KR101373107B1 - Pharmaceutical composition for reversing multidrug resistance comprising piperazine derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient - Google Patents

Abstract

본 발명은 당단백질 활성 저해작용을 나타내는 피페라진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 화합물들은 약물의 세포독성을 증진시키는 효과가 우수하고, P-당단백질(P-gp)활성을 저해하여 세포 밖으로의 약물의 배출을 억제함으로써 암세포 내로의 약물의 축적을 증가시키므로 본 발명의 화합물들은 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용 투여함으로써, 암의 성장을 억제하므로 항암제 보조용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance, containing a piperazine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof exhibiting glycoprotein activity inhibition. The compounds according to the present invention have an excellent effect of enhancing the cytotoxicity of the drug, and inhibit the P-glycoprotein (P-gp) activity to inhibit the release of the drug out of the cell, thereby increasing the accumulation of the drug into cancer cells. The compounds of the present invention can be used not only as a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance, but also can be usefully used as an anticancer adjuvant pharmaceutical composition by inhibiting the growth of cancer by administering the compound of the present invention in combination with an anticancer agent.

Description

피페라진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for reversing multidrug resistance comprising piperazine derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient}Pharmaceutical composition for reversing multidrug resistance comprising piperazine derivative or pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient}

본 발명은 당단백질 활성 저해작용을 나타내는 피페라진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance, containing a piperazine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof exhibiting glycoprotein activity inhibition.

국내 사망원인을 살펴보면, 심혈관질환, 악성종양, 뇌졸중, 그리고 알츠하이머병 순으로 암으로 인한 사망률이 2위를 차지하고 있어 그 심각성을 짐작할 수 있다. 이와 같이 최근 암 발생률은 산업의 급격한 발달, 지구 생태계 및 식생활의 변화 등으로 과거에 비해서 급격히 증가하고 있으나, 아직도 암에 대한 발생기전이 불명확하여 난치성 질병으로 알려져 있다(한국기술은행, 국내기술동향, 2005). The causes of death in Korea are as follows: cardiovascular disease, malignant tumor, stroke, and Alzheimer's disease. The recent incidence of cancer is rapidly increasing compared to the past due to rapid development of industry, changes in global ecosystem and diet, but it is still known as a refractory disease due to unclear mechanism of cancer (Korea Technology Bank, domestic technology trend, 2005).

암을 치료하는 방법은 크게 수술, 방사선 치료, 항암화학요법, 그리고 생물학적 치료법 등으로 나눌 수 있다. 이 중 수술이나 방사선 치료가 용이하지 않은 환자(전체 암 사례의 약 50%)와 이미 암이 전이된 환자들은 주로 화학요법으로 치료한다(생명공학연구원, 기술동향. 2005). 현재 사용되고 있는 의약품들은 효소제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수합성 의약품 및 천연물 유래의 의약품으로 구분할 수 있는데, 이 중에서 유전자, 효소, 백신 등을 이용한 항암제는 실용 단계에는 아직 미흡한 상태이며, 화학요법에 의해 개발된 많은 항암제는 암의 종류에 따라 약리 작용이 다양하고 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암의 치료의 문제점으로 지적되고 있다(한국기술은행, 국내기술동향, 2005).
Cancer can be categorized into surgery, radiation therapy, chemotherapy, and biological therapy. Of these, patients who are not easily operated or treated with radiation (about 50% of all cancer cases) and patients who have already metastasized are treated with chemotherapy (Biotechnology Researcher, Technology Trends, 2005). The currently used drugs can be classified into biological agents such as enzymes and vaccines, pure synthetic drugs, and medicines derived from natural products. Among them, anticancer drugs using genes, enzymes, vaccines and the like are not yet in practical use. Many anti-cancer drugs have been reported to be a problem of cancer treatment because of their various pharmacological effects and various side effects due to toxicity (Korea Technology Bank, domestic technology trend, 2005).

암의 화학요법에서 항암제에 대한 내성의 발현은 암 치료의 중대한 장애요소로 남아있으며, 한가지 약제에 대해 내성이 생긴 세포는 작용부위나 작용기작이 상이한 다른 종류의 약제에 대해서도 교차내성이 발생하는 경우가 많아 항암치료 실패의 주요한 원인이 되고 있다. 이러한 항암제에 대한 내성의 발현은 치료의 중대한 장애요소로 남아있으며, 암세포에 대한 내성 기작의 연구는 전 세계적으로 그 중요성이 점차로 증가하는 추세에 있으며, 암세포에 대한 다양한 분자생물학적, 생화학적 정보들이 밝혀지고 있으나, 아직까지 암세포의 약제내성 기작에 대한 이해는 초기단계를 벗어나지 못하고 있는 실정이다.
In chemotherapy of cancer, the expression of resistance to anticancer drugs remains a major obstacle to cancer therapy, and cells resistant to one drug are cross-resistant to other drugs with different action or mechanism Is a major cause of failure in chemotherapy. The expression of resistance to these anticancer drugs remains a major obstacle to therapy, and the study of the resistance mechanism against cancer cells is becoming increasingly important in the world, and various molecular biochemical and biochemical information on cancer cells is revealed However, the understanding of drug resistance mechanism of cancer cells has not yet reached the initial stage.

항암화학요법을 이용한 암치료에 있어서 장애가 되는 요소 중의 하나는 항암제내성이다. 항암제에 대한 약제내성은 암세포를 죽일 수 있는 혈중농도에 도달할 수 있는 양의 항암제를 투여했음에도 불구하고 암세포가 죽지 않는 경우를 말하는 것으로 다양한 생물학적 기전들이 밝혀져 있으나, 최근, 이러한 다약제 내성(multidrug resistance, MDR) 현상에 대하여 P-당단백질(P-glycoprotein, P-gp)이라 불리는 수송 단백질의 과다발현과 밀접한 관계가 있으며, P-gp는 항암제를 포함한 다양한 종류의 지용성 물질들을 세포 밖으로 배출시키는 ATP-의존성 수송단백질로서 암세포 내에서 치료 약물의 농도를 감소시켜 내성을 증가시키는 것으로 알려진 바 있다(Juranka et al., FASEB J., 3, pp2583-2592, 1989; Fuqua et al., Cancer Res ., 47, pp2103-2106, 1987; Endicott et al., Ann . Rev . Biochem ., 58, pp137-171, 1989; Gottesman et al., Ann . Rev . Biochem, 62, pp385-427, 1993).
One of the obstacles to cancer therapy using chemotherapy is resistance to chemotherapy. Drug resistance to anticancer drugs is a disease in which cancer cells do not die despite the administration of an amount of anticancer drugs that can reach blood levels that can kill cancer cells. Various biological mechanisms have been identified. Recently, however, multidrug resistance , P-glycoprotein (P-gp), and P-gp are closely related to overexpression of P-glycoprotein (P-gp) (Juranka et al., FASEB J. , 3 , pp 2583-2592, 1989; Fuqua et al., Cancer Res . , 47, pp2103-2106, 1987; Endicott et al, Ann Rev Biochem, 58, pp137-171, 1989;....... Gottesman et al, Ann Rev Biochem, 62, pp385-427, 1993).

다약제내성 억제제의 개발은 1980년대 초에 츠루오(Tsuruo) 등에 의해 베라파밀의 다약제내성 억제효과가 처음으로 발표된 이후, 베라파밀을 비롯하여, 세팔란틴(cephalanthine), 페노티아진(phenothiazine), 시클로스포린(cyclosporine A), 디피리다몰(dipyridamol), 퀴니딘(quinidine), 프로게스테론(progesterone), 세포페라존(cefoperazone) 등 다수의 약물이 지금까지 보고되고 있으며, 이들 중 덱스베라파밀(dexverapamil)(Knoll Pharm), 덱스니굴디핀(dexniguldipine)(Byk Gulden Lomberg Chem), Ro11-2933(Roche), PSC-833(Sandoz), S9788(Sevier Res.), LY335979(Eli Lilly) 등의 화합물들은 현재 임상실험 단계에 있다. 그러나, 지금까지 알려진 약물의 대부분이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서의 강력한 P-당단백질 억제효과에도 불구하고, 임상실험에서 심장독성이나 면역독성 등의 문제로 인해 개발이 극히 제한되고 있는 실정이다.The development of multidrug resistance inhibitors has been under way since the first release of multidrug resistance-inhibiting effect of verapamil by Tsuruo et al. In the early 1980's, including verapamil, cephalalanthine, phenothiazine, A number of drugs have been reported to date including cyclosporine A, dipyridamol, quinidine, progesterone, and cell felazone, among which dexverapamil ( Compounds such as Knoll Pharm, dexniguldipine (Byk Gulden Lomberg Chem), Ro11-2933 (Roche), PSC-833 (Sandoz), S9788 (Sevier Res.) And LY335979 (Eli Lilly) Step process. However, despite the fact that most of the drugs known so far have shown potent inhibitory effects on P-glycoprotein in vitro or in vivo, they have been developed in clinical trials due to problems of cardiac toxicity or immunotoxicity It is extremely limited.

국내에서 지금까지 개발된 다약제 내성 억제제로는 P-gp를 저해함으로써 항암제의 흡수를 촉진하는 약물로써, 한미약품에서 개발한 HM30181A를 파클리탁셀과 함께 포장하여 약물(Co-Package Drug)으로 개발하여 유방·위·폐암을 타겟으로 ‘오락솔’ 이라는 이름으로 현재 국내 임상 2상이 진행되고 있으며, 폐·대장암을 타겟으로 하여 이리노테칸과 HM30181A를 함께 포장한 약물로 개발한 '오라테칸'의 경우, 임상 1상이 진행중에 있으나, 아직까지 미미하여 다약제 내성 억제제의 지속적인 개발이 요구되고 있다.
The multi-drug resistance inhibitor developed so far in Korea is a drug that promotes the absorption of anti-cancer drugs by inhibiting P-gp, and developed HM30181A developed by Hanmi Pharm with paclitaxel as a drug (Co-Package Drug) Phase II clinical trials are underway under the name 'Oraxol' targeting stomach and lung cancer.In the case of 'Oratecan' developed as a drug packaged with irinotecan and HM30181A targeting lung and colon cancer, Phase 1 is in progress, but so far, there is a need for continuous development of multi-drug resistance inhibitors.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 종래 항암제에 내성을 갖는 암세포에 특이적으로 작용하는 다약제 내성 억제제를 개발하기 위해 연구하던 중, 본 발명의 화합물들이 P-gp 활성 저해작용을 함으로써, 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention have solved the above problems and have found that the compounds of the present invention inhibit P-gp activity during research to develop multidrug resistance-inhibiting agents specifically acting on cancer cells resistant to anticancer drugs, The present invention has been completed upon confirming that it can be effectively used as a pharmaceutical composition for inhibiting multidrug resistance.

본 발명의 목적은 P-당단백질의 활성을 저해하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting multidrug resistance which inhibits the activity of P-glycoprotein.

본 발명의 다른 목적은 항암제 보조용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for assisting an anticancer drug.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting multidrug resistance comprising a compound represented by the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

(상기 화학식 1에서 R¹ 및 R²는 본 발명의 명세서 내에서 정의한 바와 같다).(In Formula 1, R ¹ and R ² are as defined in the specification of the present invention).

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 보조용 약학적 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for assisting an anticancer agent comprising the compound of Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에 의한 화합물들은 약물의 세포독성을 증진시키는 효과가 우수하고, P-당단백질(P-gp)활성을 저해하여 세포 밖으로의 항암제의 배출을 억제함으로써 암세포 내로의 항암제의 축적을 증가시키므로 본 발명의 화합물들은 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용 투여함으로써, 암의 성장을 억제하므로 항암제 보조용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The compounds according to the present invention have an excellent effect of enhancing the cytotoxicity of the drug, and inhibit the P-glycoprotein (P-gp) activity to inhibit the release of anti-cancer drugs out of the cell, thereby increasing the accumulation of anticancer drugs into cancer cells. The compounds of the present invention can be used not only as a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance, but also can be usefully used as an anticancer adjuvant pharmaceutical composition by inhibiting the growth of cancer by administering the compound according to the present invention in combination with an anticancer agent.

도 1은 본 발명에 따른 화합물의 MCF-7/ADR 암세포에서의 DNM(도노마이신) 축적에 대한 효과를 나타내는 도면이다(각 데이터 점은 평균±S.D.(n=3)이며, * p value<0.01, **p value<0.001).
도 2는 본 발명에 따른 화합물의 MCF-7/ADR 암세포로부터의 DNM 배출에 대한 효과를 나타내는 도면이다(각 데이터 점은 평균±S.D.(n=3)이며, *p value<0.01, ** p value<0.001). 1 is a diagram showing the effect of the compound according to the invention on the accumulation of DNM (donomycin) in MCF-7 / ADR cancer cells (each data point is the mean ± SD (n = 3), * p value <0.01 , ** p value <0.001).
FIG. 2 is a diagram showing the effect of DNM excretion from MCF-7 / ADR cancer cells of a compound according to the invention (each data point is mean ± SD (n = 3), * p value <0.01, ** p value <0.001).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다:The present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting multidrug resistance comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

(상기 화학식 1에서, (In the formula 1,

R¹은 비치환 또는 C₁-C₄ 직쇄 또는 측쇄 알킬옥시로 치환된 C₅-C₆ 아릴 C₁-C₄ 알킬; 할로겐으로 치환된 C₅-C₆ 아릴 또는 C₁-C₄ 직쇄 또는 측쇄 알킬로 치환된 5-6원자 헤테로아릴이고, 이때, 상기 헤테로아릴은 탄소가 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하고; 및R ¹ is C ₅ -C ₆ aryl C ₁ -C ₄ alkyl unsubstituted or substituted with C ₁ -C ₄ straight or branched alkyloxy; C ₅ -C ₆ aryl substituted with halogen or 5-6 membered heteroaryl substituted with C ₁ -C ₄ straight or branched alkyl, wherein the heteroaryl is selected from the group consisting of N, O and S with carbon At least one hetero atom; And

R²는 C₁-C₄ 직쇄 또는 측쇄 알킬; C₅-C₆ 아릴 C₀-C₄ 알킬; C₉-C₁₂의 이중고리의 아릴이다).
R ² is C ₁ -C ₄ straight or branched alkyl; C ₅ -C ₆ aryl C ₀ -C ₄ alkyl; C ₉ -C ₁₂ bicyclic aryl).

바람직하게, 상기 화학식 1에서,Preferably, in Formula 1,

R¹은 비치환 또는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 또는 부톡시로 치환된 벤질; 클로로, 브로모 또는 플루오로로 치환된 페닐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 t-부틸로 치환된 이소옥사졸릴 또는 티아졸릴이고; 및R ¹ is benzyl unsubstituted or substituted with methoxy, ethoxy, propoxy or butoxy; Isooxazolyl or thiazolyl substituted with phenyl, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl or t-butyl substituted with chloro, bromo or fluoro; And

R²는 메틸; 에틸; 프로필; 이소프로필; 부틸; 이소부틸; t-부틸; 페닐; 벤질 또는 나프탈레닐이다.
R ² is methyl; ethyl; profile; Isopropyl; Butyl; Isobutyl; t-butyl; Phenyl; Benzyl or naphthalenyl.

더욱 바람직하게는 상기 화학식 1에서,More preferably in Formula 1,

R¹은 벤질, p-메톡시벤질, t-부틸이소옥사졸릴, 클로로페닐티아졸릴 또는 브로모페닐티아졸릴이고; 및R ¹ is benzyl, p-methoxybenzyl, t-butylisooxazolyl, chlorophenylthiazolyl or bromophenylthiazolyl; And

R²는 메틸, 페닐, 벤질 또는 나프탈레닐이다.
R ² is methyl, phenyl, benzyl or naphthalenyl.

가장 바람직하게, 본 발명에 따른 화학식 1의 유도체를 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:Most preferably, the derivative of formula (1) according to the present invention is more specifically exemplified by:

(1) N-(2-(벤질아미노)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-2-나프타아미드;(1) N- (2- (benzylamino) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxa Ethyl) -2-naphthaamide;

(2) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-메톡시벤질아미노)-2-옥사에틸)벤즈아미드;(2) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-methoxybenzylamino) -2-oxaethyl) benzamide;

(3) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일아미노)-2-옥사에틸)-2-페닐아세트아미드;(3) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-chlorophenyl ) Thiazol-2-ylamino) -2-oxaethyl) -2-phenylacetamide;

(4) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일아미노)-2-옥사에틸)-2-나프타아미드;(4) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-chlorophenyl ) Thiazol-2-ylamino) -2-oxaethyl) -2-naphthaamide;

(5) N-(2-(5-tert-부틸아소옥사졸-3-일아미노)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)벤즈아미드; 및(5) N- (2- (5-tert-butylisoxazol-3-ylamino) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) benzamide; And

(6) N-(4-(4-브로모페닐)티아졸-2-일)-2-(N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)아세트아미도)아세트아미드이다.
(6) N- (4- (4-bromophenyl) thiazol-2-yl) -2- (N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1 -Yl) -2-oxaethyl) acetamido) acetamide.

상기 구체적으로 예시한 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물을 하기 표 1에 나타내었다.The compounds of Formula 1 according to the present invention are shown in Table 1 below.

구분division 구조rescue 화학식 1Formula 1

화학식 2(2)

화학식 3(3)

화학식 4Formula 4

화학식 5Formula 5

화학식 66

본 발명의 화학식 1의 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.The derivative of formula 1 of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. From non-toxic organic acids such as dioate, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, acetic acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid. Such pharmaceutically innocuous salts include, but are not limited to, sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogenphosphate, dihydrogenphosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, Butyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, succinate, maleic anhydride, maleic anhydride, , Sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, chlorobenzene sulfide Propyl sulphonate, naphthalene-1-yne, xylenesulfonate, phenylsulfate, phenylbutyrate, citrate, lactate,? -Hydroxybutyrate, glycolate, maleate, Sulfonate, naphthalene-2-sulfonate or mandelate.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다. The acid addition salt according to the present invention can be obtained by a conventional method, for example, by dissolving a derivative of Chemical Formula 1 in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, , Or may be prepared by drying, or after the solvent and excess acid are distilled off under reduced pressure, followed by drying or crystallization in an organic solvent.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is preferable for the metal salt to produce sodium, potassium or calcium salt. The corresponding silver salt is also obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable salt (such as silver nitrate).

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 유도체 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.
In addition, the present invention encompasses derivatives of Formula 1 and pharmaceutically acceptable salts thereof, as well as possible solvates, hydrates, isomers and the like which can be prepared therefrom.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.The compound of formula (I) according to the present invention can be prepared by the following method, but is not limited thereto.

제법 1Recipe 1

하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, As shown in Scheme 1 below,

화학식 2의 이미노디아세트산에서 질소는 t-부틸옥시카르보닐(Boc)기로 보호하고, 인-시츄(in-situ) 반응으로 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDCI)를 사용하여 화학식 3의 이미노디아세트산 무수물 주형을 제조하는 단계(단계 1); In the iminodiacetic acid of formula (2), nitrogen is protected by t-butyloxycarbonyl (Boc) group and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl-carbodiimide hydro by in-situ reaction. Preparing an iminodiacetic anhydride template of Formula 3 using chloride (EDCI) (step 1);

상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 이미노디아세트산 무수물 주형을 아민류와 반응시켜, 이미노디아세트산 무수물의 첫 번째 작용기를 활성화하여 환을 오픈하여 두번째 활성화 자리에 모노 카르복실산이 남아있는 화학식 4의 화합물을 얻는 단계(단계 2);The iminodiacetic anhydride template of Formula 3 prepared in step 1 is reacted with amines to activate the first functional group of the iminodiacetic anhydride to open the ring, thereby leaving the compound of formula 4 having monocarboxylic acid remaining at the second activation site. Obtaining step (step 2);

상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물에, 결합제로 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스피롤리디노 포스포니움 헥사플루오로포스페이트(PyBOP)를 사용하여 화학식 5의 화합물 1-(4-클로로벤즈하이드릴)피페라진와 반응시켜, 두개의 작용기가 결합되어진 화학식 6의 화합물을 얻는 단계(단계 3); 및To compound of formula 4 prepared in step 2, using the benzotriazol-1-yl-oxy-trispyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) as a binder compound 1- (4- Reacting with chlorobenzhydryl) piperazine to obtain a compound of formula 6 having two functional groups bonded (step 3); And

상기 단계 3에서 얻어진 화학식 6의 화합물에 염산-다이옥산을 반응시켜 질소에 결합되어 있던 보호기를 제거하고, 결합제로 브로모트리스피롤리디노 포스포니움 헥사플루오로포스페이트(PyBrOP)를 사용하여, 화학식 1의 화합물을 얻는 단계(단계 4)를 포함하여 제조될 수 있다.Hydrochloric acid-dioxane is reacted with the compound of formula 6 obtained in step 3 to remove the protecting group bound to nitrogen, and using bromotrispyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate (PyBrOP) as a binder, Formula 1 It can be prepared including the step of obtaining a compound of (step 4).

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

상기 제법 1에 있어서, 단계 1 내지 4는 일반적으로 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
In Preparation 1, Steps 1 to 4 can be prepared by a generally known method.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 약물의 세포독성을 증진시키는 효과가 우수하고, P-당단백질(P-gp)활성을 저해하여 세포 밖으로의 항암제의 배출을 억제함으로써 암세포 내로의 항암제의 축적을 증가시키는 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention has an excellent effect of enhancing the cytotoxicity of the drug, and inhibits the release of anti-cancer agents out of cells by inhibiting P-glycoprotein (P-gp) activity, thereby preventing the accumulation of anticancer agents into cancer cells. It can be usefully used as a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance to increase.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 P-gp 활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 P-gp가 과다 발현되어 여러 약물(항암제)에 대한 내성을 가진 인체 유방암 세포(MCF-7/ADR)에서 수행한 세포독성, 항암제 축적 및 배출 실험 결과에 의하면, 종래 대표적인 p-gp 활성을 저해하는 약물로 알려진 베라파밀과 대비하여 항암제의 세포독성(IC₅₀)이 보다 우수 또는 동등한 정도임을 알 수 있다(실시예 1 참조). In order to examine the effect on the P-gp activity of the compound of Formula 1 according to the present invention, P-gp is overexpressed and performed in human breast cancer cells (MCF-7 / ADR) resistant to various drugs (anticancer agents) According to the cytotoxicity, anticancer accumulation and excretion experiments, it can be seen that the cytotoxicity (IC ₅₀ ) of the anticancer agent is better or equivalent to that of verapamil, which is known as a drug that inhibits the representative p-gp activity. 1).

또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물들의 세포 내 약물 축적 및 배출 실험결과에 따르면, 베라파밀과 대비하여 동등하거나 다소 우수한 정도로 나타남을 알 수 있다(실시예 2 및 3 참조).
In addition, according to the results of intracellular drug accumulation and excretion of the compounds of the formula 1 according to the present invention, it can be seen that they appear to be equivalent to or somewhat superior to verapamil (see Examples 2 and 3).

본 발명에 있어서, 상기 다약제 내성은 바람직하게는 항암제에 대한 다약제 내성이다.In the present invention, the multidrug resistance is preferably multidrug resistance to an anticancer drug.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 등 이다.In the present invention, the anticancer agent is selected from the group consisting of cyclophosphamide, 5-FU, amsacrine, daunomycin, vinblastine, vincristine, navelbine, Paclitaxel, taxotere, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, etoposide, teniposide, ), Colchicine, mitoxantrone, dactinomycin, topotecan, trimetrexate, mithramycin, mitomycin C, and the like. .

바람직하게는 상기 항암제는 파클리탁셀 또는 도노마이신이다.
Preferably, the anticancer agent is paclitaxel or donomycin.

상기 항암제는 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 요관암 등에 사용될 수 있다.
The anticancer agent may be selected from the group consisting of oral cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, , Ureteral cancer, and the like.

또한, 본 발명은 항암제와 병용투여 하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 피페라진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 항암제 보조용 약학적 조성물을 제공한다:The present invention also provides a pharmaceutical composition for assisting an anticancer agent comprising, as an active ingredient, a piperazine derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is administered in combination with an anticancer agent:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

(상기 화학식 1의 R¹ 및 R²는 본 명세서에서 정의한 바와 같다).
(R ¹ and R ² in Formula 1 are as defined herein).

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 항암제의 세포독성을 증진시키는 효과가 우수하고(실시예 1 참조), P-당단백질(P-gp)활성을 저해하여 세포 밖으로의 항암제의 배출을 억제함으로써 암세포 내로의 항암제의 축적을 증가시키는 효과가 있어(실시예 2 및 3 참조), 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용 투여함으로써, 암의 성장을 억제하므로 항암제 보조용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The compound of formula 1 according to the present invention is excellent in improving the cytotoxicity of the anticancer agent (see Example 1), by inhibiting the release of the anticancer agent out of the cell by inhibiting P-glycoprotein (P-gp) activity It has the effect of increasing the accumulation of anticancer agents into cancer cells (see Examples 2 and 3), and by using the compound according to the present invention in combination with an anticancer agent, it inhibits the growth of cancer and can be useful as an anticancer pharmaceutical composition have.

본 발명에 따른 항암제 보조용 약학적 조성물에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 등이다. In the pharmaceutical composition for adjuvanting an anticancer agent according to the present invention, the anticancer agent is selected from the group consisting of cyclophosphamide, 5-FU, amsacrine, daunomycin, vincristine, navelbine ), Paclitaxel, taxotere, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, etoposide, teniposide (see, for example, such as teniposide, colchicine, mitoxantrone, dactinomycin, topotecan, trimetrexate, mithramycin, mitomycin C, etc. to be.

바람직하게는 상기 항암제는 파클리탁셀 또는 도노마이신이다.
Preferably, the anticancer agent is paclitaxel or donomycin.

상기 항암제는 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 요관암 등에 사용될 수 있다.
The anticancer agent may be selected from the group consisting of oral cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, , Ureteral cancer, and the like.

본 발명의 화합물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The compounds of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of medicaments.

본 발명에 따른 화합물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The compounds according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols or the like, oral preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method have. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

제제 화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may be formulated into the compositions of the present invention with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, (sucrose), lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerol gelatin and the like can be used.

본 발명의 화합물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.The compound of the present invention can be administered orally or parenterally, and any parenteral administration method can be used, and systemic administration or topical administration is possible, but systemic administration is more preferable, and intravenous administration is most preferable.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약물의 경구 투여 흡수증진제는 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
Preferred dosages of the compounds of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, oral administration of the drug of the present invention, the absorption enhancer is preferably administered at 0.0001 to 0.03 g / kg, preferably at 0.001 to 8 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Production Examples and Examples.

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
The following Preparation Examples and Examples are illustrative of the present invention, but the present invention is not limited by the Preparation Examples and Examples.

<제조예 1> N-(2-(Production Example 1 N- (2- ( 벤질아미노Benzylamino )-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-2-) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -2- 나프타아미드의Naphthaamide 제조(화합물 1) Preparation (Compound 1)

단계 1: N-((t-Step 1: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)Carbonyl) 이미노디아세트산의Iminodiacetic 제조 Produce

1ℓ플라스크에 이미노디아세트산(13.3g, 100mmol), 다이옥산(200㎖), 물 200㎖에 녹인 수산화나트륨(8g, 200mmol)을 넣고, 용액이 균일해질 때까지 교반하였다. 상기 용액에 디-t-부틸디카보네이트(25㎖, 110mmol)를 소량 넣고, 실온에서 72시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에테르(2×100㎖)로 세척하였다. 수용액 층을 10% 염산(100㎖)으로 산성화하고, 에틸아세테이트(3×150㎖)로 추출하였다. 모아진 유기층을 포화 소금물(2×150㎖)로 세척하고, Na₂SO₄로 수분을 제거한 후, 재결정(에틸아세테이트:헥산=1:2)하여 무색 결정의 목적화합물 5.75 g(25%)을 얻었다.Into a 1 L flask was placed imino diacetic acid (13.3 g, 100 mmol), dioxane (200 mL) and sodium hydroxide (8 g, 200 mmol) dissolved in 200 mL of water, and stirred until the solution became uniform. A small amount of di-t-butyldicarbonate (25 mL, 110 mmol) was added to the solution, stirred at room temperature for 72 hours, and then the reaction mixture was washed with ether (2 x 100 mL). The aqueous layer was acidified with 10% hydrochloric acid (100 mL) and extracted with ethyl acetate (3 x 150 mL). The combined organic layers were washed with saturated brine (2 × 150 mL), water was removed with Na ₂ SO ₄ , and then recrystallized (ethyl acetate: hexane = 1: 2) to obtain 5.75 g (25%) of the target compound as colorless crystals. .

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 4.12 및 4.08(2s, 4H), 1.4(s, 9H)
¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 4.12 and 4.08 (2s, 4H), 1.4 (s, 9H)

단계 2: N-((t-Step 2: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -- 벤질이미노디아세트산Benzyliminodiacetic acid 모노아미드(M2)Monoamide (M2) 의 제조Manufacturing

플라스크에 상기 단계 1에서 제조한 N-((t-부틸옥시)카르보닐)이미노디아세트산(0.5g, 2.13mmol)과 EDCI(0.408g, 2.13mmol)가 녹아있는 DMF 6.4㎖를 넣고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 여기에 벤질아민(0.23g, 2.13mmol)을 주사기를 통해 천천히 적가한 후, 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응물을 에틸아세테이트(60㎖)로 희석시키고, 10% 염산 수용액(2×40㎖), 포화된 소금물(40㎖)로 세척한 후, Na₂SO₄로 수분을 제거하고, 용매를 감압하에 제거하여 백색 고체의 목적화합물 0.52 g(75%)을 얻었다.Into a flask, 6.4 ml of N-((t-butyloxy) carbonyl) iminodiacetic acid (0.5g, 2.13mmol) and EDCI (0.408g, 2.13mmol) prepared in step 1 was added thereto, and at room temperature Stir for 1 hour. Benzylamine (0.23 g, 2.13 mmol) was slowly added dropwise through a syringe, followed by stirring at room temperature for 20 hours. Dilute the reaction with ethyl acetate (60 mL), wash with 10% aqueous hydrochloric acid solution (2 × 40 mL), saturated brine (40 mL), remove moisture with Na ₂ SO ₄ , and remove the solvent under reduced pressure. To give 0.52 g (75%) of the title compound as a white solid.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400 MHz) δ 7.2(5H, m), 4.4(2H, t), 4.0(2H, d), 3.9(2H, d), 1.3 및 1.4(9H, 2s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.2 (5H, m), 4.4 (2H, t), 4.0 (2H, d), 3.9 (2H, d), 1.3 and 1.4 (9H, 2s)

FABMS m/z 323.15
FABMS m / z 323.15

단계 3: N-((t-Step 3: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -벤질--benzyl- N'N ' -1-(4--1- (4- 클로로벤즈하이드릴Chlorobenzhydryl )피페라진 Piperazine 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 디아미드의Diamide 제조( Produce( pM2pM2 ))

30㎖ 바이알에 상기 단계 2에서 제조된 화합물 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드(0.48g, 1.31mmol, 1.0eq.), 1-(4-클로로벤즈하이드릴)피페라진(0.41g, 1.441mmol, 1.1eq.), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스피롤리디노 포스포니움 헥사플루오로포스페이트(PyBOP) 0.75g (1.44mmol, 1.1eq.)을 넣은 뒤, DMF(15㎖), N,N-디이소프로필에틸아민(i-Pr₂NEt; 0.5㎖, 2.62mmol, 2.0eq.)을 넣고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸아세테이트(100㎖)로 희석시키고, 10% 염산 수용액(100㎖), 포화 NaHCO₃ 수용액(2×50㎖), 포화 소금물(50㎖)로 차례로 세척하고, Na₂SO₄로 수분을 제거한 후, 감압하에 용매를 제거하여 오렌지색 고체의 목적화합물을 0.61g(73%) 얻었다. In a 30 ml vial compound N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide (0.48 g, 1.31 mmol, 1.0 eq.) Prepared in Step 2, 1- (4- Chlorobenzhydryl) piperazine (0.41 g, 1.441 mmol, 1.1 eq.), Benzotriazol-1-yl-oxy-trispyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) 0.75 g (1.44 mmol, 1.1 eq.) was added, and then DMF (15 mL), N, N-diisopropylethylamine (i-Pr ₂ NEt; 0.5 mL, 2.62 mmol, 2.0 eq.) was added thereto, followed by stirring at room temperature for 16 hours. The mixture was diluted with ethyl acetate (100 mL), washed sequentially with 10% aqueous hydrochloric acid solution (100 mL), saturated aqueous NaHCO ₃ solution (2 x 50 mL), saturated brine (50 mL), and washed with Na ₂ SO ₄ . After the removal, the solvent was removed under reduced pressure to obtain 0.61 g (73%) of the title compound as an orange solid.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 7.2-7.5(14H, m), 4.4(3H, ds), 4.2(2H, d), 3.8(2H, d), 3.6(4H, s), 2.4(4H, m), 1.4(9H, d) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 7.2-7.5 (14H, m), 4.4 (3H, ds), 4.2 (2H, d), 3.8 (2H, d), 3.6 (4H, s), 2.4 (4H, m), 1.4 (9H, d)

FABMS m/z : 591.27
FABMS m / z: 591.27

단계 4: N-(2-(Step 4: N- (2- ( 벤질아미노Benzylamino )-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-2-) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -2- 나프타아미드의Naphthaamide 제조 Produce

4㎖ 바이알에 클로로포름(1㎖), 4M 염산-다이옥산(1㎖), 상기 3에서 제조한 화합물 0.035g(0.056mmol)을 넣고, 3시간 동안 교반하였다. 용매와 과량의 산을 증발시켜 제거하고, 잔여물을 DMF 1㎖에 녹이고, i-Pr₂NEt 29.3㎕(0.168mmol)을 가한 뒤, 2-나프토익산 10.68㎎(0.062mmol, 1.1eq.), PyBrOP 28.9㎎(0.062mmol)을 넣고, 16시간 동안 교반시켰다. 교반한 후, 반응혼합물을 에틸아세테이트(40㎖)로 희석시키고, 10% 염산 수용액(3×30㎖), 포화 NaHCO₃ 수용액(2×30㎖), 포화 소금물(30㎖)로 세척한 후, Na₂SO₄로 수분을 제거하고 농축하여, 노란색 오일의 목적 화합물 0.008 g(19%)을 얻었다.Into a 4 mL vial was added chloroform (1 mL), 4M hydrochloric acid-dioxane (1 mL), and 0.035 g (0.056 mmol) of the compound prepared in 3 above, and stirred for 3 hours. Solvent and excess acid were removed by evaporation, the residue was dissolved in 1 mL of DMF, 29.3 μl (0.168 mmol) of i-Pr ₂ NEt was added, followed by 10.68 mg (0.062 mmol, 1.1eq.) Of 2-naphthoic acid. , PyBrOP 28.9 mg (0.062 mmol) was added and stirred for 16 hours. After stirring, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (40 mL), washed with 10% aqueous hydrochloric acid solution (3 x 30 mL), saturated aqueous NaHCO ₃ solution (2 x 30 mL), and saturated brine (30 mL). Water was removed with Na ₂ SO ₄ and concentrated to give 0.008 g (19%) of the title compound as a yellow oil.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 7.3-8.0(21H, m), 4.4(3H, ds), 4.2(2H, d), 3.8(2H, d), 3.6(4H, s), 2.4(4H, m) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.3-8.0 (21H, m), 4.4 (3H, ds), 4.2 (2H, d), 3.8 (2H, d), 3.6 (4H, s), 2.4 (4H, m)

FABMS m/z 645.2
FABMS m / z 645.2

<< 제조예Manufacturing example 2> N-(2-(4-((4- 2> N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- 메톡시벤질아미노Methoxybenzylamino )-2-옥사에틸)) -2-oxaethyl) 벤즈아미드의Benzamide 제조(화합물 2) Preparation (Compound 2)

단계 1: N-((t-Step 1: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(4-메톡시벤질)-(4-methoxybenzyl) 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 모노 아미드( Monoamide ( M4M4 )의 제조)

상기 제조예 1의 단계 2에서 벤질아민을 사용하는 대신 4-메톡시벤질아민을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 미색 오일의 목적화합물 0.43g(55%)을 얻었다.0.43 g (55%) of the target compound of the off-white oil was obtained by the same method except that 4-methoxybenzylamine was used instead of benzylamine in step 2 of Preparation Example 1.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 6.8(2H, dt), 7.2 and 7.3(2H, t), 4.4(2H, d), 4.2(2H, d), 4.0(2H, d), 3.8(3H, s), 1.4(9H, two s) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 6.8 (2H, dt), 7.2 and 7.3 (2H, t), 4.4 (2H, d), 4.2 (2H, d), 4.0 (2H, d), 3.8 (3H, s), 1.4 (9H, two s)

FABMS m/z : 353.16
FABMS m / z: 353.16

단계 2: N-((t-Step 2: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(4-메톡시벤질)--(4-methoxybenzyl)- N'N ' -1-(4--1- (4- 클로로벤즈하이드릴Chlorobenzhydryl )피페라진 Piperazine 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 디아미드의Diamide 제조( Produce( pM4pM4 ))

상기 제조예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 대신 상기 단계 1에서 제조된 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 오렌지색 고체의 목적화합물 0.67g(89%)을 얻었다.Except for using the compound prepared in Step 1 instead of N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide in Step 3 of Preparation Example 1 0.67 g (89%) of the title compound as an orange solid were obtained.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 7.2-7.6(11H, m), 6.8(2H, t), 4.4(1H, s), 4.3(2H, d), 4.2(2H, d), 3.8(2H, d), 3.7(3H, s), 3.6(4H, m), 2.4(4H, m), 1.4(9H, d) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 7.2-7.6 (11H, m), 6.8 (2H, t), 4.4 (1H, s), 4.3 (2H, d), 4.2 (2H, d), 3.8 (2H, d), 3.7 (3H, s), 3.6 (4H, m), 2.4 (4H, m), 1.4 (9H, d)

FABMS m/z : 621.28
FABMS m / z: 621.28

단계 3: N-(2-(4-((4-Step 3: N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-메Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-meth) 톡시벤질Tolylbenzyl 아미노)-2-옥사에틸)Amino) -2-oxaethyl) 벤즈아미드의Benzamide 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 4에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 및 2-나프토산을 사용하는 대신 상기 단계 2에서 제조된 화합물(10.815 ㎎, 0.017 mmol) 및 벤조산(2.3 ㎎, 0.019 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 붉은빛의 갈색 오일의 목적 화합물 0.009 g(53%)을 얻었다.In step 4 of Preparation Example 1, instead of using N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide and 2-naphthoic acid, the compound prepared in step 2 (10.815 mg, 0.09 mmol) and benzoic acid (2.3 mg, 0.019 mmol) were used in the same manner to obtain 0.009 g (53%) of the title compound as a reddish brown oil.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 6.8-7.5(18H, m), 4.4(1H, d), 4.3 (2H, m), 4.1-4.2(2H, m), 3.8(2H, d), 3.7-3.8(3H, m), 3.6(4H, m), 2.3(4H, m) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 6.8-7.5 (18H, m), 4.4 (1H, d), 4.3 (2H, m), 4.1-4.2 (2H, m), 3.8 (2H, d ), 3.7-3.8 (3H, m), 3.6 (4H, m), 2.3 (4H, m)

FABMS m/z 647.24
FABMS m / z 647.24

<< 제조예Manufacturing example 3> N-(2-(4-((4- 3> N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-) 클로로페닐Chlorophenyl )티아졸-2-) Thiazol-2- 일아미노Amino )-2-옥사에틸)-2-) -2-oxaethyl) -2- 페닐아세트아미드의Phenylacetamide 제조(화합물 3) Preparation (Compound 3)

M7S3M7S3

단계 1: N-((t-Step 1: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(2-(4-(4--(2- (4- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )티아졸))Thiazole)) 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 모노아미드의Monoamide 제조( Produce( M7M7 ))

상기 제조예 1의 단계 2에서 벤질아민을 사용하는 대신 2-아미노-4-(4-클로로페닐)티아졸(0.448 g, 2.13 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 목적화합물 0.29 g(32%)을 얻었다.0.29 of the target compound was carried out in the same manner, except that 2-amino-4- (4-chlorophenyl) thiazole (0.448 g, 2.13 mmol) was used instead of benzylamine in step 2 of Preparation Example 1. g (32%) was obtained.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 8.0(2H, d), 7.5(2H, d), 7.4(1H, s), 3.9(2H, d), 3.7(2H, d), 1.3(9H, s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 8.0 (2H, d), 7.5 (2H, d), 7.4 (1H, s), 3.9 (2H, d), 3.7 (2H, d), 1.3 ( 9H, s)

FABMS m/z 426.08
FABMS m / z 426.08

단계 2: N-((t-Step 2: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(2-(4-(4--(2- (4- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )티아졸))-Thiazole))- N'N ' -1-(4-클-1- (4-clock 로로벤즈하이드Lobobenzhide 릴)피페라진 Reel) piperazine 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 디아미드의Diamide 제조( Produce( pM7pM7 ))

상기 실시예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 대신 상기 단계 1에서 제조된 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 미색 고체의 목적화합물 0.34g(69%)을 얻었다.Except for using the compound prepared in step 1 instead of N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide in step 3 of Example 1 0.34 g (69%) of the title compound was obtained as an off-white solid.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 7.2-8.0(14H, m), 4.45(1H, s), 4.4(2H, d), 4.1-4.15(2H, d), 3.6-3.8(4H, m), 2.4(4H, m), 1.3-1.4(9H, d) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 7.2-8.0 (14H, m), 4.45 (1H, s), 4.4 (2H, d), 4.1-4.15 (2H, d), 3.6-3.8 (4H , m), 2.4 (4H, m), 1.3-1.4 (9H, d)

FABMS m/z : 694.19
FABMS m / z: 694.19

단계 3: N-(2-(4-((4-Step 3: N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-chlorophenyl) thiazole-2- 일아미노Amino )-2-옥사에틸)-2-) -2-oxaethyl) -2- 페닐아세트아미드의Phenylacetamide 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 4에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 및 2-나프토산을 사용하는 대신 상기 단계 2에서 제조된 화합물(12.065 ㎎, 0.017 mmol) 및 2-페닐아세트산(2.587 ㎎, 0.019 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 노란색 오일의 목적 화합물 0.04 g(27%)을 얻었다.Compound (12.065 mg, prepared in Step 2, instead of using N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide and 2-naphthoic acid in Step 4 of Preparation Example 1; 0.04 g (27%) of the title compound as a yellow oil was obtained in the same manner except that 0.017 mmol) and 2-phenylacetic acid (2.587 mg, 0.019 mmol) were used.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 7.2-8.0(14H, m), 7.0-7.2(5H, m), 4.45(1H, s), 4.4(2H, d), 4.1-4.15(2H, d), 3.6-3.8(4H, m), 3.4(2H, s), 2.4(4H, m) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.2-8.0 (14H, m), 7.0-7.2 (5H, m), 4.45 (1H, s), 4.4 (2H, d), 4.1-4.15 (2H , d), 3.6-3.8 (4H, m), 3.4 (2H, s), 2.4 (4H, m)

FABMS m/z 711.95
FABMS m / z 711.95

<< 제조예Manufacturing example 4> N-(2-(4-((4- 4> N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-) 클로로페닐Chlorophenyl )티아졸-2-) Thiazol-2- 일아미노Amino )-2-옥사에틸)-2-) -2-oxaethyl) -2- 나프타아미드의Naphthaamide 제조(화합물 3) Preparation (Compound 3)

M7S4M7S4

상기 제조예 1의 단계 4에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드을 사용하는 대신 상기 제조예 3의 단계 2에서 제조된 화합물(12.065 ㎎, 0.017 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 노란빛의 갈색 오일의 목적 화합물 0.08 g(99%)을 얻었다.Compound (12.065 mg, 0.017 mmol, prepared in Step 2 of Preparation Example 3, instead of using N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide in Step 4 of Preparation Example 1 Except for using), the same procedure was followed to obtain 0.08 g (99%) of the target compound as a yellowish brown oil.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 7.0-8.0(21H, m), 4.2-4.3(5H, m), 3.4-3.8 (4H, m), 1.8-2.0(4H, m) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.0-8.0 (21H, m), 4.2-4.3 (5H, m), 3.4-3.8 (4H, m), 1.8-2.0 (4H, m)

FABMS m/z 748.03
FABMS m / z 748.03

<< 제조예Manufacturing example 5> N-(2-(5- 5> N- (2- (5- terttert -- 부틸아소옥사졸Butyl Axoxazole -3--3- 일아미노Amino )-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-Cl) 로로Roro 페닐)(Phenyl) ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) 벤즈아미드의Benzamide 제조(화합물 5) Preparation (Compound 5)

M8S2M8S2

단계 1: N-((t-Step 1: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(3-(5-t--(3- (5-t- 부틸이소옥사졸Butylisoxazole )))) 이미노디아Iminodia 세트산 Set mountain 모노아미드(M8)의Of monoamide (M8) 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 2에서 벤질아민을 사용하는 대신 5-tert-부틸이소옥사졸-3-아민(0.298 g, 2.13 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 백색 고체의 목적화합물 0.2 g(26%)을 얻었다.Except for using benzylamine in step 2 of Preparation Example 1 except that 5-tert-butylisoxazol-3-amine (0.298 g, 2.13 mmol) was carried out in the same manner as the target compound of a white solid 0.2 g (26%) was obtained.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 6.2(1H, s), 4.5(4H, s), 1.5(9H, s), 1.35(9H, s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 6.2 (1H, s), 4.5 (4H, s), 1.5 (9H, s), 1.35 (9H, s)

FABMS m/z 356.17
FABMS m / z 356.17

단계 2: N-((t-Step 2: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(3-(5-t--(3- (5-t- 부틸이소옥사졸Butylisoxazole ))-)) - N'N ' -1-(4--1- (4- 클Big 로로벤즈하이드릴)피페라진 Lowobenzhydryl) piperazine 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 디아미드의Diamide 제조( Produce( pM8pM8 ))

상기 실시예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 대신 상기 단계 1에서 제조된 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 미색 고체의 목적화합물 0.29g(83%)을 얻었다.Except for using the compound prepared in step 1 instead of N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide in step 3 of Example 1 0.29 g (83%) of the title compound was obtained as an off-white solid.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 7.2-7.6(9H, m), 6.6(1H, d), 4.4(1H, s), 4.3(2H, d), 3.9-4.0(2H, d), 3.5-3.7(4H, m), 2.4(4H, m), 1.3-1.4(9H, d), 1.25(9H, d) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 7.2-7.6 (9H, m), 6.6 (1H, d), 4.4 (1H, s), 4.3 (2H, d), 3.9-4.0 (2H, d ), 3.5-3.7 (4H, m), 2.4 (4H, m), 1.3-1.4 (9H, d), 1.25 (9H, d)

FABMS m/z : 624.18
FABMS m / z: 624.18

단계 3: N-(2-(5-Step 3: N- (2- (5- terttert -- 부틸아소옥사졸Butyl Axoxazole -3--3- 일아미노Amino )-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-Cl) 로로Roro 페닐)(Phenyl) ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) 벤즈아미드의Benzamide 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 및 2-나프토산을 사용하는 대신 상기 단계 2에서 제조된 화합물(10.866 ㎎, 0.017 mmol) 및 벤조산(2.3 ㎎, 0.019 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 노란색 오일의 목적 화합물 0.04 g(27%)을 얻었다.Compound (10.866 mg) prepared in step 2, instead of using N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide and 2-naphthoic acid in step 3 of Preparation Example 1 0.04 mmol (0.017 mmol) and benzoic acid (2.3 mg, 0.019 mmol) were used in the same manner to obtain 0.04 g (27%) of the title compound as a yellow oil.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 8.0-8.2(5H, m) 7.2-7.7(9H, m), 6.6(1H, s), 4.5-4.6(1H, s), 4.5(1H, s), 4.2-4.4(4H, m), 3.4-3.7(4H, d), 2.4 -2.5(4H, m), 1.4(9H, s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 8.0-8.2 (5H, m) 7.2-7.7 (9H, m), 6.6 (1H, s), 4.5-4.6 (1H, s), 4.5 (1H, s), 4.2-4.4 (4H, m), 3.4-3.7 (4H, d), 2.4 -2.5 (4H, m), 1.4 (9H, s)

FABMS m/z 628.16
FABMS m / z 628.16

<< 제조예Manufacturing example 6> N-(4-(4- 6> N- (4- (4- 브로모페닐Bromophenyl )티아졸-2-일)-2-(N-(2-(4-((4-) Thiazol-2-yl) -2- (N- (2- (4-((4- 클로로페Chlorophyll 닐)(Neil) 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) 아세트아미도Acetamido )) 아세트아미드의Acetamide 제조(화합물 6) Preparation (Compound 6)

M9S1M9S1

단계 1: N-((t-Step 1: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(2-(4-(4--(2- (4- (4- 브로모페닐Bromophenyl )티아졸))Thiazole)) 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 모노아미드(M9)의Of monoamide (M9) 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 2에서 벤질아민을 사용하는 대신 2-아미노-4-(4-브로모페닐)티아졸(0.543 g, 2.13 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 붉은 갈색 고체의 목적화합물 0.27 g(27%)을 얻었다.Red brown except that 2-amino-4- (4-bromophenyl) thiazole (0.543 g, 2.13 mmol) was used instead of benzylamine in step 2 of Preparation Example 1. 0.27 g (27%) of the title compound as a solid were obtained.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 7.7(2H, d), 7.6(1H, s), 7.5(2H, d), 4.6(4H, s), 1.4(9H, s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.7 (2H, d), 7.6 (1H, s), 7.5 (2H, d), 4.6 (4H, s), 1.4 (9H, s)

FABMS m/z 469.84
FABMS m / z 469.84

단계 2: N-((t-Step 2: N-((t- 부틸옥시Butyloxy )카르보닐)-Carbonyl) N'N ' -(2-(4-(4--(2- (4- (4- 브로모페닐Bromophenyl )티아졸))-Thiazole))- N'N ' -1-(4-클-1- (4-clock 로로벤즈하이드Lobobenzhide 릴)피페라진 Reel) piperazine 이미노디아세트산Iminodiacetic acid 디아미드의Diamide 제조( Produce( pM9pM9 ))

상기 실시예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 대신 상기 단계 1에서 제조된 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 미색 고체의 목적화합물 0.23g(92%)을 얻었다.Except for using the compound prepared in step 1 instead of N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide in step 3 of Example 1 0.23 g (92%) of the title compound was obtained as an off-white solid.

¹H-NMR(Acetone-d₆, 400MHz) : 7.2-7.9(14H, m), 4.45(1H, s), 4.4(2H, d), 4.1-4.15(2H, d), 3.4-3.6(4H, m), 2.4(4H, m), 1.3-1.4(9H, d) ¹ H-NMR (Acetone-d ₆ , 400 MHz): 7.2-7.9 (14H, m), 4.45 (1H, s), 4.4 (2H, d), 4.1-4.15 (2H, d), 3.4-3.6 (4H , m), 2.4 (4H, m), 1.3-1.4 (9H, d)

FABMS m/z : 738.14
FABMS m / z: 738.14

단계 3: N-(4-(4-Step 3: N- (4- (4- 브로모페닐Bromophenyl )티아졸-2-일)-2-(N-(2-(4-((4-) Thiazol-2-yl) -2- (N- (2- (4-((4- 클로로페닐Chlorophenyl )() ( 페닐Phenyl )) 메틸methyl )피페라진-1-일)-2-옥사에틸)) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) 아세트아미도Acetamido )) 아세트아미드의Acetamide 제조 Produce

상기 제조예 1의 단계 3에서 N-((t-부틸옥시)카르보닐)-N'-벤질이미노디아세트산 모노아미드 및 2-나프토산을 사용하는 대신 상기 단계 2에서 제조된 화합물(12.821 ㎎, 0.017 mmol) 및 아세트산(1.14 ㎎, 0.019 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 노란색 오일의 목적 화합물 0.040 g(20 %)을 얻었다.Compound (12.821 mg, prepared in Step 2 instead of using N-((t-butyloxy) carbonyl) -N'-benzyliminodiacetic acid monoamide and 2-naphthoic acid in Step 3 of Preparation Example 1, 0.017 mmol) and acetic acid (1.14 mg, 0.019 mmol) were used in the same manner to obtain 0.040 g (20%) of the title compound as a yellow oil.

¹H-NMR(Acetone-d⁶, 400MHz) δ 7.2-7.9(14H, m), 4.45(1H, s), 4.4(2H, d), 4.1-4.15(2H, d), 3.4-3.6(4H, m), 2.4(4H, m), 2.0(3H, s) ¹ H-NMR (Acetone-d ⁶ , 400 MHz) δ 7.2-7.9 (14H, m), 4.45 (1H, s), 4.4 (2H, d), 4.1-4.15 (2H, d), 3.4-3.6 (4H , m), 2.4 (4H, m), 2.0 (3H, s)

FABMS m/z 679.92
FABMS m / z 679.92

본 발명에 따른 화합물들이 P-gp 활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 P-gp가 과다 발현되어 여러 항암제에 대한 내성을 가진 인체 유방암 세포(MCF-7/ADR)에서 세포독성, 항암제 축적 및 배출 실험을 논문에 개시된 방법에 따라 수행하였다(Skehan et al., J. Natl .. Cancer . Inst., 82, 1107-1112, 1990; Critch field et al., Biochem . Pharmacol ., 48, 1437-1445, 1994; Harker et al., Cancer Res ., 45, 4091-4096, 1985; Yeh et al., Cancer Res ., 52, 6692-6695, 1992; Zhang et al., J. Pharmacol . Exp . Ther ., 304, 1258-1267, 2004; Chung et al ., Phytother Res , 21, 565-569, 2007; Chung et al ., Phytother Res , 23, 472-476, 2009).
Cytotoxicity, Anticancer Accumulation and Exhaustion in Human Breast Cancer Cells (MCF-7 / ADR) Overexpressed with P-gp to Resist Various Anticancer Drugs in order to Investigate the Effect of the Compounds According to the Invention on P-gp Activity Was performed according to the methods disclosed in the paper (Skehan et al., J. Natl .. Cancer . Inst ., 82 , 1107-1112, 1990; Critch field et al., Biochem . Pharmacol ., 48 , 1437-1445, 1994; Harker et al., Cancer Res . , &Lt; / RTI &gt; 45 , 4091-4096, 1985; Yeh et al., Cancer Res . , &Lt; / RTI &gt; 52 , 6692-6695,1992; Zhang et al., J. Pharmacol . Exp . Ther ., 304 , 1258-1267, 2004; Chung et al ., Phytother Res. , 21 , 565-569, 2007; Chung et al ., Phytother Res , 23 , 472-476, 2009).

<< 실시예Example 1> 세포 독성 측정 1> Cytotoxicity Measurement

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 항암제에 대한 내성을 가진 인체 유방암 세포(MCF-7/ADR)에서 세포독성을 알아보기 위해 하기 실험을 수행하였다.
The following experiment was carried out to determine the cytotoxicity of human breast cancer cells (MCF-7 / ADR) resistant to the anticancer agent of the compound of Formula 1 according to the present invention.

(1) 시약 및 기기(1) reagents and instruments

세포 배양 배지인 RPMI 1640, 트립신-EDTA(0.25% 트립신-1mM EDTA) 및 항생제(Antibiotic-antimycotic) 시약은 인비트로겐(Invitrogen)(Calsbad, USA)사로부터 구입하여 사용하였고, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 히클론(Hyclone)(South Logan, USA)사로부터 구입하였다. 도노마이신(daunomycin; DNM), 베라파밀(verapamil), DMSO, 설포로다민(sulforhodamine B; SRB), 탄산수소나트륨, L-글루타민, 트리클로로아세트 산(trichloroacetic acid; TCA), NaCl, KCl, MgCl₂는 시그마(Sigma-AldricH, St. Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다. CaCl₂과 인산은 쇼와화학(Showa chemical, Tokyo, Japan)사, 아세트산(Acetic acid)는 대정(Daejung, Siheung, Korea)사에서 구입하였다. HEPES(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 트리톤(Triton) X-100 및 트리스 염기(Tris base)는 USB(Cleveland, USA)사에서 구입하였고, 마이크로신트(Microscint TM40, scintillation cocktail)는 패커드(Packard Instrument Co. Inc., Meriden, USA)사에서 구입하였으며, [³H]-DNM(1-5 Ci/mmol)은 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer Inc., Wellesley, USA)사로부터 구입하였다. RPMI 1640, trypsin-EDTA (0.25% trypsin-1mM EDTA) and antibiotic-antimycotic reagents were purchased from Invitrogen (Calsbad, USA), and fetal bovine serum serum, FBS) was purchased from Hyclone (South Logan, USA). Donomycin (DNM), verapamil, DMSO, sulforhodamine B (SRB), sodium bicarbonate, L-glutamine, trichloroacetic acid (TCA), NaCl, KCl, MgCl ₂ Was purchased from Sigma-AldricH, St. Louis, USA. CaCl ₂ and phosphoric acid were purchased from Showa chemical, Tokyo, Japan, and acetic acid was purchased from Daejung, Siheung, Korea. HEPES (N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), Triton X-100 and Tris base were purchased from USB (Cleveland, USA), Microscint TM40, scintillation cocktail was purchased from Packard Instrument Co. Inc., Meriden, USA, and [ ³ H] -DNM (1-5 Ci / mmol) was Perkin-Elmer Inc., Wellesley. , USA).

세포실험을 위해 사용한 6 웰 플레이트(well plate) 및 96 웰 플레이트는 BD 바이오사이언스(Biosciences, Bedford, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 기기로는 세포배양기(3158, Forma Scientific Inc., Marietta, USA), 방사성 측정기(Topcount NXT, Packard Instrument Co. Inc., Meriden USA), 오비탈 진탕기(orbital shake, SLOS-20, SLB, Seoul, Korea), 역상 현미경(Inverted Microscope, Axiovert 200, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 및 ELISA 리더(Reader)(3550, Bio-Rad, Hercules, USA)를 사용하였다. Six well plates and 96 well plates used for cell experiments were purchased from BD Biosciences (Biosciences, Bedford, USA). Instruments include cell culture (3158, Forma Scientific Inc., Marietta, USA), radiometer (Topcount NXT, Packard Instrument Co. Inc., Meriden USA), orbital shake (SLOS-20, SLB, Seoul, Korea), Inverted Microscope, Axiovert 200, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany, and ELISA Reader (3550, Bio-Rad, Hercules, USA) were used.

(2) 세포 배양(2) Cell culture

다약제 내성을 가지는 인체 유방암 세포(P-gp 과다발현 세포)인 MCF-7/ADR 세포는 CO₂ 5% 및 공기 95%가 공급되는 37 ℃의 세포 배양기 안에서 FBS 10%, 10 mM HEPES, 24 mM 탄산수소나트륨, 2 mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
MCF-7 / ADR cells, which are multidrug resistant human breast cancer cells (P-gp overexpressing cells), were cultured in a 37 ° C cell incubator supplied with 5% CO ₂ and 95% air, supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, 24 mM sodium bicarbonate, 2 mM L-glutamine, and antibiotics.

(3) 실험(3) Experiment

MCF-7/ADR 세포를 각 웰 당 5,000 개정도 들어가도록 96 웰 플레이트에 넣은 후, 세포들이 플레이트에 부착할 수 있도록 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 1.0×10^-7M-1.0×10^-4M농도 범위의 도노마이신(daunomycin; DNM)과 100 μM 농도의 대표적인 P-gp 저해제인 베라파밀(verapamil; 양성대조군) 및 본 발명에 따른 유도체 화합물 시료들을 각 웰에 넣어주었다. 이때, 본 발명에 따른 화합물들 대신에 DMSO 용매만을 넣은 그룹을 대조군으로 사용하였다. 2시간이 지난 다음, 배양액(DNM±본 발명에 따른 화합물 또는 베라파밀)을 제거하고 세포들을 RPMI 1640으로 2번 세척한 후 새 배지를 첨가하였다. 3일 후, SRB 염색법 통해 세포 독성을 검토하였다. 그 방법을 간단히 서술하면 하기와 같다. MCF-7 / ADR cells were plated in 96-well plates to contain 5,000 cells per well, and then cultured at 37 ° C for 24 hours so that the cells could be attached to the plates. Verapamil (a positive control), a representative P-gp inhibitor at a concentration of 100 μM, and derivative compounds according to the present invention, in a concentration range of 1.0 × 10 ^-7 M-1.0 × 10 ^-4 M and daunomycin Were added to each well. At this time, instead of the compounds according to the present invention, a group containing only DMSO solvent was used as a control. After 2 hours, the culture (DNM ± compound or verapamil according to the present invention) was removed and the cells washed twice with RPMI 1640 and fresh medium added. Three days later, cytotoxicity was examined by SRB staining. The method is briefly described as follows.

세포들을 10% TCA로 1 시간 동안 고정시킨 후, 물로 4번 씻어주고 건조시켰다. SRB 시약(0.4% w/v in 1% acetic acid)를 각 웰에 넣고 1시간 후에 1% 초산으로 4번 씻어주었다. 플레이트를 건조시킨 다음 단백질에 결합된 색소를 10 mM 트리스 염기(Tris base)로 1시간 동안 용해시켜 530 nm에서의 흡광도를 측정한 후 IC₅₀값을 구하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. Cells were fixed with 10% TCA for 1 hour, washed 4 times with water and dried. SRB reagent (0.4% w / v in 1% acetic acid) was added to each well and washed 4 times with 1% acetic acid after 1 hour. After the plate was dried, the dye bound to the protein was dissolved in 10 mM Tris base for 1 hour to measure the absorbance at 530 nm, and then the IC ₅₀ value was obtained. The results are shown in Table 2 below.

이때, IC₅₀값은 어떠한 반응 A의 크기를 100%로 가정하였을 때, B라는 약물을 이용하여 반응 A의 크기를 50%로 감소시킬 수 있는 B의 농도를 의미한다.
In this case, the IC ₅₀ value means the concentration of B that can reduce the size of reaction A to 50% by using drug B, assuming that the size of any reaction A is 100%.

시 료 sample 도노마이신의 IC₅₀값(μM)IC ₅₀ value of Donomycin (μM) 화합물 1Compound 1 5.45.4 화합물 2Compound 2 2.22.2 화합물 3Compound 3 7.67.6 화합물 4Compound 4 11.511.5 화합물 5Compound 5 5.55.5 화합물 6Compound 6 2.72.7 무처리군Untreated group 31.731.7 약물 대조군Drug control 3.13.1

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물들은 도노마이신의 세포독성 IC₅₀값을 2.2 내지 11.5 μM로 감소시키고, 이는 무처리군(31.7 μM)에 비해 약 2.8배 내지 14배 우수한 것으로 확인되었고, 대표적인 P-gp 저해제로 알려진 베라파밀(3.1 μM)의 도노마이신 세포 독성 IC₅₀ 값을 감소시킴으로써, 세포독성을 증진시키는 효과와 대비하여 우수하거나, 동등한 정도로 확인되었다.As shown in Table 2, the compounds of formula 1 according to the present invention reduce the cytotoxic IC ₅₀ value of donomycin from 2.2 to 11.5 μM, which is about 2.8 to 14 times better than the untreated group (31.7 μM). Reduction of the doomycin cytotoxic IC ₅₀ value of verapamil (3.1 μM), known as a representative P-gp inhibitor, was confirmed to be superior or equivalent to the effect of enhancing cytotoxicity.

<< 실시예Example 2> 세포 내 [ 2> intracellular [ ³³ H]-H] - 도노마이신Donomycin 축적에 미치는 영향 Impact on Accumulation

상기 실시예 1에서 세포독성을 측정한 화합물 중, 100 μM 농도로 사용했을 때 MCF-7/ADR 세포 생존율에 전혀 영향을 미치지 않으면서도 P-gp 저해제로서 가능성이 있다고 판단되는 화합물 3과 화합물 6이 P-gp 활성에 미치는 영향에 관하여 연구하고자 하기 실험을 수행하였다.Of the compounds measured in cytotoxicity in Example 1, Compound 3 and Compound 6, when used at a concentration of 100 μM without any effect on MCF-7 / ADR cell viability, were considered to be potential P-gp inhibitors. The following experiment was conducted to study the effect on P-gp activity.

MCF-7/ADR 세포를 6 웰 플레이트에 150,000개/웰이 되도록 넣어준 후 72 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 각 웰에 100 μM 농도의 베라파밀, 화합물 3 또는 화합물 6을 0.05 μM 농도의 [³H]-DNM을 함유하는 흡수 완충액(uptake buffer)(137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2.8 mM CaCl₂,1.2mM MgCl₂,10mM HEPS, pH7.4) 1 ㎖ 넣어 2시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰의 흡수 완충액을 제거하고 빙냉 반응중지액(ice-cold stop solution)(137 mM NaCl, 14 mM Tris, pH 7.4)을 넣어 [³H]-DNM축적을 종결시킨 뒤, 용해 완충액(lysis buffer)(1 % Triton X-100) 1 ㎖을 각 웰에 넣고 150 rpm에서 1시간 동안 진탕한 후 100 ㎕를 취하여 방사성 측정기(LSC)로 방사능을 측정하였다. 대조군의 세포 내 축적 결과와 화합물 3 또는 화합물 6으로 세포를 처리한 후 얻어진 세포 내 축적 결과를 스튜던트 시험법(student's t-test)로 통계 처리하여 p값이 0.05 이하이면(p<0.05) 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.MCF-7 / ADR cells were plated on a 6-well plate at 150,000 cells / well and cultured for 72 hours. Each well was then treated with uptake buffer (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2.8 mM CaCl ₂ , containing 0.05 μM of Verapamil, Compound 3 or Compound 6 at 0.05 μM concentration of [ ³ H] -DNM). 1.2mM MgCl ₂ , 10mM HEPS, pH7.4) 1ml was incubated for 2 hours. Then remove the absorption buffer of each well, add ice-cold stop solution (137 mM NaCl, 14 mM Tris, pH 7.4) to terminate the [ ³ H] -DNM accumulation, and then lysis buffer ( 1 ml of lysis buffer) (1% Triton X-100) was added to each well, shaken at 150 rpm for 1 hour, and 100 µl was taken to measure radioactivity using a radioactive measuring device (LSC). The intracellular accumulation results of the control group and the intracellular accumulation results obtained after treating the cells with the compound 3 or the compound 6 were statistically processed by the student's t-test, and the p-value was 0.05 or less (p <0.05). It was determined that there was significance. The results are shown in Table 3 and Fig.

시 료 sample 세포내 축적된
도노마이신의 양(%)Intracellular accumulation
Amount of donomycin (%) 화합물 3Compound 3 252.9±26.8^* 252.9 ± 26.8 ^* 화합물 6Compound 6 380.8±31.5^* 380.8 ± 31.5 ^* 무처리군Untreated group 100 100 약물대조군Drug control 335.1±14.7^** 335.1 ± 14.7 ^**

표 3 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 세포 내 도노마이신의 양이 무처리군(100%)에 비해 각각 252.9±26.8% 및 380.8±31.5%로 약 2.6배 및 3.8배 우수한 것으로 확인되었고, 특히, 화합물 6은 약물 대조군으로 사용된 베라파밀보다도 더 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
As shown in Table 3 and FIG. 1, the compound according to the present invention is about 2.6 times and 3.8 times better in the amount of donomycin in the cells, 252.9 ± 26.8% and 380.8 ± 31.5%, respectively, compared to the untreated group (100%). In particular, compound 6 was found to have a better effect than verapamil used as a drug control.

<< 실시예Example 3> 세포로부터의 [ 3> from cells [ ³³ H]-H] - 도노마이신Donomycin 배출에 On exhaust 미치는 영향Impact

본 발명에 따른 화합물 3 또는 화합물 6이 인체 유방암 세포 내 도노마이신(DNM)의 축적을 증가시킨 것이 세포 내로 유입된 DNM의 배출을 억제했기 때문인지를 재확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.The following experiment was conducted to reconfirm whether compound 3 or compound 6 according to the present invention increased the accumulation of donomycin (DNM) in human breast cancer cells because it inhibited the excretion of DNM introduced into cells.

MCF-7/ADR 세포를 6 웰 플레이트에 150,000개/웰이 되도록 넣어준 후 72 시간 동안 배양한 다음 0.05 μM 농도의 [³H]-DNM을 함유하는 흡수 완충액 1 ㎖을 각 웰에 넣어 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하여 세포 내로 DNM을 축적시켰다. 그 다음, [³H]-DNM을 함유하는 흡수 완충액을 제거하고 세포들을 씻은 후 각 웰에 100 μM 농도의 베라파밀, 상기 화합물 3 또는 화합물 6을 함유하는 흡수 완충액을 넣어 1시간 동안 배양하였다. 반면, 대조군에는 이들 물질을 함유하지 않는 약물 비함유(drug-free) 흡수 완충액을 넣어주었다. 1시간 후에 빙냉 반응 정지액(ice-cold stop solution)으로 세포들을 두 번 씻어준 다음 용해 완충액(lysis buffer) 1 ㎖을 각 웰에 넣고 150 rpm에서 1시간 동안 진탕한 후, 100 ㎕를 취하여 방사성 측정기(LSC)로 방사능(radioactivity)을 측정하였다. 이때 측정된 값은 세포 내 남아있는 DNM양이므로 1시간 동안 0.05 μM 농도의 [³H]-DNM으로 세포들을 배양한 직후 세포 내 유입된 DNM양(total amount)에서 화합물 3 또는 화합물 6으로 1시간 동안 세포들을 배양한 후 세포 내에 남아있는 양(remaining amount)의 차이로부터 1시간 동안 세포로부터 배출된 [³H]-DNM양을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다.
MCF-7 / ADR cells were placed in 6 well plates at 150,000 / well, followed by incubation for 72 hours, followed by 1 ml of absorption buffer containing 0.05 [mu] M of [ ³ H] -DNM in each well. Incubated for 1 hour at to accumulate DNM into cells. Then, the absorption buffer containing [ ³ H] -DNM was removed, and the cells were washed. Then, 100 μM of Verapamil, the compound 3 or Compound 6 containing the absorption buffer was added thereto, and the cells were incubated for 1 hour. On the other hand, a control-free drug-free absorption buffer solution containing no such substances was added. After 1 hour, the cells were washed twice with ice-cold stop solution, 1 ml of lysis buffer was added to each well, shaken at 150 rpm for 1 hour, and 100 µl was taken for radioactivity. Radioactivity was measured by a measuring instrument (LSC). Since the measured value is the amount of DNM remaining in the cell, the cells were incubated with 0.05 μM concentration of [ ³ H] -DNM for 1 hour immediately after incubating the cells with Compound 3 or Compound 6 for 1 hour. The amount of [ ³ H] -DNM released from the cells for 1 hour was calculated from the difference in the remaining amount in the cells after the cells were cultured. The results are shown in Table 4 and FIG.

시 료

sample
세포로부터 배출된
도노마이신의 양(%)Discharged from the cell
Amount of donomycin (%) 화합물 3 Compound 3 49.1±1.36^* 49.1 ± 1.36 ^* 화합물 6Compound 6 40.2±4.92^* 40.2 ± 4.92 ^* 무처리군Untreated group 63.0±3.3163.0 ± 3.31 약물대조군Drug control 48.0±1.09^* 48.0 ± 1.09 ^*

표 4 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 세포 외로 배출된 도노마이신의 양이 무처리군(63.0%)에 비해 각각 49.1±1.36% 및 40.2±4.92%로 약 1.2배 및 1.5배 우수한 것으로 확인되었고, 이는 약물 대조군으로 사용된 베라파밀과 동등 유사하거나 더 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
As shown in Table 4 and Figure 2, the compound according to the present invention is about 1.2-fold and 1.5 times the amount of donomycin released extracellularly 49.1 ± 1.36% and 40.2 ± 4.92%, respectively, compared to the untreated group (63.0%) It was found to be fold superior, which was found to have a similar or better effect than verapamil used as a drug control.

따라서, 본 발명에 따른 화합물들은 약물의 세포독성을 증진시키는 효과가 우수하고, P-당단백질(P-gp)활성을 저해하여 세포 밖으로의 항암제의 배출을 억제함으로써 암세포 내로의 항암제의 축적을 증가시켜 본 발명의 화합물들은 항암제의 다약제 내성 억제용 약학적 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용 투여함으로써, 암의 성장을 억제하므로 항암제 보조용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the compounds according to the present invention have an excellent effect of enhancing the cytotoxicity of the drug, and inhibit P-glycoprotein (P-gp) activity to inhibit the release of anti-cancer drugs out of the cell, thereby increasing the accumulation of anticancer drugs into cancer cells. In addition, the compounds of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for inhibiting the multi-drug resistance of an anticancer agent, and the compound according to the present invention can be used in combination with an anticancer agent to inhibit the growth of cancer. Can be used.

한편, 본 발명에 따른 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
Meanwhile, the compound according to the present invention can be formulated into various forms depending on the purpose. The following are illustrative of some formulations containing the compound according to the present invention as an active ingredient, but the present invention is not limited thereto.

<< 제제예Formulation example 1> 약제의 제조 1> Manufacture of Pharmaceuticals

1. 산제의 제조1. Manufacturing of powder

피페라진 화합물 500 ngPiperazine Compound 500 ng

유당 1 gLactose 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
The above components were mixed and packed in airtight bags to prepare powders.

2. 정제의 제조 2. Preparation of tablets

피페라진 화합물 500 ngPiperazine Compound 500 ng

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유당 100 ㎎Lactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.

3. 캡슐제의 제조3. Preparation of Capsule

피페라진 화합물 500 ngPiperazine Compound 500 ng

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유당 100 ㎎Lactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.

4. 주사제의 제조4. Preparation of injections

피페라진 화합물 500 ngPiperazine Compound 500 ng

만니톨 180 ㎎Mannitol 180 mg

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ O 26 mg

증류수 2974 ㎎Distilled water 2974 mg

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.According to a conventional method for preparing an injection, an injection was prepared by containing the above components in the contents shown.

Claims (9)

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제에 대한 다약제 내성 억제용 약학적 조성물에 있어서,
상기 다약제 내성은 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 및 미토마이신 C(mitomycin C)로 이루어지는 군에서 선택되는 항암제에 대한 내성인 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 다약제 내성 억제용 약학적 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R¹은 벤질, p-메톡시벤질, t-부틸이소옥사졸릴, 클로로페닐티아졸릴 또는 브로모페닐티아졸릴이고;
R²는 메틸, 페닐, 벤질 또는 나프탈레닐이다).
In the pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance to an anticancer agent containing a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient,
The multi-drug resistance is cyclophosphamide, 5-FU, amsacrine, donomycin, daunomycin, vinblastine, vincristine, navelbine, paclitaxel ( paclitaxel, taxotere, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, epirubicin, idarubicin, etoposide, teniposide, colchicine (colchicine), mitoxantrone, dactinomycin, topotecan, trimetrexate, mitramycin and mitomycin C Pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance to an anticancer agent, characterized in that it is resistant to the anticancer agent:
[Chemical Formula 1]

(In the formula 1,
R ¹ is benzyl, p-methoxybenzyl, t-butylisooxazolyl, chlorophenylthiazolyl or bromophenylthiazolyl;
R ² is methyl, phenyl, benzyl or naphthalenyl).
삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은,
(1) N-(2-(벤질아미노)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-2-나프타아미드 ;
(2) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-메톡시벤질아미노)-2-옥사에틸)벤즈아미드;
(3) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일아미노)-2-옥사에틸)-2-페닐아세트아미드;
(4) N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일아미노)-2-옥사에틸)-2-나프타아미드;
(5) N-(2-(5-tert-부틸아소옥사졸-3-일아미노)-2-옥사에틸)-N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)벤즈아미드; 및
(6) N-(4-(4-브로모페닐)티아졸-2-일)-2-(N-(2-(4-((4-클로로페닐)(페닐)메틸)피페라진-1-일)-2-옥사에틸)아세트아미도)아세트아미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 다약제 내성 억제용 약학적 조성물.
According to claim 1, wherein the compound represented by Formula 1,
(1) N- (2- (benzylamino) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxa Ethyl) -2-naphthaamide;
(2) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-methoxybenzylamino) -2-oxaethyl) benzamide;
(3) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-chlorophenyl ) Thiazol-2-ylamino) -2-oxaethyl) -2-phenylacetamide;
(4) N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) -N- (2- (4- (4-chlorophenyl ) Thiazol-2-ylamino) -2-oxaethyl) -2-naphthaamide;
(5) N- (2- (5-tert-butylisoxazol-3-ylamino) -2-oxaethyl) -N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) Piperazin-1-yl) -2-oxaethyl) benzamide; And
(6) N- (4- (4-bromophenyl) thiazol-2-yl) -2- (N- (2- (4-((4-chlorophenyl) (phenyl) methyl) piperazin-1 -Yl) -2-oxaethyl) acetamido) acetamide. A pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance to an anticancer agent, wherein the composition is selected from the group consisting of:
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다약제 내성을 유발하는 P-당단백질의 과발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 다약제 내성 억제용 약학적 조성물.
According to claim 1, wherein the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for inhibiting multi-drug resistance to anticancer drugs, characterized in that to suppress the over-expression of P-glycoprotein that causes multi-drug resistance.
삭제delete 삭제delete 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 나벨빈(navelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 탁소테르(taxotere), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin) 및 미토마이신 C(mitomycin C)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 항암제와 병용투여 하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 피페라진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 보조용 약학적 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R¹ 및 R²는 제1항에서 정의한 바와 같다).Cyclophosphamide, 5-FU, amsacrine, donomycin, vinblastine, vincristine, navelbine, paclitaxel, taxotere (taxotere), doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, epirubicin, idarubicin, etoposide, teniposide, colchicine, US At least one anticancer agent selected from the group consisting of mitoxantrone, dactinomycin, topotecan, topmetcan, trimetrexate, mitramycin and mitomycin C A pharmaceutical composition for adjuvant anticancer agent comprising a piperazine derivative represented by the following Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, which is administered in combination with:
[Chemical Formula 1]

(In Formula 1, R ¹ and R ² are as defined in claim 1). 삭제delete

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