KR101382930B1 - 꽃송이버섯의 액체배양액을 이용한 버섯 식초 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꽃송이버섯(Sparassis crispa)의 액체배양액을 이용한 버섯 식초 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 두부 순물에 글루코즈(glucose)가 포함된 배지에 꽃송이버섯 균사체를 배양하고, 상기 배양액에 수크로즈(sucrose) 또는 감자분말을 첨가하고, 초산균을 접종하여 초산발효시키는 단계를 포함하는 꽃송이버섯 식초 제조방법에 대한 것이다. 또한, 상기의 방법에 의해 제조된 꽃송이버섯 식초를 제공하는데, 상기 식초는 기존의 식초보다 항산화 활성이 높은 것을 특징으로 한다.

Description

꽃송이버섯의 액체배양액을 이용한 버섯 식초 제조방법{Method for manufacturing mushroom vinegar using liquid culture medium of Sparassis crispa}

본 발명은 꽃송이버섯(Sparassis crispa)의 액체배양액을 이용한 버섯 식초 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 꽃송이버섯의 균사체를 두부 순물이 포함된 배지에서 액체 배양하고, 2차로 초산 발효하는 기능성 버섯 식초 제조방법에 대한 것이다.

최근 건강에 대한 인식이 높아짐에 따라 생리 활성 물질을 다량 함유한 천연물에 대한 연구가 활발해지고 있으며, 천연물 중에서도 유용한 생리활성 물질이 다량 함유되어 있는 버섯에 대한 관심도가 높아지고 있다. 버섯을 기능성 식품 소재로 이용하기 위한 방법으로 대량 생산이 용이한 균사체 배양 및 버섯이 분비하는 세포 외 기능성 물질에 대한 관심이 증대되고 있다. 버섯 균사체의 생육특성을 이용하여 액체배양을 할 경우, 배지의 조성과 생육조건에 따라 항균 및 항산화 활성을 가지는 다양한 대사산물을 얻을 수 있다. 즉 버섯 균은 배지에 함유된 성분을 다양한 기능성을 갖는 물질로 생물 전환할 수 있으며, 버섯 배양을 통한 특수한 기능을 갖는 2차 대사산물이 생산되어 배양액에 축적될 수 있다. 또한 인공적으로 액체 배양을 할 경우 배양물 생산에 있어 계절적 제한을 받지 않고, 제한된 공간에서 생산이 가능하다는 장점이 있다. 버섯 균사체 액체 배양액 생산의 경제성은 배양시간을 단축시키면서 가격이 저렴한 배양 원료의 확보에 있다.

버섯의 액체 배양에 사용되는 값비싼 배지 원료를 대체하기 위한 소재로 두부 생산 시에 부산물로 얻어지는 두부 순물을 사용하였다. 두부 순물은 일반적인 두부 제조 시 단백질 응고물의 압착공정에서 나오는 부산물로 두부생산의 전체 물 첨가량의 약 50% 정도를 두부 순물로 얻을 수 있다. 두부 공장에서 배출되는 두부 순물에는 콩의 불용성 섬유질과 일부 응고된 고분자 단백질 외에 수용성 물질이 포함되어 있고, 두부 응고에 사용되고 남은 소량의 응고제가 포함되어있다. 두부 순물의 고형분 함량은 2-3%로 이 중 단백질 등의 질소화합물은 약 16%, 당류는 약 53% 정도이며, 이소플라본(isoflavone), 사포닌(saponin) 및 올리고당(oligosaccharides) 등의 기능성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 기능성 물질을 함유하고 있는 두부 순물을 이용하여 본 발명의 꽃송이버섯 배양에 이용되었다.

합성배지 및 두부 순물의 액체 배양에 사용된 버섯 종균은 꽃송이버섯(Sparassis crispa)이다. 꽃송이 버섯은 한국, 일본, 중국, 북미, 유럽, 호주 등에 분포하는 식용버섯으로 자실체는 주로 여름부터 가을까지 살아있는 나무의 뿌리 근처 줄기나 그루터기에 뭉쳐서 양배추처럼 발생한다. 꽃송이버섯은 β-글루칸(glucan)을 다량 함유(건조 자실체 100 g당 43.6 g 함유)하고 있는 것이 알려지면서 인공재배 및 기능성 물질 추출에 관한 연구가 급격히 진행되고 있다. 또한 꽃송이버섯은 β-1,3-글루칸(glucan)의 함량이 다른 버섯에 비해 월등히 높아 항암 효과, 항종양 효과가 있는 것으로 입증되어 식용뿐만 아니라 약용으로도 널리 인정받고 있다. 특히 스파랏솔(sparassol)과 같은 항균성 대사물질(antifungal metabolite)을 생산하는 것으로 알려지고 있으며, 스파랏솔(sparassol)은 인간의 질병 치료제와 엽병의 방제용으로 연구되고 있다.

식초는 술과 함께 인류의 식생활사에서 가장 오랜 역사를 갖는 발효식품 중의 하나로서 동서양을 막론하고 오랜 역사를 가지고 있는 발효 식품이다. 산미용 조미료로 사용되는 등 우리의 식생활에 밀접한 관련을 맺고 있으며 특유의 강한 산성 때문에 식품 내의 유해 미생물의 생육을 억제하는 효과가 있다. 그리고 초산 이외에 다양한 유기산류, 당류, 아미노산류 및 에스테르(ester)류를 함유하고 있어 독특한 향과 맛으로 식욕을 자극하며, 동맥경화, 고혈압 등의 성인병 예방에 효과적이다. 또한 콜레스테롤 저하효과, 체지방 감소, 젖산 분해에 따른 피로회복 효과와 비타민C 보호 작용이 있으며 최근 식초에 대한 관심이 높아져 마시는 식초와 식초를 첨가한 다양한 음료가 출시되고 있다. 활성 산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질은 질병 예방 및 완화에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 항산화 능력을 갖는 물질의 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 식초는 항산화 활성이 높다고 알려져 있어 국내에서 시판되고 있는 식초 19종(벌꿀 식초, 석류 식초, 복분자 식초, 오디식초, 홍삼 식초, 오미자 식초, 백년초 식초, 블루베리 식초, 오곡 흑초, 매실 화이버 흑초, 감식초, 레몬 식초, 배 식초, 사과 식초, 현미 식초, 발사믹 식초, 화이트 와인(white wine) 식초, 레드 와인(red wine) 식초, 식용 빙초산)에 대한 연구가 이루어지기는 했으나, 상기 언급한 꽃송이버섯 액체배양액을 이용한 버섯식초에 대한 연구는 거의 없다고 볼 수 있다.

한편, 한국특허출원 제10-2009-0053175호는 꽃송이버섯 추출액을 이용한 꽃송이버섯 음료 제조방법에 대하여 개시하고 있지만, 본 발명의 꽃송이버섯 액체배양액을 이용한 버섯식초를 제조하는 방법에 대한 언급은 없다.

따라서, 본 발명자들은 약용 및 식용으로 알려진 β-글루칸(glucan)을 다량 함유하는 꽃송이버섯의 균사체를 두부 순물이 포함된 배지에서 액체 배양하고, 2차로 초산 발효를 한 후 항산화 활성을 평가하여 기능성 식초를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 두부 순물에 글루코즈(glucose)가 포함된 배지에 꽃송이버섯 균사체를 배양하고, 상기 배양액에 수크로즈(sucrose) 또는 감자분말을 첨가하고, 초산균을 접종하여 초산발효시키는 단계를 포함하는 꽃송이버섯 식초 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 꽃송이버섯 식초를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전체 두부 순물에 대하여 1 내지 10 중량% 글루코즈(glucose), 1 내지 15 중량% 수크로즈(sucrose) 또는 1 내지 5 중량% 감자분말이 포함된 두부 순물 배지에 꽃송이버섯 균사체를 배양하는 단계; 및 상기 꽃송이버섯 균사체 배양액에 초산균을 접종하고, 주정을 전체 배양액에 대하여 3 내지 9 중량%를 첨가하여 발효시키는 초산 발효 단계를 포함하는 꽃송이버섯 식초 제조방법을 제공한다.

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상세하게는, 상기 초산균은 글루콘아세토박터 한세니(Gluconacetobacter hansenii)인 것을 특징으로 하고, 상기 초산 발효는 20 내지 40 ℃에서 3 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 꽃송이버섯 식초를 제공한다.

본 발명은 꽃송이버섯의 액체배양액을 이용한 버섯 식초 제조방법으로서, 약용 및 식용으로 알려진 β-글루칸(glucan)을 다량 함유하는 꽃송이버섯의 균사체를 두부 순물이 포함된 배지에서 액체 배양하고, 2차로 초산 발효를 한 후 항산화 활성을 평가하여 기능성 식초를 개발하였다.

도 1은 PD 아가 배지에서 배양한 꽃송이 버섯 균사체 및 PD 액체 배지에서 배양한 꽃송이버섯 배양액 사진이다.
도 2는 5L 자 발효조(jar fermenter) 및 5L 배양 병에서 배양시킨 꽃송이버섯의 배양액 사진이다.
도 3은 만니톨(Mannitol) 배지에서 계대배양한 글루콘아세토박터 한세니(Gluconacetobacter hansenii) 고체 배지 배양 및 액체 배양액 사진이다.
도 4는 두부 순물 배지 및 증류수에 첨가된 수크로즈(sucrose) 농도에 따른 꽃송이버섯 배양액의 화학적 성분을 나타낸다.
도 5는 두부 순물 배지에서 발효 시간에 따른 꽃송이버섯 배양액의 화학적 성분을 나타낸다.
도 6은 혼합 배양액의 화학적 성분에 있어서 꽃송이버섯 배양액의 발효 시간에 따른 효과를 나타낸다.
도 7은 두부 순물 배지에 첨가된 감자 전분 농도에 따른 꽃송이버섯 배양액의 화학적 성분을 나타낸다.
도 8은 혼합 배양액의 화학적 성분에 있어서 꽃송이버섯 배양액의 전분 농도에 따른 효과를 나타낸다.
도 9는 혼합 배양액의 화학적 성분에 있어서 꽃송이버섯 배양액의 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타낸다. Pleurotus eryngii : 송이버섯 식초, Phellinus baumii : 상황버섯 식초.
도 10은 혼합 배양액의 화학적 성분에 있어서 꽃송이버섯 배양액의 ABTS 라디칼 소거 효과를 나타낸다. Pleurotus eryngii : 송이버섯 식초, Phellinus baumii : 상황버섯 식초.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 꽃송이버섯 균사체 배양액의 이화학적 특성

1. 재료

두부 순물은 두원 식품(Gimcheon, Korea)에서 공급받아 사용하였으며, 실험에 사용되는 KH₂PO₄, MgSO₄, 글루코즈(glucose)는 Sigma 회사 제품, 효모 추출물(yeast extract)은 Difuco 회사 제품, 가용성 전분(soluble starch)은 덕산 화학(Ansan, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다. 대두분(Soy bean flour)은 천호식품(Daegu, Korea)에서 구입하여 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다. 수크로즈(Sucrose)는 CJ 제일제당 (Incheon, Korea)에서 백설탕을 구입하여 사용하였고, 겉보리는 가가호호 (Hapcheon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 감자전분은 삼진식품(Seongju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 초산발효에 사용되는 대추엑기스는 이든타운에프앤비(Incheon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 발효주정으로 프레타놀 A(prethanol A)는 덕산 화학(Ansan, Korea) 제품을 구입하였으며, Protein assay kit(SMART™ BCA)은 Intron Biotechnology INC.(Sungnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

2. 두부 순물의 성분 분석

두부 순물의 수분, 조단백질, 조지방 함량은 AOAC법에 따라 정량하였다. 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 단백질 자동 분석기(Buchi 339, Buchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 사용하여 질소함량을 측정하였으며, 조지방은 Soxhlet 추출법을 이용하였고 무기질 분석은 ICP-MS(ELAN 9000, Perkin Elmer Inc., CA, USA)를 이용하여 정량하였다.

3. 꽃송이버섯 균사 배양

농촌진흥청에서 분양받은 꽃송이버섯(Sparassis crispa Wulf. ex Fr)을 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco. Co. USA) 배지에 접종하여 온도 25℃, pH 5.1±0.2, 암 조건에서 20일 이상 배양하여 사용하였다(도 1).

4. 꽃송이버섯 균사체 액체 배양

PDA 아가 평판 배지에 배양된 꽃송이버섯 종균을 가로×세로(5×5 cm)로 무균적으로 절개한 것을 potato dextrose broth 100 mL에 첨가하여 균질기(homogenizer; 10,000 rpm, 3 min)로 균질화한 후, potato dextrose broth 100 mL에 각각 균질화한 액체를 10 mL씩 첨가하여 온도 25℃, 회전속도 160 rpm, 10일 이상 배양하여 액체종균용 배지로 사용하였다(도 1).

1) 제한 배지를 이용한 배양

액체배지 조성은 수크로즈(sucrose) 10.75 g/L, 수용성 전분(soluble starch) 5.35 g/L, 대두분(soybean flour) 1.5 g/L, K₂HPO₄ 0.5 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L를 혼합하여 사용하였다. 액체 배양으로 5 L 자 발효조(jar fermenter; Fermentec Co. Ltd., Cheongwon, Korea)를 사용하였고, 배양 조건으로 온도 25℃, 공기 주입량 1 vvm, 회전 속도 300 rpm으로 하여 10일 배양하여 분석하였다.

2) 겉보리 당화배지를 이용한 배양

꽃송이버섯 균사체 액체 배양에 이용한 겉보리 당화배지 제조는 겉보리를 당화하여 꽃송이버섯 균사체 액체배양에 이용하였다. 당화배지를 제조하기 위해 겉보리를 이물질과 손상된 곡립을 제거하기 위해 지하수로 세척하고, 체를 사용하여 정선하였다. 정선된 보리를 20℃에서 2일간 물에 담가 보리를 발아시켰으며, 수분함량이 55%인 발아된 보리에 물을 1:1로 첨가하여 균질기(homogenizer; 10,000 rpm, 2 min)로 균질화 한 후 천으로 압착하여 상등액을 분리하였다. 상등액에 액화효소 Termamyl을 고형분 기준으로 0.1%(w/w) 첨가하여 85℃에서 1시간 열처리하여 당화시켰다. 당화가 완료된 액체는 당도가 17.8˚Brix로 나타났으며, 물로 3배 희석한 후 121℃, 30분간 고압살균한 후 꽃송이버섯의 대량 액체배지로 사용하였다. 액체 배양으로 5 L 자 발효조(jar fermenter)를 사용하여 온도 25℃, 공기 주입량 1 vvm, 회전 속도 300 rpm, 10일 배양하여 분석하였다.

3) 두부 순물을 이용한 배양

두부 순물 배지는 두부 순물 중량 대비 글루코즈(glucose)를 2%(w/v) 첨가하여 사용하였다. 액체 배양으로 5 L jar fermenter를 사용하여 온도 25℃, 공기 주입량 1 vvm, 회전 속도 300 rpm, 10일 배양하여 분석하였다(도 2).

5. 결과

겉보리 당화배지 및 산업용 배지 조성과 두부 순물을 이용한 배지 조성에 따른 꽃송이버섯 균사체 배양액의 이화학적 특성을 분석한 결과는 표 1과 같다. 일반적으로 버섯 균사체 액체 배양에 사용되는 산업용 배지 조성을 이용하여 10일 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 분석한 결과, pH 3.26, 산도 0.1%, 당도는 1.0˚Brix로 나타났다. 균사체 함량은 1.45 g/L, 세포외 다당류 함량은 0.23 g/L로서 매우 낮게 나타났다. 이는 산업용 배지에서 꽃송이버섯 균사체 배양을 했을 때 꽃송이버섯 종균의 균사체가 잘 증식하지 않고 세포 외 다당류 생산량도 낮아 꽃송이버섯 배양에 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 따라서 겉보리를 당화하여 꽃송이버섯 액체종균용 배지에 사용하여 꽃송이버섯 균사체 액체배양에 이용하였다.

보리는 일반적으로 발아 중에 호분층 세포에서 지베렐린산(gibberellic acid; GA3)에 반응하여 다양한 가수분해 효소를 합성하고 호분층 세포벽으로부터 전분질 배유로 분비하는 역할이 있으며, 이들 효소는 α-아밀라아제(α-amylase), β-글루카나아제(β-glucanase), 자일라나아제(xylanase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 등이 관여하고, 보리가 발아시 호분층과 배유 세포벽의 구조형성 다당류들이 β-글루카나아제(β-glucanase), 자일라나아제(xylanase) 등의 세포벽 분해효소의 작용에 의해 우선적으로 분해되어 이로 인해 노출된 전분이 α-아밀라아제(α-amylase)와 β-아밀라아제(β-amylase) 등에 의해 분해되면서 당화가 진행된다. 따라서 보리 발아 시 다양한 효소가 생성되고, 당화한 후 희석하여 균사배양에 적합한 조건을 선발하여 꽃송이버섯 균사생장의 이용에 양호할 것으로 사료되어 겉보리 당화배지를 제조하여 꽃송이버섯 균사체 액체배양을 하였다. 겉보리 당화가 끝난 수용액을 물로 3배 희석하여 6˚Brix로 조절하여 꽃송이버섯 균사체 액체배양에 사용하였다. 이는 당의 농도가 낮은 조건에서 수용성 당은 균사 생육이 양호하여 자실체를 형성하는데 에너지를 공급할 뿐만 아니라 균체 형성에 계속 이용한다고 보고하여 본 시험을 행하였다.

겉보리 당화배지를 이용하여 10일간 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 분석한 결과, pH 4.34, 산도 0.08%, 7.5˚Brix로 나타났다(표 1). 균사체 함량은 22.15 g/L, 세포외 다당류 함량은 39.39 g/L로서 매우 높게 나타났다. 이는 꽃송이버섯 균사체 함량 측정 시 원심분리를 할 때, 배지 성분으로 겉보리와 꽃송이버섯 균사체가 함께 침전되어 함량이 매우 높게 나타났다. 다당류 함량 또한 높은 것은 겉보리에 함유된 다당류가 함께 회수되어 높게 나타났다. 산업용 배지 및 겉보리 당화배지를 이용하여 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액의 단백질 함량을 측정하기 위해 BCA 방법을 이용하여 측정한 결과, 각각 65.27 mg%, 1.68 mg%로 나타났다. 또한 배양액을 동결건조하여 베타글루칸 함량을 측정한 결과, 각각 4.98 (%, w/w), 4.34 (%, w/w)로 나타나 함량이 매우 저조하였다. 본 발명에서 겉보리를 당화하여 꽃송이버섯 균사체 액체배양을 하였으나 배지재료와 시험균주의 차이로 인해 이화학적 분석 결과 함량이 낮게 나타난 것으로 판단된다. 또한 보리 발아 시 보리에 함유된 저분자성 당류의 생성이 적어져서 점도가 높아지는 경향이 있다고 보고하였는데, 본 발명에서 겉보리를 발아하여 당화한 배지의 높은 점도의 영향으로 버섯 생육을 억제하는 것으로 생각되었다. 따라서 값비싼 기존 배지를 대체할 수 있는 부산물인 두부 순물을 이용하여 꽃송이버섯 균사체를 배양하였다.

배양에 사용된 두부 순물은 탄수화물 1%, 단백질 1%, 지방 0%이며, 무기질 중에서 특히 칼륨의 함량이 107.94 mg/100 g으로 높아 버섯 배양에 유리한 배지조성으로 판단되었다(표 2). 두부 순물을 분석한 결과, pH 5.7, 산도 0.12%, 당도 3.28˚Brix로 나타났으며, 수분 함량은 97.71%, 고형분 함량은 32.83 mg/ml로 측정되었다. 꽃송이버섯 액체 배양 시 적합한 온도는 25℃, pH 5.0∼6.0의 범위에서 균사 생장이 양호하였다는 결과를 볼 때, 두부 순물의 pH는 꽃송이버섯 균사생장에 유리한 것으로 판단되었다. 따라서 두부 순물에 탄소원으로 글루코즈(glucose) 2% 만을 첨가한 액체배지를 이용하여 25℃에서 10일간 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 이화학적 분석 결과를 표 1에 나타내었다. 버섯 배양액의 pH는 6.91로서 중성에 가깝게 나타났으며, 산도는 0.05%, 당도는 1.84˚Brix로 측정되었다. 꽃송이버섯 배양액의 균사체 함량은 17.76 g/L, 다당류 함량은 0.35 g/L로 측정되었다. 꽃송이버섯 배양액의 단백질 함량을 측정한 결과 511.85 mg%로 나타났다. 이는 산업용 배지 및 겉보리 당화배지를 이용하여 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액의 단백질 함량이 각각 65.27 mg%, 1.68 mg%의 결과보다 높게 나타났다. 또한 베타글루칸 함량을 측정한 결과 10.64 (%, w/w)로 나타난 것으로 산업용 배지 및 겉보리 당화배지를 이용한 배양액에서 각각 4.98 (%, w/w), 4.34 (%, w/w)의 결과보다 높게 나타났다. 따라서 두부 순물을 이용한 배양액을 이용하여 초산발효를 한 후 이화학적 분석 및 항산화를 평가하고, 웰빙 식품 소재를 이용한 기능성 제품으로 버섯 식초를 개발하고자 하였다.

꽃송이버섯 배양액 내의 화학적 조성

	제한배지	겉보리 당화 배지	두부 순물 배지
pH	3.26±0.01	4.34±0.01	6.91±0.11
산도 (%)	0.10±0.01	0.08±0.03	0.05±0.01
당도 (˚Brix)	1.0±0.10	7.5±0.01	1.84±0.45
균사체 함량 (g/L)	1.45±0.35	22.15±0.21	17.76±0.63
다당류 함량 (g/L)	0.23±0.11	39.39±0.08	0.35±0.05
수용성 단백질 함량 (mg%)	65.27±14.85	1.68±5.68	511.85±9.54
β-글루칸 함량 (%, w/w)	4.98±0.14	4.34±0.72	10.64±1.25

배양액은 10일 동안 발효하여 얻었다.

두부 순물(Soybean curd whey)의 화학적 조성

두부 순물 시험 항목		시험 결과
열량		10 Kcal / 100 g
탄수화물	탄수화물	2 g / 100 g(1%, % Nutrient Standard)
	당류	1 g / 100 g
단백질		1 g below / 100 g (1%, % Nutrient Standard)
지방	지방	0 g / 100 g (0%, % Nutrient Standard)
	포화 지방	0 g / 100 g (0%, % Nutrient Standard)
	트랜스 지방	0 g / 100 g
	콜레스테롤	0 mg / 100 g (0%, % Nutrient Standard)
식이섬유		0 g / 100 g (0%, % Nutrient Standard)
미네랄	Mg	13.646 mg / 100 g
	Ca	25.081 mg / 100 g
	K	107.942 mg / 100 g
	Na	50 mg / 100 g (3%)
	Mn	0.026 mg / 100g
	P	8.294 mg / 100 g

< 실시예 2 > 수크로즈 ( Sucrose ) 농도에 따른 꽃송이버섯의 두부 순물을 이용한 배양 및 초산발효

1. 초산균 배양

초산균으로 글루콘아세토박터 한세니(Gluconacetobacter hansenii) KCCM 40230를 한국미생물보존센터에서 분양받아 사용하였다. 배양에 이용한 배지 조성은 만니톨(mannitol) 25 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 5 g/L, 펩톤(peptone) 3 g/L을 혼합하여 사용하였고, 초산균을 온도 30℃, 회전속도 200 rpm, 3일 이상 배양하여 사용하였다(도 3).

2. pH 및 산도 측정

pH는 pH meter(Digital pH meter 420A+, Thermo Orion. Beverly, MA., USA)를 이용하여 측정하였으며, 10 mL을 취하여 측정하였다. 적정 산도는 pH meter로 pH가 8.3에 도달할 때 까지 0.1 N-NaOH로 적정하고 그 소비량을 타르타르산(tartaric acid) 함량(%, v/v)으로 환산하였다.

3. 생균수 측정

121℃에서 15분간 멸균한 만니톨(mannitol) 배지에 배양한 초산균을 10⁴, 10⁵, 10⁶ 배로 단계별 희석하여 만니톨(mannitol) 아가 배지에 20 μL 도말한 후, 30℃ 항온배양기에서 3일 이상 배양한 생균수를 CFU/mL로 나타내었다.

4. 당도 및 고형분 함량 측정

당도는 전자당도계(POCKET REFRACTOMETER, 0∼93 ˚Brix)를 이용해 배양액의 당도를 측정하였다. 고형분 함량은 적외선 수분측정기(KETT ELECTRIC LABORATORY, FD-720)를 이용하여 배양액 5 mL에 함유된 수분을 건조한 후 남아있는 고형분의 무게를 측정하여 나타내었다.

5. 균사체 및 다당류 함량 분석

균사체 액체 배양의 목적은 높은 수율의 세포외 다당류를 생산하는데 있다. 꽃송이버섯 균사 배양액에 함유된 균사체와 세포외 다당류 함량을 측정하기 위해 배양액 200 mL씩 취하여 원심분리기를 이용하여 원심분리(7,000 rpm, 20 min)하여 침전물과 상등액으로 분리하였다. 침전물은 균사체 성분으로 증류수로 2회 세척하여 동결 건조하여 무게를 측정하였고, 분리된 상등액은 세포외 다당류를 분리하기 위해 95% ethanol을 200 mL을 첨가하고 냉장 보관하여 overnight 한 후에 침전된 다당류를 회수하여 증류수로 2회 세척한 후 동결 건조하여 무게를 측정하였다.

6. 수용성 단백질 함량 측정

꽃송이버섯 배양액의 수용성 단백질 함량 측정은 Protein assay kit(SMARTTM BCA, Intron Biotechnology INC., Sungnam, Korea)를 이용하여 측정하였으며 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 표준물질로 하여 환산하여 계산하였다.

7. 베타글루칸 함량 측정

꽃송이버섯 균사체 배양액을 동결건조시킨 분말 100 mg을 정량하여 Megazyme kit(K-BGLU, Megazyme International Ireland Ltd, wicklow, Ireland)를 이용하여 베타글루칸 함량을 측정하였다. 총 글루칸 함량은 시료 100 mg에 37% 염산(hydrochloric acid)을 1.5 mL 첨가한 후, 30℃에서 45분간 반응시켰다. 반응액에 증류수 10 mL을 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 2 M KOH 10 mL과 200 mM 소듐 아세테이트 완충액(sodium acetate buffer; pH 5.0)를 이용하여 100 mL까지 부피를 조정하였다. 1,500×g에서 10분간 원심분리한 후 회수한 상등액 중 0.1 mL을 취하여 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 0.1 mL을 가하여 40℃에서 60분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 GOPOD 시약 3 mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 알파글루칸 함량은 시료 100 mg에 2 M KOH 2 mL을 첨가하여 20분간 냉각상태에서 반응시킨 다음, 1.2 mM 소듐 아세테이트 완충액(sodium acetater buffer; pH 3.8) 8 mL과 아밀로글루코시다아제(Amyloglucosidase; 1,630 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 40℃에서 30분간 반응시켰다. 1,500×g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액 중 0.1 mL을 취하고, 여기에 GOPOD 시약 3 mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응하였다. 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총 글루칸과 알파글루칸 함량의 차이를 베타글루칸 함량으로 계산하였다.

8. 결과

두부 순물과 증류수에 각각 수크로즈(sucrose)를 1, 5, 10, 15%(w/v)로 첨가하고, 대두분(soybean flour) 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄ 0.05%를 각각 첨가하여 500 mL 삼각 플라스크를 사용하여 온도 25℃, 회전 속도 160 rpm, 30일 배양하여 분석하였다. 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액을 최적조건으로 선정하여 배양기간을 5일 간격으로 10, 15, 20, 25, 30일로 샘플링하여 분석 및 초산발효를 하였다. 배양액에 주정 7%(w/v)을 첨가하고 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 250 mL 삼각 플라스크를 사용하여 온도 30℃, 회전 속도 200 rpm, 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하여 분석하였다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, 두부 순물과 증류수에 각각 수크로즈(sucrose)를 농도별로 1, 5, 10, 15%를 첨가한 배지에서 30일 동안 1차 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액의 pH를 측정한 결과, 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 1%를 첨가한 배양액은 5.24, 증류수에 sucrose 1%를 첨가한 배양액은 5.65로서 두부 순물과 증류수에 따른 차이가 없었으며, 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 5%를 첨가한 배양액은 5.21, 수크로즈(sucrose) 10%를 첨가한 배양액은 5.22로서 수크로즈(sucrose) 농도에 따라서도 큰 차이가 없었다. 당도는 두부 순물에 포함된 수크로즈(sucrose)의 농도가 증가될수록 각각 3.8 ˚Brix 에서 15.4 ˚Brix로 높아지는 것으로 나타났다. 증류수 역시 수크로즈(sucrose)를 1, 5, 10, 15%를 농도별로 첨가할수록 각각 1.1 ˚Brix, 4.9 ˚Brix, 9.5 ˚Brix, 11.3 ˚Brix로 높게 나타났다. 그러나 두부 순물 자체의 당도가 약 3 ˚Brix정도 되므로, 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 5%를 첨가한 배지의 당도가 8.0 ˚Brix이며, 증류수에 수크로즈(sucrose) 5%를 첨가한 배지의 당도가 4.9 ˚Brix로 나타난 것으로 보아 두부 순물에 수크로즈(sucrose)를 첨가한 배지의 당도가 더 높은 것으로 나타났다. 또한 두부 순물과 증류수에 각각 수크로즈(sucrose)를 1, 5, 10, 15%를 농도별로 첨가할수록 균사체 함량 및 다당류 함량이 높게 나타났다. 이들 중에서 균사체 함량이 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액은 19.8 g/L, 증류수에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액은 12.1 g/L로 나타났으며, 다당류 함량은 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액은 5.87 g/L, 증류수에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액은 2.93 g/L로 나타나 두부 순물에 수크로즈(sucrose) 15%를 첨가한 배양액을 최적조건으로 선정하여 배양기간을 5일 간격으로 10, 15, 20, 25, 30일로 샘플링하여 분석 및 초산발효를 하였다.

초산발효에 사용한 초산균으로 한국미생물보존센터에서 분양받은 글루콘아세토박터 한세니(Gluconacetobacter hansenii) KCCM 40230 균주를 온도 30℃, 회전속도 200 rpm, 3일 이상 배양하여 이화학적 분석을 한 결과, pH 5.53, 산도 0.04%, 생균수 1.5×10¹¹ CFU/mL로 나타났다.

두부 순물에 수크로즈(sucrose) 15%, 대두분(soybean flour) 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄ 0.05%를 각각 첨가하여 500 mL 플라스크를 사용하여 온도 25℃, 회전 속도 160 rpm로 배양하였으며, 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 배양기간 10일부터 5일 간격으로 30일까지 샘플링하여 분석한 결과는 도 5와 같다. 배양기간이 길어될수록 pH가 10일 배양했을 때 5.34, 30일 배양했을 때 6.26으로 증가하는 경향이 나타났다. 산도와 당도는 배양기간에 따라서 차이가 없었으며, 균사체 함량 또한 10일 배양했을 때 21.2 g/L, 30일 배양했을 때 23.0 g/L로 큰 차이가 없었다.

배양기간에 따라 샘플링한 배양액에 주정 7%(w/v)을 첨가하고 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 250 mL 플라스크를 사용하여 온도 30℃, 회전 속도 200 rpm, 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하여 분석한 결과는 도 6과 같다. pH 측정 결과 10일 배양액을 3일 동안 초산발효를 했을 때는 5.31, 5일 동안 초산발효를 했을 때는 4.07, 7일 동안 초산발효를 했을 때는 3.71로 점점 감소하는 경향이 나타났다. 산도 또한 30일 배양액을 3일 초산발효 했을 때는 0.30%, 7일 초산발효 했을 때는 1.30%로 증가하였다. 그러나 꽃송이버섯 균사체 배양액의 배양기간에 따라 초산발효를 3, 5, 7일 동안 한 후, pH 및 산도 측정 결과 꽃송이버섯 배양액의 배양기간에 따른 차이는 없었다.

< 실시예 3 > 감자분말 농도에 따른 꽃송이버섯의 두부 순물을 이용한 배양 및 초산발효

두부 순물에 감자분말을 0, 1, 3, 5%(w/v)로 첨가하고, 대두분(soybean flour) 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄ 0.05%를 각각 첨가하여 500 mL 삼각 플라스크를 사용하여 온도 25℃, 회전 속도 160 rpm, 30일 배양하여 분석 및 초산발효를 하였다. 배양액에 주정 7%(w/v), 대추농축액 10%(w/v)를 첨가하고 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 250 mL 삼각 플라스크를 사용하여 온도 30℃, 회전 속도 200 rpm, 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하여 분석하였다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, pH 측정 결과 감자분말을 첨가하지 않은 배양액은 5.09, 감자분말 5% 첨가한 배양액은 4.53으로 나타나 감자분말을 농도별로 첨가할수록 pH가 조금 감소하였다. 또한 산도는 감자분말을 첨가하지 않은 배양액은 0.26%, 감자분말 5% 첨가한 배양액은 0.43%로 감자분말 농도가 높을수록 산도가 증가하였다. 당도는 감자분말을 첨가하지 않은 배양액은 3.4 ˚Brix, 감자분말 5% 첨가한 배양액은 4.9 ˚Brix로 조금 증가하였다. 균사체 함량은 감자분말 1% 첨가한 배양액은 6.3 g/L, 감자분말 5% 첨가한 배양액은 18.7 g/L로 감자분말 농도에 따라서 높게 나타났다. 이는 꽃송이버섯 균사체 함량 측정 시 배양액을 원심분리를 할 때, 배지 성분으로 감자분말과 꽃송이버섯 균사체가 함께 침전되어 함량이 매우 높게 나타난 것으로 생각된다.

감자분말 농도에 따라 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액에 주정 7%(w/v), 대추농축액 10%(w/v)를 첨가하고 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 250 mL 플라스크를 사용하여 온도 30℃, 회전 속도 200 rpm, 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하였고 분석한 결과는 도 8과 같다. pH 측정 결과 초산발효를 3일한 감자분말 0%는 4.88, 감자분말 1%는 4.67, 감자분말 3%는 4.74, 감자분말 5%는 4.59로 차이가 없는 것으로 감자분말 농도에 따른 pH는 변화가 없었다. 또한 초산발효를 5일한 감자분말 1%는 4.68, 초산발효를 7일한 감자분말 1%는 4.66으로 나타난 것으로 초산발효 배양기간에 따른 큰 차이도 없었다. 산도 및 당도를 측정한 결과 또한 감자분말 농도에 따른 차이와 초산발효 기간에 따른 차이 모두 없었다.

< 실시예 4 > 글루코즈 및 미강을 첨가한 꽃송이버섯의 두부 순물을 이용한 배양 및 초산발효

1. DPPH 라디칼 소거 활성 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 소거활성은 Blois의 방법에 따라 측정하였다. 시료를 농도별로 희석한 희석액 160 μL와 에탄올에 녹인 0.15 mM DPPH용액 40 μL를 가하여 실온에서 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 상대 활성의 비교를 위하여 대조군으로 (주) 류충현약용버섯(Andong, Korea)에서 상황현미식초(상황버섯현미균사체 100%)와 송이식초(송이버섯 액체균사체 100%)를 구입하여 사용하였다.

2. ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS radical라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay 방법에 의하여 시행하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma Chemical Co., USA)와 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70 (±0.02)이 되게 포스페이트 완충 용액(phosphate buffer saline; PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 180 μL에 샘플 20 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 이 때 상대 활성의 비교를 위하여 대조군으로 (주) 류충현약용버섯(Andong, Korea)에서 상황현미식초(상황버섯현미균사체 100%)와 송이식초(송이버섯 액체균사체 100%)를 구입하여 사용하였다.

3. 결과

두부 순물에 글루코즈(glucose) 2%, 미강 5%, 수용성 전분(soluble starch) 1%, 대두분(soybean flour) 0.5%, 효모 추출물(yeast extract) 0.2%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄ 0.05%를 각각 첨가하여 5 L 병을 사용하여 온도 25℃, 공기는 (주) 고성밸브의 Air-pump를 이용하여 0.01 MPa 주입하였으며 10일 배양하여 분석 및 초산발효를 하였다. 배양액에 주정 7%(w/v), 대추농축액 10%(w/v), 시트르산(citric acid) 0.1%(w/v)을 첨가하고, 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 온도 30℃, 공기는 인위적으로 주입하여 0.01 MPa로 하였으며 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하여 분석하였다.

10일 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액의 이화학적 분석 결과, pH 5.06, 산도 0.18%, 당도 5.8 ˚Brix로 나타났다. 균사체 함량은 30.8 g/L, 다당류 함량은 3.45 g/L로 나타났다. 균사체 함량이 높게 나타난 것은 꽃송이버섯 균사체 함량 측정시 배양액을 원심분리를 할 때, 배지 성분으로 미강과 꽃송이버섯 균사체가 함께 침전되어 함량이 매우 높게 나타난 것으로 생각된다.

앞서 두부 순물에 수크로즈(sucrose)와 감자분말을 농도별로 첨가하여 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액에 초산발효를 하여 분석한 결과 산도가 약 1% 정도 나타났다. 이는 시판되는 식초가 4% 이상으로 나타나는 데에 비해 산도가 매우 낮으므로 두부 순물에 글루코즈(glucose)와 미강을 첨가한 본 실험에서는 초산발효 시 식용 시트르산(citric acid) 용액을 첨가하여 초산균의 산 생성을 증가시키도록 하였고, 식감을 높이기 위해 대추농축액을 첨가하였다. 사용한 식용 시트르산(citric acid) 20% 용액은 pH 1.31, 산도 20.68%로 나타났다.

꽃송이버섯 균사체 배양액에 주정 7%(w/v), 대추농축액 10%(w/v), 시트르산(citric acid) 0.1%(w/v)을 첨가하고, 초산균을 10% 접종하여 2차 초산발효를 하였다. 배양조건으로 온도 30℃, 공기는 인위적으로 주입하여 0.01 MPa로 하였으며 7일 동안 초산발효를 하여 2일 간격으로 샘플링하여 이화학적 분석 및 항산화 평가를 하였다. 3일 동안 초산발효를 한 결과 pH 3.62, 산도 2.9%, 당도 16.1 ˚Brix로 나타났다. 5일 동안 초산발효를 한 결과는 pH 3.62, 산도 3.33%, 당도 17.2 ˚Brix로 나타났으며, 7일 동안 초산발효를 하였을 때는 pH 3.69, 산도 3.62%, 당도 19.4 ˚Brix로 나타났다. 초산발효의 배양기간이 지속될수록 산도가 증가하는 경향을 볼 수 있었다.

두부 순물에 글루코즈(Glucose)와 미강을 첨가하여 배양한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 초산발효하여 제조한 식초의 항산화능을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성 실험을 하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 항산화성 물질로부터 전자, 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하므로, 전자공여능(electron donating ability)으로부터 항산화 활성을 추정할 수 있다. 이러한 DPPH법은 토코페롤(tocopherol), 아스코르빈산(ascorbate), 플라보노이드(flavonoid) 화합물, 방향족 아민류, 메일라드(maillard)형 갈변 생성물질, 펩타이드(peptide) 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질에 의해 환원됨으로써 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 항산화 효과를 전자공여능으로 측정하는 방법으로 항산화제 탐색에 일반적으로 이용되는 방법으로 알려져 있다. 따라서 DPPH 라디칼 소거 활성법을 이용한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 초산발효하여 제조한 식초를 5배 희석한 후 황산화력을 측정한 결과는 도 9와 같다. 이 때 구입한 상황현미식초(상황버섯현미균사체 100%)와 송이식초(송이버섯 액체균사체 100%)를 제조한 꽃송이버섯 식초와 비교를 위해 대조군으로 사용하였다. 시판되는 두 식초를 이화학적 분석 결과, 송이버섯 식초는 pH 2.83, 산도 5.6%, 당도 4.9 ˚Brix로 나타났으며, 상황버섯 식초는 pH 3.03, 산도 5.0%, 당도 4.9 ˚Brix로 나타났다. DPPH 측정 결과, 초산발효 전 꽃송이버섯 균사체 배양액은 72%, 초산발효를 3일한 배양액은 70.25%, 초산발효를 5일한 배양액은 69.13%, 초산발효를 7일한 배양액은 77.25%의 저해율이 나타났다. 초산발효가 진행되는 동안 저해율의 차이가 없었다. 또한 시판되는 송이버섯(Pleurotus eryngii) 식초는 36.22%, 상황버섯(Phellinus baumii) 식초는 39.14%의 전자 공여능이 나타난 것으로 제조한 꽃송이버섯 식초보다 소거 활성이 매우 낮았다. 따라서 제조한 꽃송이버섯 식초가 시판되는 송이버섯 식초와 상황버섯 식초보다 항산화성이 높다고 판단된다.

또한 초산발효하여 제조한 식초를 ABTS+ 라디칼 소거 활성법을 이용하여 항산화능을 알아보았다. ABTS 라디칼 소거능은 ABTS와 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 암소에 방치하여 ABTS+ 라디칼이 생성되면 시료의 항산화력에 의해 ABTS+ 라디칼이 소거되어 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS+ 라디칼의 소거 활성능을 측정할 수 있다. 따라서 ABTS 라디칼 소거 활성법을 이용한 꽃송이버섯 균사체 배양액을 초산발효하여 제조한 식초의 10배 희석한 후 항산화력을 측정한 결과는 도 10과 같다. 이 때 구입한 상황현미식초(상황버섯현미균사체 100%)와 송이식초(송이버섯 액체균사체 100%)를 제조한 꽃송이버섯 식초와 비교를 위해 대조군으로 사용하였다. ABTS 측정 결과, 초산발효 전 꽃송이버섯 균사체 배양액은 76.48%, 초산발효를 3일한 배양액은 93.44%, 초산발효를 5일한 배양액은 92.75%, 초산발효를 7일한 배양액은 91%의 저해율이 나타났다. 초산발효가 진행되면서 저해율이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 시판되는 송이버섯(Pleurotus eryngii) 식초는 9.98%, 상황버섯(Phellinus baumii) 식초는 22.83%의 전자 공여능이 나타난 것으로 제조한 꽃송이버섯 식초보다 소거 활성이 매우 낮았다. 따라서 DPPH 및 ABTS 측정 결과 제조한 꽃송이버섯 식초가 시판되는 송이버섯 식초와 상황버섯 식초보다 항산화성이 매우 높아 우수하다고 판단된다.

Claims (6)

1. 전체 두부 순물에 대하여 1 내지 10 중량% 글루코즈(glucose), 1 내지 15 중량% 수크로즈(sucrose) 또는 1 내지 5 중량% 감자분말이 포함된 두부 순물 배지에 꽃송이버섯 균사체를 배양하는 단계; 및
   상기 꽃송이버섯 균사체 배양액에 초산균을 접종하고, 주정을 전체 배양액에 대하여 3 내지 9 중량%를 첨가하여 발효시키는 초산 발효 단계를 포함하는 꽃송이버섯 식초 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 초산균은 글루콘아세토박터 한세니(Gluconacetobacter hansenii)인 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 식초 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 초산 발효는 20 내지 40℃에서 3 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 식초 제조방법.
6. 제1항, 제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조된 꽃송이버섯 식초.

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