KR101384349B1

KR101384349B1 - 세린-팔미토일트랜스퍼라아제 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR101384349B1
Application number: KR1020110038197A
Authority: KR
Inventors: 유환수; 이윤선; 이용문; 윤여표
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2014-04-24
Also published as: KR20120090733A

Abstract

본 발명은 세린-팔리토일트랜스퍼라아제(SPT)의 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 SPT 활성 저해제는 암세포내에서 스핑고지질의 함유량을 변화시킴으로써 암세포 주기의 진행을 저해하여 뛰어난 암세포 항증식 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 유효성분인 SPT 활성 저해제는 항암제로 개발될 수 있다.

Description

세린-팔미토일트랜스퍼라아제 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Anti-Cancer Composition Comprising An Inhibitor for Serine-Palmitoyltransferase As Active Ingredient}

본 발명은 세린-팔미토일트랜스퍼라아제 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

악성 진행성 멜라노마(melanoma)는 예후가 좋지 않은 가장 침윤성이 높은 암이며, 이의 발병률이 빠르게 증가하고 있다. 전이성 멜라노마 환자의 생존기간은 4.7 내지 11 개월이며, 평균 생존기간은 8.5 개월이다(1). 멜라노마 환자에 있어서 생존율이 낮은 주요 원인은 세포사 경로의 조절 이상에 의해서 나타나는 방사선 및 화학요법제 치료에 대한 내성이다(2-4). 멜라노마의 경우 수술후 사용가능한 몇 종류의 보조적 면역치료제가 승인 받았다(5-6). 진행성 멜라노마의 면역치료에 인터페론-α 및 IL-2가 일반적으로 사용되어 왔으나(5-7), 이들은 심각한 독성을 나타내며 만족할 만한 항암효과를 보이지 않았다.

천연물을 소재로한 효과적 항암효과를 갖는 후보 약물 탐색 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 미리오신(myriocin)은 무포자균목(Mycelia sterilia), 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 및 눈꽃동충하초(Cordyceps cicadae)에 의해 생성되며, ISP-1 또는 써모지모시딘(thermozymocidin)으로도 알려졌으며, 이의 화학구조는 (2S, 3R, 4R, 6E)-2-아미노-3,4-디히드록시-2-히드록시메틸-14-옥소-6-에이코세노인산인 것으로 밝혀져 있다(8-9)(도 1a).

미리오신은 림프구와 IL-2 의존성 마우스 세포독성 T 세포의 증식을 억제한다(10). 또한, 미리오신은 스핑고지질 중간체의 세포내 풀(pool)을 감소시키는 스핑고지질 생합성 경로의 첫 단계 효소인 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase)를 억제하는 것으로 알려져 있다(11). 스핑고지질은 고도의 생리활성을 가지며, 세포사, 세포 증식, 세포 이동, 노쇠 또는 염증의 조절에 관여한다(12-16). 세라미드 및 스핑고신은 세포사 조절에 관여하며, 일인산 스핑고신은 세포 증식의 신호전달 경로에 작용하는 것으로 보고되었다(17-19). 일인산 세라미드는 염증성 반응을 중개하는 세포질 포스포리파아제 A2의 직접적인 활성인자로 확인되었다(13). 다제 내성 난소암세포에서 글라이코스핑고리피드(당스핑고지질) 프로파일의 변화는 락토실세라미드 생합성과 골지체내 글루코실세라미드 생합성이 서로 관련이 없다는 것을 시사한다(20).

세포 증식은 CDK (cyclin-dependent kinase)와 결합하여 작용하는 사이클린(cyclin)에 의해 조절되는 세포주기의 진행과 밀접하게 관련되어 있다(21). 세포주기의 G1 단계에서 S 단계로의 진행 및 G2 단계에서 M 단계로의 진행과정은 다양한 종류의 CDKs에 의해 조절된다. 세포주기의 진행은 CDK4, CDK6, Cdc2, cyclin B1, cyclin D, cyclin E 및 CDK 억제단백질들의 활성을 경유하여 발생한다(22-24). 세포주기의 진행 정지(cell cycle arrest)는 CDK 억제단백질이 사이클린-CDK 복합체와 결합함으로써 유도된다(25).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포내의 새로운 항암 타겟 발굴을 통하여 효율적인 신개념 항암제를 개발하기 위한 연구를 진행하였다. 그 결과, 스핑고지질 생합성 경로의 핵심 효소인 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serin palmitoyltransferase, SPT)의 활성 저해제인 미리오신(myriocin)이 세포내에서의 스핑고지질의 함량 변화를 유도하고, 세포주기의 G2/M 전이(transition)를 특이적으로 억제함으로써 암세포의 증식 억제 활성이 있다는 것을 실험적으로 증명하였고, 이로써 상기 SPT 효소가 새로운 항암 타겟이 될 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase, SPT)의 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase, SPT) 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 용어 "세린 팔미토일트랜스퍼라아제(SPT)"는 팔미토일-CoA와 L-세린을 기질로하여, 3-디하이드로-D-스핑가닌 (3-keto sphinganine), CoA 및 CO₂를 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 반응은 세포내 스핑고지질 대사체인 스핑고신(sphingosine)의 신생합성 경로(de novo synthesis)에서 율속 단계(rate-limiting step)이다.

본 발명은 상기 암세포에서 세린 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성을 저해하면 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 최초로 규명한 것에 기초한다.

본 발명의 항암 활성성분은 "세린 팔미토일트랜스퍼라아제"의 활성 저해제이다. 하기 실시예에서 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(SPT)의 특이적 저해제로서, 이미 공지된 미리오신(myriocin)을 이용하여 항암활성을 확인하고 있으나, 본 발명은 세린 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성을 억제함으로써 스핑고지질의 생합성을 저해하고, 이로써 항암활성이 발휘된다는 것을 명확히 규명하고 있으므로, SPT 저해 활성을 갖는 것이라면 미리오신 이외의 다른 어떠한 물질도 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업자에게 자명하다.

현재까지 공지되어 있는 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(SPT)의 활성 저해제로는 미리오신(myriocin), 스핑고펀진(Sphingofungin) B, 스핑고펀진 C, 및 리폭사마이신(Lipoxamycin)을 들 수 있으나[The Journal of Biological Chemistry, Vol 267, No.35, Issue of December 15, pp. 25032-25038, 1992; Medical Mycology 2009, 47 (Supplement I), S53-S71); The Open Enzyme Inhibition Journal, 2008, 1, 72-79], 본 발명의 SPT 활성 저해제가 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 "세린 팔미토일트랜스퍼라아제(SPT)"의 활성 저해제는 미리오신(myriocin)이다.

하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 SPT 활성 저해제인 미리오신은 멜라노마 세포는 물론 이외의 다양한 암세포, 즉 유방암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 간암 세포, 대장암 세포 및 전립선암 세포의 증식을 매우 효과적으로 억제하였다. 또한, 멜라노마 세포의 이종이식 동물모델을 대상으로 한 생체 내(in vivo) 실험에서 종양의 성장을 현저히 억제하였다.

본 발명의 SPT 활성 저해제는 세포내의 세라미드, 스핑고미엘린, 디하이드로세라미드, 스핑고신, 스핑가닌, 일인산 스핑고신, 일인산 스핑가닌과 같은 다양한 스핑고지질(sphingolipid)의 합성을 저해하여, 이들의 세포내 함량을 감소시킨다.

또한, 본 발명의 SPT 활성 저해제는 암세포의 세포주기 중 G2/M으로의 진행(transition)을 억제함으로써, 암세포 증식 억제작용을 나타낸다.

또한, 본 발명의 SPT 활성 저해제는 암세포에서 세포의 주기 조절 단백질인 p53, p21의 발현을 상향조절하고, Cdc2, 사이클린(cyclin) B1, Cdc25C의 발현을 하향조절한다.

또한, 본 발명의 SPT 활성 저해제는 세포이동(cell migration)을 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항암용 조성물은 (a) "세린 팔미토일트랜스퍼라아제 활성 저해제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인“암(cancer)”은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침윤적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용된다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암은 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 위암(stomach cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer), 골수암(bone marrow tumor) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 본 발명의 조성물은 피부암, 피부흑색종(melanoma), 유방암, 폐암, 위암, 간암, 대장암 또는 전립선암의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ⅱ) 질환 또는 질병의 경감; 및 (ⅲ) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 암질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예컨대, 피부암에 적용되는 경우 피부내 주입이 가장 효과적인 경로로 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 항암용 식품, 특히 항암용 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 활성성분인 세린 팔미토일트랜스퍼라아제 활성 저해제 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 암의 예방 매우 유용하다.

이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 세린-팔리토일트랜스퍼라아제(SPT)의 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 SPT 활성 저해제는 암세포내에서 스핑고지질의 함유량을 변화시킴으로써 암세포 주기의 진행을 저해하여 뛰어난 암세포 항증식 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 유효성분인 SPT 활성 저해제는 항암제로 개발될 수 있다.

도 1b, 도 1c 및 도 1d는 각각 멜라노마 세포 증식, DNA 합성과 세포이동에 대한 미리오신(myriocin)의 억제 효과에 관한 결과를 보여준다.
도 1a는 미리오신(myriocin)인 (2S,3R,4R,6E)-2-아미노-3,4-디히드록시-2-히드록시메틸-14-옥소-6-에이코세노인산의 화학구조식을 보여준다.
도 1b는 미리오신의 멜라노마 세포의 증식 억제 효과를 보여준다. B16F10 멜라노마 세포들을 6-웰 플레이트내에서 웰(10 cm²)당 10⁵ 세포의 농도로 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. 세포들을 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 미리오신에 24-96 시간 동안 노출시키고, 형태적 외관 및 세포 컨플루언시 위상차 현미경하에서 관찰하였다(확대비율, x100). 이어서, 세포들을 트립신 처리하고, 세포의 수를 혈구계수기를 사용하여 측정하였다.
도 1c는 미리오신의 멜라노마 세포의 DNA 합성 저해 효과를 보여준다. 미리오신에 세포를 노출시키면서 4 시간 동안 [³H] 티미딘 처리를 하였다. 이후에 라벨링 반응을 종료하고, 액체 신틸레이션 카운터를 사용하여 정량하였다. 데이터는 각각 3회 반복한 3번의 독립적 실험 결과에 대하여 평균±SD으로 표현하였다. 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성있는 차이는 *P < 0.05 및 **P < 0.01 이었다.
도 1d는 미리오신의 멜라노마 세포 이동억제 효과를 보여준다. 세포에 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 미리오신을 24-48 시간 동안 노출시킨 후 세포를 제거한 지역(denuded area)으로의 세포이동을 산정하였다. 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의성있는 차이는 *P < 0.05 및 **P < 0.01이었다.
도 1e, 도 1f 및 도 1g는 다양한 암세포주에서 미리오신의 세포 증식 억제 효과를 보여준다. 사람으로부터 유래한 유방암세포(MCF7), 폐암세포(H460), 위암세포(NKM45), 간암세포(HepG2), 대장암세포(HCT116), 전립선암세포(PC3)의 세포들을 6-웰 플레이트내에서 웰(10 cm²)당 10⁵ 세포의 농도로 접종하고, 24 시간 동안 배양하였다. 세포들을 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 미리오신에 24 - 72 시간 동안 노출시키고, 외관 형태 및 세포 컨플루언시를 위상차 현미경하에서 관찰하였다(확대비율, x100). 이어서, 세포들을 트립신으로 처리하고, 세포의 수를 혈구계수기를 사용하여 측정하였다.
도 2a 내지 도 2c는 미리오신의 세포 독성 여부의 실험결과를 보여준다.
도 2a는 세포들을 1 μM 및 10 μM 농도의 미리오신에 24-96 시간 동안 노출시키고, WST 분석에 의해 세포 생존능 분석을 행한 결과이다.
도 2b는 세포들을 1 μM 농도의 미리오신으로 처리한 후, 세포 용해물을 10％ SDS-PAGE 및 면역블로팅을 사용하여 분석한 결과이다. 농도 측정기로 정량한 후에, 각각 2회 반복된 3회의 상이한 실험으로부터의 데이터를 평균±SD으로 표현하였다. 카스파아제(caspase) 3 및 단편화된 카스파아제 3의 발현 수준을 측정하였다.
도 2c는 세포들을 아넥신(annexin) V-FITC/PI 이중 염색한 후에, 유세포 분석에 의해 아폽토시스를 평가한 결과를 보여준다.
도 3은 멜라노마 세포 주기 진행에 대한 미리오신의 억제 효과를 보여준다. 도 3의 패널 A는 B16F10 세포를 0, 1 및 10 μM의 미리오신으로 48 시간 동안 처리하고, 트립신 처리하여 세포를 수집한 것이다. 도 3의 패널 B는 세포를 1 μM 농도의 미리오신에 0-72 시간 동안 노출시키고 수집한 것이다. 세포들은 PI 용액으로 염색하고, 유세포 분석기를 사용하여 실험당 10,000 이벤트(event)를 분석하였다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 적어도 3회의 독립적인 실험의 대푯값이다. 세포 주기 진행은 Modifit LT 프로그램을 사용하여 결정하였다.
도 4는 세포 주기 조절 단백질의 발현에 대한 미리오신의 영향을 측정한 결과이다. B16F10 세포를 농도가 0 μM 부터 10 μM까지 증가되는 미리오신에 24-48 시간 노출시켰다. p53, p21 및 Chk2의 발현 측정을 위해 세포 샘플을 미리오신 처리 후, 24 시간에서 수집하였고, Cdc25C, PLK1, 사이클린(cyclin) B1, Cdc2 및 Wee1 발현 측정을 위한 세포 샘플들은 48 시간에서 수집하였다. 세포 용해물을 10％ SDS-PAGE 및 면역블로팅 방법으로 분석하였다. 농도측정기로 정량한 후, 데이터는 각각 2회 반복된 3번의 상이한 실험의 평균±SD로서 표현하였다(*P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 대조군).
도 5는 미리오신에 의해 유도되는 p53 및 p21 발현증가에 대한 카페인(caffeine)의 영향을 측정한 결과이다. B16F10 세포들을 카페인(0, 3 및 5 mM) + 미리오신(1 μM)에 24 시간 동안 노출시켰다. 세포 용해물은 10％ SDS-PAGE 및 면역블로팅 방법으로 분석하였다. 농도측정기로 정량분석한 후에, 데이터는 각각 2회 반복된 3회의 상이한 실험의 평균±SD로서 표현하였다(**P < 0.01 vs. 미리오신 단독 처리군).
도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d는 스핑고지질 생합성에 대한 미리오신의 영향을 보여준다.
도 6a는 세라미드가 신생 합성에 의해 생성될 수 있으며, 세라미다아제에 의해 분해되어 스핑고신을 형성할 수 있음을 보여준다. 미리오신은 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase)의 특이 억제제로서 작용한다.
도 6b는 멜라노마 세포를 1μM 농도의 미리오신에 0-72 시간 동안 노출시키고, 지질 추출 및 SCDase에 의한 디아실화에 이어서 HPLC 분석에 의해 세라미드 수준을 측정한 결과이다.
도 6c는 지질 추출에 이어서 HPLC 분석에 의해 스핑고신 농도를 측정한 결과이다. 측정값들은 3회(n=3-5)의 상이한 실험의 평균±SD으로서 표현하였다.
도 6d는 멜라노마 세포를 1μM 농도의 미리오신에 0-72 시간 동안 노출시키고, 지질 추출 및 SCDase와 스핑고마이엘리나아제(sphingomyelinase) 반응에 의해 스핑고이드 베이스를 방출시켜 HPLC 분석으로 스핑고마이엘린(sphingomyelin)의 함량을 측정한 결과이다. 측정값들은 3회(n=3-5)의 상이한 실험의 평균±SD으로서 표현하였다.
도 7a 및 도 7b는 미리오신에 의해 유도되는 세포성장억제 및 감소된 세라미드 함량에 대한 C8-세라미드의 효과를 보여준다.
도 7a는 B16F10 멜라노마 세포를 1 mM 미리오신 및 C8-세라미드(0, 0.1, 1, 10 및 20 μM)으로 24-72 시간 동안 노출시키고, 세포의 수를 세포계수기를 사용하여 계수한 결과이다.
도 7b는 지질을 추출하고, SCDase에 의해 디아실화시킨 후에, HPLC 분석에 의해 세라미드의 수준을 측정한 결과이다. 측정값들은 3회(n=3)의 상이한 실험의 평균±SD으로 표현하였다.
도 8은 본 발명자들이 제안하는 멜라노마 세포내에서 미리오신에 의한 세포 주기의 정지와 관련된 신호전달 경로이다.
도 9는 이종이식 동물모델의 실험 디자인을 보여주는 도면이다. B16F10 멜라노마 세포를 C57BL/6J 마우스의 옆구리 부분에 피부내 주사를 통해 접종하였다. 2일 후에, 미리오신을 1 mg/kg 용량으로 피부내(i.d.), 복강내(i.p.) 또는 경구(p.o.) 경로로 3 주간 격일로 투여하였다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 미리오신의 항종양 효과를 투여경로에 따라 조사한 결과를 보여준다.
도 10a는 마우스에게 미리오신을 피부내 투여한 후 실험기간동안 격일로 체중을 측정한 결과와, 실험 종료시에 동물을 희생시키고 주위의 근육과 피부를 제거하여 분리한 종양의 사진이다. 측정값들은 평균±SD으로 표현하였다(*P < 0.05 and **P < 0.01 vs. 식염수).
도 10b는 마우스에 미리오신을 복강내 투여한 후, 실험동안 격일로 체중을 측정한 결과와, 실험 종료시에 동물을 희생시키고 주위의 근육과 피부를 제거하여 분리한 종양 사진이다. 측정값들은 평균±SD으로 표현하였다(*P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 식염수).
도 10c는 마우스에 미리오신을 경구 투여한 후, 실험동안 격일로 체중을 측정한 결과와, 실험 종료시에 동물을 희생시키고 주위의 근육과 피부를 제거하여 분리한 종양 사진이다. 측정값들은 평균±SD으로 표현하였다(*P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 식염수).
도 11a 내지 도 11d는 종양 질량과 마우스 종양 조직에서의 스핑고지질과의 관련성을 보여주는 실험결과이다.
도 11a는 마우스 멜라노마 모델의 종양 조직으로부터 분리한 종양의 무게를 측정한 결과이다. 종양의 무게는 그램(gram)으로 표현하였다.
도 11b는 마우스 멜라노마 모델의 종양 조직으로부터 분리한 종양의 크기를 측정한 결과이다. 종양의 크기는 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, mm³으로 표현하였다.
도 11c는 마우스 멜라노마 모델의 종양 조직으로부터 지질을 추출하고, SCDase에 의한 디아실화 및 HPLC 분석에 의해 세라미드 및 디하이드로세라미드 수준을 측정한 결과이다.
도 11d는 마우스 멜라노마 모델의 종양 조직으로부터 지질을 추출하고, HPLC 분석에 의해 스핑고신 및 스핑가닌 수준을 측정한 결과이다.
도 11a 내지 도 11d에서 상기 데이터는 3회의 상이한 실험(n=5)의 평균±SD으로 표현하였다. *P < 0.05 및 **P < 0.01을 대조군과 통계학적 유의한 차이를 보이는 것으로 하였다.
도 12a 내지 도 12c는 마우스 종양 조직에서 세포 주기 조절 단백질의 발현에 대한 미리오신의 영향을 측정한 결과이다.
도 12a는 대조군 및 미리오신-처리한 마우스로부터의 종양 조직 균질물을 용해시켜 Cdc2의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 12b는 대조군 및 미리오신-처리한 마우스로부터의 종양 조직 균질물을 용해시켜 사이클린(cyclin) B1의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 12c는 대조군 및 미리오신-처리한 마우스로부터의 종양 조직 균질물을 용해시켜 Cdc25C의 발현수준을 측정한 결과이다.
상기 도 12a 내지 도 12c에서 조직 용해물은 10％ SDS-PAGE 및 면역블로팅을 사용하여 분석하였다. 농도측정기에 의한 정량후에 데이터를 각각 3회 반복한 3회의 독립적인 실험의 평균±SD의 값으로 표현하였다(*P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 식염수 대조군(saline control)).
도 13a 및 도 13b는 마우스 종양 조직에서 p53 및 p21^waf1 ^/ ^cip1의 발현에 대한 미리오신의 영향을 측정한 결과이다.
도 13a는 대조군 및 미리오신-처리한 마우스로부터의 종양 조직 균질물을 용해시켜, p53의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 13b는 대조군 및 미리오신-처리한 마우스로부터의 종양 조직 균질물을 용해시켜 p21^waf1 ^/ ^cip1의 발현수준을 측정한 결과이다.
상기 도 13a 및 도 13b에서 조직 용해물은 10％ SDS-PAGE 및 면역블로팅으로 분석하였다. 농도측정기에 의한 정량 후에 데이터를 각각 3회 반복한 3회의 독립적인 실험의 평균±SD의 값으로 표현하였다(*P < 0.05 and **P < 0.01 vs. 식염수 대조군).
도 14a 및 도 14b는 미리오신의 반복적 투여와 종양 성장 사이의 연관성을 보여주는 도면이다. C57BL/6J 마우스를 B16F10 멜라노마 세포로 접종하였다. 미리오신(1 mg/kg)을 멜라노마 세포를 접종한 후에 2, 10, 및 16일에 투여 개시하여 3주간 피부내 투여하였다. 미리오신 투여의 반복 횟수는 초기 용량 시간 스케쥴에 따라 3회, 6회 및 10회 반복하였다.
도 14a는 마우스 각 실험군의 종양 발생을 보여주는 도면이다.
도 14b는 측정된 종양의 무게를 그램(gram)으로 표시한 결과와, 종양을 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 이의 부피를 [(폭)² X (길이)/2]에 의해 산출한 결과를 보여준다. 측정된 값은 평균±SD으로 표시하였다. **P < 0.01 vs. 식염수 투여 대조군(10회 투여) 및 #P < 0.01 vs. 식염수 투여 대조군(6 회 투여).
도 15는 본 발명자들에 의해 제안되는 종양 성장에 대한 미리오신의 억제적 영향을 보여주는 메카니즘이다. 미리오신은 스핑고지질 신생 합성 경로에서 세린 팔미토일트랜스퍼라아제 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이종이식 멜라노마 동물 모델에서 스핑고지질 대사물의 수준이 감소함으로써, p53 및 p21^waf1/cip1의 발현을 상향조절하거나 Cdc25C의 발현을 하향조절하고, 이어서 사이클린(cyclin) B1 및 Cdc2 발현을 억제하며, G2/M 단계 중지 결과를 가져와 최종적으로 종양의 성장을 억제한다. ⊥, ↑, ↓의 기호는 각각 억제, 상향조절, 하향조절을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 시약

미리오신(myriocin), 카페인(caffeine) 및 OPA(o-phthalaldehyde)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)으로부터 구입하였으며, RPMI 1640 배지는 Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA)으로부터 구입하였다. SCDase(Sphingolipid ceramide N-deacylase)는 Takara (Shiga, Japan)으로부터 구입하였으며, [³H]-티미딘은 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)으로부터 구입하였다. 카스파아제(Caspase) 3 및 단편화된 카스파아제 3에 대한 항체들은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. 사이클린(cyclin) B1, Cdc2, Cdc25C, Chk2, PLK1, Wee1, p53 및 β-액틴에 대한 1차 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)으로부터 구입하였고, p21^waf1/cip1 항체는 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)으로부터 구입하였다. C₁₇ based-스핑고신, C₈-세라미드 및 N-올레오일-D-에리트로-스핑고신(C₁₇ base)은 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)으로부터 구입하였다. 다른 시약들은 최고 순도의 것을 사용하였다.

2. 세포 배양

쥐 멜라노마로부터 유래한 B16F10 세포를 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하고, 37℃의 CO₂ 인큐베이터내에서 10％ FBS(fetal bovine serum), 100 units/㎖의 페니실린, 100 μg/㎖의 스트렙토마이신 및 2 mM의 L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 미리오신은 에탄올 용액의 형태로 세포에 첨가하였고, 대조군 세포들은 동일한 농도의 용해제(vehicle)(0.05％를 초과하지 않음)를 첨가 하였다.

3. 세포증식 및 생존 분석

세포증식의 측정을 위해, B16F10 멜라노마 세포를 6-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하고, 10％ FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포들이 70％의 컨플루언스에 도달하였을 때, 배지에 미리오신(myriocin)을 첨가하여 24-96 시간 동안 처리하였다. 처리 후에 웰의 세포를 트립신-EDTA로 처리하여 수집하고 세포계수기(hemocytometer)를 사용하여 계수하였다. 세포 생존능을 결정하기 위해, 세포들을 96-웰 배양 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/㎖의 농도로 접종하여 24 시간 배양하고, 미리오신(myriocin)의 존재하에서 24 - 96 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. WST-1 시약을 배양물에 첨가하여 4 시간 동안 인큐베이션하고, 마이크로플레이트 리더(Packard Instrument Co.; Downers Glove, IL, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. DNA 합성 분석

DNA의 합성은 [³H]-티미딘이 혼입되는 양을 통해 측정하였다. 간략하게 설명하면, B16F10 세포를 배양하여 미리오신에 24 - 96 시간 동안 노출시키면서 2 μCi/㎖의 [³H]-티미딘을 4 시간 동안 처리하였다. 세포들을 10％ 트리클로로아세트산 및 에탄올/에테르(1:1, v/v)를 포함하는 얼음 냉각된 PBS을 사용하여 약하게 세척하고, 0.5N NaOH으로 용해시켰다. 세포 용해물을 액체 신틸레이션 칵테일(Ultimagold, Packard Bioscience; Meriden, CT, USA)과 혼합하고, 방사능을 액체 신틸레이션 카운터(LS3801, Beckman; Dㆌsseldorf, Germany)를 사용하여 측정하였다.

5. 세포이동 분석

세포이동은 세포를 제거한 지역(denuded area)으로 세포가 이동하는 정도를 측정하였다. B16F10 세포를 컨플루언스가 될 때까지 배양한 후 파이펫 팁(200 μl)으로 배양용기 바닥에 자란 세포를 제거하였다. 미리오신에 24 - 48 시간 동안 노출시킨 후 세포 제거지역으로의 세포 이동을 산정하였다. 이동거리는 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

6. 아넥신(Annexin) V 및 PI 이중 염색 분석

세포사(apoptosis)는 제조자(Roche; Mannheim, Germany)의 지시서에 따라, Annexin V-FLOUS 키트를 사용하여 측정하였다. 아넥신(annexin) V는, 아폽토시스 과정에 있는 세포 표면에 노출되나 정상세포에서는 노출되지 않는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 잔기에 결합하는 단백질이다. 간략하게 설명하면, 쥐(murine) 멜라노마 세포를 24 시간 동안 배양하고, 미리오신으로 48 시간 동안 처리하였다. 멜라노마 세포들을 수집하고 결합 완충액내에서 재현탁하고, FITC-표지된 아넥신(annexin) V와 암조건에서 15 분간 인큐베이션하였다. 멜라노마 세포들을 FACS Calibur (Becton Dickinson; San Jose, CA, USA)에 의해 분석하였다.

7. 세포 주기 진행 분석

세포 주기(cell cycle)은 PI(propidium iodide) 염색후에 유세포분석에 의해 측정하였다. 세포 주기 진행을 분석하기 위해, 웰당 10⁵ 세포의 농도를 갖는 세포 현탁액을 70％의 에탄올로 4℃에서 하룻밤 고정하였고, 이어서 PI 염색 시약으로 하룻밤 인큐베이션하였다. 염색 후에 한 실험당 10,000 세포를 FACS Calibur를 사용하여 분석하였고, 세포주기의 진행은 Modifit LT program (Verity Software House; Topsham, ME, USA)을 사용하여 결정하였다.

8. 웨스턴 블롯 분석

멜라노마 세포들을 미리오신을 포함하는 RPMI 1640 배지내에서 24 - 48 시간 동안 배양하였다. 사이클린 B1, Cdc2, Cdc25C, Chk2, PLK1, Wee1, p53 및 p21^waf1/cip1 발현의 분석을 위해, 세포들을 단백질 용해 완충액내에서 재현탁하고, BCA 단백질 분석을 행하였다. 단백질 샘플들을 10 - 15％ SDS-PAGE에 의해 전기영동하여 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(GE Healthcare Life Sciences; Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 막을 1차 및 2차 항체와 인큐베이션하고, ECL (enhanced chemiluminescence)(Amersham Pharmacia Biotech)으로 전개한 후, X-레이 필름(Eastman-Kodak; Rochester, NY, USA)에 노출시켰다. 1차 항체 및 이들의 희석 비율을 다음과 같았다: 사이클린 B1 (1:500); Cdc2 (1:200); Cdc25C (1:1000); p21^waf1/cip1 (1:1000); Chk2 (1:1000); PLK1 (1:1000); Weel (1:500); p53 (1:1000); 카스파아제(caspase) 3 (1:1000); 단편화된 카스파아제(caspase) 3 (1:1000) 및 β-actin (1:1000).

9. 스핑고지질 분석 (sphingolipid analysis)

세라미드 및 스핑고미엘린 분석은 기존에 기술된 방법(26, 43)에 따라 수행하였다. 간략하게 설명하면, 세라미드(C₁₇ base) 또는 디하이드로스핑고미엘린(C₁₈ base)을 내부 표준물질로서 샘플에 첨가한 후에, 샘플로부터 지질성분을 37℃에서 1 시간 동안 추출하고, 세라미드 및 디하이드로세라미드 또는 스핑고미엘린은 디이소프로필에테르/메탄올/29％ NH₄OH (40:10:1, v/v/v) 또는 클로르포름/메탄올/29％ NH₄OH (65:25:4, v/v/v)내에서 전개한 후 TLC에 의해 분리하였다. 세라미드를 SCDase에 의해 디아실화시키거나 또는 스핑고미엘린은 SCDase와 sphingomyelinase의 동시처리에 의해 방출되는 스핑고신을 HPLC로 분석하였다. 스핑고신을 측정하기 위해, 내부 표준물질로서 스핑고신(C₁₇ base)를 첨가한 후 37℃에서 1 시간 동안 지질성분을 추출하였다. 이어서 OPA 유도체화시킨 후 HPLC에 의해 분석을 행하였다. 한편, 스핑고이드 염기 및 일인산 스핑고이드 염기를 정량하기 위해서는, 내부 표준물질로서 스핑고신(C₁₇ base)와 일인산 스핑고신(C₁₇ base)를 각각 첨가하고, 지질성분을 0.1 M 메탄올성 KOH/클로로포름(2:1, v/v)으로 37℃에서 1 시간 동안 추출하였다. 일인산 스핑고신 및 일인산 스핑가닌은 알카라인 포스파타아제에 의해 탈인산화시켰다. 스핑고신 및 스핑가닌은 OPA 유도체화시킨 후에 HPLC에 의해 분석하였다.

10. 생체 내(in vivo) B16F10 종양 이종이식(xenograft) 모델

6-7 주령의 수컷 C57BL/6J (20-23g) 마우스를 Japan SLC (Hamamatsu, Japan)으로부터 구입하고, 동물 사육시설내에서 1 주일간 적응시켰다(22℃, 12 시간 명/암 사이클). 동물을 Samyang Co. (Wonju, Korea)으로부터 상업적으로 구매한 펠렛 다이어트와 식수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. B16F10 멜라노마 세포를 26-게이지 니들을 사용한 피내주사(10⁶ 종양세포/0.2 ㎖ PBS/마우스)에 의해 동물의 피내에 주입하여 접종하였다. 2일 후에, 마우스에 미리오신을 1 mg/kg의 용량으로 3주 동안 이틀에 1회씩 복강내(intraperitoneally), 피부내(intradermally), 또는 경구(orally) 투여하였다. 식염수를 투여한 군을 대조군으로 사용하였다. 동물의 체중을 주기적으로 모니터링하였다. 종양의 부피를 버니어캘리퍼스(vernier calipers)로 측정하고 다음의 식에 의해 계산하였다: (A x B²)/2, 여기에서 "A"는 종양의 2차원 측정값에서 더 큰 값이며, "B" 더 작은 값이다. 실험의 종료시점에서, 동물을 경추탈골에 의해 희생시켰다. 종양을 주변 근육과 피부로부터 분리하여 떼어내고 중량을 측정하였다. 혈액을 수집하고 기관은 제거하여 스핑고지질 분석에 사용하였다(도 9 참조).

11. 실험동물 윤리

본 실험은 충북대학교 실험동물의 사용 및 보호에 관한 가이드에 따라 행해졌다.

12. 면역블로팅 분석

사이클린(cyclin) B1, Cdc2 및 Cdc25C 단백질에 대한 1차 항체의 발현을 위해, 샘플을 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8), 2％ SDS, 10％ 글리세롤, 50 mM DTT(dithiothreitol) 및 프로테아제 억제자 칵테일 테블릿(Roche, Mannheim, Germany)을 포함하는 SDS 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 용해물을 13,000 X g에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 수집하였다. 단백질 측정은 BSA를 표준물질로 사용하여 제조자의 지시서에 따라 BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 단백질은 Mini-Protein Ⅱ System (Bio-Rad, CA)을 사용하여 10 내지 15％ SDS-PAGE에서 분리하였다. 분리된 단백질들을 25 mM Tris-HCl, 192 mM 글리신 및 20％ 메탄올을 포함하는 트랜스퍼 완충액(pH 8.3)내에서 250 mA을 사용하여 PVDF 막(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)으로 이전시켰다. PVDF 막은 TBS-T내의 5％ BSA으로 상온에서 4 시간 동안 블로킹하였다. 막을 TBS-T를 사용하여 세척하고, 1차 Cdc25C (1:1000); Cdc2 (1:200); 사이클린(cyclin) B1 (1:500); p21^waf1/cip1 (1:1000); p53 (1:1000) 또는 β-액틴 (1:1000) 항체들과 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 IgG 2차 항체(Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)를 BSA/TBS-T 완충액내에서 1:5000 희석비율로 사용하여 4℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척후에, 막에 대해 화학형광반응(ECL plus kit, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)시킨 후, Hyperfilm ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)에 노출시켜 검출을 수행하였다. 관심의 단백질은 β-액틴에 의해 정상화시키고, 밴드의 강도는 Window Program용 Scion-Image(Scion Corporation, Maryland, USA)를 사용하여 정량하였다.

13. 통계 분석

실험결과들은 평균±S.D.으로 표시하였다. Sigma Stat® (Jandel Co.; San Rafael, CA, USA)을 사용하여 다중 비교를 위한 일원 변량분석(one-way analysis of variance)을 수행하였다. *P < 0.05 및 **P < 0.01의 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험결과

1. 멜라노마 세포의 증식에 대한 미리오신(myriocin)의 억제 효과

본 발명자들은 먼저 미리오신(myriocin)이 멜라노마 세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 미리오신으로 처리된 멜라노마 세포의 컨플루언시(confluency)는 대조군의 것과 비교하여 매우 적었으나, 미리오신에 노출된 후에 유동성(floating) 세포는 관찰되지 않았다. 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 미리오신으로 B16F10 멜라노마 세포들을 최장 96 시간 까지 처리한 경우 농도-의존적 방식 및 시간-의존적 방식으로 세포 성장이 억제되었다(도 1b 참조). 세포의 수는 미리오신에 노출시킨 후 48 시간에서 감소하기 시작하였고, 1, 5 및 10 μM의 농도에서 96 시간 동안 처리한 경우, 세포의 증식은 대조군과 비교하여 약 70％ 억 제되었다. 멜라노마 세포의 DNA 합성은 [³H] 티미딘 혼입 분석에 의해 측정하였다(도 1c 참조). 1 μM의 농도에서 48 내지 96 시간 동안 미리오신으로 B16F10 세포들을 처리한 경우, 방사능 수준이 대조군의 것과 비교하여 감소되었다(도 1c 참조). 대조군 세포에서 DNA 안으로의 [³H] 티미딘 혼입은 24, 48, 72 및 96 시간에 대해 각 웰당 각각 5150, 8499, 13194 및 19819 cpm 이었으나, 1 μM 농도의 미리오신으로 처리된 멜라노마 세포내에서 [³H] 티미딘 흠수는 각 웰당 약 5357, 5575, 8230 및 9931 cpm 이었다. 1 μM의 농도로 96 시간동안 미리오신으로 처리한 배양에서 DNA 합성은 병행 대조군의 것에 비해 약 50％ 억제되었다. 이러한 결과들은 미리오신에 의해 유도되는, DNA 합성의 억제 효과가 시간-의존적 방식으로 세포의 성장과 관련되어 있다는 것을 암시한다. 한편, 미리오신을 1 및 10 μM 농도로 48 시간 처리한 경우 세포 이동은 대조군과 비교 시 각각 69％ 및 73％ 억제되었다 (도 1d 참조).

미리오신(myriocin)이 멜라노마 이외에 다양한 암세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 미리오신으로 처리된 멜라노마 세포의 컨플루언시(confluency)는 대조군의 것과 비교하여 매우 적었으나, 미리오신에 노출된 후에 유동성(floating) 세포는 관찰되지 않았다. 0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 미리오신으로 사람으로부터 유래한 유방암세포(MCF7), 폐암세포(H460), 위암세포 (NKM45), 간암세포(HepG2), 대장암세포(HCT116), 전립선암세포(PC3)를 최장 72 시간 까지 처리한 경우 농도-의존적 방식 및 시간-의존적 방식으로 이들 세포의 성장이 억제됨을 확인하였다. 세포의 수는 미리오신에 노출시킨 후 암세포 종류따라 24 또는 48 시간에서 감소하기 시작하였고, 미리오신을 5 - 10 μM의 농도에서 72 시간 동안 처리한 경우, 세포의 증식은 대조군과 비교하여 약 46％ - 61％ 억제되었다(도 1e, 도 1f 및 도 1g 참조).

미리오신에 의해 유도되는 세포 성장의 억제와 세포독성을 구분하기 위해, 세포사멸에 대한 몇 가지 분석을 추가로 수행하였다. WST-1 분석을 사용한 실험에서, 24 - 96 시간 동안 1 및 10 μM 농도의 미리오신으로 처리된 B16F10 세포들은 대조군 및 처리된 배양군 사이에 세포독성에 대해서 의미 있는 차이가 없었다(도 2a 참조). 멜라노마 세포들을 1 μM 농도의 미리오신으로 48 시간 동안 노출시킨 후에 측정한 절단된 카스파아제(caspase)-3 발현수준은 병행 대조군의 것과 비교하여 증가되어 있지 않았고(도 2b 참조), 아폽토시스 세포 사멸은 PI 및 아넥신(annexin)-V-FITC의 이중염색으로부터 관찰되지 않았다(도 2c 참조).

2. 미리오신은 G2/M 단계에서 세포 주기의 중지를 통해 멜라노마 세포의 증식을 억제한다.

세포 주기 진행의 각각의 상이한 단계에 대한 미리오신의 영향을 조사하였다(도 3 참조). 서브-G₀ 분획(수퍼코일된 DNA 함량)에서의 아폽토시스 세포 군집은 검출되지 않았고, 미리오신을 첨가한 후에 G2/M 단계에서 세포의 축적이 발생하였다(도 3 참조). 48 시간 동안 B16F10 세포를 배양한 결과, G0/G1 단계에서는 59.8％의 세포 주기 동조화가 관찰되었고, S 단계에서는 33.5％의 세포 주기 동조화가 있었다. 0, 1 및 10 μM의 농도의 미리오신으로 처리된 세포의 G2/M 단계 존재 세포 백분율은 각각 약 6.7, 18.4 및 18.7％이었다(도 3 패널 A 참조).

1 μM의 미리오신에 0, 24, 48 및 72 시간 동안 노출시킨 세포의 G2/M 단계에서 백분율은 각각 4.7, 8.3, 16.2 및 18.6％ 이었다. 멜라노마 세포를 미리오신으로 처리한 경우 G2/M 단계에서 세포 군집이 시간-의존적 방식으로 현저하게 증가되는 결과를 얻었다(도 3 패널 B 참조). 따라서, G2/M 단계에서 B16F10 멜라노마 세포의 백분율은 미리오신 처리한 경우가 대조군과 비교하여 볼때 현저하게 증가하였다. 이러한 결과는 미리오신이 세포 주기 진행에서의 G2/M 중지를 통해 세포 증식을 억제할 수도 있다는 것을 암시하는 것이다.

3. 세포 주기 조절 단백질에 대한 미리오신의 영향

G2/M 단계내에서 미리오신이 유도하는 세포 주기 중지의 메카니즘을 규명하기 위해, 세포 주기 조절 인자들에 대한 미리오신의 영향을 측정하였다(도 4 참조). 멜라노마 세포를 1 및 10 μM의 미리오신으로 48 시간 동안 처리한 경우, 대조군 세포와 비교하여 사이클린(cyclin) B1, Cdc2 및 Cdc25C의 발현을 억제한 반면, 미리오신으로 24 시간 처리한 경우는 조절 단백질들의 발현 수준을 변화시키지 못하였다. 멜라노마 세포를 미리오신에 노출시킨 후에, 사이클린 B1 및 Cdc2에 대한 업스트림 신호 분자인 p53 및 p21^waf1/cip1의 발현수준을 측정하였다. B16F10 세포를 미리오신으로 24 시간 동안 처리한 경우 p53 및 p21^waf1 ^/ ^cip1의 발현이 증가함이 관찰되었으나(도 4 참조), p53의 발현은 초기 시간 기간 동안에는 변화가 없었다. Cdc25C의 업스트림 신호 분자인 Chk2, PLK1 및 Wee1, Cdc2/사이클인(cyclin) B1 복합체 억제자의 발현은 미리오신 노출 후에 변화하지 않았다. 카페인(caffeine)은 p53의 인산화를 억제하는 것으로 알려져 있다(27). 0, 3 및 5 mM 농도의 카페인과 함께 1 μM의 미리오신으로 처리한 멜라노마 세포에서 p53 및 p21^waf1 ^/ ^cip1의 발현을 현저하게 감소시키는 결과를 보여주었는데, 이는 미리오신에 의한 세포 증식 억제가 p53의 활성화를 통해 발생될 수 있음을 확인하여 주는 결과이다(도 5 참조). 상기 결과들은 미리오신에 의한 세포 증식 억제 효과가 G2/M 단계에서의 세포 주기 중지에 이르는 Cdc25C의 억제와 p53 및 p21^waf1 ^/ ^cip1 신호전달 경로의 활성화 양쪽을 통해 발생될 수 있음을 증명하는 것이다.

4. 미리오신에 의해 유도되는 세포 성장 억제에서의 스핑고지질 생합성의 관여

미리오신은 스핑고지질의 신생 생합성에서의 세린 팔미토일트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase)를 특이적으로 억제함으로써, 세포 세라미드 및 스핑고신의 수준을 감소시킬 것으로 예상할 수 있다(도 6a 참조). 1 μM 농도의 미리오신으로 24-27 시간 동안 처리한 멜라노마 세포들은 병행 대조군과 비교하여 세라미드 및 스핑고신의 수준을 매우 크게 감소시켰다(도 6b 및 도 6c 참조). 미리오신에 24 시간 동안 노출된 멜라노마 세포에서 세라미드 농도는 병행 대조군에서 단백질 1 mg당 2.2 nmol으로부터 0.3 nmol 까지 크게 감소하여, 세라미드 수준이 약 7 배 정도 감소하였다(도 6b 참조). 미리오신으로 24 시간 동안 처리된 멜라노마 세포에서 스핑고신의 농도는 0.03 nmol인데 반하여, 병행 대조군에서의 농도는 단백질 1 mg당 약 0.12 nmol이었다(도 6c 참조). 미리오신 처리된 세포내에서 세라미드 및 스핑고신의 감소된 수준은 72 시간 까지 유지되었다. 세포 스핑고지질의 현저한 감소는 멜라노마 세포를 미리오신에 노출시키고 3 시간이 지난 후에 발생하기 시작하였다(도 6b의 내부 도면 참조). 또한, 멜라노마 세포를 1μM 농도의 미리오신에 0-72 시간 동안 노출시킨 후 스핑고마이엘린(sphingomyelin)의 농도를 측정한 결과, 미리오신 노출 시간에 의존하는 방식으로 스핑고마이엘린의 농도가 크게 감소하였다(도 6d 참조). 이러한 결과는 미리오신에 의해 유도되는 세포 스핑고지질의 감소가 멜라노마 세포의 세포 성장 억제에 밀접하게 관련되어 있을 수 있다는 것을 암시한다.

세포 투과성 합성 스핑고지질인 C8-세라미드는 미리오신에 의해 유발된 세포 성장 억제를 농도 및 시간 의존적 방식으로 반전시켰다(도 7a 참조). 10 및 20 μM 농도의 C8-세라미드와 1 μM의 미리오신을 멜라노마 세포에 72 시간 노출시킨 경우 대조군과 유사한 세포 증식 패턴을 나타내었다. 동일한 조건하에서, C-8 세라미드는 미리오신 처리된 멜라노마 세포에 풍부하게 되어 내인성 세라미드 수준을 증가시켰다. 20 μM C-8 세라미드와 1 μM 미리오신에서의 내인성 세라미드 수준의 증가는 24 시간에서 최고치를 나타내었으며, 48 시간에서는 병행 대조군의 수준으로 감소하였고, 72 시간에서 대조군의 50％를 유지하였다(도 7b 참조). 상기 결과들은 내인성 세라미드는 세포의 스핑고지질을 풍부하게 함으로써 미리오신에 의해 유도되는 세포 성장 억제로부터 멜라노마 세포를 보호하는 것을 지시한다. 종합하면, 미리오신은 스핑고지질의 신생 생합성을 차단함으로써 세포 주기 조절 단백질의 조절에 의한 G2/M 단계 중지를 통해 멜라노마 세포 증식을 억제하는 것으로 판단된다.

5. 종양형성에 대한 미리오신(myriocin)의 억제적 효과

본 발명자들은 미리오신을 피내투여(i.d.), 복강내투여(i.p.), 경구투여(p.o.)한 경우의 B16F10 세포 멜라노마 종양 성장에 대한 억제적 효과를 조사하였다. 이종이식 모델 마우스에 있어서, 종양 성장에 대한 미리오신의 억제적 효과는 매우 두드러지게 나타났다(도 10a 내지 도 10c 참조). 미리오신으로 처리한 군(1 mg/kg, n=5)의 종양의 상대적 성장을 생리식염수 투여 대조군(saline, n=5)의 것과 비교하여 측정하였고, 실험군의 체중도 아울러 측정하였다. 미리오신의 가장 효과적인 항종양 효과는 미리오신을 피부내로 투여한 경우에 나타났다. 미리오신-처리군의 종양 질량 감소 효과 정도는 피부내 투여 > 복강내 투여 > 경구 투여의 순으로 나타났다. 미리오신을 피부내 투여 방식으로 투여한 마우스에서 종양 조직은 1 마리의 마우스에서의 경우를 제외하고 전혀 관찰되지 않았으나, 반면 미리오신을 경구 투여 방식으로 투여한 모든 마우스는 식염수를 투여한 대조군과 비교하여 종양의 질량이 크게 감소되었음에도 불구하고 상당량의 종양 조직이 관찰되었다.

식염수 투여 대조군에서는 멜라노마 세포를 접종한 후 8일 부터 희생시키기 까지 체중이 비정상적으로 증가하는 것이 관찰되었는데, 이는 아마도 멜라노마 조직의 형성에 기인한 것으로 판단되었다. 미리오신을 피부내 투여 및 복강내 투여 방식으로 투여한 군에서는 식염수 투여 대조군과 비교하여 동물의 체중이 유의하게 증가하지 않았으나(도 10a 및 도 10b 참조), 식염수 투여 대조군과 미리오신 경구 투여군 사이의 체중의 차이는 관찰되지 않았다(도 10c 참조). 상기의 결과들은 미리오신을 마우스에 피부내 및 복강내 투여 경로로 투여하면 종양의 형성을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내고 있다.

6. 미리오신에 의한 종양성장의 억제와 스핑고지질 합성의 억제와의 연관성

멜라노마 종양 질량 및 크기는 미리오신 투여군(특히, 피부내 투여군 및 복강내 투여군)에서 식염수 투여 대조군과 비교하여 크게 감소하였다(도 11a 및 도 11b 참조). 미리오신의 피부내 투여군의 종양의 평균 무게는 0.2g인데 반하여, 식염수 투여 대조군은 약 2.0g의 종양 평균 무게를 나타내었다(도 11a 참조). 미리오신의 피부내 투여군에서의 종양의 평균 크기는 245.9 mm³ 이었는데 반하여, 식염수의 피부내 투여 대조군에서의 종양의 평균 크기는 1433.0 mm³ 이었다. 이는 종양의 크기가 미리오신-노출에 의해 대조군 대비 약 83％의 감소되었다는 것을 의미한다(도 11b 참조). 상기의 결과로부터 미리오신의 피부내 투여 경로가 다른 경로에 비해 가장 강력한 항-종양 활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

미리오신이 스핑고지질의 신생 생합성에 관여하는 세린 팔미토일트랜스퍼라아제 억제 활성을 갖는다는 것으로부터, 멜라노마 마우스 모멜에서 미리오신에 의한 스핑고지질 합성 저해가 상기의 항종양 효과와 연관이 있을 것이라는 가설을 세울 수 있었다. 먼저, 종양 조직, 혈청 및 간(liver)에서의 세라미드, 디하이드로세라미드, 스핑고신, 스핑가닌, 일인산 스핑고신 및 일인산 스핑가닌의 함량을 측정하였다(도 11c 및 도 11d, 표 1 참조). 마우스를 미리오신으로 처리한 경우에서 종양 조직, 혈청 및 간에서의 스핑고 지질의 수준이 식염수 투여 대조군과 비교하여 감소하였다. 미리오신을 피부내 투여한 후 마우스 종양 조직에서의 세라미드, 디하이드로세라미드, 스핑고신 및 스핑가닌의 수준이 현저하게 감소되어 있었다.

식염수를 피부내 투여한 대조군 마우스로부터의 종양 조직내에서 세라미드 및 디하이드로세라미드의 수준이 각각 9.3±1.8 및 2.3±2.4 nmol/mg 단백질 인데 반하여, 미리오신 처리군에서의 세라미드 및 디하이드로세라미드의 함량은 각각 5.7±2.0 및 0.8±0.3 nmol/mg 단백질 이었다(도 11c 참조). 식염수를 피부내 투여한 대조군 마우스로부터의 종양 조직내에서의 스핑고신 및 스핑가닌의 수준이 각각 159.6±17.6 및 52.8±20.6 pmol/mg 단백질인데 반하여, 미리오신 투여 처리군에서의 스핑고신 및 스핑가닌의 함량은 각각 84.0±11.0 및 24.3±12.5 pmol/mg 단백질이었다(도 11d 참조).

미리오신을 피부내, 복강내 및 경구 투여한 경우 마우스의 혈청내에서의 세라미드, 디하이드로세라미드, 일인산 스핑고신 및 일인산 스핑가닌의 수준이 크게 감소되었다(표 1 참조).

식염수 투여 대조군과 미리오신 처리군에서의 세라미드의 혈청내 수준은 각각 10.9±1.1 및 6.0±1.2 μM 이었다. 미리오신을 마우스내로 복강내 투여한 경우 병행 대조군에 비해 세라미드의 혈청 수준이 약 73％ 감소하였다. 스핑고신-1-포스페이트의 혈청 수준은 미리오신의 복강내 투여에 의해 30％ 현저히 감소하였다. 디하이드로세라미드 및 일인산 스핑가닌의 혈청 수준도 미리오신 처리한 후에 감소하였다. 하기 표 2에서 보여지는 바와 같이, 마우스 간에서의 세라미드, 디하이드로세라미드, 스핑고신 및 스핑가닌의 수준은 미리오신의 피부내 및 복강내 투여에 의해 감소되었다.

7. 세포주기 조절 단백질 발현에 대한 미리오신의 영향

세포 주기 진행은 CDKs 및 사이클린(cyclin)을 포함한 세포 주기 조절 단백질들의 복잡한 네트워크를 통해 조절된다. 미리오신은 멜라노마 세포의 증식을 억제하고, G2/M 단계에서 세포주기 중지를 유도하였다. 미리오신-유도 G2/M 중지의 조절 기작을 규명하기 위해 Cdc2, 사이클린 B1 및 Cdc25C의 발현을 측정하였다. 미리오신을 피부내 및 경구 경로로 투여한 마우스의 종양 조직에서의 Cdc2 발현을 측정한 결과 식염수 투여 대조군과 비교하여 볼때 감소되었음을 확인하였다(도 12a 참조). 미리오신을 멜라노마 이식 마우스에 피부내 투여한 후의 사이클린 측정한 B1의 발현도 크게 감소되어 있었다(도 12b 참조).

미리오신을 피부내 및 복강내 투여한 후 마우스 종양 조직으로부터, Cdc2/Cyclin B1 복합체의 업스트림 조절자인 Cdc25C의 발현을 측정한 결과, 대조군과 대비하여 이의 발현 수준이 크게 감소하였다(도 12c 참조). 사이클린(cyclin) B1 및 Cdc2의 업스트림 신호 분자인 p53 및 p21^waf1/cip1의 발현을 측정하였다. 미리오신을 피부내 및 복강내 투여한 후 마우스로부터의 종양 조직에서 p53 및 p21^waf1/cip1의 발현이 증가되었음을 확인하였다(도 13a 및 도 13b 참조).

8. 미리오신의 다중 반복 투여에 의해 종양 성장이 더욱 억제되었다.

멜라노마 이종 이식 모델에서 미리오신을 피부내 투여한 경우가 가장 강력한 항종양 활성을 나타내었다. 미리오신의 다중 투여의 종양 성장에 대한 효과를 조사하기 위해, 미리오신을 피부내 투여한 후의 측정한 종양 무게 및 크기를 식염수 투여 대조군의 것과 비교하였다. 미리오신을 10회 투여한 경우 4 마리의 마우스중에서 1 마리가 작은 종양 조직을 갖는 것으로 관찰되었다. 미리오신을 3회 또는 6회 투여한 경우, 모든 멜라노마 마우스에서 종양의 발생이 관찰되었다. 미리오신의 10회, 6회 및 3회 투여한 군에서의 종양 무게의 평균값은 각각 0.1, 0.2 및 0.8 이었다. 미리오신을 10회 투여한 경우에서 멜라노마 마우스의 종양 크기가 가장 작았다(도 14a 및 도 14b 참조). 상기의 결과는 생체 내 (in vivo) 실험에서 미리오신의 투여 횟수가 종양의 성장 저해에 있어서 중요한 요인이 될 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 멜라노마 마우스를 실험 기간 중의 최후 4일간 노출시켰을 때, 종양 발생 및 크기는 식염수 대조군의 것과 비교할 때 효과적으로 감소되어 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

미리오신(Myriocin)을 유효성분으로 포함하는 흑색종(melanoma), 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 또는 전립선암의 예방, 치료 또는 개선용 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 흑색종(melanoma), 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 또는 전립선암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 흑색종(melanoma), 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 또는 전립선암의 개선용 기능성 식품조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 미리오신(Myriocin)은 세포주기의 G2/M 전이(transition)를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 미리오신(Myriocin)은 세포주기 조절 단백질인 p53 및 p21^waf1/cip1의 발현을 상향조절하고, Cdc2, 사이클린(cyclin) B1 및 Cdc25C의 발현을 하향조절하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 미리오신(Myriocin)은 세포내 스핑고지질(sphingolipid)의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 미리오신(Myriocin)은 세포이동(cell migration)을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.