CN105188376A - Malt1的小分子抑制剂 - Google Patents
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Abstract
MALT1的切割活性与活化的B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)的发病机制有关,所述ABC-DLBCL是耐化疗形式的DLBCL。我们开发了MALT1的活性检测方法并鉴定了化学多样性的MALT1的抑制剂。所选的先导化合物MI-2的特征在于直接结合MALT1并抑制其蛋白酶功能。MI-2在人ABC-DLBCL细胞内富集并不可逆地抑制对MALT1的底物的切割作用。上述作用伴随着NF-κB报告子活性的抑制、c-REL核定位的抑制和NF-κB靶基因标记物的下调。最值得注意的是,MI-2对小鼠是无毒的,并且在体外针对ABC-DLBCL细胞系、以及在体内针对异种移植的ABC-DLBCL肿瘤显示出有效的和特异性的活性。所述化合物在体外针对原代的人非GCB-DLBCL也是有效的。
Description
相关申请的交叉引用
本发明要求2012年11月9日提交的美国临时专利申请号61/724,650的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是排名第七的最常见癌症((Siegeletal.,2012)。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是NHL最常见的亚型,占所有淋巴瘤病例的约25%(Swerdlow,2008)。基因表达谱能够将DLBCL亚分类分成不同的分子亚型,包括:生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化的B细胞样(ABC)DLBCL和原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)(Alizadehetal.,2000;Rosenwaldetal.,2003)。这些亚型在其复发性体细胞突变谱、对不同信号通路的依赖性和对目前标准疗法的应答上具有显著差异(Lenzetal.,2008b;Wrightetal.,2003)。患有GCB亚型的患者相较于患有ABC亚型的患者具有显著更优的总存活率(Alizadehetal.,2000;Rosenwaldetal.,2002)。所有的DLBCL均需要改进的疗法,但是最耐受化疗的ABC-DLBCL的这种需要最为迫切。
ABC-DLBCL的特征为其依赖于通过多种不同机制的NF-κB通路的致癌性活化。这些大多涉及参与B细胞受体(BCR)下游通路的分子的体细胞突变,包括:CARMA1/CARD11(Lenzetal.,2008a)和CD79A/B(Davisetal.,2010)的活化突变、TNFAIP3/A20的同源性缺失/失活突变(Compagnoetal.,2009;Honmaetal.,2009)或Toll样受体下游的MYD88的活化突变(Ngoetal.,2011)。CARMA1形成CBM复合体(CARMA1-BCL10-MALT1)的一部分并且介导了B细胞受体、T细胞受体(Ruefli-Brasseetal.,2003;Rulandetal.,2003)和ITAM偶联的NK细胞受体(Grossetal.,2008)下游的NF-κB的激活。MALT1亚基是所述CBM复合体的活性信号成分(Lucasetal.,2001),并具有这样的蛋白酶活性特征:其切割和灭活NF-κB信号通路的抑制因子,例如TNFAIP3/A20(Coornaertetal.,2008)、CYLD(Staaletal.,2011)和RELB(Hailfingeretal.,2011)、或BCL10蛋白(Rebeaudetal.,2008),间接地激活NF-kB信号。在多至55%的MALT型淋巴瘤患者中,检测到了MALT1的易位(产生API2-MALT1融合体的t(11;18)(q21;q21)和导致IGH-MALT1易位的t(14;18)(q32;q21))(FarinhaandGascoyne,2005)。此易位导致MALT1的过表达,并且在所述API2-MALT1易位的情况下,导致所述通路的组成型活化(Dierlammetal.,1999;Sanchez-Izquierdoetal.,2003;Streubeletal.,2003)。在小鼠中MALT1的组成型表达诱导了类似于人的MALT淋巴瘤的疾病并且在p53缺失的背景下诱导了ABC样的DLBCL(Vicente-Duenasetal.,2012)。MALT1尚未在DLBCL中被发现突变或易位,但随着BCL2的升高而升高,并且此低拷贝数扩增与ABC-DLBCL的表型相关(Dierlammetal.,2008)。此外,已显示ABC-DLBCL细胞系依赖于MALT1的催化活性(Ferchetal.,2009;Hailfingeretal.,2009;Ngoetal.,2006)。
MALT1是类半胱天冬酶(paracaspase),与半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)家族的蛋白酶相关,但其在精氨酸或赖氨酸残基之后而非在天冬氨酸之后进行切割(Rebeaudetal.,2008)。MALT1缺失的动物显示出B和T细胞功能的缺陷,但在其它方面是健康的(Ruefli-Brasseetal.,2003;Rulandetal.,2003),并且MALT1是人类基因组中仅有的paracaspase。这些因素表明,MALT1靶向治疗将有可能是耐受良好的,并具有很少的或可控的毒性。因此,MALT1代表了ABC-DLBCL和MALT淋巴瘤的潜在重要的治疗靶点。
发明概述
MALT1是独特的paracaspase蛋白,其转导成在ABC-DLBCL中异常的致癌信号。本发明人在本文中公开了对组成型活化形式的MALT1的开发,所述组成型活化形式的MALT1使得筛选小分子抑制剂成为可能;并要求保护MALT1抑制性化合物及其在治疗医学疾病(如B细胞淋巴瘤)中的用途。化合物MI-2(MALT1蛋白酶的不可逆抑制剂)被鉴定为在基于细胞的测定中具有纳摩尔级活性并且针对ABC-DLBCL具有选择性活性的先导化合物。重要的是,我们证明了MALT1抑制剂在体外和体内杀死ABC-DLBCL、是对动物无毒的、并且还抑制原代人非GCB-DLBCL标本。因此,我们证实了MALT1是真实的治疗靶点,并提供了作为新一类B细胞淋巴瘤治疗剂的基础的先导化合物。
在多种实施方式中,本发明提供了一种调节MALT1的方法,所述方法包括使MALT1接触有效量或浓度的式(I)化合物
其中
虚线键表明键是可存在或不存在的;
当Y1和Y2之间存在双键时,Y1是N或CR,Y2是C,且存在Ar1;当Y1和Y2之间存在单键时,Y1是CR2,Y2是O或S,且不存在Ar1,以及各自被独立地选择的R是H或(C1-C6)烷基;
R1是烷基、烷氧烷基、或芳烷基,其中任何烷基、烷氧烷基、或芳烷基,可以被卤素或(C1-C6)烷氧基单一地或多个独立地取代,条件是当所述氧原子和所述包含Y3的环之间存在双键时,不存在R1且存在Ar3,而当所述氧原子和所述环之间存在单键时,存在R1,Y3和带有所述氧原子的所述碳原子之间存在双键,且不存在Ar3;
Ar1是被1-3个J1基团取代的苯基;J1是卤素或(C1-C6)烷氧基;
Ar2是被1-3个J2基团取代的苯基;J2是以式-N(R)C(O)-R2表示的组且R2是烷基、芳基或芳基氨基,其中任何烷基、芳基或芳基氨基被0-2个卤素、硝基、或(C1-C6)烷氧基取代;
Ar3是被1-3个J3基团取代的苯基;J3是卤素或(C1-C6)烷氧基;
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
在多种实施方式中,本发明进一步提供了治疗或预防癌症的方法,该方法包括将有效剂量的上述式(I)化合物施用给患者。更具体的,所述癌症可以是淋巴瘤,例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在多种实施方式中,本发明另外提供了一种鉴定MALT1的小分子调节物的方法,所述方法包括使融合有亮氨酸拉链二聚化基序(LZ-MALT1)的重组形式的MALT1(340-789)与候选的调节化合物接触,使用与所述荧光发生素AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)连接的所述MALT1的底物肽LRSR,从而使得MALT1对所述Ac-LRSR-AMC底物的切割作用导致AMC和荧光信号的释放,其中在存在所述候选的调节物的条件下,所述重组形式的MALT1对所述Ac-LRSR-AMC底物的切割作用的降低表明所述候选的调节物是MALT1的小分子调节物。
附图简述
图1A描绘了与亮氨酸拉链二聚化基序(LZ-MALT1)融合的重组型MALT1(340-789)结构的两种透视图,所述结构促进其二聚体化和活化。
图1B是如下结果的图形表示:通过该结果从化合物文库中选择了324种候选的化合物用于在使用LZ-MALT1的浓度应答测定中进行验证。
图1C是如下结果的图形表示:通过该结果基于生化活性(IC50<20μM)选择了19种化合物用于进一步进行验证。
图1D显示了化合物MI-2的化学结构。
图1E显示了免疫印迹(Westernblot)的凝胶电泳结果的照片,根据免疫印迹数据图中显示的未切割的CYLD蛋白的增加和切割形式的CYLD蛋白的降低,该结果证实MI-2引起了MALT1介导的切割作用的剂量依赖性的降低。
图2A是如下结果的图形表示:通过该结果选择出了19种展示出与MI-2相同的或比其更高活性的类似物。
图2B显示了被选择用于在细胞增殖测定中进行进一步特性分析的5种MI-2类似物(MI-2A1至MI-2A5)的化学结构,上述5种类似物具有与MI-2相似范围的生化IC50;图2B还显示了2种在体外不具有LZ-MALT1抑制活性的类似物(MI-2A6和MI-2A7)的化学结构,上述2种类似物用作在相同的剂量范围内对细胞增殖没有作用的化学对照。
图2C是化合物MI-2A1至MI-2A5的生物测定结果的图形表示。
图2D是获自所述5种化合物MI-2A1至MI-2A5的关于切割抑制结果的图形表示,所述化合物以5μM施用8小时,并且使用Z-VRPR-FMKMALT1封闭肽(50μM)作为阳性对照。
图3A是MI-2与MALT1的paracaspase结构域(残基329-728)结合的异核单量子相干(HSQC)核磁共振(NMR)光谱图。
图3B显示了NMR光谱图,该图证明MALT1的paracaspase结构域(残基329-728)与没有活性的类似物MI-2A6和MI-2A7间没有结合。
图3C显示了质谱分析数据,该数据表明MALT1的paracaspase结构域(残基329-728)在55,988.4Da处呈现出主峰,以及经与化合物MI-2共孵育后,所述MALT1的主峰移至56,407.5Da处,增加了419.1Da。
图3D显示了用分子建模程序AutoDock4.2的分子对接程序计算得到的MI-2与所述MALT1的paracaspase结构域潜在结合模式的图像,其中MI-2显示出与活性位点裂隙结合并且其氯甲基靠近所述paracaspase结构域中的活性位点C464。
图3E显示了当LZ-MALT1与不同浓度的MI-2(不可逆抑制)相比其与不同浓度的MI-2A2(可逆抑制)预孵育5至80分钟,并随后加入荧光报告底物Ac-LRSR-AMC时,酶活性的时间进程。
图4A显示了这样的免疫印迹的凝胶电泳结果照片:使用蛋白酶抑制剂MG-132作用30分钟以促进在暴露于MI-2(2μM)或载剂的HBL-1和TMD8细胞系中显示酶切产物,随后用5μM的MG-132再额外作用一小时(泳道2、3)或再作用两小时(泳道4、5)以允许在暴露于MI-2的过程中切割形式的MALT1底物的积聚。
图4B显示了实验结果,其中HBL-1细胞暴露于200nMMI-2、50μMZ-VRPR-FMK(阳性对照)或载剂24小时,随后对全细胞或分离的核进行c-REL流式细胞术。MI-2和Z-VRPR-FMK将核中c-REL降至相似的程度,但不影响此蛋白的全细胞水平。
图4C显示了HBL-1和TMD8细胞的核提取物中c-REL和p65的免疫印迹,所述HBL-1和TMD8细胞经GI50浓度的MI-2(对HBL-1细胞为200nM而对TMD8细胞为500nM)处理24小时。在两个细胞系中,暴露于MI-2均引起了核c-REL明显的降低但其不影响p65的水平。
图4D是MI-2对PMA/离子霉素诱导的NF-κB激活的减弱效应数据的图形表示,其中使用NF-κB报告载体(NF-κB)5-luc2CP-pGL4和TK-pRL对照,连同表达BCL10和MALT1WT或MALT1C464A(失活突变体)的质粒转染了293T细胞。
图4E是MI-2对PMA/离子霉素诱导的NF-κB活化的减弱效应数据的图形表示,其中使用NF-κB报告载体(NF-κB)5-luc2CP-pGL4和TK-pRL对照转染了HBL-1细胞。
图4F显示了对Z-VRPR-FMK信号的基因集富集分析(GSEA)结果,所述基因集富集分析是与根据在每个细胞系中MI-2处理组和载剂处理组细胞之间的倍数变化预排的所有基因的差异表达相比较的。在两种细胞系中,所述Z-VRPR-FMK信号显著富集于MI-2处理之后被下调的基因中(HBL-1:FDR<0.0001;和TMD8:FDR<0.0001)。
图5A是来自如下实验的结果的图形表示:将8种细胞系暴露于渐增浓度的MI-2(单次剂量)并在第48小时使用基于ATP的代谢发光测定检测细胞增殖。
图5B是MI-2胞内浓度实验的结果的图形表示,其中将HBL-1细胞暴露于0.02、0.2或2μM的MI-22小时,洗涤3次,并用LC-MS检测MI-2。
图5C1、5C2和5C3显示了如下实验结果:其中使用渐增浓度的MI-2处理HBL-1、TMD8、OCI-Ly10和GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly1。在第48、72和96小时,使用CFSE稀释测定,通过流式细胞术在活细胞上检测了细胞增殖。MI-2基本抑制了HBL-1、TMD8和OCI-Ly10中的增殖然而其不影响OCI-Ly1。
图5D显示了如下实验结果的图形表示:使用BrdU掺入法-DAPI染色和流式细胞术来评估细胞周期,很明显,MI-2诱导了剂量依赖性的S期的降低,相反的,G1-0和sub-G0中细胞的比例有所上升。
图5E显示的实验的图形结果证明,虽然MI-2对OCI-Ly1细胞没有效应,但是其显著抑制了HBL-1和TMD8细胞,并且前者展现出更早和更高的凋亡细胞丰度。
图6显示了实验结果,其中将5只C57BL/6小鼠暴露于如下施用:在10天的过程中每天腹腔内(IP)施用渐增剂量的MI-2(范围从0.05至25mg/kg)以达到51.1mg/kg的累积剂量;并且将另外5只小鼠仅暴露于载剂(5%DMSO,n=5)(图6A,毒性1)。没有嗜睡、体重下降(图6B,毒性1)或其它疾病生理指标的证据。为了确定在14天的计划中25mg/kg的最大施用剂量是否安全,我们将10只小鼠暴露于如下施用:在14天中每天IP施用25mg/kgMI-2以达到350mg/kg的累积剂量,并且以5只仅被注射载剂的小鼠作为对照(图6A,毒性2)。在所述14天的MI-2施用过程之后,处死5只小鼠(连同所述5只对照小鼠),并在10天的洗脱期之后处死另外5只小鼠,以评估延迟毒性。没有发现毒性效应或其它疾病指标,包括体重减轻(图6B,毒性2)或组织损伤(宏观或微观的)(图6C1和6C2)。检测了大脑、心脏、肺、肝、肾、肠、脾、胸腺和骨髓组织。
图7A显示的图形数据证明了与载剂相比,MI-2显著抑制了TMD8(p=0.015,t检验)和HBL1(p=0.014,t检验)ABC-DLBCL异种移植物的生长,然而其对OCI-Ly1肿瘤的生长没有效应。
图7B的图显示了使用TUNEL测定来检测凋亡细胞的组织学检测结果,该结果显示相对于载剂,经MI-2处理的HBL-1(p=0.0008,t检验)和TMD8(p<0.0001,t检验)异种移植物中的凋亡细胞显著上升,但在OCI-Ly1异种移植物中没有此发现(p=0.5580,t检验)。
图7C的图显示的结果证明与载剂相比,Ki-67染色测定的增殖在HBL-1(p<0.0001,t检验)和TMD8异种移植物(p=0.0006,t检验)中显著降低,但是在OCI-Ly1异种移植物中未观察到差异(p=1.0,t检验)。
图7D显示的染色显微照片表明经MI-2处理的肿瘤展现出降低的c-REL核蛋白。
图7E的图显示的数据获自来源于5位DLBLC患者的***活检的单细胞悬浮液,对于所述患者,其GCB对非GCB状态的相对关系可通过免疫组化由汉斯标准确定,其中分离了淋巴瘤细胞并以4个复孔将其暴露于0.8μM的MI-2或载剂。暴露48小时之后,使用台盼蓝确定细胞数量和存活力。
发明详述
概述
在多种实施方式中,本发明提供了调节MALT1的方法,所述方法包括将MALT1与有效量或浓度的式(I)的化合物接触
其中
虚线键表明键是可存在或不存在的;
当Y1和Y2之间存在双键时,Y1是N或CR,Y2是C,且存在Ar1;当Y1和Y2之间存在单键时,Y1是CR2,Y2是O或S,且不存在Ar1,以及各自被独立地选择的R是H或(C1-C6)烷基;
R1是烷基、烷氧烷基、或芳烷基,其中任何烷基、烷氧烷基、或芳烷基,可以被卤素或(C1-C6)烷氧基单一地或多个独立地取代,条件是当所述氧原子和所述包含Y3的环之间存在双键时,不存在R1且存在Ar3,而当所述氧原子和所述环之间存在单键时,存在R1,Y3和带有所述氧原子的所述碳原子之间存在双键,且不存在Ar3;
Ar1是被1-3个J1基团取代的苯基;J1是卤素或(C1-C6)烷氧基;
Ar2是被1-3个J2基团取代的苯基;J2是以式-N(R)C(O)-R2表示的组且R2是烷基、芳基或芳基氨基,其中任何烷基、芳基或芳基氨基被0-2个卤素、硝基、或(C1-C6)烷氧基取代;
Ar3是被1-3个J3基团取代的苯基;J3是卤素或(C1-C6)烷氧基;
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
更具体地,所述式(I)化合物可以是式(IA)化合物
其中R1、Ar1、和Ar2如对式(I)的定义,或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
更具体地,所述式(I)化合物可以是式(IB)化合物
其中Ar2和Ar3如对式(I)化合物的定义,或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
例如,用于实现本发明的方法的式(I)化合物可以是以下的任一个:
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
例如,在实现本发明的方法时,可在活的动物内处理MALT1,例如当所述活的动物是患有癌症(例如,弥漫性大B细胞淋巴瘤)的人时。
因此,本发明进一步在多种实施方式中提供了治疗或预防癌症的方法,该方法包括将有效剂量的上述式(I)化合物施用给患者;例如,式(I)、式(IA)、式(IB)的化合物,或可被使用的具体化合物例子的任一个。
例如,癌症可以是淋巴瘤,例如弥漫性大B细胞淋巴瘤。
除非上下文另外清楚地指明,否则本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象。
当表示数值或范围时,本文中使用的术语“约”,允许所述值或范围有一定程度的变化,例如,在所述值或所述范围界限的10%以内或5%以内。
本文中使用的“个体”(如在所述治疗的受试者中)或“患者”是指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括,例如,人、非人灵长类动物(例如猿和猴)和非灵长类动物(例如狗、猫、牛、马、绵羊和山羊)。非哺乳动物包括例如,鱼和鸟。
术语“病证”或“疾病”或“不良状况”可互换使用,用于表示这样的病证或病况:其中MALT1在参与该病证或病况或其症状的生化机制中具有作用,由此可通过作用于MALT1来实现治疗的有益效果。“作用于”MALT1或“调节”MALT1,可以包括在体内结合MALT1和/或抑制MALT1的生物活性和/或变构调节MALT1的生物活性。
当用于描述针对患有疾病的个体的治疗时,表述“有效量”是指本发明的化合物的这样的量:其在所述个体的组织(其中参与所述疾病的MALT1是活化的)中有效地抑制或以其它方式作用于MALT1,其中,这样的抑制或其它作用发生的程度足以产生有益的治疗效果。
本文中使用的术语“基本上”是指完全的或几乎完全的;例如,“基本上不含”一种成分的组合物是指要么不具有任何所述成分或者含有痕量的所述成分以至于所述组合物的任何相关的功能性质不受该痕量存在的影响;或者化合物是“基本上纯的”表示仅存在可忽略不计的痕量杂质。
本文所指的“治疗”或“处理”是指减轻与疾病或病证相关的症状、或者抑制那些症状的进一步发展或恶化、或者阻止或预防所述病证或疾病、或者治愈所述病证或疾病。类似地,对于本发明的化合物,本文中使用的“有效量”或“治疗有效量”是指所述化合物的这样的量:其整体地或部分地减轻与所述疾病或病况相关的症状,或中止或减慢那些症状的进一步发展或恶化,或阻止所述疾病或病况,或提供针对其的预防。特别地,“治疗有效量”是指在剂量上和在必要的时间段内,有效达到所想要的治疗结果的量。治疗有效量也可以是这样的:其治疗的有益效果能超过本发明的化合物的任何毒性的或有害的效应。
本文在合成方法的上下文中使用的短语例如“在适合于提供…的条件下”或“足以产生…的条件下”等是指反应条件(例如时间、温度、溶剂、反应物浓度等)在实验员的普通技术范围内变化,并能提供有用数量或产量的反应产物。所想要的反应产物没有必要是唯一的反应产物或者起始材料没有必要被完全消耗,前提是所想要的反应产物是可被分离的或可以其他方式进一步被使用的。
“化学上可行的”是指没有违反一般理解的有机结构规则的键合排列或化合物;例如,将理解权利要求定义范围内的如下结构并不在所述权利要求之内:在某些情况下会含有自然界中不存在的五价碳原子的结构。对于本文公开的结构,在其所有的实施方式中,仅意在包括“化学上可行的”结构,并且本文无意公开或要求保护所叙述的任何不属于化学上可行的结构,例如,显示具有可变的原子或基团的结构。
本文使用的术语化学结构的“类似物”是指这样的化学结构:虽然其不易从所述母体结构合成性地衍生得到,但其保留了与母体结构的基本相似性。易于从母体化学结构合成性地衍生得到的相关化学结构被称为“衍生物”。
当将取代基指定为具有特定特征的一个原子或多个原子、“或键”时,构型是指当所述取代基是“键”时,紧邻所述特定的取代基的基团以化学上可行的键合构型直接彼此相连。
除非明确指出了具体的立体化学或异构体形式,否则意指结构的所有单一对映体、非对映体和外消旋形式。在某些情况下,虽然在明确要求保护的化合物中描述了单个的立体异构体,但是所述立体化学的指定并不意味着替代的异构体形式是不太优选的、不想要的或者不要求被保护的。从描述中显而易见,本发明中使用的化合物可以包括在任何或所有不对称原子处以任意富集程度富集或拆分(resolved)的旋光异构体。外消旋的和非对映的混合物以及单个旋光异构体都可以被分离或合成,使得其基本上不含其对映体或非对映体伴侣,而这些都在本发明的范围内。
“小分子”是指分子量小于约2kDa的有机化合物(包括有机金属化合物),其不是由多个重复单元组成的多核苷酸、多肽、多糖或合成聚合物。
对于本文中所述的含有一个或多个取代基的任何基团,可以理解,这样的基团不含有空间上不切实际的和/或合成上不可行的任何取代或取代方式。此外,本公开主题的化合物包括所有产生于对这些化合物的取代的立体化学异构体。
本文中使用的术语“稳定的化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物:其足够稳固,能从反应混合物中被分离成有用的纯度,以及被制成有效的治疗剂。本文中仅涉及稳定的化合物。
当叙述基团时,其中所述基团在结构中以多于一个的方向存在,导致了多于一个的分子结构,例如,羰酰胺基C(=O)NR,可以理解,除非上下文清楚地限制了所述分子结构内所述基团的方向,否则所述基团可以以任何可能的方向存在,例如,X-C(=O)N(R)-Y或X-N(R)C(=O)-Y。
对于在分子中包含不同于自然界中天然发生的原子同位素分布的同位素形式的一个或多个原子,将其称为所述分子的“同位素标记形式”。除非指出了原子具体的同位素形式,否则包括原子的所有同位素形式,作为任何分子的组合物的可选项。例如,分子中的任何氢原子或者其集合可以是氢同位素形式的任一种,即:氕(1H)、氘(2H)或氚(3H)的任何组合。类似地,分子中的任何碳原子或者其集合可以是碳同位素形式的任一种,例如11C、12C、13C或14C,或者分子中的任何氮原子或者其集合可以是氮同位素形式的任一种,例如13N、14N或15N。分子可以在组成所述分子的原子成分中包括同位素形式的任何组合,并且独立地选择形成所述分子的每个原子的所述同位素形式。在化合物的多分子样品中,不是每个单分子必需具有相同的同位素成分。例如,化合物的样品可以包括含有多种不同的同位素成分的分子,例如在氚或14C放射性标记的样品中,只有组成所述宏观样品的分子集合的某些部分含有放射性原子。还应该理解,许多本身非人为地同位素富集的元素是天然发生的同位素形式的混合物,例如14N和15N、32S和34S等等。本文中叙述的分子被定义为在该分子的每个位置包括所有其组成元素的同位素形式。如本领域所熟知的,可通过常规的化学合成方法(除了对同位素标记的前体分子进行替换)制备同位素标记的化合物。可通过本领域已知的任何方法,例如在核反应器中通过中子吸收前体核素生成、通过回旋加速器反应生成或通过同位素分离如通过质谱法生成,得到放射标记的或稳定的同位素。在任何特定的合成途径中,根据使用要求,将所述同位素形式掺入前体。例如,可以使用在核反应器中产生的中子来制备14C和3H。在核转化之后,将14C和3H掺入前体分子,随后根据需要进一步加工。
一般的,“取代的”是指本文中定义的有机基团,其含有的与氢原子键合的一个或多个键被与以下非氢原子键合的一个或多个键取代:例如,但不限于,卤素(即,F、Cl、Br和I);以下基团中的氧原子:例如羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氧代羰基、羧基(包括羧酸、羧酸盐和羧酸酯);以下基团中的硫原子:例如硫醇基、烷基和芳基硫化物基团、亚砜基、砜基、磺酰基和磺胺基基团;以下基团中的氮原子:例如胺、羟胺、腈、硝基、氮-氧化物、酰肼、叠氮化物和烯胺;和多种其它基团中的其它杂原子。能与取代的碳(或其它)原子结合的J1、J2和J3的非限制性例子包括F、Cl、Br、I、OR'、OC(O)N(R')2、CN、NO、NO2、ONO2、叠氮基、CF3、OCF3、R'、O(氧代)、S(硫羰)、亚甲二氧基、乙烯二氧基、N(R')2、SR'、SOR'、SO2R'、SO2N(R')2、SO3R'、C(O)R'、C(O)C(O)R'、C(O)CH2C(O)R'、C(S)R'、C(O)OR'、OC(O)R'、C(O)N(R')2、OC(O)N(R')2、C(S)N(R')2、(CH2)0-2N(R')C(O)R'、(CH2)0-2N(R')N(R')2、N(R')N(R')C(O)R'、N(R')N(R')C(O)OR'、N(R')N(R')CON(R')2、N(R')SO2R'、N(R')SO2N(R')2、N(R')C(O)OR'、N(R')C(O)R'、N(R')C(S)R'、N(R')C(O)N(R')2、N(R')C(S)N(R')2、N(COR')COR'、N(OR')R'、C(=NH)N(R')2、C(O)N(OR')R'或C(=NOR')R',其中R'可以是氢或碳基部分,并且其中所述碳基部分本身可以被进一步取代;例如,其中R'可以是氢、烷基、酰基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基或杂芳基烷基,其中任何烷基,酰基,环烷基,芳基,芳烷基,杂环基,杂芳基或杂芳基烷基;或者其中与氮原子键合的或与相邻的多个氮原子键合的两个R'基团可以与该氮原子或多个氮原子形成杂环基,所述杂环基可以被J单一地或多个独立地取代。
在多种实施方式中,J1、J2和J3可以各自独立地是卤素、硝基、氰基、OR、NR'2或R',或者是C(O)OR’、C(O)NR’2、OC(O)OR’、OC(O)NR’2、N(R’)C(O)OR’、N(R’)C(O)NR’2或其硫代/硫羰类似物。对于含有O的基团,“其硫代/硫羰类似物”表示在所述基团中的任何或所有O原子能被S原子取代;例如,对于基团C(O)OR,“其硫代/硫羰类似物”包括C(S)OR、C(O)SR和C(S)SR;例如,对于基团OC(O)NR2,“其硫代/硫羰类似物”包括SC(O)NR2、OC(S)NR2和SC(S)NR2;等等。
在多种实施方式中,J1、J2和J3是以下的任一个:卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、羟基(C1-C6)烷基、烷氧基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、氰基、硝基、叠氮基、R'2N、R2NC(O)、R'2NC(O)O、R'2NC(O)NR、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C6-C10)芳基、(C6-C10)芳氧基、(C6-C10)芳酰基、(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、(C6-C10)芳基(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷基、(C6-C10)芳氧基(C1-C6)烷氧基、(3-至9-元)杂环基、(3-至9-元)杂环基(C1-C6)烷基、(3-到9元)杂环基(C1-C6)烷氧基、(5-至10-元)杂芳基、(5-至10-元)杂芳基(C1-C6)烷基、(5-至10-元)杂芳基(C1-C6)烷氧基、或(5-至10-元)杂芳酰基。例如,每次出现的R'各自独立地可以是H、(C1-C6)烷基、或(C6-C10)芳基,其中任何烷基或芳基被0-3个J取代。当取代基是单价的,如,例如,F或Cl,其以单键与其所取代的原子键合。当取代基是多价的,例如二价O,其可以以一个以上的键与其所取代的原子键合,即,二价取代基通过双键键合;例如,O取代C形成羰基,C=O,其也可以写成“CO”、“C(O)”或“C(=O)”,其中,所述C和所述O是以双键键合。当碳原子被双键氧(=O)基团取代时,所述氧取代基被称为“氧代(oxo)”基团。当二价取代基例如NR'与碳原子双键键合时,所得到的C(=NR’)基团被称为“亚氨基”基团。当二价取代基例如S与碳原子双键键合时,所得到的C(=S)基团被称为“硫代羰基”或“硫羰”基团。
或者,二价取代基例如O或S可以通过两个单键和两个不同的碳原子连接。例如,二价取代基O,可以和两个相邻碳原子的每一个键合,以提供环氧化物基团;或者,所述O可在相邻的或不相邻的碳原子之间形成被称为“氧基”基团的桥连醚基,例如,桥接环己基的1,4-碳以形成[2.2.1]-氧杂二环体系。此外,任何取代基可以通过以下接头和碳或其它原子键合:例如,(CH2)n或(CR'2)n,其中n是1、2、3或更多,且每个R'被独立地选择。
另一二价取代基是亚烷基碳,表示成C=,并且意味着如此所示的还带有两个额外的基团的碳原子与第三基团双键键合。例如,(CH3)2C=表示与另一碳或氮原子键合的亚异丙基。C(O)和S(O)2基团也能与一个或两个杂原子例如氮或氧结合,但不与碳原子结合。例如,当C(O)基团与一个碳原子和一个氮原子结合时,所得到的基团称为“酰胺”或“羧酰胺”。当C(O)基团与两个氮原子结合时,该官能团被称为“尿素”。当C(O)与一个氧原子和一个氮原子键合时,所得到的基团被称为“氨基甲酸酯”或“尿烷”。当S(O)2基团与一个碳原子和一个氮原子结合时,所得到的单元被称为“磺胺基”。当S(O)2基团与两个氮原子结合时,所得到的单元被称为“硫酰胺”。
取代的烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基以及其它取代的基团也包括这样的基团:其中连至氢原子的一个或多个键被连至碳原子或杂原子(例如但不限于,羰基(氧代)、羧基、酯、酰胺、酰亚胺、氨基甲酸乙酯和脲基中的氧;亚胺、羟基亚氨基(hydroxyimines)、肟、腙、脒、胍和腈中的氮)的一个或多个键取代,包括双键或三键。
取代的环基,例如取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基还包括环和稠环***,其中连至氢原子的键被连至碳原子的键取代。因此,如本文所明确的,取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基也可以被烷基、烯基和炔基取代。
当以范围指定基团(例如,烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基等)中的碳原子数时,意在用每个单独的整数代表碳原子数。例如,描述(C1-C4)烷基表示该烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基中的任一个。可以理解,具体的碳原子数必需是整数。
烷基包括具有1至约20个碳原子,并且通常为1至12个碳原子,或者在某些实施方式中,1至8个碳原子的直链和支链烷基和环烷基。直链烷基的例子包括具有1至8个碳原子的直链烷基,例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支链烷基的例子包括,但不限于,异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2,2-二甲基丙基基团。本文中所用的术语“烷基”包括正烷基、异烷基和反异基以及其它支链形式的烷基。
代表性的取代烷基可以被上面所列的任何基团(例如,氨基、羟基、氰基、羧基、硝基、硫代、烷氧基和卤素基团)取代一次或多次。示例性的烷基包括,但不限于:1-6、1-4或1-3个碳原子的直链或支链烃,其在本文中分别被称为C1-6烷基、C1-4烷基和C1-3烷基。示例性的烷基包括,但不限于,甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-2-丁基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基等。
芳基是环中不含有杂原子的环芳香烃。因此,芳基包括,但不限于,苯基、薁基、庚搭烯基(heptalenyl)、联苯基、引达省基(indacenyl)、芴基、菲基(phenanthrenyl)、三亚苯基、芘基、并四苯基、草屈基(chrysenyl)、亚联苯基、蒽基和萘基基团。在某些实施方式中,芳基在该基团的环部分含有约6至约14个碳。如上文中明确的,芳基可以是未取代的或取代的。代表性的取代芳基可以被取代单次或取代多次,例如,但不限于,2、3、4、5或6次取代的苯基或2-8次取代的萘基,所述萘基可以被碳基团或上面列出的那些非碳基团取代。
芳烷基是如上文所定义的烷基,其中烷基的氢或碳的键被连至如上文所定义的连至芳基的键所取代。代表性的芳烷基包括苯甲基和苯乙基及稠合的(环烷基芳基)烷基基团例如4-乙基-茚满基。芳烯基是如上文所定义的烯基,其中烷基的氢或碳的键被连至芳基的键所取代。
如上文所定义,术语“烷氧基”或“烷氧基的”是指氧原子与烷基(包括环烷基)连接。线性烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。支链烷氧基的例子包括但不限于异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基、异己氧基(isohexyloxy)等。示例性的烷氧基包括,但不限于,本文中分别被称为C1-6烷氧基和C2-6烷氧基的1-6或2-6个碳原子的烷氧基基团。示例性的烷氧基基团包括,但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基等。
烷氧基可以包括1至约12-20个键连至所述氧原子的碳原子,并且可以另外包括双键或三键,并且还可以包括杂原子。例如,烯丙氧基是本文所指的烷氧基。甲氧基乙氧基也是本文所指的烷氧基,同样地在结构中的两个相邻原子被取代的背景下得到的亚甲二氧基也是本文所指的烷氧基。
除非另有说明,否则术语“卤代”或“卤素”或“卤化物”本身或作为另一取代基的一部分,表示氟、氯、溴或碘原子,优选氟、氯或溴。
“卤代烷基”基团包括单卤代烷基基团、多卤代烷基基团(其中所有卤原子可以是相同的或不同的)和全卤代烷基基团(其中所有氢原子被卤素原子(例如氟)取代)。卤代烷基的例子包括三氟甲基、1,1-二氯乙基、1,2-二氯乙基、1,3-二溴-3,3-二氟丙基、全氟丁基等。
“卤代烷氧基”基团包括单卤代烷氧基基团、多卤代烷基基团(其中所有的卤素原子可以是相同的或不同的)和全卤代烷基基团(其中所有氢原子被卤素原子(例如氟)取代)。卤代烷氧基的例子包括三氟甲氧基、1,1-二氯乙氧基、1,2-二氯乙氧基、1,3-二溴-3,3-二氟丙氧基、全氟丁氧基等。
术语“胺”或“氨”包括伯胺、仲胺和叔胺,其具有如N(基团)3的分子式,在所述分子式N(基团)3中,每个基团可以独立地是H或非H,例如烷基、芳基等。胺包括但不限于R’-NH2,例如,烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺;R’2NH,其中每个R被独立地选择,例如二烷基胺、二芳基胺、芳烷基胺,杂环基胺等;和R’3N,其中每个R被独立地选择,例如三烷基胺、二烷基芳基胺、烷基二芳基胺、三芳基胺等。所述术语“胺”还包括如本文中使用的铵离子。
“氨”基是-NH2、-NHR’、-NR’2、-NR’3 +形式的(其中每个R'被独立地选择)和各个的质子化形式(不能被质子化的-NR’3 +除外)的取代基。因此,任何被氨基取代的化合物可被视为胺。本文所指的“氨基”可以是伯、仲、叔或季氨基。“烷氨”基包括单烷氨基、二烷氨基和三烷氨基。
“铵”离子包括未取代的铵离子NH4 +,但除非另有说明,其也包括任何质子化或季铵化形式的胺。因此,三甲基胺盐酸盐和四甲基氯化铵都是本文所指的铵离子和铵。
术语“酰胺”(或“酰氨基”)包括C-和N-酰胺基,即,分别是-C(O)NR’2和–NR’C(O)R’基团。因此,酰胺基基团包括但不限于伯酰胺基团(-C(O)NH2)和甲酰胺基团(-NHC(O)H)。“甲酰”基团是以式C(O)NR’2表示的基团,其中R'可以是H、烷基、芳基等。
如本领域熟知的,“盐”包括以离子形式与抗衡离子组合的有机化合物,例如羧酸、磺酸、或胺。例如,阴离子形式的酸可以与以下形成盐:阳离子例如金属阳离子(例如钠、钾等);铵盐例如NH4 +或各种胺的阳离子,包括四烷基铵盐(例如四甲基铵),或其它阳离子如三甲基锍,等。“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”盐是形成于这样的离子的盐:其已被批准用于人类服用且通常是无毒的,例如氯化盐或钠盐。“两性离子”是内盐,例如,可以形成于分子中,所述分子具有至少两个可离子化的基团,一个形成阴离子而另一个形成阳离子,从而起到相互平衡的作用。例如,氨基酸例如甘氨酸可以以两性离子的形式存在。“两性离子”是本文所指的盐。本发明的所述化合物可以采用盐的形式。术语“盐”包括作为本发明的化合物的游离酸或游离碱的加成盐。盐可以是“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指这样的盐:其具有的毒性特征的范围能满足在药物应用中的使用。药学上不可接受的盐仍然可能具有例如如高结晶度的属性,其在本发明的实践中具有实用性,例如用于本发明的化合物的合成、纯化或配制的过程中。
“药学上或药理学上可接受的”包括这样的分子实体和组合物:当被施用给适当的动物或人时,其不产生不利的、过敏的或其它不良反应。对于人体施用,制剂应达到FDA生物制剂标准办公室所要求的无菌、热原和一般的安全性和纯度标准。
“水合物”是与水分子组合存在的化合物。所述组合物可以包含化学计量数量的水,例如一水合物或二水合物,或者可以包含随机量的水。本文中使用的术语“水合物”是指固体形式,即,虽然水溶液中的化合物可以是水合的,但其并不是本文中所使用的术语水合物。
此外,本领域技术人员将认识到,在以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时,也由此以马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述本发明。例如,如果X被描述成选自下组:溴、氯和碘,则已充分描述了X是溴的权利要求和X是溴和氯的权利要求。此外,本领域技术人员将认识到,在以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时,也由此以马库什组的任何单个成员或成员的亚组的组合来描述本发明。因此,例如,如果X被描述成选自下组:溴、氯和碘,并且Y被描述成选自下组:甲基、乙基和丙基,则已充分描述了X是溴且Y是甲基的权利要求。
如果将必须是整数(例如,烷基中的碳原子数或环上的取代基数)的变量的值描述成范围,例如,0-4,指的是该值可以是0和4(包括0和4)之间的任何整数,即0、1、2、3或4。
在多种实施方式中,所述化合物或化合物集合,例如本发明的方法中使用的化合物或化合物集合,可以是上面列出的实施方式的任何组合和/或亚组合的任一个。
在多种实施方式中,提供了任何所述实施例中所示的化合物,或所述示例性化合物中的化合物。任何所述公开的类别或实施方式在这样的时候可能适用附带条件:其中任何一个或多个其它的上文公开的实施方式或物质可能被排除在这些类别或实施方式之外。
基于本文中包含的教导和本领域已知的合成步骤,可以用多种方式制备本文中描述的用于本发明的方法的所述化合物。在下面所述的关于合成方法的描述中,应该理解,所提出的反应条件,包括溶剂的选择、反应气氛、反应温度、实验的持续时间和后处理程序,除非另有说明,否则可被选做该反应的标准条件。有机合成领域的技术人员应该理解,存在于所述分子各部分的功能应与拟使用的试剂和反应相容。对于本领域技术人员,不与所述反应条件相容的取代基将是显而易见的,并且因此提示了替代方法。对于所述实施例,起始原料是可商购的或可容易地通过标准方法从已知材料中制得的。所有可商购的化学品获自Aldrich、AlfaAesare、Wako、Acros、Fisher、Fluka、Maybridege等,并且除非另有说明,使用前无需进一步纯化。通过,例如,将这些穿过活化的氧化铝柱得到干溶剂。
本发明另外包括分离的本发明的化合物。术语“分离的化合物”是指本发明的化合物的制品,或本发明的化合物的混合物,其中在合成所述化合物的过程中,已将所述分离的化合物从所使用的试剂和/或形成的副产物中分离出来。“分离的”并不意味着所述制品在技术层面是纯的(均一的),但对于能在治疗上使用形式的化合物来说,其是足够纯的。优选的,“分离的化合物”是指本发明的化合物的制品,或本发明的化合物的混合物,其含有占总重量的10%重量的本发明所指定的化合物或化合物的混合物。优选的,所述制品含有占总重量的至少50%重量的所述指定的化合物或化合物的混合物;更优选地,占所述制品总重量的至少80%重量;以及最优选占总重量的至少90%、至少95%或至少98%重量。
本发明所述化合物和中间体可从其反应混合物中被分离出来,并通过标准技术例如过滤、液液萃取、固相萃取、蒸馏、重结晶或色谱法(包括快速柱色谱法,或HPLC)被纯化。
应该理解,当本发明的化合物含有一个或多个手性中心时,所述化合物可以以这样的形式存在或被分离:单一且基本上纯的对映体或非对映体形式,或外消旋混合物。因此,本发明包括本发明所述化合物的任何可能的对映体、非对映体、外消旋物或其混合物。
本发明所述的化合物,或本发明实施方法中使用的化合物,可以含有一个或多个手性中心,并且因此作为立体异构体存在。本文中使用的术语“立体异构体”由所有对映体或非对映体组成。根据所述立体异构碳原子周围的取代基的构型,可以用符号“(+),”“(-),”“R”或“S,”命名这些化合物,但是本领域技术人员将认识到,结构可以隐含表示手性中心。本发明包括这些化合物的多种立体异构体及其混合物。
在命名法中,可以以“(±)”命名对映体或非对映体的混合物,但本领域技术人员将认识到,结构可以隐含表示手性中心。
本公开所述化合物可以含有一个或多个双键,并且碳-碳双键周围的取代基的排列导致其以几何异构体形式存在。符号表示这样的键:如本文所述,其可以是单键、双键或三键。将碳-碳双键周围的取代基命名成具有“Z”或“E”构型,其中所述术语“Z”和“E”是根据IUPAC标准使用的。除非另外指明,表示双键的结构包括“E”和“Z”异构体。将碳-碳双键周围的取代基分别称为“顺式”或“反式”,其中“顺式”代表在所述双键的同一侧的取代基,而“反式”代表在所述双键的相对侧的取代基。
本发明所述化合物,或本发明实施方法中使用的化合物,可含有碳环或杂环,并且所述环周围的取代基的排列导致其以几何异构体形式存在。将碳环或杂环周围的取代基的排列称为以“Z”或“E”构型存在,其中所述术语“Z”和“E”是根据IUPAC标准使用的。除非另外指明,描绘碳环或杂环的结构即包括“E”又包括“Z”异构体。也可将碳环或杂环周围的取代基称为“顺式”或“反式”,其中所述术语“顺式”代表在所述环的平面的同一侧的取代基,而所述术语“反式”代表在所述环的平面的相对侧的取代基。将这样的化合物的混合物指定成“顺/反式(cis/trans)”:其中所述取代基既存在于所述环平面的同一侧又存在于所述环平面的相对侧。
所涵盖的化合物的单个对映体和非对映体可从市售的含有不对称中心或手性中心的原料合成性地制得,或通过制备外消旋混合物并随后通过本领域普通技术人员熟知的拆分方法制得。这些拆分方法如下示例:(1)对映体混合物附着于手性助剂,通过重结晶或色谱法对所得到的非对映体的混合物进行分离,并将所述光学纯产物从所述助剂中放出,(2)采用光学活性的拆分剂形成盐,(3)在手性液相色谱柱上直接分离所述光学对映体的混合物,或(4)利用立体选择化学试剂或酶试剂进行的动力学拆分。通过熟知的方法,例如手性液相色谱法或在手性溶剂中结晶所述化合物,能将外消旋混合物拆分成它们的组分对映体。立体选择性合成是本领域熟知的,其是这样的化学或酶促反应:在创建新的立体中心的过程中或在预先存在的立体中心的转化过程中,单一反应物形成立体异构体的不对等混合物。立体选择性合成包括对映的和非对映的选择性转换,并可能涉及使用手性助剂。例如,参见CarreiraandKvaerno,ClassicsinStereoselectiveSynthesis,Wiley-VCH:Weinheim,2009。
由手性中心的存在而产生的异构体包含一对被称为“对映体”的不能重叠的异构体。纯化合物的单一对映体是旋光的,即,它们能够旋转平面偏振光的平面。根据Cahn-Ingold-Prelog***命名单一对映体。取代基的优先级是基于原子量排序的,由***方法确定的更高的原子量,具有更高的优先级排序。一旦确定了四个基团的优先顺序,则定向所述分子以致于排名最低的基团指向远离观察者的方向。然后,如果其它基团的排序以顺时针递减,则该分子被指定为具有(R)绝对构型,然而如果其它基团的排序以逆时针递减,则该分子被指定为具有(S)绝对构型。在下面图式的例子中,所述Cahn-Ingold-Prelog排序是A>B>C>D。排名最低的原子D是指向远离观察者的方向。
如上所示,带有A-D原子的碳原子被称为“手性”碳原子,并且这样的碳原子在分子中的位置被称为“手性中心”。本发明的化合物可以含有一个以上的手性中心,并且以相同的方式描述每个手性中心处的构型。
本发明意在包括非对映体以及它们的外消旋的和拆分的非对映体和对映体纯化形式及其盐。可通过已知的分离技术包括正相色谱法和反相色谱以及结晶法拆分非对映异构对。
“分离的光学异构体”或“分离的对映异构体”是指已经从相同化学式的相应的光学异构体中基本上被纯化的化合物。按重量计算,优选地,所述分离的异构体是至少约80%,更优选地,至少90%对映体纯的,甚至更优选地,至少98%对映体纯的,最优选至少约99%对映体纯的。“对映体纯度”是指在化合物的光学异构体的对映体混合物中,主要对映体的百分数。纯的单一对映异构体具有100%的对映体纯度。
可通过熟知的手性分离技术从外消旋混合物中纯化光学异构体。根据这样一种方法,使用合适的手性柱,例如柱(Daicel化学工业株式会社,东京,日本)家族系列成员,通过HPLC,可将本发明的化合物的外消旋混合物,或其手性中间物,分离成99%(重量%)纯的光学异构体。根据制造商的说明对柱进行操作。
另一种获得分离的且基本上纯的光学异构体的熟知的方法是经典拆分,通过含有离子化的官能团(例如质子化胺或羧酸基团)的手性外消旋化合物,与离子化相反的手性非外消旋的添加剂形成非对映体盐。随后可以通过标准的物理方法,例如差异溶解度,分离所得到的非对映体盐形式,并且随后通过标准化学方法除去所述手性非外消旋添加剂,或将其与交替的抗衡离子替换,或者,以盐的形式保留非对映体盐形式以用作治疗剂或治疗剂的前体。
本发明的实施方式的另一方面提供了单独的本发明所述化合物的组合物或与另一药剂组合的本发明所述化合物的组合物。如本文中所述,本发明的化合物包括立体异构体、互变异构体、溶剂化物、前药、药学上可接受的盐和其混合物。可通过常规技术制备含有本发明化合物的组合物,例如,如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995或其更高版本中所述,其通过引用并入本文。所述该组合物能够以常规形式呈现,例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液、悬浮液或局部应用试剂。
典型的组合物包括本发明的化合物和药学可接受的赋形剂,所述赋形剂可以是载体或稀释剂。例如,所述活性化合物通常与载体混合,或用载体稀释,或包于载体内,所述载体可以是安瓿、胶囊、小袋、纸或其他容器的形式。当所述活性化合物与载体混合时,或者当所述载体用作稀释剂时,其可以是作为所述活性化合物的载剂、赋形剂或介质的固体、半固体或液体物质。所述活性化合物可被吸附在粒状固体载体上,例如包含在小袋中。合适的载体的一些例子是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、白土、蔗糖、糊精、碳酸镁、糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。类似地,所述载体或稀释剂可以包括本领域中已知的任何缓释材料,例如单独的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
所述制剂可以和不与所述活性化合物发生有害反应的助剂混合。这样的添加剂可以包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂,用于影响渗透压的盐、保护试剂的缓冲液和/或着色物质、甜味剂或调味剂。如果需要,也可灭菌所述组合物。
施用途径可以是任何有效地将本发明所述活性化合物输送到适当的或想要的作用位点的途径,例如口服、经鼻、肺、口腔、皮下、皮内、经皮或肠胃外,例如,直肠、储库(depot)、皮下、静脉内、尿道内、肌内、鼻内、眼用溶液或软膏,优选口服途径。
如果使用固体载体用于口服给药,所述制剂可以是成片的,以粉末或球粒形式置于硬明胶胶囊中或者其可以是片剂或锭剂的形式。如果使用液体载体,所述制剂可以是糖浆、乳剂、软明胶胶囊或无菌可注射液体的形式,例如水性或非水性液体悬浮液或溶液。
注射剂型一般包括水悬浮液或油悬浮液,所述油悬浮液可通过使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。可注射形式可以在溶液相中或是用溶剂或稀释剂制备的悬浮液的形式。可接受的溶剂或载剂包括无菌水、林格氏溶液或等渗盐水溶液。或者,无菌油可以用作溶剂或助悬剂。优选地,所述油或脂肪酸是不挥发的,包括天然的或合成的油、脂肪酸、单甘油酯、二甘油酯或三甘油酯。
对于注射,所述制剂还可以是适于用如上所述适当的溶液配制的粉末。这些的例子包括,但不限于,冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末,无定形粉末,颗粒,沉淀物或微粒。对于注射,所述制剂可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度改性剂和这些的组合。可配制所述化合物用于肠胃外注射(例如通过推注或连续输注)施用。用于注射的单位剂型可以是在安瓿中或多剂量容器中。
通过采用本领域熟知的方法,可将本发明的所述制剂设计成在施用给患者之后,提供快速、持续或延迟释放所述活性成分。因此,所述制剂也可被制成用于控释或用于缓释。
本发明涵盖的组合物可以包括,例如,微胶粒或脂质体,或某些其它的包封形式,或可以以缓释形式施用,以提供延长的储存和/或递送效果。因此,可将所述制剂压成球状或圆柱形,并将其作为储库注射剂植入肌内或皮下。这样的植入物可以采用已知的惰性材料例如有机硅和可生物降解的聚合物,例如,聚丙交酯-聚乙交酯。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。
对于经鼻施用,所述制剂可以含有溶解或悬浮在液体载体(优选水性载体)中的本发明的化合物,用于气溶胶应用。所述载体可以含有添加剂例如增溶剂,例如,丙二醇、表面活性剂、吸收促进剂(如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精)、或防腐剂(如对羟基苯甲酸酯)。
对于胃肠外应用,特别合适的是可注射的溶液或悬浮液,优选活性化合物溶于多羟基化蓖麻油中的水溶液。
具有滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂等的片剂、糖衣丸或胶囊特别适合于口服应用。片剂、糖衣丸或胶囊的优选的载体包括乳糖、玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。在可以采用增甜的载剂的情况下,可以使用糖浆或酏剂。
通过常规的压片技术可以制备的典型片剂可以含有:
*酰化单酸甘油酯用作增塑剂,用于薄膜包衣。
典型的用于口服施用的胶囊含有本发明的化合物(250mg)、乳糖(75mg)和硬脂酸镁(15mg)。将所述混合物通过60目筛并填充到1号明胶胶囊中。通过在无菌条件下将250mg的本发明化合物装入小瓶,无菌冻干并密封,生产典型的可注射制剂。使用时,将所述小瓶中的内容物与2mL的无菌生理盐水混合,以产生可注射的制剂。
本公开提供了用于实施本发明的方法的药物组合物,所述药物组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的本文中所公开的化合物。具体地,本公开提供了用于这些方法的药物组合物,所述药物组合物包含与一个或多个药学上可接受的载体一起制备的本文中所公开的化合物。这些制剂包括那些适合于口服、直肠、局部、口腔、肠胃外(例如,皮下、肌内、皮内或静脉内)、直肠、***或气雾剂施用的制剂,虽然在任何给定的情况下,最适的施用形式将取决于所治疗的病况的程度和严重性,和所使用的特定化合物的性质。例如,公开的组合物可被配制成单位剂量,和/或可被配制用于口服或皮下施用。
本发明的所述化合物可施用于哺乳动物,特别是需要这种治疗、预防、消除、减轻或改善不良状况的人。这样的哺乳动物也包括动物:家畜(例如家庭宠物、农场动物)和非家畜(例如野生动物)。
本发明所述的化合物在很宽的剂量范围内是有效的。例如,在对成年人的治疗中,可以使用每天从约0.05至约5000mg(优选从约1至约2000mg,更优选约2至约2000mg)的剂量。典型的剂量是每天约10mg至约1000mg。在选择患者的治疗方案时,经常有必要从较高的剂量开始并且当控制了所述病况时,减少所述剂量。确切的剂量将取决于所述化合物的活性、施用方式、需要的治疗、施用形式、待治疗的受试者和待治疗的受试者的体重,以及负责的医生或兽医的偏好和经验。
一般的,将本发明的所述化合物分配成单位剂型,其中每单位剂量包括从约0.05mg至约1000mg的活性成分以及药学上可接受的载体。
通常,适于口服、经鼻、经肺或经皮施用的剂型包括从约125μg至约1250mg(优选从约250μg至约500mg,并且更优选从约2.5mg至约250mg)的、与药学上可接受的载体或稀释剂混合的化合物。
可以每天,或每天多次,例如,每天2次或3次,施用剂型。或者,如果处方医生认为可取,可以用比每天更低的频率施用剂型,例如隔日或每周。
对本文中公开的和要求保护的任何化合物,使用上述的或在科学文献中发现的步骤评估其在抑制MALT1和在多种细胞检测方法中的效应,是在普通技术范围之内的。因此,本领域普通技术人员无需过度实验就可以制备和评估任何所要求保护的化合物。
可以用研究者的技能和经验对任何被发现是MALT1的有效抑制剂的化合物同样在动物模型和人临床研究中进行测试,以指导选择剂量和治疗方案。
生化筛选鉴定MALT1蛋白水解活性的低分子量抑制剂
我们推断,MALT1的小分子抑制剂可能是用于研究MALT1生物和治疗嗜MALT1肿瘤的有用的化学工具。然而,全长MALT1及其paracaspase域(氨基酸340-789)是作为单体天然存在于生理溶液中的,其具有非常低的蛋白水解活性。半胱天冬酶一般必须同型二聚化以获得最大的催化活性(Popetal.,2006;Walkeretal.,1994;Yinetal.,2006),并且相应地,最近报导的与肽抑制剂形成复合体的MALT1的paracaspase域是二聚化的(Wiesmannetal.,2012;Yuetal.,2011)。为了生成用于有效测试的催化活性MALT1,以筛选抑制剂,我们生化改造了重组形式的MALT1,其中MALT1(340-789)与亮氨酸拉链二聚化基序(LZ-MALT1)融合,所述LZ-MALT1促进其二聚化和活化(图1A)。我们开发了一种MALT1活性测试法,其使用与荧光发生素AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)连接的MALT1底物肽LRSR。MALT1对Ac-LRSR-AMC底物的切割作用导致AMC和荧光信号的释放。
通过酶和底物在二维网格中的***变化确定用于高通量筛选的最佳条件。每45秒进行荧光检测,持续60分钟。将所述检测绘制成时间的函数。荧光和时间之间为线性关系的条件被认为是适合于筛选的。使用Z'因子评估质量,所述Z'因子是反映测定方法的动态范围和数据方差的系数(Zhangetal.,1999),由式Z'因子=1-3*(σp+σn)/(|μp-μn|)计算得到,其中σp/n是阳性和阴性对照的标准偏差;μp/n表示阳性和阴性对照的平均值。对于本筛选,所述Z'因子是0.738,其在0.5-1的最佳范围内(Zhangetal.,1999)。共筛选了46,464种化合物。
所述化合物库获自纽约州奥尔巴尼的奥尔巴尼分子研究公司(AMRI)。
对于MI-2,来自AMRI的ID号是ALB-H03200218;
MI-2A1:CGX-01216062
MI-2A2:CGX-01216044
MI-2A3:CGX-01207032
MI-2A4:ALB-H09612295
MI-2A5:ALB-H01205459
使用40%抑制作为阈值,选择了324种候选化合物用于在浓度应答测试中进行验证(图1B)。在这些化合物中,基于其生化活性选择了19种化合物用于进一步验证(IC50<20μM,图1C)。
候选抑制剂选择性地抑制ABC-DLBCL细胞系和MALT1的催化活性
MALT1活性在选择性维持ABC-DLBCL细胞系的增殖中起重要作用(Ngoetal.,2006)。因此,对于肽Z-VRPR-FMK对MALT1切割作用的抑制,ABC和GCB-DLBCL细胞系表现出不同的敏感性(Ferchetal.,2009;Hailfingeretal.,2009;Rebeaudetal.,2008)。为了确定候选小分子是否表现出类似的属性,将两个ABC-DLBCL细胞系HBL-1和TMD8,以及一个GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly1,暴露于浓度渐增的19种被选分子。在暴露于单剂量化合物48小时后,使用基于ATP的代谢发光测试方法检测细胞增殖(总结在图1C中)。三种化合物一致诱导了对ABC-DLBCL细胞的显著的选择性的剂量依赖性的抑制(MI-2,p<0.0001;MI-4,p=0.006和MI-11,p<0.0001-平方和增量回归F检验)。因此,这些化合物在细胞中是有活性的,选择性针对ABC-DLBL的,并且没有非特异性细胞毒性。MI-6和MI-15也显示出针对ABC-DLBCL细胞的差异抑制,但未达到统计学意义。
在基于细胞的测定法中,化合物MI-2是最有效的,其中GI25的浓度在高纳摩尔范围内。因此,接下来在淋巴瘤细胞中测定了MI-2(图1D)对MALT1介导的底物切割的抑制作用。用浓度渐增的MI-2处理HBL-1细胞24小时,并通过免疫印迹和光密度测定法检测MALT1对靶蛋白CYLD的切割作用。MI-2引起了MALT1介导的切割作用的剂量依赖性的降低,显示为未切割的CYLD蛋白的升高和切割形式的所述蛋白质的降低(图1E)。作为MALT1paracaspase的抑制剂,MI-2是有选择性的,这是因为其针对结构相关的半胱天冬酶(caspase)家族成员Caspase-3、-8和-9显示出很少的活性。此外,在基于细胞的测定法中MI-2以抑制MALT1的浓度存在时,不抑制Caspase-3/7的活性或者凋亡。因此,MI-2是潜在的作为治疗性MALT1抑制剂的先导化合物。
MI-2类似物展示出针对MALT1的抑制活性
为了确定化合物MI-2是否代表用于开发MALT1抑制剂的潜在骨架,我们在电脑模拟中将MI-2与其它化合物进行比较以鉴定潜在的类似物。通过LZ-MALT1荧光测定法从可用的库中共筛选出704种相似度分数≥70%(Tanimoto相似度函数)的类似化合物。选择了19种与MI-2相比展示出相同或更高活性的类似物(图2A)。五种具有与MI-2相似范围内的生化IC50的类似物被选择用于在细胞增殖测定中作进一步表征(图2B和2C)。所有五种类似物(MI-2A1-5)显示出相同的偏向选择性抑制所述ABC-DLBCL细胞系的趋势,其中GI25浓度在微摩尔范围内(图2C)。用作化学对照的、体外无LZ-MALT1抑制活性的两种模拟化合物(MI-2A6-7)在相同剂量范围内对细胞增殖无明显效应。测定了所述五种活性MI-2类似物对MALT1切割CYLD的抑制作用。虽然MI-2本身仍是最有效的化合物,所有五种化合物在5μM施用8小时时显示出与用作阳性对照的Z-VRPR-FMKMALT1封闭肽(50μM)相似的切割抑制作用(图2D)。总的来说,在化学上相关的化合物中,体外和在基于细胞的测定法中MALT1抑制剂活性的保留指示MI-2及其类似物适合作为MALT1抑制剂的先导化合物。
MI-2直接结合并不可逆地抑制MALT1
我们接下来研究了MI-2是否直接结合MALT1或间接影响MALT1活性,例如,通过结合所述融合蛋白的LZ区。使用异核单量子相干(HSQC)核磁共振(NMR)谱来表征MI-2与MALT1的paracaspase结构域(残基329-728)的结合。随着MI-2的滴定,对应于所述MALT1的未结合状态的共振的强度下降,而对应于所述MALT1-MI-2复合物的另一组共振逐渐显现(图3A)。这种化学位移变化的模式是核磁共振时间尺度上慢交换的特点,并且表明了MALT1和MI-2之间强大的相互作用。相反地,NMR光谱法研究没有显示关于无活性类似物MI-2A6和MI-2A7的结合的证据(图3B)。
由于MI-2含有的反应性氯甲基酰胺,我们使用液相色谱-质谱法(LC-MS)研究了MI-2是否能共价地修饰MALT1。如图3C所示,MALT1的paracaspase结构域(329-728)在55,988.4Da处呈现出主峰。在与化合物MI-2孵育时,所述MALT1的主峰移至56,407.5Da,升高了419.1Da。这与加入了减去氯基团的MI-2是一致的,表明MI-2可以共价结合到MALT1上并潜在地充当不可逆的抑制剂。由于所述氯甲基酰胺基团在所述活性MI-2类似物中是不保守的(图2B),最有可能的是MI-2系列中共同的化学骨架提供针对MALT1的特异性。值得注意的是,用MI-2和MALT1活性位点突变体C464A进行的LC-MS揭示了明显降低的共价结合,表明所述活性位点C464残基是MI-2进行修饰的主要靶点(图3C)。为了进一步探讨MI-2结合于MALT1的paracaspase结构域的潜在模式,我们采用了使用AUTODOCK4.2的分子对接(Morrisetal.,2009)。将MALT1的晶体结构(Wiesmannetal.,2012;Yuetal.,2011)保持为刚体,同时允许MI-2的构象柔性。对于每个对接构象,将最终结果在预测的结合自由能和簇的大小上进行排序。选择前5位,所有这些都具有类似的对接得分,伴有其方向上的细微变化。如顶图所示,MI-2显示与所述活性位点裂隙结合并且其氯甲基基团靠近所述paracaspase结构域中的活性位点C464(图3D),这与这两个基团之间的共价键的形成一致。总的来说,这些数据表明MI-2占据并不可逆地结合所述MALT1活性中心。
为了检测MI-2对MALT1的抑制是否与不可逆的结合动力学一致,将LZ-MALT1与不同浓度的MI-2预孵育5至80分钟,随后加入底物Ac-LRSR-AMC以确定酶活性(图3E)。值得注意的是,MALT1的灭活百分比随时间升高,在所述测试接近结束时达到平台期,这与共价和不可逆的抑制作用一致。抑制是浓度依赖性的,较高的浓度显示出更强烈的失活和更快的饱和速率。相反地,所述不具有所述氯甲基酰胺基基团的活性MI-2类似物MI-2A2,没有显示出累积抑制MALT1的证据,这与可逆抑制一致。应当指出的是,MI-2达到了接近100%的抑制,而具有较低的IC50的MI-2A2仅达到约50%的抑制(图3E)。如已在肽基卤代甲基酮蛋白酶抑制剂的情况中所提到的(Powersetal.,2002),所述不可逆动力学可能有助于MI-2在基于细胞的测定法中,与缺乏所述氯甲基酰胺基基团且仅以可逆的方式结合的类似物相比,表现出更有效的作用。
MI-2在ABC-DLBCL细胞系中抑制MALT1的功能
已经证实MI-2是先导化合物,我们接下来探讨其在ABC-DLBCL细胞中对MALT1信号传导的效应。我们首先检测了MI-2对其他的MALT1底物(例如A20、BCL10和RELB)的切割作用的影响。由于这些蛋白质在被切割之后会被引导至蛋白酶体降解途径(Coornaertetal.,2008;Hailfingeretal.,2011;Rebeaudetal.,2008),我们使用了蛋白酶体抑制剂MG-132以辅助切割产物的可视化(图4A)。将HBL-1和TMD8细胞系在MI-2(2μM)或载剂下暴露30分钟,然后再在5μM的MG-132下暴露30分钟(泳道2、3),或暴露两个小时(泳道4、5),以允许切割形式的MALT1底物在暴露于MI-2的过程中累积。如所预期的,暴露于MG-132揭示了A20、BCL10和RELB切割产物的累积,所述累积归因于MALT1在这些DLBCL细胞中的组成型的活性。然而,与MALT1酶活性损失一致,暴露于MI-2减少了切割形式的丰度和/或提升了全长蛋白质的丰度(图4A)。
MALT1介导了BCR刺激之后的C-REL向细胞核的易位(Ferchetal.,2007)。因此,将HBL-1细胞在200nMMI-2、50μMZ-VRPR-FMK(阳性对照)或在载剂下暴露24小时,随后对全细胞或分离的细胞核进行c-REL流式细胞计数。MI-2和Z-VRPR-FMK将核c-REL减少到类似的程度,但不影响该蛋白质的全细胞水平(图4B)。为了进一步证实该结果,我们还对经GI50浓度的MI-2(200nM用于HBL-1;和500nM用于TMD8)处理24小时的HBL-1和TMD8细胞的核提取物中的c-REL和p65进行了免疫印迹。在两种细胞系中,对MI-2的暴露引起核c-REL明显的减少,而其并不影响p65的水平(图4C)。这种对c-REL的选择性之前已在MALT1敲除小鼠中和在MALT1封闭肽Z-VRPR-FMK抑制MALT1的切割作用之后,有所显示(Ferchetal.,2009;Ferchetal.,2007;Hailfingeretal.,2011)。
抗原受体介导的NF-κB信号传导部分依赖于MALT1活性(Ruefli-Brasseetal.,2003;Rulandetal.,2003)。因此,我们测试了MI-2在减弱PMA/离子霉素诱导的NF-κB活化上的效应,所述PMA/离子霉素模拟BCR的活化并激活MALT1依赖的切割作用(Coornaertetal.,2008;Rebeaudetal.,2008)。首先,用NF-κB报告载体(NF-κB)5-luc2CP-pGL4(具有5个拷贝的NF-κB共有序列反应元件和去稳定的萤火虫荧光素酶)和TK-pRL对照,连同表达BCL10和MALT1WT或MALT1C464A(失活突变体)的质粒,转染293T细胞。当转染了MALT1WT而非MALT1C464A突变体时,暴露于PMA/离子霉素显著提升了293T细胞中的萤光素酶活性(p<0.001;ANOVA和邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法)。与Z-VRPR-FMK(p<0.05)类似,MI-2的预处理显著抑制了PMA/离子霉素刺激对NF-κB的诱导(P<0.01;ANOVA和邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法),但其并没有显著影响MALT1C464A对NF-κB的诱导(图4D)。据报道,HBL-1细胞表现出慢性的活化B细胞受体信号传导和随后的NF-κB活化(Davisetal.,2010)。用所述报告构建体(NF-κB)5-luc2CP-pGL4和TK-pRL对照转染了HBL-1。在第8和24小时时,MI-2的处理分别促进NF-κB报告子活性减少20%和50%。类似的结果发现于50μM的Z-VRPR-FMK50(图4E)。对于MI-2(p<0.001;ANOVA和邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法)和所述封闭肽Z-VRPR-FMK(p<0.05),这种NF-κB报告子活性的减少在第24小时时是显著的。
MI-2对NF-κB信号传导的影响通过基因表达谱进一步得到表征。对于这些实验,所述HBL-1和TMD8细胞系经GI50浓度的MI-2(对HBL-1细胞为200nM而对TMD8细胞为500nM)或50μM的Z-VRPR-FMK处理8小时,并提取RNA用于基因表达研究,所述研究使用寡核苷酸微阵列方法。Z-VRPR-FMK先前显示能在ABC-DLBCL细胞系中减弱NF-κB信号(Hailfingeretal.,2009)。MI-2预期会表现出类似的谱。在此研究中,对于每个细胞系,我们通过捕捉与载剂相比经Z-VRPR-FMK处理后基因下调最高的200个来分配Z-VRPR-FMK标识。我们接下来对每个细胞系以MI-2处理组和载剂处理组细胞间的表达倍数变化预排基因,并针对所有这些基因的差异性表达,对这个Z-VRPR-FMK标识进行了基因集富集分析(GSEA)。对于两个细胞系,所述Z-VRPR-FMK标识显著富集于经MI-2处理之后被下调的基因中(HBL-1:FDR<0.0001;和TMD8:FDR<0.0001,图4F)。接下来利用来自OCI-LY3和OCI-Ly10、或HBL-1细胞系的两个独立的ABC-DLBCLNF-κB基因表达信号执行了GSEA。在两种细胞系(NF-κBOCI-Ly3/OCI-Ly10,HBL-1:FDR=0.015和TMD8:FDR<0.0001)和(NF-κBHBL-1,HBL-1:FDR=0.051和TMD8:FDR<0.0001)中,在经MI-2处理之后被下调的基因中,我们观察到这些NF-kB基因集的显著富集。总的来说,这些数据表明,MI-2抑制了MALT1诱导的NF-κB活性,其类似于用Z-VRPR-FMK观察到的效果。
MI-2选择性地抑制MALT1依赖的DLBLC细胞系
为了进一步探讨MI-2介导的MALT1抑制效应谱,我们转至六种ABC-DLBCL和两种GCB-DLBCL细胞系的更大的组。在这些细胞系中,影响B细胞受体和NF-κB通路的遗传特性总结在表1中。
表1:存在于本研究使用的细胞系中的ABC-DLBCL可激活NF-κB的突变
对于A20、BCL10和CYLD,通过免疫印迹法评价了内源性MALT1活性;并通过磷酸化的IκB-α和总IκB-α评价NF-κB的活化。通过用50μMZ-VRPR-FMK处理48小时测试增殖对MALT1蛋白水解活性的依赖性。如所预期的,所述两种GCB-DLBCL细胞系(OCI-Ly7和OCI-LY1)没有显示出MALT1或NF-κB信号传导的证据,也没有对Z-VRPR-FMK做出应答。所述ABC-DLBCL细胞系U2932和HLY1具有TAK1和A20的突变,所述突变激活MALT1下游的NF-κB信号。因此,这两种细胞系显示出对Z-VRPR-FMK相对很小的反应。相反的,所述ABC-DLBCL细胞HBL-1、TMD8、OCI-LY3和OCI-LY10显示出MALT1活性的证据,以及Z-VRPR-FMK对增殖的抑制,表明这四种细胞系是依赖于MALT1的。
所有八种细胞系暴露于浓度升高的MI-2(单剂量)并在第48小时使用基于ATP的代谢发光测定法测量细胞增殖(图5A)。MI-2的生长抑制作用是选择性针对MALT1依赖性细胞系的,而不依赖MALT1的ABC-DLBCL细胞系U2932和HLY-1以及所述两种GCB-DLBCL细胞系对其是具有抗性的。在HBL-1、TMD8、OCI-LY3和OCI-LY10细胞中,MI-2的GI50分别是0.2、0.5、0.4和0.4μM,所述GI50比其体外的IC50低(图1)。这可能是由于图3中所示的MI-2与MALT1的不可逆结合,但还可能归因于所述化合物在细胞内的积累。事实上,我们在实验中观察到MI-2细胞内浓度的18至30倍的升高,在所述实验中,HBL-1细胞在0.02、0.2或2μMMI-2下暴露2小时,洗涤三次,并用LC-MS测量MI-2(图5B)。在经0.2μMMI-2处理的细胞中,所述细胞内浓度是5μM,类似于体外计算得到的IC50(图5B)。为了确定游离药物积累的动力学,我们在GI50浓度为0.2μM的情况下,于30min、2、6、12、24和48小时测量了MI-2的细胞内浓度。到12小时为止,所述细胞内基本上没有可被检测到的游离MI-2。然而,在将HBL-1细胞暴露于浓度升高的单次MI-2剂量之后,细胞的恢复在48小时之后才开始变得明显(0.2μM剂量水平下)。这些数据表明,MI-2有效的生物学效应至少部分地归因于其与MALT1的不可逆结合,所述不可逆结合是由其在细胞中聚集的倾向所辅助的。
为了更详细地探讨MALT1抑制的生物学效应,用浓度升高的MI-2处理HBL-1、TMD8、OCI-Ly10和所述GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly1。使用CFSE稀释测定法通过流式细胞术在48、72和96小时对活细胞检测细胞增殖。在HBL-1、TMD8和OCI-LY10中,MI-2基本抑制了增殖,但其并不影响OCI-Ly1(图5C1、5C2、5C3)。使用BrdU掺入-DAPI染色和流式细胞术评估细胞周期,很明显,MI-2诱导了剂量依赖性的S期的降低,并伴有G1-0和亚G0期细胞比例的倒数增长(图5D)。为了确定MALT1抑制剂是否诱导凋亡,对ABC-DLBCL细胞系HBL1和TMD8分别使用其各自的GI25和GI50量的MI-2每天对其进行处理,并用用于TMD8的较高剂量处理对照的OCI-Ly1细胞系。通过台盼蓝染色排除法和AnnexinV+DAPI-流式细胞术评估细胞凋亡,在为期14天内每48小时对其进行测量。虽然MI-2对OCI-Ly1细胞没有效应,但其显著抑制了HBL-1和TMD8细胞,伴随着前者表现出更早和更高丰度的凋亡细胞(图5E)。通过使用更灵敏的半胱天冬酶(Caspase)3/7切割测定法,我们在两种ABC-DLBCL细胞系中观察到在48小时内的剂量依赖性凋亡的证据。因此,MI-2有力地抑制了ABC-DLBLC细胞系的生长和存活。
化合物MI-2对动物是无毒的
为了确定其作为MALT1的先导化合物用于体内研究的适当性,我们检测了MI-2是否在小鼠中诱导毒性效应。将五只C57BL/6小鼠暴露于每日腹膜内(IP)施用剂量升高的MI-2,所述剂量范围从0.05到25mg/kg,历时10天以达到51.1mg/kg的累积剂量,并且将另五只小鼠仅暴露于载剂(5%DMSO,n=5)(图6A,毒性1)。没有关于嗜睡、体重下降(图6B,毒性1)或其它疾病物理指标的证据。为了确定在14天的日程中25mg/kg的最大施用剂量是安全的,我们将十只小鼠暴露于每天IP施用25mg/kgMI-2,历时14天以达到350mg/kg的累积剂量,并对用作对照的五只小鼠仅注射载剂(图6A,毒性2)。在为期14天的MI-2施用之后,处死五只小鼠(连同所述5只对照),并在10天的清除期后处死其它5只小鼠以评估延迟毒性。没有注意到毒性效应或其它疾病指标,包括体重减轻(图6B,毒性2)或组织损伤(宏观的或微观的)(图6C1,6C2)。检测了大脑、心脏、肺、肝、肾、肠、脾、胸腺和骨髓组织。骨髓是增生活跃的,并伴有三系成熟造血细胞。髓系对红系的比是4-5:1。巨核细胞数量和分布是正常的。原始细胞或淋巴细胞既没有纤维化也没有发生数量的增加。完整的外周血计数、生化和肝功能检查都是正常的(表2)。
表2:来自毒性2实验的细胞血细胞计数和血清化学结果(每天IP施用25mg/kg MI-2或等体积的载剂,历时14天)
a在经载剂和MI-2处理的动物体内,葡萄糖有轻度升高,这可能归因于将葡萄糖用作赋形剂进行施用,或是因为小鼠没有被禁食。
这些研究确立了MI-2在用于抗淋巴瘤效力研究中的安全性。
MI-2在活体外抑制人ABC-DLBCL异种移植物和原代人DLBCL。
为了确定MI-2能否在体内抑制DLBCL,我们将DLBCL细胞HBL-1和TMD8(MALT1依赖的)和OCI-LY1(MALT1不依赖的)移植入NOD-SCID小鼠的右胁区域。一旦肿瘤达到平均120mm3的体积,小鼠随机接受25mg/kg/天的MI-2(n=10用于TMD8,n=5用于HBL1和n=10用于OCI-Ly1)或载剂(5%DMSO,n=10用于TMD8,n=4用于HBL1和n=10用于OCI-Ly1)的IP注射。在第14次注射后的24小时,处死动物。值得注意的是,相对于载剂,MI-2显著抑制了所述TMD8(p=0.015,t检验)和HBL1(p=0.014,t检验)ABC-DLBCL异种移植物的生长,而其对所述OCI-Ly1肿瘤的生长没有效应(p=0.47,t检验)(图7A)。所述OCI-Ly1肿瘤没有被影响的事实表明,MI-2的活性归因于其对淋巴瘤细胞的效应,而非宿主微环境。使用TUNEL测定法来检测凋亡细胞的组织学检查显示,经MI-2处理的HBL-1(p=0.0008,t检验)和TMD8(P<0.0001,t检验)异种移植物中的凋亡细胞相与载剂组相比显著增加,但在OCI-Ly1异种移植物中没有此发现(p=0.5580,t检验)(图7B)。通过Ki-67染色检测,我们还观察到HBL-1(p<0.0001,t检验)和TMD8(p=0.0006,t检验)异种移植物中的增殖相与载剂组相比显著降低,但在OCI-Ly1异种移植物中没有观察到差异(p=1.0,t检验;图7C)。为了评估MI-2处理对异种移植物中NF-κB信号的效应,在石蜡化肿瘤切片中进行c-REL免疫荧光检测。与图4B和4C所示的数据一致,经MI-2处理的肿瘤表现出减少的c-REL核蛋白(图7D)。因此,所述MALT1的小分子抑制剂MI-2以淋巴瘤细胞自激方式特异性地体内抑制ABC-DLBCL的增殖、存活和NF-κB活性。
最后,为了确定MI-2是否也能抑制原代人DLBCL,我们从五位DLBC患者的***活检中获得单细胞悬液,对所述患者来说,其GCB对非GCB的状态可以通过免疫组化由汉斯标准来确定(Hansetal.,2004),用于替代GCB对ABC分类。在四次重复实验中,分离淋巴瘤细胞并将其暴露于0.8μM的MI-2或载剂。暴露48小时后,使用台盼蓝确定细胞数量和存活率。值得注意的是,所述非GCB病例中有两例对MI-2产生应答(与载剂组对比,分别为p=0.04和0.003),而没有一例GCB有这样的应答(图7E)。所述非GCB有一例没有对MI-2应答,可能本例没有被汉斯标准精确分类。总的来说,这些研究表明,使用所述MI-2小分子抑制剂来治疗性靶向MALT1对人ABC-DLBCL细胞具有强大的抑制效应并值得转化以在临床试验中使用。
所述CARMA1-BCL10-MALT1(CBM)复合物在抗原受体活化后组装,导致MALT1的二聚体化和其paracaspase活性的诱导。MALT1对底物蛋白A20、BCL10、CYLD和RELB的切割通过不同的机制增强NF-κB的信号传导(Coornaertetal.,2008;Hailfingeretal.,2011;Rebeaudetal.,2008;Staaletal.,2011)。在ABC-DLBCL的亚组中,BCR信号传导是长期活化的,这归因于多种基因的体细胞突变,所述突变导致组成性的MALT1信号传导和NF-κB的活化(Davisetal.,2010)。此外,小鼠中MALT1的组成性表达模拟MALT淋巴瘤和ABC-DLBCL(Vicente-Duenasetal.,2012)。因此,所述MALT1蛋白水解活性的小分子抑制剂可以代表用于治疗ABC-DLBCL或MALT淋巴瘤、以及多种炎性和自身免疫性疾病的非常有用的治疗剂。
MALT1的催化活性是非常明确的并涉及底物的特征,例如肽的长度和氨基酸的组成和位置(Hachmannetal.,2012)。纯化的MALT1,无论是全长蛋白质或是所述paracaspase结构域,在溶液中是不很活跃的,这是因为其在溶液中以单体代替其活化的二聚体形式存在。二聚化可由高盐浓度(1M柠檬酸钠)诱导(Boatrightetal.,2003)。然而这些高盐条件是非生理性的,从而阻碍对生理学相关的小分子抑制剂的生化筛查。为了避免这种情况,我们改造了融合有亮氨酸拉链结构域的重组型MALT1蛋白,使得MALT1的paracaspase结构域(340-789)在其二聚体活性构象内(图1A),允许我们使用更生理的条件来进行筛选。我们使用此方法鉴定了19种化合物,所述化合物能体外抑制MALT1并具有微摩尔范围内的IC50。我们侧重于最有效的抑制剂MI-2。我们发现MI-2是MALT1的共价不可逆的且是选择性的抑制剂,与蛋白酶抑制剂药物类似,如抗丙型肝炎病毒的NS3/4A蛋白酶的Telaprevir(Klibanovetal.,2011)、蛋白酶体抑制剂Carfilzomib(Geninetal.,2010)等(Powersetal.,2002)。虽然肽抑制剂Z-VRPR-FMK作为研究工具一直是有用的,但是考虑到其相对较大的大小、电荷和随之产生的较低的细胞渗透性,其不适合作为MALT1治疗剂。因此,MI-2在基于细胞的测定中显示出优越的活性,伴随着优良的细胞渗透性和真正特征性的细胞内高浓度,但相对于其它天冬半胱氨酶,仍然对MALT1具有高度选择性。值得注意的是,所述酪氨酸激酶BTK的选择性的和不可逆的小分子抑制剂PCI-32765(Ibrutinib),目前正处于在患有B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者上的临床开发中(Honigbergetal.,2010)。MI-2的不可逆性可能提供药代动力学优势。由于ABC-DLBCL具有长期活化的BCR信号传导,对MALT1切割作用的长期抑制可能对于最强的抗淋巴瘤活性是必要的。当使用不可逆抑制剂时,活性将只在合成新酶时才能恢复。这可以允许药物在较低血浆浓度时是有效的,从而降低剂量水平和频率、限制对长血浆半衰期的需求而不弱化药效,并最大限度地减少与长时间暴露于循环药物相关的潜在毒性效应。事实上,我们的详细研究表明,MI-2在动物体内是无毒的。这一结果与以下事实是一致的:MALT1是人类中唯一的paracaspase并且MALT1缺陷小鼠是相对健康的(Ruefli-Brasseetal.,2003;Rulandetal.,2003)。
ABC-DLBC中BCR通路的长期活化是由几种不同的机制介导的,其有很多是MALT1的上游。ABC-DLBCL嗜此通路并且经常特异性地嗜MALT1切割活性(Ferchetal.,2009;Hailfingeretal.,2009;Ngoetal.,2006)。值得注意的是,MI-2选择性杀死了具有CD79A/B、CARMA1和/或MYD88突变的ABC-DLBCL细胞系,而非那些具有发生于MALT1下游蛋白质突变(包括具有A20纯合性缺失的突变或TAK1突变)的ABC-DLBCL细胞系(图5A和表1)。这些发现强调了对淋巴瘤中反复突变的等位基因的定向重测序,对合理调配靶向治疗的重要性。虽然能被MALT1抑制剂靶向的淋巴瘤全谱尚不完全清楚,但是我们使用离体***能够首次显示原代人非GCB-DLBCL标本也嗜MALT1并被MI-2抑制。
由于单剂通常是非治愈性的并迅速产生抗性(Misaleetal.,2012),对组合靶向治疗的兴趣与日俱增。MALT1切割抑制的合理组合可以包括与靶向Src家族的酪氨酸激酶抑制剂(达沙替尼,塞卡替尼,波舒替尼,以及KX01)、Syk(fostamatinibdisodium)或Btk(PCI-32765)组合。这些药物可能会通过进一步抑制BCR信号(包括促***原活化蛋白(MAP)激酶和磷脂酰肌醇(PI)3-激酶),与MALT1对NF-κB的切割抑制协同作用(Limetal.,2012)。PKC抑制也将是潜在的有益的组合,因为其可能进一步抑制所述NF-κB通路,包括依赖于MALT1、但独立于其蛋白水解活性的那些活性。在临床试验中用于预防移植排斥反应和治疗银屑病(Manicassamy,2009;Matzetal.,2011)的所述PKC抑制剂sotrastaurin,最近已被显示能抑制ABC-DLBCL移植瘤的生长(Nayloretal.,2011),指向其作为针对这种淋巴瘤亚型的抗淋巴瘤治疗的潜在用途。ABC-DLBCL还具有BCL6易位、SPI-B扩增或PRDM1缺失或突变的特征(LenzandStaudt,2010)。BCL6抑制剂通过释放关键的检查点基因促进凋亡和细胞周期阻滞(Cerchiettietal.,2010;Cerchiettietal.,2009;Poloetal.,2004)。因此,MI-2和BCL6抑制剂的组合将抑制ABC-DLBCL中两个关键的通路(BCL6和NF-κB),可能导致治疗的协同作用。总的来说,这里报告的结果将MI-2鉴定为靶向MALT1的先导化合物,并证实MALT1作为治疗靶点和MI-2作为治疗剂治疗侵略性NHL的意义、安全性和有效性,所述侵略性NHL既依赖于NF-κB信号又耐常规化疗方案。
实施例
对MALT1蛋白水解活性抑制剂的高通量筛选
Ac-LRSR-AMC用作底物并用360/465nm的激发/发射波长测量反应。在抑制百分比的计算中使用对照的平均值。用下式计算最终的抑制百分比:{[荧光测试化合物(T2-T1)–荧光阴性对照(T2-T1)]/[荧光阳性对照(T2-T1)–荧光阴性对照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK(300nM)用作阳性对照,并且单独的缓冲液用作阴性对照。
生长抑制测定
使用发光法(CellTiter-Glo,Promega,麦迪逊,WI)和台盼蓝染料排斥法(Sigma,圣路易斯,MO),通过ATP定量确定细胞增殖。将药物处理组细胞的细胞存活率用其各自的对照基准化(分数存活率)并且将结果以1-分数存活率给出。使用CompuSyn软件(Biosoft,剑桥,UK)确定相对于对照组能抑制分数生长的药物浓度。
小鼠异种移植实验
对八周龄雄性SCIDNOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠皮下注射107个低传代的人HBL-1、TMD8或OCI-Ly1细胞。通过腹膜内注射施用治疗。通过每周三次的数字测量监测肿瘤体积。所有程序遵循美国NIH协议并被威尔康乃尔医学院的动物研究委员会批准。
登录号
微阵列数据:GSE40003。
对MALT1蛋白水解活性抑制剂的高通量筛选
所述筛选由在384孔黑色板中的20μl反应组成(GreinerBioOne,韦梅尔,比利时,目录号784076),其中100nMLZ-MALT1、200μMAc-LRSR-AMC和12.5μM测试化合物在缓冲液A(20mMHEPESpH7.5、10mMKCl、1.5mMMgCl2、1mMEDTA、1mMDTT、0.01%TritonX-100)中。使用Envision多标记阅读仪(Perkin-Elmer,沃尔瑟姆,MA),用360/465nm处的激发/发射波长测量所述反应。对于每个反应,测量两个时间点;将时间点(T2-T1)之间的荧光差异视为MALT1的活性,以消除由于化合物自身荧光导致的假阳性。在抑制百分比的计算中使用对照的平均值。用下式计算最终的抑制百分比:{[荧光测试化合物(T2-T1)–荧光阴性对照(T2-T1)]/[荧光阳性对照(T2-T1)–荧光阴性对照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK(300nM)用作阳性对照,缓冲液仅用作阴性对照。使用40%抑制作为阈值,324种化合物被鉴定为潜在的MALT1抑制剂。在0.122μM至62.5μM的剂量范围内,在浓度-应答实验中验证了阳性命中率,以确定所述化合物的IC50(抑制50%)。除了用于筛选的所述LZ-MALT1之外,还使用重组型全长野生型MALT1来验证活性。
蛋白表达和纯化
将MALT1(340-789)与来自GCN4(251-281)的N末端的亮氨酸拉链序列融合(LZ-MALT1)。在大肠杆菌中表达N-末端his标记过的LZ-MALT1并通过Ni-NTA亲和层析法(Qiagen,瓦伦西亚,CA),并随后使用在含有20mMTris(pH7.5)、150mMNaCl和5mMDTT的缓冲液中的Superdex200HR10/300(GEHealthcare,UK)的凝胶过滤色谱将其纯化。
细胞培养
DLBCL细胞系OCI-Ly1、OCI-Ly7和OCI-Ly10生长于80%的Iscove氏培养基、20%FBS和青霉素G/链霉素。DLBCL细胞系HBL-1、TMD8、U2932培养于90%的RPMI培养基、10%FBS、2mM谷氨酰胺、10mMHepes和青霉素G/链霉素。DLBCL细胞系OCI-Ly3和HLY1培养于80%的RPMI培养基、20%FBS、2mM谷氨酰胺、10mMHepes和青霉素G/链霉素。293T细胞培养于90%的RPMI培养基、10%FBS和青霉素G/链霉素。所有的细胞系在5%CO2的潮湿气氛中在37℃培养。细胞系由单核苷酸多态性分析(指纹图谱)认证。
生长抑制的确定
在治疗的48小时期间,DLBCL细胞系在指数生长的条件下生长。使用通过ATP定量的发光法(CellTiter-Glo,Promega,麦迪逊,WI)和台盼蓝染料排除法(Sigma,圣路易斯,MO)确定细胞增殖。使用Synergy4酶标仪(BioTek仪器公司,威努斯基,VT)测量发光。通过绘制细胞数目(由台盼蓝法确定)与其发光值的图来计算每个细胞系的标准曲线,并相应地计算细胞数目。将药物处理组细胞的细胞存活率通过其各自的对照基准化(分数存活力)并且将结果以1-分数存活率给出。使用CompuSyn软件(Biosoft,剑桥,UK)确定相对于对照组的抑制25%的细胞系生长的药物浓度(GI25)。实验以三复管进行。
基于所述先导化合物MI-2的类似物筛选
将相似性搜索设置成0.7的临界值并使用协同药物发现(CDD,伯林格姆,CA)数据库(www.collaborativedrug.com)的相似性搜索功能执行所述相似性搜索。如(http://www.chemaxon.com/jchem/doc/dev/search/index.html#simil)中所描述的,所述CDD搜索功能是以ChemAxon(www.chemaxon.com,布达佩斯,匈牙利)的散列指纹的标准Tanimoto相似性函数为基础的。简单地说,计算每个查询结构的散列指纹并随后应用相异性公式:1-(NA&B/NA+NB-NA&B),其中NA和NB分别是分子A和B的指纹图谱中设定的比特数,NA&B是在两个指纹图谱中设定的比特数。相异阈值是介于0和1的数字,其在相似度计算中指定临界极限。如果所述相异度值小于所述阈值,则认为所述查询结构和给定的数据库结构是相似的。使用与初步筛选中同样的方法执行类似物筛查,除了该类似物筛查以三复管进行。19种具有比MI-2更高活性的化合物被选择用于进一步的验证。
NMR
在生长于M9培养基中的BL21(DE3)大肠杆菌中表达由15N和13C均匀标记的MALT1(329-728),所述M9培养基含有1g/l[15N]氯化铵和3g/l[13C]葡萄糖(剑桥同位素实验室,安多弗,MA),并如(Wiesmannetal.,2012)中所述从大肠杆菌细胞裂解物中纯化所述MALT1。
在样品中记录MALT1(329-728)的标准2D1H13CNMR谱,所述样品含有在50mMHEPES(pH7.5)中的10.0mg/ml蛋白质、50mMNaCl和10%D2O。在BrukerAV500MHz光谱仪(Bruker,比尔里卡,MA)上于310K处,记录NMR光谱实验。
在样品中记录MALT1(329-728)的标准2D1H15NHSQC谱,所述样品含有在25mMTris(pH7.5)中的70μM蛋白质、250mMNaCl、5mMDTT、10%D2O、0.02%NaN3、2%DMSO。在600MHz瓦里安(瓦里安,帕洛阿尔托,CA)上于37℃运行HSQC。
HPLC/ESI-MS
在5μl样品上以1mg/ml的蛋白浓度开展了HPLC/ESI-MS实验。在HP1100***(HewlettPackard,帕洛阿尔托,CA,美国)上采用1mmx150mm的装填有POROSR1/H(PerseptiveBiosystems,福斯特城,CA,美国)的LC填料柱,执行了蛋白质的分离。将所述柱保持在80℃。使用CTCPAL自动进样器(CTC,Zwingen瑞士)将样品注到所述柱的上面,所述进样器装有瓦尔科模型C6UWHPLC阀(瓦尔科,休斯敦,TX,美国)和10μl的注射环。HPLC由MassLynx软件(Micromass,曼彻斯特,英国)控制。在214nm处执行UV检测。洗脱液A是含有0.05%TFA的水。洗脱液B是含有0.045%TFA的1:9的水:乙腈混合物。在20分钟内运行从20%B至90%B的梯度。流速通常为60μl/min。从所述LC***的总流量被先引入到所述UV检测细胞,随后再引入到ESI源中。控制所述HPLC***并使用MassLynx软件处理来自所述UV检测器的信号。用配备有MicromassZ型电喷雾电离源的Q-tof(Micromass,曼彻斯特,英国)四级杆飞行时间混合型串联质谱仪开展质谱分析。获得的质量范围通常为m/z500-2000。记录数据,并用MassLynx软件处理该数据。通过使用马心脏肌红蛋白(MW16,951.5Da)的多电荷离子峰实现对所述500-2000m/z数值范围的校准。
MALT1抑制的剂量效应和时间过程
在384孔黑色板(GreinerBioOne,韦梅尔,比利时,目录号784076)中,以指定的时间(从5分钟到80分钟)将8pMole纯化的LZ-MALT1与不同浓度(125、62.5、31.25、15.625、7.8125或0μM)的化合物MI-2在室温下于缓冲液中孵育,所述缓冲液含有5%DMSO、20mMHEPESpH7.5、10mMKCl、1.5mMMgCL2、1mMEDTA、1mMDTT、0.01%TritonX-100,随后将4μMol的Ac-LRSR-AMC加入每个混合物以开始反应。在SpectraMaxM5酶标仪(MolecularDevices公司,桑尼维尔,加州,美国)中,以360/465nm处的激发/发射波长和20秒的间隔监测所述反应。通过下式计算基准化的抑制百分比:(M(T2-T1)-N(T2-T1))/(P(T2-T1)–N(T2-T1))*100,其中M(T2-T1)是化合物在时间点200s和0s的信号差,N(T2-T1)是阴性对照缓冲液的信号差,P(T2-T1)是阳性对照Z-VRPR-FMK的信号差。
MI-2向MALT1的对接
生成了MI-2的结构并优化了其几何结构。选择与所述Z-VRPR-FMK肽抑制剂(PDBID:3UOA)形成复合物的含有paracaspase和Ig3结构域的MALT1的原子坐标(Wiesmannetal.,2012;Yuetal.,2011),用于抑制剂对接。除去所述肽抑制剂和溶剂分子后,将氢原子加入所述MALT1的结构。对接模拟开始于定义针对MI-2的MALT1的3D潜在网格。计算出的网格地图尺寸为60×40×40点,间距为/点。使用AutoDock4.2中的通用算法(Morrisetal.,2009)并通过将MALT1用作刚性分子同时允许所述MI-2抑制剂的柔性,执行所述对接。基于所预测的结合自由能对最终结果进行排序。
免疫印迹
在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离等量的总蛋白(20-75μg),并将其电转移到硝酸纤维素膜上。将膜与一抗(来自SantaCruz生物技术公司,圣克鲁斯,CA的MALT1、BCL-10、CYLD;来自eBioscience,圣地亚哥,CA的A20;来自CellSignaling,丹弗斯,MA的磷酸化IκB-α、IκB-α、C-REL、RELB;以及来自Sigma的α微管蛋白)孵育,随后与结合辣根过氧化物酶的二抗孵育,所述辣根过氧化物酶由化学发光法(Pierce,ThermoScientific,罗克福德,IL)检测。
流式细胞术
为了研究MI-2在细胞增殖中的效应,用0.5μM的羧基二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE,Invitrogen,LifeTechnologies,格兰德岛,NY)在37℃标记细胞10分钟。CFSE共价地标记长寿命的具有羧基荧光素的细胞内分子。在每次细胞***之后,荧光分子在子细胞中稀释,从而可以对细胞***动力学进行比较研究。细胞经DAPI(Sigma)染色,随后进行流式细胞术。对DAPIneg细胞进行门控用于分析。
为了确定细胞周期的分布,使用脉冲BrdU(溴脱氧尿苷)掺入APCBrdU流式试剂盒(BDPharmingen公司,圣何塞,CA),通过流式细胞术分析细胞。
通过AnnexinV-APC/DAPI(BDPharmingen)染色以及随后的流式细胞术评估凋亡。
通过流式细胞术研究c-REL的核输出。如所示处理细胞并制备总细胞或分离的细胞核并对c-REL染色。使用来自Dako公司(Glostrup,丹麦)的Intrastain试剂盒固定并透化所述总细胞。对于核提取,将细胞再悬浮于冷的核提取缓冲液(320mM蔗糖、5mMMgCl2、10mMHEPES、pH7.4的1%TritonX-100)中,在冰上孵育10min并用核洗涤缓冲液(320mM蔗糖、5mMMgCl2、pH7.4的10mMHEPES、无TritonX-100)洗涤两次。核的产率和完整性由台盼蓝染色镜检确认。对于标记,细胞核洗涤缓冲液补充有1%BSA,0.1%叠氮化钠和1:100的c-REL抗体(CellSignaling公司)。洗涤细胞然后将其与来自Invitrogen的AlexaFluor-488结合的二抗孵育。再次洗涤细胞并用DAPI染色,随后进行流式细胞术。
荧光素酶测定法
在293T细胞中执行报告子测定法,所述293T细胞以每孔2×105个细胞的密度接种于12孔培养皿。使用Lipofectamine2000(Invitrogen公司),将100ng的(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4和10ng的TK-Renilla内参质粒,与25ng所示质粒(MIGR1-MALT1WT或MIGR1-MALT1C464A和pcDNA4-Flag-Bcl10)一起共转染。依照制造商的流程(Promega)将裂解物用于双荧光素酶测定法。在HBL-1中,使用核转染(Amaxa公司,龙沙,巴塞尔,瑞士),每5×106个细胞共转染5μg的(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4和50ng的TK-Renilla内参质粒。在转染后的48小时,以24孔板每孔5×104个细胞的密度铺板细胞并如所示处理所述细胞。依照制造商的方案(Promega)将裂解物用于双荧光素酶测定法。
微阵列数据分析
从经化合物MI-2或载剂以所示浓度处理8小时的HBL-1和TMD8细胞中提取RNA并使用RNeasyPlus试剂盒(Qiagen,瓦伦西亚,CA)分离mRNA,并且随后使用无RNA酶的DNA酶试剂(Qiagen)进行DNA酶的处理。在Agilent2100生物分析仪(安捷伦科技公司,圣克拉拉,CA)上,使用RNA6000NanoLabChip试剂盒确定RNA的完整性。遵照Illumina的建议处理样品并将cRNA杂交到HumanHT-12v4表达芯片(Illumina公司,圣地亚哥,CA)上。在iScan***上扫描阵列。使用GenomeStudio进行数据的预处理和质量控制。结合分位数标准化,对数据进行log2转化(Duetal.,2008)。GEO登录号GSE40003。
为了确定所述结果的生物学意义,开展了关于相关基因集的富集试验。为此,我们使用了GSEA(基因集富集分析)软件,并通过倍数变化值预排数据集(Subramanianetal.,2005)。基于1,000次迭代和多个FDR计算的假设测试校正(StoreyandTibshirani,2003),计算了每个基因集的p值。
小鼠异种移植实验
8周龄雄性SCIDNOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠购自JacksonLaboratories(巴尔港,MN)并饲养在干净的环境中。对小鼠皮下注射在50%基质胶(BDBiosciences,编号354234)中的107个低传代的人TMD8或OCI-Ly1细胞。当肿瘤达到120mm3的平均大小(移植后的17天)时,开始治疗。将药物重新溶解在DMSO中并保存于-80℃直至使用,并且通过腹膜内注射进行施用。通过每周三次的数字测量(FisherScientific,ThermoScientific,罗克福德,IL)监测肿瘤体积并用下式计算:(最小直径2×最大直径)/2。数据表示为平均值±SEM并且当由配对学生t检验得到p<0.05时,认为差异是统计学显著的。所有涉及动物的程序遵循美国NIH协议并被康奈尔大学的威尔康乃尔医学院的动物研究委员会批准。
石蜡中的免疫荧光(IF-P)和免疫组织化学(IHC)
将石蜡包埋的肿瘤异种移植物切片、脱蜡、并进行抗原检索。对于IF-P,使用了来自Invitrogen的AlexaFluor-488结合的二抗并用DAPI复染细胞核。使用Axiovert200M荧光显微镜(卡尔蔡司公司,索恩伍德,NY).Oberkochen,德国)拍摄荧光图像。对于IHC,使用了生物素结合的二抗。然后将抗生物素蛋白/生物素过氧化物酶加到载玻片(VectorLaboratories)。用二氨基色原过氧化物酶底物(Vector)显色并用hematoxilin-eosyn复染。使用与AxioSkopII光学显微镜(卡尔蔡司公司)连接的AxioCam(卡尔蔡司公司)相机获得照片。样品由病理学家检验。
TUNEL
使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记,TUNEL测试法(ApopTag,Chemicon,Temecula,CA),检测凋亡DNA的片段化(Gavrielietal.,1992)。简单地说,将***固定的石蜡包埋的移植瘤脱石蜡并用胰蛋白酶预处理(Zymed,旧金山,CA)以暴露DNA。内源性过氧化物经3%过氧化氢(Sigma)猝灭并随后与TdT酶孵育1小时。然后,将抗地高辛-过氧化物酶施加到所述载玻片。用二氨基色原过氧化物酶底物(VectorLaboratories,伯林格姆,CA)显色并用甲基绿(FisherScientific,ThermoScientific,罗克福德,IL)复染。使用与AxioSkopII光学显微镜(卡尔蔡司公司)连接的AxioCam(卡尔蔡司公司)相机获得照片。样品由病理学家检验。
原代细胞
按照威尔康乃尔医学院审查委员会的指导和批准,获得患者匿名化的组织。如先前所述(Cerchiettietal.,2010)处理患者样品。简单地说,通过物理破坏组织,并且随后使用细胞密度梯度分离法(Fico/LiteLymphoH,亚特兰大生物制品公司,劳伦斯维尔,佐治亚州)从***活检获得单细胞悬液。通过台盼蓝排除测定法确定细胞的数目和存活率。在96孔板中培养原代DLBCL细胞。细胞在含有20%FBS并补充有抗生素的高级RPMI培养基中生长48小时。将细胞一式四份暴露于0.8μMMI-2(1μM用于Pt.2)或对照(DMSO)。暴露48小时后,通过使用台盼蓝(Sigma)确定存活率。将所有样品依照其自己的重复对照基准化。使用配对t检验计算统计学显著性。
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本文中提及的所有专利和出版物以相同的程度通过引用并入本文,如同具体地且单个地指出每篇单独的出版物通过引用整体并入。
已采用的术语和表达被用作描述的术语但不是限制的,并且不意味着这种术语和表达的使用把所示和所描述的特征的任何等价物或其部分排除在外,但可以意识到在本发明所要求保护的范围内可以有各种修改。因此应该理解,尽管已通过优选的实施方案具体地公开了本发明,但是本文中公开的可选特征、修改和概念变化可由本领域那些技术人员采取并且这样的修改和变化被认为是在由所附的权利要求所限定的本发明的范围内。
Claims (13)
1.一种调节MALT1的方法,所述方法包括使MALT1接触有效剂量或浓度的式(I)化合物
其中
虚线键表明键是可存在或不存在的;
当Y1和Y2之间存在双键时,Y1是N或CR,Y2是C,且存在Ar1;当Y1和Y2之间存在单键时,Y1是CR2,Y2是O或S,且不存在Ar1,以及各自被独立地选择的R是H或(C1-C6)烷基;
R1是烷基、烷氧烷基、或芳烷基,其中任何烷基、烷氧烷基、或芳烷基,可以被卤素或(C1-C6)烷氧基单一地或多个独立地取代,条件是当所述氧原子和所述包含Y3的环之间存在双键时,不存在R1且存在Ar3,而当所述氧原子和所述环之间存在单键时,存在R1,Y3和带有所述氧原子的所述碳原子之间存在双键,且不存在Ar3;
Ar1是被1-3个J1基团取代的苯基;J1是卤素或(C1-C6)烷氧基;
Ar2是被1-3个J2基团取代的苯基;J2是以式-N(R)C(O)-R2表示的组且R2是烷基、芳基或芳基氨基,其中任何烷基、芳基或芳基氨基被0-2个卤素、硝基、或(C1-C6)烷氧基取代;
Ar3是被1-3个J3基团取代的苯基;J3是卤素或(C1-C6)烷氧基;
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述式(I)化合物是式(IA)化合物
其中R1、Ar1、和Ar2如对式(I)的定义,
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述式(I)化合物是式IB)化合物
其中Ar2和Ar3如对式(I)的定义,
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述化合物是以下的任一个:
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
5.根据权利要求1所述的方法,其中在活的动物内处理所述MALT1。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述活的动物是患有癌症的人类。
7.一种治疗或预防癌症的方法,所述方法包括向患者施用有效剂量的式(I)化合物
其中
虚线键表明键是可存在或不存在的;
当Y1和Y2之间存在双键时,Y1是N或CR,Y2是C,且存在Ar1;当Y1和Y2之间存在单键时,Y1是CR2,Y2是O或S,且不存在Ar1,以及各自被独立地选择的R是H或(C1-C6)烷基;
R1是烷基、烷氧烷基、或芳烷基,其中任何烷基、烷氧烷基、或芳烷基可以被卤素或(C1-C6)烷氧基单一地或多个独立地取代,条件是当所述氧原子和所述包含Y3的环之间存在双键时,不存在R1且存在Ar3,而当所述氧原子和所述环之间存在单键时,存在R1,Y3和带有所述氧原子的所述碳原子之间存在双键,且不存在Ar3;
Ar1是被1-3个J1基团取代的苯基;J1是卤素或(C1-C6)烷氧基;
Ar2是被1-3个J2基团取代的苯基;J2是以式-N(R)C(O)-R2表示的组且R2是烷基、芳基或芳基氨基,其中任何烷基、芳基或芳基氨基被0-2个卤素、硝基、或(C1-C6)烷氧基取代;
Ar3是被1-3个J3基团取代的苯基;J3是卤素或(C1-C6)烷氧基;
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述式(I)化合物是式(IA)化合物
其中R1、Ar1和Ar2如对式(I)的定义,
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述式(I)化合物是式IB)化合物
其中Ar2和Ar3如对式(I)的定义,
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
10.根据权利要求7所述的方法,其中所述化合物是以下的任一个:
或其任何盐、水合物、互变异构体、或立体异构体。
11.根据权利要求7所述的方法,其中所述癌症是淋巴瘤。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
13.一种鉴定MALT1的小分子调节物的方法,所述方法包括使融合有亮氨酸拉链二聚化基序(LZ-MALT1)的重组形式的MALT1(340-789)与候选的调节化合物接触,使用与所述荧光发生素AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)连接的所述MALT1的底物肽LRSR,从而使得MALT1对所述Ac-LRSR-AMC底物的切割作用导致AMC和荧光信号的释放,其中在存在所述候选的调节物的条件下,所述重组形式的MALT1对所述Ac-LRSR-AMC底物的切割作用的降低表明所述候选的调节物是MALT1的小分子调节物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171201 Termination date: 20181108 |