrn1/atbrn2-3 이중 변이체 식물체는 춘화처리 후 단일(SD) 조건하에서 개화시기의 촉진 효과가 감소되었다(도 2a). 개화시기 억제에 있어서 AtBRN1 또는 AtBRN2의 역할은 아마도 춘화처리에 의한 개화 촉진과 연과되어 있을 것으로 분석된다. 간접적인 증거로서, AtBRN1 또는 AtBRN2의 유전자의 발현은 영양 상태에서 화아기로 갈수록 감소되었다(도 1c). AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자들이 춘화처리에 의해서 영향을 받는 것인지 분석하기 위해, 야생형 식물과 춘화-둔감한 변이체 vin3에 춘화처리 후 AtBRN1 또는 AtBRN2의 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과, 야생형 식물에서는 AtBRN1 또는 AtBRN2의 유전자 발현이 감소한 반면, vin3 식물에서는 AtBRN1 또는 AtBRN2 유전자 발현량이 변화하지 않았다. vin3 변이체의 경우 춘화처리에 둔감하기 때문에 AtBRN1 또는 AtBRN2의 유전자 발현에 대한 춘화처리 효과가 약했다. 다음 실험으로 atbrn1/atbrn2-3 이중 변이체에서 개화시기 조절자들의 발현을 조사하였다. 예를 들어, 목적 유전자는 FLOWERING LOCUS T(FT), FLOWERING LOCUS C(FLC), FLK, CONSTANS(CO), SOC1, AGAMOUS-LIKE24(AGL24), AP1 또는 LFY로 대부분의 개화 경로 유전자들의 발현 수준은 야생형 식물과 비교해서 변화하지 않았으나, LFY, AP1 및 FT는 각각 3.3배, 4.2배, 2.5배 발현량이 증가하였다(도 2b).
 For functional analysis of AtBRN1 or AtBRN2 genes, 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 overexpressing plants were generated. In addition, we identified a variant or atbrn2-2 arbrn2-3 variants atbrn1 and AtBRN2 of AtBRN1. No phenotypic changes were observed in T-DNA mutants in which the expression of a single gene was inhibited. Which made atbrn1 / atbrn2-3 double mutant of AtBRN1 or AtBRN2 (Fig. 1d). The 35S :: AtBRN1, 35S :: AtBRN2 and atbrn1 / atbrn2-3 mutants showed no phenotypic difference except for the flowering time as compared with the wild type plants. Overexpression of 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 in long-term (LD) or single (SD) conditions showed that the flowering time was delayed while that of atbrn1 / atbrn2-3 (Fig. 2a). In addition, 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 overexpression plants still exhibited a delayed flowering phenotype even under single (SD) conditions. However, the atbrn1 / atbrn2-3 double mutant plants reduced the promoting effect of flowering time under single (SD) conditions after the vernalization (Fig. 2a). The role of AtBRN1 or AtBRN2 in the control of flowering time is presumed to be related to the promotion of flowering by vernalization treatment. As indirect evidence, the expression of genes for AtBRN1 or AtBRN2 was reduced from the nutritional state to the offspring (Figure 1c). AtBRN1 or AtBRN2 In order to analyze whether the genes are affected by the sexualization process, gene expression of AtBRN1 or AtBRN2 was analyzed in the wild-type plant and the vernalization-insensitive variant vin3 after the vernalization . As a result, expression of AtBRN1 or AtBRN2 gene was decreased in wild type plants, while expression of AtBRN1 or AtBRN2 gene was not changed in vin3 plants. The vin3 mutant was insensitive to the vernalization treatment, so the effect of the vernalization treatment on gene expression of AtBRN1 or AtBRN2 was weak. The following experiments examined the expression of flowering-time regulators in the atbrn1 / atbrn2-3 double mutant. For example, the gene of interest is a FLOWERING LOCUS T (FT), FLOWERING LOCUS C (FLC), FLK, CONSTANS (CO), SOC1, AGAMOUS-LIKE24 (AGL24), expression levels of most flowering pathway genes by AP1 or LFY is But the LFY, AP1 and FT increased 3.3-fold, 4.2-fold and 2.5-fold expression levels, respectively (Fig. 2b).

실시예 3. Example 3. AtBRN1AtBRN1 또는  or AtBRN2AtBRN2 유전자의 과다발현은  Overexpression of the gene SOC1 101-DSOC1 101-D 가 나타내는 극조기 개화 표현형을 억제한다. To inhibit the extremely early flowering phenotype.

AtBRN1 또는 AtBRN2 및 개화에 관여되는 유전자들 사이의 상위성을 알아보기 위해서, 35S::AtBRN1 또는 35S::BRN2 식물을 잠정적인 표적 유전자인 SOC1 101-D, 35S::AGL24, 35S::LFY, 35S::AP1 또는 35S::FT 식물과 교배하였다. 액티베이션 태깅 변이체 SOC1 101-D는 극조기 개화 표현형을 보이며(Lee et al., 2000, Genes Dev 14: 2366-2376), 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S::AtBRN2/SOC 1 101-D 교배종들은 야생형 식물과 동일하게 개화되었다(도 3a, b). 이것은 AtBRN1 또는 AtBRN2 가 SOC1 101-D의 극조기 개화 표현형을 억제한 것을 나타낸다(도 3a, b). 35S::AtBRN1/SOC1 101-D 또는 35S::AtBRN2/SOC1 101-D와 더불어, 다른 이중 과발현 식물체(35S::AtBRN1/35S::AP1, 35S::AtBRN1/35S::LFY, 35S::AtBRN1/35S::FT, AtBRN1/35S::AGL24, 35S::AtBRN2/35S::AP1, 35S::AtBRN2/35S::LFY, 35S::AtBRN2/35S::FT 또는 AtBRN2/35S::AGL24)에 과발현된 유전자들은 SOC1의 하위이며, 이들 유전자들은 단일 유전자가 과발현된 식물과 동일한 표현형을 보이는것으로 이들 유전자의 경우, 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2와 교배된 식물체에서 조기 개화 표현형을 보여주었다(도 3a, b). SOC1 101-D 식물체와 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2의 형질전환체를 교배한 후 개화시기 표현형을 살펴본 결과, 35S::AtBRN1/SOC1 101-D(n=5) 또는 35S::AtBRN2/SOC1 101-D(n=4) 동질형의 식물체는 SOC1 101-D 식물보다 개화시기가 지연되었다. 그렇지만, 개화시기가 가장 늦은 것은 AtBRN1 또는 AtBRN2의 발현 수준에 의존적으로 나타났다(도 4a, b). 종합하면, 35S:: AtBRN1 또는 35S:: AtBRN2는 완벽하게 SOC1 101-D 식물체의 극조기 개화 표현형을 억제하지만, 35S::AGL24, 35S::AP1, 35S::FT 또는 35S::LFY는 SOC1 101-D 식물체의 극조기 개화 표현형을 억제하지는 못하였다. 이것은 AtBRN1 또는 AtBRN2가 AGL24, AP1, FT 또는 LFY의 상위에서 작용하며, SOC1의 하위에 있는 것으로 분석된다. 이 결과를 토대로, 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2는 SOC1 101-D 식물체의 극조기 개화 표현형을 억제하였다(도 3a, b). 비록 야생형과 비교하였을 때 atbrn1 / atbrn2 -3 이중 변이체의 SOC1 mRNA의 수준이 약간 영향을 받았더라도, 그것은 SOC1 mRNA가 AtBRN1 또는 AtBRN2 전사후에 조절되어지는 것을 나타낸다(도 2b). 따라서, 이들 결과는 AtBRN1 또는 AtBRN2가 AtSOC1 이후의 유전자를 조절하는 것이 아니라 SOC1 또는 SOC1의 조절을 받는 유전자와 상호작용하는 것을 알 수 있다.
AtBRN1 or AtBRN2 And to find out the epistasis between genes involved in flowering, 35S :: AtBRN1 or 35S :: potential target genes of the plants BRN2 SOC1 101-D, 35S :: AGL24 , 35S :: LFY, 35S :: AP1 or 35S :: FT plants. AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D , the activation tagging mutant SOC1 101-D shows a very early flowering phenotype (Lee et al., 2000, Genes Dev 14: 2366-2376) D hybrids flowered the same as wild-type plants (Fig. 3a, b). This indicates that AtBRN1 or AtBRN2 inhibited the extremely early flowering phenotype of SOC1 101-D (Fig. 3a, b). 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D, with the other dual-overexpressing plants (35S :: AtBRN1 / 35S :: AP1 , 35S :: AtBRN1 / 35S :: LFY, 35S :: AtBRN1 / 35S :: FT, AtBRN1 / 35S :: AGL24, 35S :: AtBRN2 / 35S :: AP1, 35S :: AtBRN2 / 35S :: LFY, 35S :: AtBRN2 / 35S :: FT or AtBRN2 / 35S :: AGL24 ) Are subordinate to SOC1, and these genes exhibit the same phenotype as plants overexpressing a single gene. For these genes, an early flowering phenotype is shown in plants crossed with 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 (Fig. 3a, b). SOC1 101-D and 35S :: plant AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 of transfection after crossing the transformants result of examining the flowering-time phenotype, 35S :: AtBRN1 / SOC1 101- D (n = 5) or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D (n = 4) homozygous plants were delayed in flowering time than SOC1 101-D plants. However, the slowest flowering time was dependent on the expression level of AtBRN1 or AtBRN2 (Fig. 4a, b). In summary, 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 completely suppresses the extremely early flowering phenotype of SOC1 101-D plants, while 35S :: AGL24, 35S :: AP1, 35S :: FT or 35S :: LFY inhibits SOC1 Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 101-D &lt; / RTI &gt; It is interpreted that AtBRN1 or AtBRN2 acts at the upper level of AGL24, AP1, FT or LFY and is below SOC1 . Based on these results, 35S :: AtBRN1 or 35S :: AtBRN2 inhibited the extremely early flowering phenotype of SOC1 101-D plants (Fig. 3a, b). Even when compared to the wild type atbrn1 / atbrn2 -3, even if the received bit level of SOC1 mRNA of the double mutant effect, it indicates that the SOC1 mRNA is regulated after AtBRN1 or AtBRN2 transcription (Fig. 2b). Therefore, these results indicate that AtBRN1 or AtBRN2 does not regulate genes after AtSOC1 but interacts with genes regulated by SOC1 or SOC1 .

실시예Example 4.  4. AtBRN1AtBRN1 또는  or AtBRN2AtBRN2 는 The SOC1SOC1 mRNAmRNA 의 3' 3 ' UTRUTR 에 결합하여 In combination with SOC1SOC1 의 활성을 억제함으로써, 식물체의By inhibiting the activity of the plant 개화시기를 조절한다. Adjust the flowering time.

AtBRN1 또는 AtBRN2는 SOC1 mRNA의 시스인자(cis-element)에 결합한다. SOC1 mRNA는 3' UTR에 잠재적인 브루노 반응인자(UAUGUAU)인 시스인자가 위치한다. AtBRN1 또는 AtBRN2가 잠정적인 브루노 반응인자에 결합하는지 가능성을 검사하기 위해, 이스트 3-하이브리드 분석(SenGupta et al., 1996, PNAS 93: 8496-8501)을 수행하였다. 이것은 AtBRN1 또는 AtBRN2 단백질과 전장 SOC1 전사체(5' UTR + CDS + 3 'UTR) 사이의 상호작용을 검사하기 위한 것이다. AtBRN1 또는 AtBRN2 단백질 및 SOC1 mRNA가 공동 발현되면, HIS3 및 lacZ 유전자의 발현이 활성화된다(도 5a). 그 다음으로 AtBRN1 또는 AtBRN2와 SOC1 3' UTR 염기서열의 직접적인 상호작용을 실험하기 위해서, EMSA를 수행하였으며, 이때 GST-AtBRN1 또는 GST-AtBRN2 융합 단백질을 정제한 것과 바이오틴-표지된 SOC1 3' UTR(도 5b)를 사용하였다. GST-AtBRN1 또는 GST-AtBRN2가 SOC1 mRNA의 3' UTR(레인 3 및 8)에 결합하였으며, 대조구 GST는 RNA와 결합하지 않았다(레인 2 및 7). 경합분석에서, 10배의 몰을 초과하는 차가운 기질(SOC1 3' UTR)은 SOC1-AtBRN1 RNP 복합체(레인 4 및 9)의 형성으로 감소하였으며, 경합인자의 50배 이상 몰에서는 복합체 형성이 거의 완벽하게 억제되었다(레인 5 및 10). 더 나아가 AtBRN1 또는 AtBRN2 및 SOC1 mRNA의 상호작용을 입증하기 위해서, RNA 면역 침강(RNA immunoprecipitation, RIP) 실험을 AtBRN2(AtBRN1 항체는 불가능)의 항체를 이용하여 수행하였으며, 이것은 AtBRN 단백질을 특이적으로 인지하는 것으로, 후에 RT-PCR을 수행하였다. 항-AtBRN2 항체의 특이성을 보기 위해, 웨스턴블랏을 수행하였다. 항-AtBRN2 항체에서 높은 특이성을 관찰하였으며, 야생형과 35S:: AtBRN2 식물체에서 대략 48kDa의 크기로 검출되었으며, atbrn2 넉-아웃 식물에서는 검출되지 않았으며, 로딩 대조구는 항-액틴을 사용하였다. SOC1 전사체는 pre-immune serum를 사용해서 얻어진 침전물에서 검출되지 않은 반면에, AtBRN2 항체(도 5c)를 사용하여 얻어진 침전물에서는 증폭되었다. 이것은 식물체내에서 AtBRN2가 SOC1 mRNA와 상호작용하는 것을 보여주었다. 35S::GFP:AtBRN1 또는 35S::GFP:AtBRN2 식물체의 뿌리 세포에서, GFP 신호는 세포질에 독점적으로 위치해 있었지만, 세포질내의 GFP-AtBRN2 형태의 작은 반점들은,선택적 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐레이션(polyadenylation)으로 AtBRN1 또는 AtBRN2가 핵에서 기능을 하지 못하는 것으로 사료되며(도 5d), 이것은 다른 브루노 단백질 FCA에 의해 보여주었다(Quesada et al., 2003, Embo J. 22: 3142-3152). AtBRN1 또는 AtBRN2 및 SOC1 mRNA의 위치를 고려하였을때, 번역을 위해서는 세포질(cytosol)안으로 수송되어야만 한다. AtBRN1 또는 AtBRN2가 세포질안에서 SOC1 mRNA와 결합하는 가능성을 조사하기 위해서, SOC1 3' UTR이 과발현된 식물체에서 AtBRN1-GFP 또는 AtBRN2의 세포적인 위치를 조사하였다. AtBRN1 또는 AtBRN2가 직접적으로 핵으로 이동하기 위해서, 본 발명에서는 AtBRN1 또는 AtBRN2의 하부에 NLS(Nuclear localization signal; 핵위치신호)를 융합하였다. 융합 단백질 AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP의 세포학적 위치는 핵으로 국한시킨다. 또한, 35S:: AtBRN1 : NLS : GFP 또는 35S::AtBRN2:NLS:GFP와 35S:: SOC1(-3'UTR) 또는 35S:: AtBRN1 : NLS : GFP 또는 35S::AtBRN2:NLS:GFP와 35S:: SOC1(+3'UTR)를 공동으로 형질전환하였다. 원형질체 내에서 AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP와 SOC1(-3UTR) mRNA가 공동으로 발현되었을때, AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP의 위치가 대조구와 비교해서 차이가 없었다(도 6). 그렇지만, 원형질체 내에서 AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP와 SOC1(+3'UTR)은 공동으로 발현되었을 때, AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP는 세포질에 위치하며, 이것은 핵에 존재하던 AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP가 세포질의 SOC1 mRNA의 3' UTR과 결합하여 세포질로 이동된 것을 의미한다. AtBRN1-NLS-GFP 또는 AtBRN2-NLS-GFP의 세포질적 위치는 AtBRN1 또는 AtBRN2가 SOC1 mRNA와 결합하기 때문이다. 또한, 식물체 내에서 AtBRN이 SOC1 3'UTR-의존적 방식에 의해 SOC1의 활성을 억제하는지 알아보기 위해서, 본 발명에서는 35S::SOC1(CDS)/35S::AtBRN1 또는 35S:: SOC1 ( CDS )/35S:: AtBRN2 식물 및 SOC1 101-D(CDS + 3' UTR)/35S::AtBRN1 또는 SOC1 101-D(CDS + 3' UTR)/35S::AtBRN2 식물의 개화 표현형을 비교하였다. AtBRN1 or AtBRN2 binds to the cis-element of SOC1 mRNA. SOC1 mRNA is located in the 3 'UTR, a potential Bruno-responsive factor (UAUGUAU). Hybrid analysis (SenGupta et al., 1996, PNAS 93: 8496-8501) was performed to examine the possibility that AtBRN1 or AtBRN2 binds to a potential Bruno reaction factor. This is to examine the interaction between the AtBRN1 or AtBRN2 protein and the full-length SOC1 transcript (5 'UTR + CDS + 3' UTR). When the AtBRN1 or AtBRN2 protein and SOC1 mRNA are coexpressed , the expression of the HIS3 and lacZ genes is activated (Fig. 5A). Next, EMSA was performed to examine the direct interaction of AtBRN1 or AtBRN2 with the SOC1 3 'UTR nucleotide sequence, in which the GST-AtBRN1 or GST-AtBRN2 fusion protein was purified and the biotin-labeled SOC1 3' UTR 5b) was used. GST-AtBRN1 or GST-AtBRN2 bound to the 3 'UTR of SOC1 mRNA (lanes 3 and 8) and the control GST did not bind to RNA (lanes 2 and 7). In the competition analysis, a 10-fold molar excess of the cool substrate ( SOC1 3 'UTR) was reduced by the formation of the SOC1-AtBRN1 RNP complex (lanes 4 and 9) (Lanes 5 and 10). Furthermore, in order to demonstrate the interaction of AtBRN1 or AtBRN2 and SOC1 mRNA, RNA immunoprecipitation (RIP) experiments were carried out using antibodies to AtBRN2 (not capable of AtBRN1 antibody), which identified the AtBRN protein specifically Followed by RT-PCR. Western blot was performed to see the specificity of anti-AtBRN2 antibody. High specificity was observed in the anti-ATRBRN2 antibody and was detected at approximately 48 kDa in the wild-type and 35S :: AtBRN2 plants, It was not detected in atbrn2 knock-out plants, and anti-actin was used as a loading control. The SOC1 transcript was not detected in the precipitate obtained using the pre-immune serum, but was amplified in the precipitate obtained using the AtBRN2 antibody (Figure 5c). This showed that AtBRN2 interacts with SOC1 mRNA in the plant body. In the root cells of 35S :: GFP: AtBRN1 or 35S :: GFP: AtBRN2 plants, the GFP signal was located exclusively in the cytoplasm, but the small spots in GFP-AtBRN2 form in the cytoplasm were selectively spliced and polyadenylated It is believed that AtBRN1 or AtBRN2 fails to function in the nucleus with polyadenylation (Fig. 5d), which is shown by another Bruno protein FCA (Quesada et al., 2003, Embo J. 22: 3142-3152). Given the location of AtBRN1 or AtBRN2 and SOC1 mRNA, it must be transported into the cytosol for translation. To investigate the possibility of AtBRN1 or AtBRN2 binding to SOC1 mRNA in cytoplasm, the cellular location of AtBRN1-GFP or AtBRN2 in SOC1 3 'UTR overexpressed plants was investigated. In order to transfer AtBRN1 or AtBRN2 directly to the nucleus, NLS (Nuclear localization signal) is fused to the lower part of AtBRN1 or AtBRN2 in the present invention. The cytologic location of the fusion proteins AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP is localized to the nucleus. In addition, 35S :: AtBRN1: NLS: GFP or 35S :: AtBRN2: NLS: GFP and 35S :: SOC1 (-3'UTR) or 35S :: AtBRN1: NLS: GFP or 35S :: AtBRN2: NLS: GFP and 35S : & Lt; / RTI &gt; SOC1 (+ 3'UTR). When AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP and SOC1 (-3UTR) mRNA were co-expressed in the protoplast, the positions of AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP were not different from those of the control 6). However, AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP is located in the cytoplasm when AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP and SOC1 (+ 3'UTR) are co- NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP present in the cytoplasmic SOC1 mRNA binds to the 3 'UTR of the cytoplasm and is transferred to the cytoplasm. The cellular localization of AtBRN1-NLS-GFP or AtBRN2-NLS-GFP is determined by the presence of AtBRN1 or AtBRN2 SOC1 &lt; / RTI &gt; mRNA. In order to examine whether AtBRN suppresses the activity of SOC1 in a SOC1 3'UTR-dependent manner in plants, 35S :: SOC1 (CDS) / 35S :: AtBRN1 or 35S :: SOC1 ( CDS ) / The flowering phenotype of 35S :: AtBRN2 plants and SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) / 35S :: AtBRN1 or SOC1 101-D (CDS + 3' UTR) / 35S :: AtBRN2 plants were compared.

35S:: SOC1(CDS)/35S:: AtBRN1 또는 35S:: SOC1(CDS)/35S:: AtBRN2 식물의 개화 표현형은 35S:: SOC1(CDS)와 유사하였고, SOC1 101-D(CDS + 3' UTR)/35S:: AtBRN1 또는 SOC1 101-D(CDS + 3' UTR)/35S:: AtBRN2 식물은 야생형 식물(도 8a, b)과 유사한 정상적인 개화 표현형을 보여주었다. AtBRN1 또는 AtBRN2는 SOC1 mRNA의 3' UTR을 포함하는 SOC1 과발현 식물체에서 초기 개화를 억제한 것을 나타냈다. 다음으로, SOC1 mRNA 및 단백질의 발현수준을 Col-0, SOC1 101-D, 35S::SOC1(CDS), 35S:: AtBRN1 / SOC1 101-D(CDS + 3' UTR) 또는 35S:: AtBRN2 / SOC1 101-D(CDS + 3' UTR) 및 35S::AtBRN1/35S::SOC1(CDS) 또는 35S::AtBRN2/35S::SOC1(CDS) 식물체에서 확인하였다. 35S::AtBRN1/SOC1 101-D(CDS + 3' UTR) 또는 35S:: AtBRN2 / SOC1 101-D(CDS + 3' UTR) 식물체에서 SOC1 전사체 및 단백질 수준이 크게 감소된 반면에 35S:: AtBRN1 /35S:: SOC1(CDS) 또는 35S::AtBRN2/35S::SOC1(CDS) 식물체에서 SOC1의 전사체 및 단백질 수준은 35S::SOC1(CDS) 식물체와 유사하였다(도 8c). SOC1 101-D를 백그라운드로 사용한 AtBRN1 또는 AtBRN2 과발현 식물체에서 SOC1의 전사체는 각각 8.3% 및 16.6%가 감소한 반면, 야생형 식물을 백그라운드로 사용하였을 경우, 각각 17.8 및 48.4%로 감소하였다. 항체의 혼성화 능력이 낮은 이유로 SOC1 단백질은 야생형 식물체에서는 검출되지 않았지만, 전체적인 SOC1 RNA의 발현수준과 단백질 발현 수준은 본 발명에 사용하였던 식물체의 개화 표현형과 밀접한 관계를 보여주었다(도 8a, b, c). SOC1 mRNA의 3' UTR이 SOC1 mRNA의 감쇠에 관여되는지를 알아보고자, 본 발명에서는 35S::AtBRN1 또는 35S::AtBRN2 형질전환체 식물에서 유래한 원형질체를 이용하여 일시적인 형질도입 실험을 수행하였다. 4개의 크기로 절단된 35S::GFP:SOC1 3' UTR 구조물인 SOC1 I, SOC1 II, SOC1 III, SOC1 IV(도 7a)를 원형질체로 형질도입시킨 후, GFP-SOC1 발현을 GFP 항체를 이용하여 분석하였다(도 7b). GFP의 수준은 단지 브루노 반응인자(UAUGUAU)가 위치하는(도 7b, 도 8d) 3' UTR이 존재한 곳에서만 크게 감소되었다.
 35S :: SOC1 (CDS) / 35S :: AtBRN1 Or 35S :: SOC1 (CDS) / 35S :: AtBRN2 plants were similar to 35S :: SOC1 (CDS) and SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) / 35S :: AtBRN1 Or SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) / 35S :: AtBRN2 plants showed normal flowering phenotypes similar to wild-type plants (Fig. 8a, b). AtBRN1 or AtBRN2 inhibited early flowering in SOC1 overexpressing plants containing the 3 'UTR of SOC1 mRNA. Next, the expression levels of mRNA and protein SOC1 Col-0, SOC1 101-D , 35S :: SOC1 (CDS), 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) and 35S :: AtBRN1 / 35S :: SOC1 (CDS) or 35S :: AtBRN2 / 35S :: SOC1 (CDS) plants. 35S :: AtBRN1 / SOC1 101-D (CDS + 3 'UTR) or 35S :: AtBRN2 / SOC1 101-D (CDS + 3' UTR) SOC1 in plants and 35S transcripts, whereas the protein level is significantly reduced: AtBRN1 / 35S :: SOC1 (CDS) or 35S :: AtBRN2 / 35S :: SOC1 ( CDS) transcript and protein levels in plants SOC1 was similar to that of 35S :: SOC1 (CDS) plants (Fig. 8c). In the AtBRN1 or AtBRN2 overexpressing plants using SOC1 101-D in the background, the transcripts of SOC1 were reduced by 8.3% and 16.6%, respectively, while those of wild-type plants were reduced to 17.8 and 48.4%, respectively. Because of the low ability of the antibody to hybridize, the SOC1 protein was not detected in wild-type plants, The expression level and protein expression level of SOC1 RNA showed a close relationship with the flowering phenotype of the plants used in the present invention (Fig. 8 (a), (b) and (c)). The 3 'UTR of the mRNA to evaluate whether the SOC1 involved in the attenuation of SOC1 mRNA, in the present invention by using a 35S :: 35S :: AtBRN2 AtBRN1 or transfected by protoplast derived from a transformant plant experiments were performed transient transfection. The 35S :: GFP cut into four sizes: the SOC1 3 'UTR structure in SOC1 I, SOC1 II, III SOC1, SOC1 IV (Fig. 7a) was transfected into protoplasts, the GFP-expressing SOC1 using a GFP antibody (Fig. 7B). The level of GFP was significantly reduced only where there was a 3 'UTR in which the Brunau reaction factor (UAUGUAU) was located (FIG. 7b, FIG. 8d).

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Claims (17)

애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법. AtBRN ( Arabidopsis) derived from Arabidopsis thaliana and regulating the expression of the AtBRN gene by transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding a thaliana Bruno RNA-binding protein. 제1항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN2인 것을 특징으로 하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.2. The method according to claim 1, wherein the AtBRN protein is AtBRN1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or AtBRN2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 제1항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자를 과발현시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.2. The method according to claim 1, wherein the recombinant vector comprising the gene encoding the AtBRN protein is transfected into a plant cell to over-express the AtBRN gene to delay the flowering time of the plant than to the wild type. Way. 제1항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 저해시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.2. The method according to claim 1, wherein the flowering time of the plant is promoted by inhibiting the expression of the AtBRN gene by transforming a recombinant vector comprising the gene encoding the AtBRN protein into plant cells, How to control. 제1항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtBRN1 단백질 코딩 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 AtBRN2 단백질 코딩 유전자인 것을 특징으로 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.2. The method according to claim 1, wherein the gene coding for the AtBRN protein is an AtBRN1 protein coding gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or an AtBRN2 protein coding gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, Way. 제1항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질은 AtSOC1(Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1) mRNA의 3' UTR에 결합하여 AtSOC1 단백질의 활성을 조절하여 식물체의 개화시기를 조절하는 것을 특징으로 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.The method of claim 1, wherein the AtBRN protein is selected from the group consisting of AtSOCl ( Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1) mRNA to regulate the flowering time of the plant by regulating the activity of the AtSOC1 protein to regulate the flowering time of the plant. 제6항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질은 AtSOC1(Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1) mRNA의 3' UTR에 결합하여 AtSOC1 단백질의 활성을 억제하여 식물체의 개화시기를 지연하는 것을 특징으로 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the AtBRN protein is selected from the group consisting of AtSOCl ( Arabidopsis thaliana Suppressor of Overexpression of CO1) mRNA to inhibit the activity of AtSOC1 protein to delay the flowering time of the plant. 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.AtBRN ( Arabidopsis) derived from Arabidopsis thaliana thaliana Bruno RNA-binding protein) gene, and regulating the expression of the AtBRN gene by transforming the plant cell with a recombinant vector comprising the gene encoding the Thaliana Bruno RNA-binding protein. 제8항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 AtBRN2인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.9. The method according to claim 8, wherein the AtBRN protein is AtBRN1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or AtBRN2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 제8항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자를 과발현시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.[Claim 9] The method according to claim 8, wherein the recombinant vector comprising the gene encoding the AtBRN protein is transfected into a plant cell to overexpress the AtBRN gene to delay the flowering time of the plant. 제8항에 있어서, 상기 AtBRN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtBRN 유전자의 발현을 저해시켜 야생형보다 식물체의 개화시기를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.9. The method according to claim 8, wherein the plant cell is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the AtBRN protein AtBRN And promoting the flowering time of the plant by inhibiting the expression of the gene. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 개화시기가 조절된 형질전환 식물체.12. A transgenic plant having regulated flowering time, which is produced by the method of any one of claims 8 to 11. 제12항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 개화시기가 조절된 형질전환 식물체.13. The transgenic plant according to claim 12, wherein the transgenic plant is a dicotyledonous plant. 제13항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 개화시기가 조절된 형질전환 식물체.14. The transgenic plant according to claim 13, wherein the dicotyledon is a Arabidopsis thaliana. 제12항의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 종자.The seed of the transgenic plant of claim 12, wherein the flowering time is controlled. 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 개화시기가 조절된 형질전환 식물체.A transgenic plant transformed with a recombinant vector containing a gene coding for Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein (ATBRN) derived from Arabidopsis thaliana and regulated in flowering time. 애기장대 유래의 AtBRN(Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 개화시기 조절용 조성물.A composition for regulating flowering time of a plant, which contains, as an active ingredient, a recombinant vector comprising a gene encoding Arabidopsis thaliana Bruno RNA-binding protein (ATBRN) derived from Arabidopsis thaliana .
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