KR101368736B1 - 척수 외상, 염증, 및 면역 질환: 치료제의 국소적 제어 방출 - Google Patents

척수 외상, 염증, 및 면역 질환: 치료제의 국소적 제어 방출 Download PDF

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Abstract

산화 스트레스의 치료를 위한 약물 운반 시스템이 제공된다. 상기 약물 운반 시스템은 치료제 및 매트릭스를 포함할 수 있다. 상기 치료제는 항산화제 또는 스테로이드를 포함할 수 있다. 상기 매트릭스는 하이드로겔, 파티클, 마이크로파티클 또는 나노파티클을 포함할 수 있다. 말초 신경 손상 또는 척수 손상을 포함하는 외상 치료 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 상기 약물 운반 시스템을 외상 부위에 주입하는 것을 포함한다.

Description

척수 외상, 염증, 및 면역 질환: 치료제의 국소적 제어 방출{SPINAL CORD INJURY, INFLAMMATION, AND IMMUNE-DISEASE: LOCAL CONTROLLED RELEASE OF THERAPEUTIC AGENTS}
본 발명은 외상부에 운반되는 치료제에 관한 것이다.
산화 질소(NO)는 인체에 걸친 다양한 생리학적 프로세스와 관련된 가스성 화학 메신저이다. 이는 중추신경계(CNS)에서 최고 농도로 발견된다. NO 합성은 효소 NO 신타아제(NOS)에 의해 촉진된다(Conti, A., Miscusi., Cardali, S., Germano, A., Suzuki, H., Cuzzocrea, S., and Tomasello, F.(2007) Nitric oxide in the injured spinal cord: Synthases cross-talk, oxidative stress and inflammation. Brain Research Reviews 54, 205-218). CNS에 NOS의 4가지 이소폼이 존재한다. 둘은 구성적으로 발현된다: 신경(nNOS) 및 내피(eNOS) 이소폼. 기능적으로 활성적인 이소폼은 미토콘드리아(mtNOS)에서 발견되며, 그리고 4번재 이소폼은 병적 상태하에서 유도가능하다(iNOS).
정상적인 컨디션하에서, nNOS는 뉴런, 혈관주위 신경에 국한되고, 성상세포에 매우 저수준으로 국한된다. eNOS는 뇌혈관 내피에서 발견될 수 있다. iNOS는 성상세포, 마이크로글리아, 혈관 평활근 및 내피세포에서 발현된다.
그러나, 정상적인 기능에 이의 역할에 부가적으로 NO는 독성 영향을 미칠 수 있다. NO는 페록시니트라이트 음이온을 형성하는 과산화물 음이온 라디칼(O2 ·-)에 대한 과산화물 디스무타아제를 더 잘 수행할 수 있다. 페록시니트라이트 자체가 독성적일 수 있다. 또한, 생리학적 컨디션하에서, 페록시니트라이트는 히드록실 라디칼, 카보네이트 라디칼 및 이산화질소로 분해되며, 이들은 모두 세포에 독성적인 산화 스트레스를 준다.
페록시니트라이드 및 이의 분해 산물에 기인한 산화 스트레스는 척수 외상(SCI), 뇌졸증, 심근 경색, 만성 심부전, 당뇨, 혈액순환 쇼크, 만성 염증 질환, 암 및 신경퇴행성 질환을 포함하는 과잉의 질병 및 외상 상태에 연루된다.
신경 외상 후, nNOS는 단기간동안(1시간) 상향 조절된다. 이는 허혈성 손상에 기여함을 보여주는 증거이다. 한편, eNOS 생성 NO는 혈관확장을 촉진하고 미세혈관 응집 및 유착을 저해함으로써 신경보호 역할을 할 수 있다. 이는 이러한 정황에서 NO가 국소 빈혈도중에 생성된 반응성 산소종(ROS)를 스캐벤징하는 보호 기능을 가질 수 있다는 가설을 제기한다. 그러나, nNOS의 초기 상향 조절 후, NO의 구성적 수준이하로의 하향 조절은 산화 스트레스 및 iNOS의 과유도에 기여할 수 있다.
iNOS는 염증, 면역 반응 및 트라우마와 같은 병적 컨디션하에서 사실상 거의 모든 세포 타입에서 발현된다. 유도는 염증 사이토카인을 필요로 하며, 이는 전사 인자 STAT-1 및 (NF)-κB의 활성화를 일으킨다. iNOS가 발현되면, 이는 시공간적으로 고농축된 NO를 생성한다. NO가 식작용 프로세스에서 중요하나, 과당 NO는 비조절 방식으로 방출될 경우 만성 염증, 자가면역 질병 및 트라우마에서 관찰되는 바와 같이 조직에 손상을 야기할 수 있다.
SCI에서, iNOS mRNA는 손상된 조직에서 외상 후 2시간만에 발현되며, 이는 수일간 지속된다. 염증 세포는 외상 후 3시간 전에 조직을 침입하지 않는다. 따라서, SCI 후 초기 iNOS 발현은 상주하는 척수 세포, 특히 마이크로글리아에만 기인하는 경향이 있다. 이 시점 후에 iNOS 발현은 침투된 염증 세포에 주로 기인한다. 호중구는 외상 후 1시간에 척수에서 검출될 수 있으나, 주로 혈관내에서 검출된다. 관외 유출은 외상 후 3-4시간에 일어난다. 호중구 퍼짐은 외상 후 1-3일에 최대에 이르며, 최고 10일까지 상승한다. 호중구는 케모카인, 사이토카인, 효소들, ROS 및 반응성 질소 라디칼을 포함하는 다수의 물질을 방출한다.
NO는 CNS에서 허혈성 및 정신적 외상 후 신경독성에 연구된다(Xiong, Y, Rabchevsky, A.G. and Hall, E.D.(2007) Role of peroxynitrite in secondary oxidative damage after spinal cord injury. J. Neurochem. 100 (1). 639-649).자유 라디칼로서 NO는 단백질 니트로실화를 일으킬 수 있다. 이는 산화적 인산화를 약화시키며 다수의 메카니즘을 통해 글리코실화를 저해할 수 있어, 이에 따라 에너지 고갈, 산소 스타베이션 및 신경세포사를 일으킨다. NO는 돌연변이 유발성 DNA 디아미드화를 촉진하고 인지질 과산화를 야기할 수 있으며, 이는 세포막의 구조 및 기능적 보전성에 손상을 주며 세포사를 일으킨다.
SCI 후, 외상 후 적어도 1주일간 지속적인 상승된 수준의 페록시니트라이트 형성이 연구결과 나타났으며, 이는 단백질 산화 및 지질 과산화에 부합하는 것이다. 참조 Deng, Y., Thompson, B.M., Gao, X. and Hall, E.D. (2007) Temporal relationship of peroxynitrite-induced oxidative damage, calpain-mediated cytoskeletal degradation and neurodegeneration after traumatic brain injury. Exp. Neurol. 205. 154-165. 또 다른 연구는 페니실라민, 템폴(Hillard, V.H., Peng, H., Zhang, Y., Das, K., Murali, R and Etlinger, J.D. (2004) Tempol, a nitroxide antioxidant, improves locomotor and histological outcomes after spinal cord contusion in rats, J Neurotrauma 21(10). 1405-1414("Hillard et al.")), 및 요산(Scott, G.S., Cuzzocrea, S., Genovese, T., Koprowski, H., and Hooper, D. C. (2005) Uric acid protects against secondary damage after spinal cord injury. Proc. Natl. Acad. Sci. 102(9), 3483-3488("Scott et al."))을 포함하는 2차 외상 완화시 다수의 제제들의 효과를 나타내었다. 또한, 임상적으로 투여된 글루코코르티코이드 스테로이드의 신경보호 효과는 리셉터 매개 항염증보다는 대부분 지질 과산화의 저해에 기인한다는 연구가 제시되었다(Hall, E.D. and Springer, J.E.(2004) Neuroprotection and Acute Spinal Cord Injury: A Reappraisal. NeuroRx. 1, 80-100).
1990년대에, 고 투여량의 메틸프레드니솔론은 급성 SCI에 대한 주의기준으로 채택되었다. 그러나, 급성 SCI에 대한 스테로이드의 투여는 주로 해로운 부작용(예, 감염, 폐렴, 폐혈성 쇼크, 당뇨 합병증, 및 지연된 창상치유) 및 복용량 곤란성(예, 초기 시점에 따라 달라지는 요구 치료 기간에 걸친 예리한 2상성 투여-반응 곡선 및 변화)의 위험에 기인하여 논란이 되고 있다. 메틸프레드니솔론은 국소 투여되어왔다. 참조 Chvatal, S. A., Kim, Y.-T., Bratt-Leal, A. M., Lee, H., and Bellamkonda, R.V.(2008) Spatial distrubution and anti-inflammatory effects of Methylaprednisolone after sustained local delivery to the contused spinal cord. Biomaterials, 1-9. The administration in Chvatal et al. required surgical esposure of the spinal cord through laminectomy. 또한, 운반 매체, 온 아가로즈가 그 기간외에 적용되었다.
SCI 후 척수세포 및 외상 후 말초 신경에 대한 산화적 스트레스는 생리학적 조건하에서 NO 및 ROS 형성 페록시니트라이트 및 페록시니트라이트 반응성 분해 산물에 기인하는 것으로 여겨질 수 있다. 페록시니트라이트에 기인한 산화적 스트레스로부터 발생한 괴저성 프로세스 또는 세포사멸 캐스캐이드는 척수 외상 후 또는 주변 신경에 대한 외상 후의 병변 확장의 특성이다.
본 발명은 외상부위 또는 염증부위에서 산화 스트레스의 치료를 위한 약물 운반 시스템을 제공하는 것이다.
일 견지로, 본 발명은 환자에서 외상부위에 외상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 매트릭스 및 하나 이상의 치료제를 갖는 약물 운반 시스템을 외상부위에 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 견지로, 본 발명은 매트릭스 및 하나 이상의 치료제를 갖는 약물 운반 시스템에 관한 것이다.
하기 본 발명의 바람직한 구현의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하면 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하는 목적으로 바람직한 구현을 도면으로 나타내었다. 그러나, 이와 같이 나타낸 정확한 배열 및 수단으로 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
도면에서:
도 1은 PEG-400(Fluka)에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다
도 2는 PLGA 50:50 Lactel에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 연쇄 전달제 CP-PLGA-pPEG-PLGA-RAFT-funct를 검출하는데 사용된 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 S-(티오벤조질) 티오글리콜릭산 클로라이드 DJS-CP-티오벤조일-티오글리콜릭산 클로라이드-1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 CP-PLGA-PEG-PLGA-CTA-Cl-rxn-1에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 S-티오벤조일-티오글리콜릭산 연쇄 전달제로 기능화된 CP-PGS-CTA 폴리(글리세롤-코-세바신산)에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 50μL 하이드로겔내에 5mg 마이크로파티클을 함유한 하이드로겔-마이크로파티클로부터의 치료제 방출 곡선을 나타낸 것이다.
청구범위 및 명세서에 사용된 용어 "하나(a 및 one)"는 달리 언급하지 않는 한 관련 아이템의 하나 이상을 포함하는 것으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 "매트릭스"는 하이드로겔, 파티클, 나노파티클, 마이크로파티클 또는 이의 조합물을 칭한다.
본 명세서에 사용된 "치료제" 및 "약물"은 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 "외상"은 이에 한정하는 것은 아니나 트라우마, 질병, 면역 질환 또는 염증을 포함하는 어느 수단에 의해 야기된 외상을 칭한다.
본 명세서에 사용된 "환자"는 척삭동물문내의 인간 또는 비인간 동물을 칭한다.
본 명세서에 사용된 "약학적으로 허용되는 염" 또는 "약학적으로 허용되는 염들"은 환자에 사용하기에 안전하고 효과적이며 원하는 생물학적 활성을 갖는 화합물의 염을 의미한다. 약학적으로 허용되는 염은 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 산 첨가염은 이에 한정하는 것은 아니나, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오드, 니트레이트, 설페이트, 비설페이트, 포스페이트, 액시드 포스페이트, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 소디움 숙시네이트, 말레이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염기성 염은 이에 한정하는 것은 아니나, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소디움, 아연 및 디에탄올아민 염을 포함한다.
본 명세서에 나타낸 구현들은 외상부위 또는 염증부위에서 치료제의 국소 투여를 통해 정신적외상 후 2차 외상을 조절하는 전략을 제공한다. 원하지 않는 부작용을 수반하는 약물(예, 글루코코르티코이달 스테로이드)의 전신성 투여에 기인하여, 2차 외상을 완화하기 위한 항염 약물(예, 미노시클린 또는 메틸프레드니솔론) 또는 자유 라디칼 스캐벤저(예, 요산 또는 템폴)을 포함하는 치료제의 국소 투여가 중요할 수 있다. 치료제의 국소 투여에 작용하도록, 외상후 신경 손상에 중요한 약물 운반 시스템 표적 프로세스가 제공된다. 표적 프로세스는 외상에 의해 야기된 손상으로부터 생긴 산화 스트레스를 포함한다. 약물 운반 시스템의 구현은 SCI 후 척수의 치료용으로 맞추어질 수 있다. 그러나, 약물 운반 시스템의 구현은 외상 또는 염증의 어느 부위에 사용될 수 있다. 약물 운반 시스템을 이용한 치료법은 세포내 리전, 세포외 리전, 혈관내 리전 및/또는 세포막에 대한 것일 수 있다. 약물 운반 시스템 및 방법의 구현은 염증의 유래한 영향을 해소할 수 있으며, 이러한 구현은 만성 염증, 자가면역 질환, 척수 외상(SCI), 뇌졸증, 심근경색, 만성 심부전, 당뇨, 혈액순환 쇼크, 만성 염증 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 정신적외상 뇌손상, 주변 말초신경의 절단, 신경 루트 충돌 및 기타 질환 또는 정신적외상 손상의 치료에 사용될 수 있다. 상기 약물 운반 시스템은 매트릭스 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 장치이다. 치료방법은 상기 약물 운반 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
상기 약물 운반 시스템은 이에 한정하는 것은 아니나 하기의 매트릭스와 치료제의 조합물을 포함할 수 있다: 1) 하이드로겔 + 치료제; 2) 하이드로겔 + 다중 치료제의 조합물; 3) 파티클과 치료제; 4) 파티클 + 다중 치료제; 5) 하이드로겔 + 파티클 + 치료제(여기서 치료제는 하이드로겔, 파티클 또는 이들 두 가지 모두에 위치함); 6) 하이드로겔 + 파티클 + 다중 치료제(여기서 치료제는 하이드로겔, 하이드로겔내의 파티클(아마도 별도의 파티클 세트), 또는 이들 두 가지 모두에 국소화됨); 및 7) 하이드로겔 + 파티클 + 다중 치료제(여기서 특정 치료제는 하이드로겔, 하이드로겔내의 파티클(아미도 별도의 파티클 세트), 또는 이들 두 가지 모두에 국소화됨). 상기 파티클은 마이크로파티클 또는 나노파티클일 수 있다. 치료제 또는 치료제들은 확산 및/또는 용해를 통한 조절 방출 역학을 위해 하이드로겔, 파티클 또는 하이드로겔 및 파티클에 용해되거나 분산될 수 있다. 바람직하게, 상기 매트릭스는 주입가능하며, 상기 약물 운반 시스템은 주입을 통해 손상부위의 한 위치에 운반될 수 있다. 그러나, 상기 약물 운반 시스템은 다른 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나 약물 운반 장치의 외과적 이식을 포함한다.
상기 하이드로겔은 온도반응성 생분해 조성물일 수 있다. 여기서 사용된 "온도반응성"은 하이드로겔이 환자 체온 이하의 온도와 환자 체온 사이에 졸-겔 전이를 나타내거나, 또는 폴리머의 혼합물이 환자 체온에 보다 가까운 온도에서 이보다 낮은 온도에서보다 쉽게 하이드로겔을 형성하도록 반응하는 것을 의미한다. 바람직하게, 환자는 인간이며, 체온은 37℃이며, 보다 낮은 온도는 실온(예, 22℃)일 수 있다. 온도반응성 하이드로겔은 환자의 체온, 바람직하게 37℃에 보다 가까운 임계 온도를 가질 수 있다.
약물 운반 시스템에서 생분해, 온도반응성 하이드로겔은 다중블록 코폴리머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 폴리머 블록은 생분해성, 생체적합성, 또는 생분해성이며 생체적합성일 수 있다. 폴리머 블록의 일부가 생분해성이고 나머지가 생체적합성일 수 있다. 바람직하게, 예를 들어, 폴리머, 모노머 또는 분해산물과 같은 하이드로겔 성분은 생분해성이고; 생체적합성이며; 또는 생체적합성이며 배설가능한 것이다. 상기 하이드로겔은 몸에 의해 배출될 수 있는 생체적합성 폴리머 블록을 포함할 수 있다.
모노머 블록들간의 에스테르 연결은 가수분해가능하며 생체내에서 분해되어 폴리머 모노머 블록을 방출할 수 있다. 에스테르 결합을 함유하는 폴리머는 생분해성이다. 아미드, 안하이드라이드 및 에테르 결합은 또한 가수분해성일 수 있다. 이러한 결합 및 효소작용, 환원조건(예, 티오에스테르, 티오에테르, 이황화 결합) 또는 환자내에 존재하는 조건에 의해 분해가능한 다른 결합이 하이드로겔 또는 파티클에 대해 예측되는 폴리머에 또한 사용될 수 있다. 상기 하이드로겔은 에테르 결합을 갖는 에틸렌 글리콜, 올리고에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 폴리머 블록을 포함할 수 있으며, 이들은 생분해가능하며 배설가능하다. 글리콜릭산, 락틱산, 글리세롤, 및 세바신산의 폴리머가 생분해 하이드로겔이며 이러한 폴리머를 포함할 수 있다. 락타이드, 글리콜라이드, 폴리(글리세롤-코-세바신산)폴리머가 생분해성이며, 하나 이상의 이러한 폴리머가 하이드로겔에 포함될 수 있다. 하이드로겔의 일부로서 고려되는 폴리머는 이에 한정하는 것은 아니나, 폴리(글리세롤-코-세바신산)아크릴레이트; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 메타크릴레이트의 다중블록 코폴리머; 및 폴리(글리세롤-코-세바신산) 및 폴리(에틸렌 글리콜), 올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 메타크릴레이트 또는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트, 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트의 그라프트 코폴리머를 포함한다. 이러한 폴리머들이 온도반응성이다.
하이드로겔은 변화하는 물리적 조건하에서 팽창하거나 줄어들 수 있으며, 이는 생리적으로 중요하다. 예를 들어, 온도, pH 또는 이온 강도의 변화는 하이드로겔을 팽창시키거나 줄어들게 할 수 있다. 바람직하게, 척수 또는 다른 손상 부위내로 주입된 하이드로겔은 손상 부우내 컨디션에 평형화될 경우 현저히 팽창하지 않는다. 그러나, 팽창성 하이드로겔이 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있다.
이에 한정하는 것은 아니나, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 비닐, 디하이드라지드 또는 티올기를 포함하는 반응성 말단을 갖는 에틸렌 글리콜 모노머 유니트를 함유하는 친수성 폴리머가 하이드로겔 또는 파티클에 폴리머로서 사용될 수 있다. 아크릴로클로라이드, 메타크릴로클로라이드, 비닐 클로라이드가 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 말단기를 형성하는데 사용될 수 있다. 티올 말단기는 메르캅토프로피온산, 시스테인 및 시스타민에 의해 제공될 수 있다. 고리-열림-중합 및 리빙 라디칼 중합과 같은 다중 합성 방법이 매트릭스용 폴리머를 생성하는데 이용될 수 있다. 상기 하이드로겔은 공유결합 또는 물리적 가교 네트워크로 구성될 수 있다. 물리적 가교는 소수성 블록의 응집을 가리킨다.
아크릴레이트, 메타크릴레이트, 비닐, 디하이드라지드 또는 티올 기능화 화합물을 갖는 폴리머들은 호환적 반응성 말단기를 갖는 다른 폴리머와 반응가능하여 하이드로겔을 형성한다. 아크릴레이트, 메타크릴레이트 및 비닐 반응성 말단 기는 서로서로 그리고 티올과 모두 호환적이다. 티올 및 아크릴레이트 기능화 폴리머 또는 폴리머 블록은 마일드 컨디션(열 또는 빛)하에서 티올-에테르를 형성하도록 반응할 수 있다. 따라서, 티올 및 아크릴레이트 기능화 수용해성 폴리머가 상기 약물 운반 시스템에서 하이드로겔에 대한 적절한 후보이다. 일부 하이드로겔은 겔화 후 평형화될 경우 팽창하거나 줄어들 수 있으며, 이는 불완전한 전환에 기인하거나 생리적 조건(예, 온도, pH, 이온강도)하에서 겔내 후속적인 평형 농도와 비교하여 충분히 신속한 반응에 필요한 고농도의 반응물에 기인할 수 있다. 티올-아크릴레이트 기능화 폴리머는 신속한 반응 속도 및 고도의 하이드로겔로의 전환에 기인하여 약물 운반 장치에 매력적인 폴리머이다. 약물 운반 시스템을 위한 하이드로겔은 호환적 반응성 말단기와 폴리머를 혼합함으로써 형성될 수 있다. 바람직하게, 상기 혼합물은 티올 함유 폴리머 및 아크릴레이트 함유 폴리머를 포함한다. 혼합 후, 그 혼합물이 충분한 온도나 빛에 노출될 경우에 티올-에스테르의 형성은 하이드로겔을 형성한다. 바람직하게, 티올-에스테르 형성은 환자의 체온보다 낮은 온도에서보다 환자의 체온에서 보다 신속히 일어난다. 예를 들어, 티올-에스테르 형성은 22℃ 부근에서보다 37℃ 부근에서 보다 신속히 일어날 수 있다. 호환성 반응 말단기를 갖는 폴리머, 바람직하게 티올 함유 및 아크릴레이트 함유 폴리머가 투여 전 또는 도중에 혼합될 수 있다. 투여 도중에 혼합될 경우, 상기 폴리머는 이식되면서 혼합되거나 다른 폴리머의 연속적 또는 병행적 주입에 의해 혼합될 수 있다. 이러한 혼합물의 비제한적 예는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트와 혼합된 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트를 포함한다.
약물 운반 시스템에서 하이드로겔은 바람직하게 손상 부위를 감싸는 조직과 유사한 압축 모듈러스를 갖는다. 예를 들어, 척수에 운반하도록 고안된 약물 운반 시스템은 척수와 유사한 압축 모듈러스를 가질 수 있다. 약물 시스템내 하이드로겔의 다공성은 방출되는 치료제의 크기와 부합될 수 있다. 만일 500달톤 치료제가 약물 운반 시스템의 일부인 경우, 하이드로겔의 메쉬는 500달톤 치료제가 겔을 통해 이동할 수 있도록 해야 한다.
상기 매트릭스는 약물을 함유하는 파티클을 포함할 수 있으며, 상기 파티클은 약물의 조절 방출 역학을 제공할 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 파티클은 손상 영역내로 서스펜션으로 주입될 수 있으며, 이는 말초 신경 또는 척수일 수 있다. 상기 파티클은 약 1-1000미크론 크기범위의 마이크로파티클일 수 있다. 상기 파티클은 약 1-1000나노미터 크기범위의 나노파티클일 수 있다. 그러나, 상기 파티클 치수는 특정 적용에 적합하도록 변경될 수 있다. 상기 치료제는 라디칼의 형성을 억제하거나, 산화질소 관련 산화 스트레스의 독성 영향을 중화하는 스캐벤징 라디칼의 효과를 달성하기에 효과적인 농도로 파티클상에 또는 파티클내에 존재할 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 파티클은 치료제를 0.1-30%w/w, 보다 바람직하게 1-30%w/w((약물의 중량)/(파티클+약물의 중량))로 함유한다. 상기 치료제는 화산, 용해 및 파티클 분해의 메카니즘에 의해 방출될 수 있다.
상기 파티클은 고형 폴리머 또는 겔일 수 있다. 바람직한 구현으로, 파티클은 생분해성, 생체적합성 폴리머로 이루어지며, 이는 예를 들어 폴리에스테르일 수 있다. 파티클용으로 적절한 폴리에스테르는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)이며, 이는 에스테르 가수분해에 의해 분해된다. 다른 적절한 물질은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 및 폴리(카르복시페녹시 프로판)-코-세반신산)(예, gliadel waferTM(MGI Pharmaceuticals)을 포함한다. 바람직하게, 상기 파티클 성분은 예를 들어 폴리머, 모노머 또는 분해산물이며, 생분해성; 생체적합성; 또는 생분해성이면서 배설가능한 것이다.
하이드로겔과 파티클의 조합물은 원위치 겔화로부터 방출 동역학을 분리하는 능력을 제공할 수 있다. 방출 동역학의 분리를 통해, 하이드로겔에 대해 파티클로부터 치료제의 방출은 다른 속도로 일어날 수 있다. 바람직한 구현으로, 각 특정 치료제가 다른 속도로 방출되도록 다른 치료제가 하이드로겔 또는 파티클, 또는 다른 타입의 파티클에 포함될 수 있다.
일 구현으로, 하이드로겔 또는 파티클 물질은 치료제로 기능화된다. 치료제는 파티클을 기능화하도록 어느 타입의 결합에 의해 부착될 수 있다. 바람직하게, 부착은 에스테르, 아미드, 에테르, 또는 아세탈 결합을 통해 폴리머 반복 유니트의 카르복실기 또는 히드록실기를 통해 이루어진다. 바람직한 구현으로, 기능화 하이드로겔은 폴리(글리세롤-코-세바케이트)아크릴레이트(PGSA)에 부착된 치료제를 포함한다.
하이드로겔 또는 파티클을 기능화하기 위해 어느 치료제가 사용될 수 있지만, 바람직한 구현으로, 상기 치료제는 하이드로겔에 부착되며, 상기 치료제는 항산화제이다. 보다 바람직하게, 항산화 아스코르브산(비타민 C) 및 알파-토코페롤(비타민 E)이 하이드로겔에 부착된다. 비타민 C와 비타민 E가 함께 존재하는 경우 서로 재생될 수 있으며, 항산화 특성이 연장될 수 있다. 다른 치료제 조합물이 약물 운반 시스템에 재생 효과를 위해 이용될 수 있다.
PGSA는 마일드 컨디션하에서 탄성중합 네트워크를 형성할 수 있으며, 이는 프로세싱도중 변성으로부터 항산화제를 보호할 수 있다. 또한, 임의적 기하학의 스캐폴드가 용융 성형 또는 솔리드 프리 폼 라피드 프로토타이핑 기술을 이용하여 PGSA로부터 형성될 수 있다. 이는 특정 병변 캐버티(또는 척수 종양 캐버티)에 대해 약물 운반 시스템을 주문제작하는데 사용될 수 있어 SCI 또는 말초 신경 손상과 같은 외상 치료에 외과적 개입의 향상을 이끌 수 있다.
하기 표 1은 7가지 약물 운반 시스템 조합물에 대한 예시적인 배합을 나타낸 것이다: 1) 하이드로겔 + 치료제; 2) 하이드로겔 + 다중 치료제의 조합물; 3) 파티클과 치료제; 4) 파티클 + 다중 치료제; 5) 하이드로겔 + 파티클 + 치료제(여기서 치료제는 하이드로겔, 파티클 또는 이들 두 가지 모두에 위치함); 6) 하이드로겔 + 파티클 + 다중 치료제(여기서 치료제는 하이드로겔, 하이드로겔내의 파티클(아마도 별도의 파티클 세트), 또는 이들 두 가지 모두에 국소화됨); 및 7) 하이드로겔 + 파티클 + 다중 치료제(여기서 특정 치료제는 하이드로겔, 하이드로겔내의 파티클(아미도 별도의 파티클 세트), 또는 이들 두 가지 모두에 국소화됨).
하이드로겔 파티클 치료제 나머지 성분들
조합물 1 25중량% ETTMP1300,
25중량% PEGDA400		 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량% PBS, pH 7.4
물
조합물 2 25중량% ETTMP1300,
25중량% PEGDA400		 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량%
미노시클린, 0.1중량%		 PBS, pH 7.4
물
조합물 3 PLGA 마이크로파티클, 1-100미크론, 10중량% 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량%
조합물 4 PLGA 마이크로파티클, 1-100미크론, 10중량% 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량%
미노시클린, 0.1중량%
조합물 5 25중량% ETTMP1300,
25중량% PEGDA400		 PLGA 마이크로파티클, 1-100미크론, 10중량% 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량% PBS, pH 7.4
물
조합물 6 25중량% ETTMP1300,
25중량% PEGDA400		 PLGA 마이크로파티클, 1-100미크론, 10중량% 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량%
미노시클린, 0.1중량%		 PBS, pH 7.4
물
조합물 7 25중량% ETTMP1300,
25중량% PEGDA400		 PLGA 마이크로파티클, 1-100미크론, 10중량% 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 0.1중량%
미노시클린, 0.1중량%		 PBS, pH 7.4
물
표 1의 예에서, 중량%는 성분의 중량을 나머지 성분들을 포함하는 혼합물의 중량으로 나누어 계산된다. PBS, pH 7.4는 pH 7.4의 인산염 완충염수이며, 이는 포타슘 포스페이트 모노베이직(KH2PO4, 136g/mol), 144mg/L(1.06mM), 소디움 클로라이드(NaCl, 58g/mol) 9000mg/L, 및 소디움 포스페이트 디베이직(Na2HPO4·7H2O) 795mg/L(2.97mM)을 포함한다.
라디칼 스캐빈저 또는 항염증제로 작용하는 어느 분자는 약물 운반 시스템에 대한 후보 치료제이다. 바람직하게, 상기 분자는 소분자이다. 치료제는 바람직하게 체내 국소에서 자유 라디칼의 수를 감소시킬 수 있으며, 그리고/또는 자유 라디칼의 생산을 감소시킬 수 있다. 약물 운반 시스템은 하나 이상의 치료제의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 치료제는 항산화제, 스테로이드 또는 이의 조합물일 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 치료제는 항산화제 또는 항산화제들, 템폴(4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 요산, 미노시클린, 메틸프레드니솔론, MnTBAP(망가니즈(III) 테트라키스(4-벤조산)포르피린), 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 항산화제는 이에 한정하는 것은 아니나 아스코르브산 또는 알파-토코페롤일 수 있다. 서로 재생될 수 있는 치료제의 조합물이 또한 상기 약물 운반 시스템에 제공될 수 있다. 예를 들어, 아스코르브산(비타민 C) 및 알파-토코페롤(비타민 E)이 서로 재생되도록 그리고 항산화 특성을 연장하도록 함께 사용될 수 있다.
치료제는 상기한 것들로 한정되지 않는다. 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있는 치료제의 비제한적 예는 NOS 또는 NO 생성의 인히비터, 항산화제, 스핀 트랩 및 페록시니트라이트 스캐빈저를 포함한다.
상기 약물 운반 시스템에 제공될 수 있는 NOS 또는 NO 생성의 인히비터의 비제한적 리스트는 1400W(N-(3-(아미노메틸)벤질)아세트아미딘); 액티노마이신 D; AET; ALLM; ALLN; NG-알릴-L-아르기닌; 아미노구아니딘, 헤미설페이트; 1-아미노-2-히드록시구아니딘; p-톨루엔설포네이트; 2-아미노-4-메틸피리딘; AMITU; AMT; S-벤질이소티오우레아; 브로모크립틴 메실레이트; L-카나바닌 설페이트; 카나발리아 엔시포르미스; 클로르프로마진, 히드로클로라이드; 커큐민; 커큐마 론자 L; 시클로헥시미드; 고순도 시클로헥시미드; 시클로스포린; 덱사메타손, 2,4-디아미노-6-히드록시피리미딘; NG,NG-디메틸-L-아르기닌; NG,NG1-디메틸-L-아르기닌; 디페닐렌요오드늄; DMHP, S(-)-에피갈로카테킨 갈레이트; S-에틸-N-페닐이소티오우레아; 2-에틸-2-티오슈도우레아; ETPI; 베이직 섬유아세포 성장인자; 보바인 베이직 섬유아세포 성장인자; 인간 재조합 베이직 섬유아세포 성장인자, GED; 할로페리돌; L-N6-(1-이미노에틸)리신, 디히드로클로라이드; L-N5-(1-이미노에틸)오르니틴; LY83583; LY231617; MEG; 멜라토닌; S-메틸이소티오우레아 설페이트; S-메틸-L-티오드트룰린, 디히드로클로라이드; NG-모노에틸-L-아르기닌; NG-모노메틸-D-아르기닌 모노아세테이트; NG-모노메틸-L-아르기닌의 DiHABS(디-히드록시아조벤젠-p'-설포네이트) 염; NG-모노메틸-L-아르기닌; NG-모노메틸-L-아르기닌의 모노하이드레이트 HABS 염; NG-모노메틸-L-호모아르기닌; 미코페놀릭산, L-NIL; 유도성 산화질소 신타아제 인히비터 세트(Calbiochem®); 신경 산화질소 신타아제 인히비터 세트(Calbiochem®); NG-니트로-D-아르기닌; NG-니트로-L-아르기닌; NG-니트로-D-아르기닌 메틸 에스테르; NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르; p-니트롤루 테트라졸리움 클로라이드; 7-니트로인다졸; 7-니트로인다졸의 소디움염; 3-브로모-7-니트로인다졸; 3-브로모-7-니트로인다졸의 소디움염; NOS 인히비터 세트(Calbiochem®), 1,3-PBITU; 펜트아미딘 이세티오네이트; PPM-18; NG-프로필-L-아르기닌; 1-피롤리딘카르보디티오익산; SKF-525A; SKF-96365; 소디움 살리실레이트; 스퍼미딘; 트리히드로클로라이드 스퍼미딘; 스퍼민; 스퍼민 테트라히드로클로라이드; L-티오시트룰린; Nα-토실-Lys 클로로메틸 케톤; Nα-토실-Phe 클로로메틸 케톤; TRIM; 및 아연(II) 프로토포르피린 IX을 포함한다. NOS 또는 NO 생성의 인히비터(들)의 약학적으로 허용되는 염이 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있다.
약물 운반 시스템에 사용될 수 있는 항산화제의 비제한적 리스트는 N-아세틸-L-시스테인; N-아세틸-S-파네실-L-시스테인; AG 1714; 암브록솔 히드로클로라이드; 항산화제 세트(Calbiochem®); L-아스코르브산; 빌리루빈, 빌리루빈 프리 액시드, 카페익산, CAPE; 카른솔; (+)-카테킨; 세룰로플라스민; 인간 플라스마 세룰로플라스민; 코엘렌테트라진; 구리 디이소프로필살리실레이트; 데페록스아민 메실레이트; R-(-)-데프레닐 히드로클로라이드; DMNQ; DTPA; 디안하이드리드; 엡셀렌; 엘라직산; 디하이드레이트 엘라직산; (-)-에피갈로카테킨 갈레이트; L-에르고티오네인; 디하이드레이트 EUK-8; 아포-페리틴, 에퀸 스플린 아포페리틴; 카드뮴 프리 페리틴; 에퀸 스플린 카드뮬 프리 페리틴; 휴먼 리버 페리틴; 휴먼 재조합 페리틴 H-체인; 휴먼 재조합 페리틴 L-체인; 포르모노네틴; 환원 글루타티온; 환원 글루타티온 프리 액시드; 글루타티온 모노에틸 에스테르; α-리포익산; 디히드로-DL-α-리포익산; 루테올린, LY231617; 페니실라민; MCI-186; MnTMPyP, 모린 하이드레이트; NCO-700; NDGA; p-니트로블루 테트라졸리움 클로라이드; O-트렌속스; 프로필 갈레이트; 레스베라트롤; 로스마리닉 산; (+)-루틴 하이드레이트; 실리마린기; L-스테폴리딘; 스테파니아 인터메디카; (±)-탁시폴린; 테트란드린; DL-티옥틱산; 티오레독신; 휴먼 재조합 로우 엔도톡신 티오레독손; 티오레독신 II; 이스트 티오레독신 II; 재조합 이스트 티오레독신 II; DL-α-토코페롤; 토코페롤 세트(Calbiochem®); DL-α-토코페롤 아세테이트, 토코트리에놀 세트(Calbiochem®), Trolox®; U-74389G; U-74389G; U-83836E; 요산; 및 비타민 E 숙시네이트를 포함한다. 항산화제(들)의 약학적으로 허용되는 염이 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있다.
상기 약물 운반 시스템에 사용될 수 있는 스핀 트랩제는 이에 한정하는 것은 아니나, N-테르트-부틸-α-페닐니트론, 템폴 및 DTCS(Iron(II) N-(디티오카르복시)사코신 Fe2+)를 포함한다. 스핀 트랩 또는 스핀 트랩들의 약학적으로 허용되는 염이 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있다.
상기 약물 운반 시스템에 사용될 수 있는 페록시니트라이트 스캐빈저는 이에 한정하는 것은 아니나, FeTMPyP; FeTPPS; 환원 글루타티온; 환원 글루타티온 프리 액시드; 멜라토닌; MnTBAP; MnTMPyP; L-셀레노메티오닌; 및 Trolox®을 포함한다. 페록시니트라이트 스캐빈저 또는 페록시니트라이트 스캐빈저들의 약학적으로 허용되는 염이 상기 약물 운반 시스템에 포함될 수 있다.
치료제(들)은 라디칼을 스캐밴징하고, 라디칼 형성을 억제하거나 산화질소 관련 스트레스의 독성 효과를 중화하기에 효과적인 어느 농도로 제공될 수 있다. 바람직하게, 치료제(들)은 0.1-30%w/v(약물의 중량/약물 운반 시스템의 용량)의 농도로 상기 약물 운반 시스템에 존재한다. 약물 운반 시스템에서 선택된 치료제의 농도는 하기 표 2에 제공된다.
치료제 제시된 농도범위 제시된 농도
비타민 C 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
비타민 C 및 비타민 E 0.1-30%(w/v) 비타민 C 및 0.1-30%(w/v) 비타민 E 0.2%(w/v)(0.1% 비타민 C 및 0.1% 비타민 E)
템폴 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
요산 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
미노시클린 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
메틸프레드니솔론 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
MnTBAP 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
덱사메타손 0.1-30%(w/v) 0.1%(w/v)
상기 약물 운반 시스템은 담체 등과 같은 약학 첨가제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 '담체'는 허용되는 보조제 및 비이클을 포함한다. 약학적으로 허용되는 캐리어는 이에 한정하는 것은 아니나 하기 리스트에 열거된 것들로부터 선택될 수 있다: 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 휴먼 혈청 알부민, 버퍼 물질, 포스페이트, 글리신, 소르빅산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 프로타민 설페이트, 디소디움 히드로겐 포스페이트, 포타슘 히드로겐 포스페이트, 소디움 클로라이드, 아연염, 콜로이달 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 왁스 및 폴리에틸렌 글리콜.
상기 치료제는 담체로서 소량의 희석제에 제공될 수 있다. 예를 들어, 1ml 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트(즉, 프레그나-1,4-디엔-3,20-디온,21-(3-카르복시-1-옥소프로폭시)-11,17-디히드록시-6-메틸-모노소디움염, (6α, 11β)(분자량 496.53) 치료제 용액은 40mg 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트; 1.6mg 모노베이직 소디움 포스페이트 안하이드로스; 17.46mg 디베이직 소디움 포스페이트 드라이드; 25mg 락토즈 하이드로스; 및 보존제로서 8.8mg 벤질 알코올을 포함할 수 있다. 필요에 따라, 각 제형의 pH는 조정될 수 있다. 예를 들어, 재구성된 용액의 pH가 7-8의 범위내가 되고, 탄력성이 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트 용액 mL당 40mg에 대해 0.50osmolar가 되도록 소디움 히드록시드가 첨가될 수 있다. 매트릭스내 컨디션은 치료제가 매트릭스에 첨가하기 전에 방출되는 희석제 또는 용액과 동일하거나, 유사하거나 다르도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트를 함유한 1ml 용량의 매트릭스는 상기 희석제로서 동일한 양의 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 모노베이직 소디움 포스페이트, 디베이직 소디움 포스페이트, 락토즈 하이드로스, 벤질 알코올, pH, 및 물을 함유하도록 디자인될 수 있다. 다른 희석제가 이용될 수 있다. 상기 치료제는 어느 약학적으로 허용되는 담체에 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 치료제는 예를 들어, 인산염 완충액 또는 인산염 완충 염수와 같은 완충 희석제에 제공될 수 있다.
상기 약물 운반 시스템은 치료제 용액에 폴리머를 용해하거나 적심으로써 어셈블링될 수 있다. 다른 파티클 또는 파티클 및 하이드로겔의 조합물이 사용될 경우, 매트릭스 성분은 조합으로 또는 개별적으로 치료제에 노출될 수 있다. 만일 다른 치료제가 파티클, 다른 부분집합의 파티클 또는 하이드로겔용으로 의도될 경우, 이러한 성분들은 모든 폴리머 성분들을 혼합하기 전에 각각의 치료제 용액에 노출될 수 있다.
다양한 디자인 파라미터가 약물 운반 시스템의 시공간적 약물 프로필에 미치는 영향을 예측하기 위해 분해, 약물 방출 및 생체내 분포의 컴퓨터 모델이 개발되었다. 파라미터는 폴리머 조성, 분자량, 다분산성, 약물 타입, 약물 크기, 약물-폴리머 상호작용 및 약물 운반 시스템의 기하학을 포함한다. 파라미터는 약물 운반 시스템을 최적화하도록 조정될 수 있다.
실시예 7에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔로서 MW 400g/mol을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 및 MW 11,600g/mol을 갖는 PLGA 폴리머와 혼합된 MW=1300g/mol을 갖는 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트가 약물 운반 시스템의 일 구현에 적절한 파라미터를 갖는 하이드로겔 및 파티클의 비제한적 예이다. 다른 파라미터를 갖는 하이드로겔 및 파티클이 약물 운반 시스템에 이용될 수 있다.
상기 약물 운반 시스템은 손상 부위 또는 염증 부위의 일 영역에 환자에게 주입되거나, 또는 수술 후 노출되는 부위내로 또는 부위에 디포지팅될 수 있다. 수술적 개입보다는 주입에 의해 상기 약물 운반 시스템은 최소한의 침습적 방식으로 투여될 수 있다. 바람직한 구현으로, 지속된 투여량을 유지하기 위해 단지 1회 투여만이 필요할 수 있다. 따라서, 상기 약물은 손상 또는 염증 지점에 직접 운반될 수 있으며, 이에 따라 전신성 투여와 관련된 부작용을 최소화할 수 있다. 바람직하게, 이에 한정하는 것은 아니나, 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트와 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트의 조합에 의해 제조된 하이드로겔이 이러한 방법에 이용될 수 있다. 이러한 약물 운반 장치의 비제한적 예를 표 1에 나타내었다.
일 치료방법은 약물 운반 시스템을 척수내 좌상 손상내로 주입하는 것이다. 이는 경막내 골수내 주입에 의해 수행될 수 있다. 약물 운반 시스템을 척수내로 주입 또는 이식함으로써, 약물 운반 시스템의 어떠한 약물 및 성분도 경막을 가로지르지 않으며, 상기 약물은 혈액 뇌 관문을 가로지를 필요가 없다. 바람직하게, 상기 약물 운반 시스템은 마이크로글리얼 활성화 및 호중구 침윤에 부분적으로 기인하는 손상 부위에서 병리생리학적으로 증가되고 일시적으로 지속된 수준의 자유 라디칼 및 자유 라디칼 생성과 일치되는 지속된 기간에 걸쳐 치료제를 방출하도록 디자인된다. 바람직하게, 이에 한정하는 것은 아니나, 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트와 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트의 조합에 의해 제조된 하이드로겔이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이러한 약물 운반 장치의 비제한적 예는 표 1에 제공된다.
바람직한 구현으로, 상기 약물 운반 시스템은 추가적인 외과적 개입이 필요없이, 가수분해에 의해 치료도중 분해되고, 정상적인 경로를 통해 몸에 의해 배설되도록 디자인된다. 바람직하게, 이에 한정하는 것은 아니나, 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트와 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트의 조합에 의해 제조된 하이드로겔이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이러한 약물 운반 장치의 비제한적 예는 표 1에 제공된다.
포텐셜 약물 운반 시스템 시험
치료제, 매트릭스 및 이의 조합물이 당 기술분야에 알려진 방법에 의해 시험될 수 있다. SIN-1 하이드로클로라이드와 같은 다양한 산화질소 도너가 페록시니트라이트 분해에 기인한 페록시니트라이드 및 라디칼의 지속된 수준을 생성하는데 시험관내에서 사용될 수 있다. 그 다음 항산화 활성은 예를 들어, 변형된 그리스 시약(Griess Reagent)을 이용하는 것과 같이 다양한 방법들을 이용하여 니트라이트를 측정함으로써 조사될 수 있다. 전형적인 상업용 그리스 시약은 5% 인산에 용해된 0.2% 나프틸렌디아민 디히드로클로라이드 및 2% 설파닐아미드를 함유한다. 시험관내 세포 보전성은 세포막 보전성에 대한 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 미토콘드리아 활성에 대하여 MTT 또는 MTS 어세이를 이용하여 조사될 수 있다. 참조 Mosmann, T. (1983) Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Meth. 65, 55-63; and Wilson, A. P. (2000) Cytotoxicity and Viability Assays in Animal Cell Culture: A Practical Approach, 3rd ed. (ed. Masters, J. R. W.) Oxford University Press: Oxford 2000, Vol. 1(본 명세서에 참고문헌으로 편입됨) 약물 운반 시스템은 또한 시험관내에서 세포 사멸 또는 세포막 손상을 감소시키는 능력 뿐만 아니라 SIN-1과 같은 도너에 의해 생성된 니트라이트의 제거 능력에 대해 시험될 수 있다. 치료제, 매트릭스 또는 약물 운반 시스템의 효능은 면역염색을 통해 또는 페록시니트라이트 산화 스트레스에 대한 마커를 이용하여 생체내 시험 후 평가될 수 있다. 마커는 이에 한정하는 것은 아니나, 3-니트로티로신 및 4-히드록시노네날을 포함한다.
래트에서 보통의 좌상 손상 후 페록시니트라이트-유도 산화적 손상의 시공간적 특성이 보고된 바 있다(Xiong, Y, Rabchevsky, A.G. and Hall, E.D. (2007) Role of peroxynitrite in secondary oxidative damage after spinal cord injury. J. Neurochem. 100(1), 639-649("Xiong et al."), 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). Xiong 등은 3-니트로티로신, 페록시니트라이트에 대한 특이 마커가 초기에(1시간 및 3시간) 신속히 축적되고, 3-니트로티로신이 현저하게 증가하는 것은 섐 래트와 비교하여 외상 후 1주까지 지속되었음을 보여주었다. 또한, Xiong 등은 단백질 산화-관련 단백질 카보닐 및 지질 페록시화-유도 4-히드록시노네날의 수준에 있어 동시에 일어나며 유지되는 증가를 보여주었다. 3-니트로티로신 및 4-히드록시노네날의 피크 증가는 외상 후 24시간에 관찰되었다. 면역 조직 화학 시험결과로, Xiong 등은 3-니트로티로신 및 4-히드록시노네날의 동시 국소화를 보여주었으며, 이는 페록시니트라이트가 지질 과산화 손상 뿐만 아니라 단백질 질산화 손상에 연루됨을 나타내는 것이다. 산화적 손상의 다른 결과는 세포내 칼슘 과적의 악화이며, 이는 사이토스켈레탈 단백질(α-스펙트린)을 포함하는 여러 세포 표적물의 분해를 일으키는 시스테인 프로테아제 칼페인을 활성화한다. Xiong 등은 또한 α-스펙트린 분해산물의 분석을 통해 칼페인에 의해 특이적으로 생성되는 α-스펙트린의 145-kDa 프레그먼트가 외상 후 1시간 정도로 빠르게 현저히 증가하였으나, 그 피크 증가는 외상 후 72시간까지 일어나지 않은 것으로 나타내었다. Xiong 등은 칼페인의 늦은 활성화는 칼슘 항상성의 페록시니트라이트-매개 2차 산화적 손상과 가장 관련이 있는 것으로 결론지었다. 후보 치료제 매트릭스 및 이의 조합물은 Xiong 등에 기재된 마커에 대해 시험될 수 있다. Xiong 등에 의해 기재된 방법을 포함하는 다양한 마커 시험 방법이 이용될 수 있다. Xiong 등에 기재된 방법은 하기와 같은 정신적 척수 좌상의 래트 모델, 3-니트로티로신 및 4-히드록시노네날에 대한 면역블롯팅 분석, α-스펙트린 분해 산물에 대한 웨스턴 블롯팅, 및 통계학적 분석을 포함한다.
정신적 척수 좌상의 래트 모델: Xiong 등에 따라, 모든 시험은 200-225g의 몸무게를 갖는 젊은 어덜트 암컷 Sprague-Dawley 래트(Charles River, Portage, MI, USA)를 사용하였다. 동물들은 무작위로 순환되었으며, 발정기 사이클 단계에서는 시험되지 않았다. 동물들은 자유롭게 음식과 물을 섭취하도록 하였다. 래트들은 케타민(80mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)으로 마취된 후, T10 척추의 라미넥토미를 수행하였다. 척수 외상은 무한 수평 장치(Scheff, S.W., Rabchevsky, A.G., Fugaccia, I., Main, J.A., and Lumpp, J.E. Jr.(2003) Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. J. Neurotrauma 20, 179-193, 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)를 이용하여 수행되었으며, 이는 끝부분이 스테인리스 강으로 된 임파운더로 규정된 힘의 충격을 신속히 적용함으로써 노출된 척수에 신뢰도 있는 좌상을 생성한다. 2.5mm보다 약간 더 큰 임팩터 팁으로 조심스럽게 라미넥토미를 수행하였다. 척추는 로스트럴 T9 및 코들 T11 척추체를 겸자를 이용하여 클램핑함으로써 안정화되었다. 척추 및 노출된 척수는 수평면 수준으로 조심스럽게 정렬되었다. 충격 도중에, 스테핑 모터가 노출된 척수를 향해 커플드 랙(coupled rack)을 구동시켜 좌상을 가하였다. 척수에 적용된 힘은 200kdyn이었으며, 이는 중간정도로 심한 외상을 생성하였다. 충격 장치는 PC에 연결되었으며, 연결된 PC는 임파운더 속도, 실제 힘 및 척수의 이동을 기록하였다.
수술 후 다른 시점에서(1, 3, 6, 24, 48, 72시간 및 1주), 첫번째 세트에서의 동물들(시점당 6 래트)은 소디움 펜토바비톨 과투여(150mg/kg)에 의해 희생되었다. 20mm 세그먼트의 척수를 함유하는 충격 에피센터를 라미넥토미에 의해 신속히 제거하였다. 수거된 조직은 차가운 스테이지상에서 해부하고, 즉시 800μL Triton 용해 버퍼[20mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 5mmol/L EGTA, 10mmol/L EDTA, 20mmol/L HEPES, 10% 글리세롤 용액 및 프로테아제 인히비터 칵테일(Roche Inc., Nutley, NJ, USA)]를 함유하는 원심분리 튜브에 옮기고, 그 다음 간략히 초음파처리하였다. 분해 후, 척수 조직 시료를 15,000rpm에서 1시간동안 4℃에서 원심분리하고, 그 상층물을 수집하고, 단백질 수준을 Protein Assay Kit(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 검출하였으며, 그 다음 시료는 1μg/μL로 노말화되고 분석할때 까지 -80℃에 보관하였다. 산화적 손상은 슬롯 면역블롯팅에 의해 평가되었다. 2μg 단백질 시료를 최적 항체-바인딩 감도용 슬롯-블롯 장치상에 로딩하였다. 지질 과산화를 위해, 래빗 폴리클로날 항-HNE 항체가 적용되었다(1:5000; Alpha Diagnostics International, Inc., San Antonio, TX, USA). 페록시니트라이트-생성 3-니트로티로신에 대해, 래빗 폴리클로날 항-니트로티로신 항체가 사용되었다(1:2000; Upstate USA, Inc., Charlottesville, VA, USA). 단백질 산화를 검출하기 위해, 옥시-블롯 기술이 사용되었다(Oxy-Blot Protein Oxidation Detection Kit; Chemicon International, Temecula, CA, USA). 슬롯-블롯 분석은 Li-Cor Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)을 이용하여 분석되었으며, 이는 2차 항체로서 IRDye800-접합 고트-항-래빗 IgG(1:5000; Rockland, Gilbertsville, PA, USA)을 이용하였다. 각각의 산화 마커들에 대한 밀도계측 곡선의 선형 범위를 측정하고, 이에 따라 획득된 밀도계측 판독이 정확한 정량화 범위를 벗어나지 않음을 확인하기 위해 예비 시험을 수행하였다.
3-니트로티로신 및 4-히드록시노네날에 대한 면역조직화학: Xiong 등에 따라, 수술 후 다른 시점에서(1, 3, 6 및 24시간), 2차 셋트의 동물들은 소디움 펜토바비탈(150mg/kg)으로 과투여되고, 150mL의 0.1mol/L PBS 및 그 다음 PBS(pH=7.4)에 용해된 200mL의 4% 파라포름알데히드로 퍼퓨징되었다. 크로스-섹션을 위해, 손상 에피센터상에 모인 5mm 척수 세그먼트를 다른 시점에서 해부하였다. 종적 섹션을 위해, 충격부위를 포함하는 15mm 척수 세그먼트를 외상 후 24시간에 해부하였다. 수거 후, 척수를 PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드에 4시간동안 침지시켰다. 그 다음, 그 조직을 PBS에 밤새 트랜스퍼하고, 포스페이트-버퍼드 20% 수크로즈에 2일간 저온보존하였다. 척수를 횡적 또는 종적 면으로 20μm에서 절편화하고, 매 5번째 섹션을 직접 Superfrost plus slides(Fisher Scientific International Inc., Hampton, NH, USA)상에 트랜스퍼하였다. 모든 척수 절편을 수집한 후, 슬라이드를 트레이상에 놓고 4℃에 보관하여 밤새 탈수시키고, 이후 이를 염색하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 염색하는 날에, 동결된 슬라이드를 -20℃에서 꺼내어 20℃에서 30분간 해동하였다. 0.2mol/L의 PBS에 린싱한 후, 절편을 0.2mol/L의 PBS에 용해된 3% 과산화수소에 30분간 배양한 다음, 블로킹 버퍼(5% 고트 혈청, 0.25% Triton-X, 0.2mol/L PBS에 용해된 1% 분유)에 1시간동안 배양한 다음, 래빗 폴리클로날 항-4-히드록시노네날(1:5000) 또는 항-3-니트로티로신 항체(1:2000)에 밤새 노출시켰다. 다음날, 절편을 바이오티닐레이티드 고트-항-래빗 2차 항체(1:200, Vector ABC-AP Kit; Vector Labs, Burlingame, CA, USA)와 함께 2시간동안 20℃에서 배양하였다. 린스 후, 절편을 VECTASTAIN ABC 시약(아비딘 DH + 바이오티닐레이티드 호스래디쉬 페록시다아제, Vector Labs)에서 1시간동안 배양한 다음, Vecter blue method(Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit; Vector Labs)을 이용하여 어두운 곳에서 10-30분간 염색을 현상하였다. 반응 후, 척수 절편은 nuclear fast red(Vector Labs)로 대비 염색되었으며, 그 다음 탈수하고 Olympus Magnafire 디지털 카메라(Olympus America, Inc., Melville, NY, USA)를 이용하여 Olympus Provis A70 현미경상에서 사진을 촬영하였다.
α-스펙트린 분해산물에 대한 웨스턴 블롯: Xiong 등은 15마이크로그램의 각 시료를 Tris-아세테이트 런닝 버퍼 시스템을 이용하여 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[3-8%(w/v) 아크릴아미드, Bio-Rad Criterion XT precast gel]상에 런닝한 다음, 20mA에서 15분간 반건조 전기-트랜스퍼 유니트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 니트로셀룰로즈 멤브레인에 트랜스퍼하였다고 기술하였다. 블롯은 마우스 모노클로날 항-α-스펙트린 항체(1:5000, Affiniti, Inc., Ft. Lauderdale, FL, USA; 현재 Biomol International(LP Plymouth, PA, USA)의 일부임)로 탐침되었으며, 이는 280kDa 패런트 α-스펙트린 뿐만 아니라 150kDa 및 145kDa의 각 단백질 가수분해 프레그먼트에 공통적인 에피토프를 인식하였다. 일차 항체에 대한 노출 후, 어두운 곳에서 1시간동안 이차 IRDye800-접합 고트-항-마우스 IgG(1:5000, Rockland)의 적용이 후속되었다. 웨스턴 블롯의 이미지 분석은 Li-Cor Odyssey Infrared Imaging System을 잉요하여 수행되어 145 및 150kDa α-스펙트린 분해산물(SBDP 145 및 SBDP150)의 함량을 정량화하였다. 각 웨스턴 블롯은 블롯 대 블롯으로부터 생기는 강도 차이와 관련된 보정이 이루어지도록 표준화 단백질 로딩 컨트롤을 포함하였다. 이러한 정량화 방법은 다른 시험에서 사용된 바 있다(Kupina, N.C., Nath R., Bernath E.E., Inoue J., Mitsuyoshi A., Yuen, P.W., Wang, K.K., and Hall E.D.(2002) Neuroimmunopholin ligand V-10,367 is neuroprotective after 24-hour delayed administration in a mouse model of diffuse traumatic brain injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 22, 1212-1221; Hall E.E., Sullivan, P.G., Gibson, T.T., Pavel, K.M., Thompson, B.M., and Scheff, W.W.(2005) Spatial and temporal characteristics of neurodegenerations after controlled cortical impact in mice: more than a focal brain injury. J. Neurotrauma 22, 252-265).
통계학적 분석: Xiong 등은 슬롯-블롯 및 웨스턴 블롯 분석을 판독하기 위해 정량적 밀도계측 분석을 활용하였다. 통계학적 분석은 STATVIEW 소프트웨어 패키지(JMP Software, Cary, NC, USA)를 이용하여 수행되었다. 모든 값들은 평균 ±SEM으로 표기되었다. 2-웨이 분산 분석을 우선 수행하였다. 분산 분석이 유의한(p<0.05) 효과가 있는 것으로 나타날 경우, 피셔의 PLSD(protected least significant difference) 시험에 의해 외상을 받지않은 그룹인 섐(sham)에 대하여 개체의 외상 시점을 비교하기 위해 사후 검증을 수행하였다. 모든 경우에, p<0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
Xiong 등에 기술되고, 상술한 바와 같은 시험을 이용하여 어느 치료제, 매트릭스 또는 약물 운반 시스템이 시험될 수 있다. 상기 치료제, 매트릭스 또는 약물 운반 시스템은 수술적으로 또는 SCI 후 주입을 통해 이식될 수 있으며, 그 다음 Xiong 등에 기재된 바와 같은 후속적인 마커 시험이 수행될 수 있다. 또한, 면역 반응에 대한 마커(예, GFAP(Glial Fibrilary Acidic Protein))가 염증 반응을 추적하기 위해 모니터될 수 있다. 병변의 전체 규모는 치료 효과를 모니터하기 위한 헤마톡실린 또는 에오신 염색에 의해 평가될 수 있다.
상술한 바와 같이 매트릭스는 단독으로 사용되거나, 약물과 함께 세포에 시딩되거나, 또는 최적화 기능성을 위해 다른 폴리머와 함께 혼합될 수 있다. 최적화될 수 있는 기능은 분해 속도, 기계적 특성 및 소규모 특징을 포함한다. 최적화는 조직 공학용 인공기관 또는 부위로서 작용할 수 있는 주입가능한 스태폴드의 적어도 일부로서 파티클, 하이드로겔 또는 파티클과 하이드로겔의 제형을 포함한다. 상기 하이드로겔 및/또는 파티클은 조직 공학에 유용한 세포, 약물 또는 다른 폴리머들을 운반할 수 있다. 상기 파티클 및/또는 하이드로겔은 세포 부착을 촉진하기 위한 펩타이드 서열(예, RGB 또는 IKVAV)을 함유할 수 있으며, 이는 폴리머 모노머의 일부로서 가교에 의해 폴리머 네트워크에 편입되거나, 상기 네트워크내에 물리적으로 제약된다. 미국 특허 제 5,759,830호; 제 5,770,417호; 제 5,770,193호; 제 5,514,378호; 제 6,689,608호; 제 6,281,015호; 제 6,095,148호; 제 6,309,635호; 및 제 5,654,381호가 폴리머의 합성, 폴리머 최적화, 세포와 함께 폴리머의 시딩, 및 조직 스캐폴드의 제조와 관련되며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
척수 외상의 치료가 바람직한 구현을 나타내지만, 약물 운반 시스템은 말초 신경 손상, 뇌졸증, 심근 경색, 만성 심부전, 당뇨, 혈액순환 쇼크, 만성 염증 질환, 암 및 신경퇴행성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 상기 약물 운반 시스템이 치료에 적응될 수 있는 부가적인 병들은 이에 한정하는 것은 아니나, Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. (2007) Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, 315-424에 기술된 것들을 포함한다. 척수 외상을 포함하는 이러한 어느 컨디션을 치료하기 위해, 상기 약물 운반 시스템은 병에 의해 유발된 손상 부위에 투여된다. 투여는 어느 수단에 의해 이루어질 수 있으며, 이는 이에 한정하는 것은 아니나 외과적 이식 또는 주입을 포함한다.
숙련자는 상기한 둘 이상의 구현이 서로 호환적일 수 있으며, 서로 함께 이식될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.
다른 택일적인 구현으로, 예를 들어, 아스코르브산과 같은 라디칼 스캐빈저는 상기한 바와 같이 매트릭스에 편입될 수 있으며, 그 조합물은 식품 및 포장 산업에 보존제로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 식용 매트릭스가 식용 항산화제와 함께 제공될 수 있으며, 바람직하게 폴리 락틱산계 폴리머 매트릭스가 비타민 C와 함께 제공된다.
실시예
실시예 1 - 다중블록 코폴리머 합성 - PGA-PEG-PGA(폴리(글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(글리콜라이드))
상기 폴리머는 친수성 폴리머의 어느 한 측면상에 중합된 소수성 말단기로 구성된 온도반응성 블록 코폴리머의 예이다. 이는 온도반응성 하이드로겔에 대한 양친매성 트리블록 코폴리머이다. 이 경우에, 고리열림 중합이 소수성 말단 사슬을 구성하는데 사용된다.
재료
1g 폴리(에틸렌-글리콜), MW 4000=0.00025mol;
0.05mol 글리콜라이드=5.805g 글리콜라이드; 및
촉매로서 스태노스 옥타노에이트, 0.025중량%=1.7mg 스태노스 옥타노에이트, 밀도=1.251g/mL, 1.36마이크로리터.
방법
1. 건조 PEG 및 글리콜라이드를 교반 바를 통해 교반하면서 40분간 진공하에 오븐 드라이 슈렌크 플라스크에 넣었다.
2. 상기 PEG 및 글리콜라이드를 150℃에서 용융하고, 아세톤에 용해된 15마이크로리터 드롭렛의 상기 촉매를 첨가하였다.
3. 반응은 용융물이 황색이 되고 점성물이 될 때까지 진행되도록 하였다.
실시예 2 - 다중블록 코폴리머 합성 - PLGA-PEG-PLGA(폴리(락타이드-코-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-코-글리콜라이드))
이는 온도반응성 하이드로겔에 대한 양친매성 트리블록 코폴리머의 다른 예이다.
재료
PEG-4000, 0.000125mol, 0.5g;
글리콜라이드, 0.00625mol, 0.725625g;
D,L-락타이드, 0.00625mol, 0.9008125g; 및
촉매로서 스태노스 옥타노에이트, 총 공급물의 0.05%=0.85mg 스태노스 옥타노에이트, 밀도=1.251g/mL, 0.68마이크로리터.
방법
1. PEG, 글리콜라이드 및 락타이드를 플라스크에 장입하였다. 플라스크를 진공하에 두고, 그 다음 아르곤으로 채웠다.
2. 상기 PEG, 글리콜라이드 및 락타이드를 150℃에서 용융하고, 아세톤에 용해된 15마이크로리터 드롭렛의 상기 촉매를 첨가하였다.
3. 반응은 1시간 및 45분간 진행되도록 하였다.
도 1, 2 및 3은 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1 트리블록 코폴리머의 성공적인 합성을 나타낸다. PEG의 메틸렌은 3.5-3.7ppm에서 시프트로서 나타내었으며(4 수소), PGA의 메틸렌은 4.6-4.9ppm에서 시프트로서 나타내었으며(2 수소), 그리고 PLA의 메틴은 5.2ppm에서 시프트로서 나타내었다(1 수소).
이러한 피크는 다음과 같은 영역을 가졌다: PEG=15.57/4=3.8925; PGA=3.6/2=1.8; 및 PGA=1. PEG(Fluka)는 폴리머 분자량=4000g/mol을 가졌으며, 여기서 모노머 MW=44이며, 그리고 중합도=91이었다. PLA 모노머는 MW=72, 중합도=91/3.8925=23.38이며, 그리고 폴리머 MW=1683.24이었다. PGA 모노머 MW=58이며, 중합도=91/(3.8925/1.8)=42.08이며, 그리고 중합도는 MW=2440.69를 가졌다. 총 PLGA-PEG-PLGA 분자량: 8881.38g/mol. PEG 블록은 약 4000g/mol의 분자량을 가졌다. 각 PLGA 블록은 약 4881.38g/mol이며, 락틱산 대 글리콜릭산 모노머의 PLGA비는 약 36:64이다.
실시예 3 - 다중블록 코폴리머 합성 - CTA-CP-PLGA-pPEG-PLGA-CTA
이 폴리머는 다중블록 코폴리머의 가역 첨가-프레그먼트화 연쇄 전달(RAFT) 중합을 위한 마크로-연쇄-전달제의 예로서 제공된다. 이 경우에, 마크로-연쇄-전달제는 트리블록이며, 5이상의 블록을 갖는 양친매성 다중블록 코폴리머를 제조하는데 사용될 수 있다.
재료
상술한 바와 같은 CP-PLGA-pPEG-PLGA 또는 히드록실 말단기 이작용기를 갖는 어느 다른 폴리머;
S-(티오벤조일)-티오글리콜릭산(CTA) 또는 다른 산 연쇄 전달제; 및
상기 연쇄 전달제를 활성화하기 위한 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC).
방법
1. 100mg CP-PLGA-pPEG-PLGA-1(8881.38g/mol에서 1.126 x 10-5mol)을 1mL 무수 디클로로메탄에 용해하였다.
2. CP-PLGA-pPEG-PLGA-1에 비하여 2x mol의 DCC(4.65mg) 및 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1에 비하여 5x mol의 CTA를 둥근 바닥 플라스크에 교반하면서 첨가하였다.
3. 상기 플라스크를 진공하에 1시간동안 두었다.
4. 진공을 아르곤으로 대체하였다.
5. 1mL의 무수 디클로로메탄을 상기 플라스크에 첨가하였다.
6. 용해된 폴리머를 상기 플라스크에 적가하고 실온에서 밤새 교반하였다(300rpm).
7. 그 결과 형성된 용액을 100mL 에틸 에테르에서 침전시켰다.
8. 그 혼합물을 여과지를 통해 진공 필터에 의해 여과하고 침전물을 건조하였다.
도 4를 참조하면, 1H-NMR 분석에 의해 연쇄 전달제의 존재는 입증되지 않는다. 그러나, 개선된 방법, 실시예 4는 히드록실 말단기를 갖는 폴리머에 연쇄 전달제를 결합하는 효능을 증가시키도록 개발되었다.
실시예 4 - 다중블록 코폴리머 합성 - DJS-CP-CTA-Cl
히드록실 말단기를 갖는 폴리머와의 반응성을 증가시키도록 산 클로라이드 형태의 RAFT 연쇄 전달제가 개발되었다. 이는 마크로머에서 알파-히드록시-산 폴리머 블록 또는 다른 가능한 에스테르 블록의 염기-촉매화 에스테르 가수분해 증가 위험에 기인하여 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)과 같은 염기 촉매를 사용하는 것이 바람직하지 않을 경우에 상술한 바와 같이 산 연쇄 전달제(CTA)의 결합을 촉진하는데 유용할 수 있다.
재료
S-(티오벤조일)-티오글리콜릭산 또는 다른 CTA
옥살릴 클로라이드
방법
1. 0.5g S-(티오벤조일)-티오글리콜릭산을 50mL 건조 둥근 바닥 플라스크에 용해된 무수 디클로로메탄에 교반하면서 용해하고 이를 아이스-워터 배스에 담그어 0℃로 냉각하였다.
2. 1.2몰 등가량의 옥살릴 클로라이드를 서서히 질소하에 첨가하고, 그 용액을 3시간동안 교반하면서 실온에 이르게 하였다.
3. 그 용액을 감압하에 농축하여 산 클로라이드를 생성하거나 디클로로메탄으로 남게 하였다.
도 5는 결과적으로 형성된 S-(티오벤조일) 티오글리콜릭산 클로라이드 DJS-CP-티오벤조일-티오글리콜릭산 클로라이드-1의 1H-NMR을 나타낸 것이다.
실시예 5 - 다중블록 코폴리머 합성 - CTA-Cl과 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1의 결합
본 방법은 열반응성 코폴리머에 기여하는 블록의 RAFT 중합을 위해 폴리머에 결합시키기 위한 산 클로라이드 형태의 연쇄 전달제를 사용하여 마크로 연쇄 전달제를 성공적으로 생성하는 것을 보여준다.
방법
1. 1mL 무수 디클로로메탄에 용해된 100mg 건조 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1를 슈렌크 플라스크에 넣은 다음, 7.84마이크로리터의 트리에틸아민을 첨가하였다.
2. 그 혼합물을 불활성 가스하에서 0℃로 냉각하였다.
3. DJS-CP-티오벤조일-티오글리콜릭산 클로라이드-1(폴리머 대비 5x mol/mol의 산 클로라이드를 위하여 디클로로메탄에 용해된 0.346mL)을 서서히 첨가하였다.
4. 반응은 실온에 이르게 하고 24시간동안 반응시켰다.
5. 그 용액을 여과하여 트리에틸아민 염을 제거하였다.
6. 여과액을 에틸 에테르에서 침전시켜 미반응 산 클로라이드 및 트리에틸아민을 제거하였다.
7. 침전물을 여과 후 진공건조하였다.
도 6은 추가적인 폴리머 블록을 부가하기 위해 RAFT 연쇄 전달제 말단기(7.6, 8.0ppm)를 이용하여 RAFT 중합용 마크로 연쇄 전달제를 생성함으로써 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1 코폴리머의 성공적인 기능화를 나타낸다. RAFT 중합 공정은 주입가능한 하이드로겔 약물 운반 장치 또는 주입가능한 조직 공학 스캐폴드를 위해 트리블록에 올리고 에틸렌 글리콜 메틸 메타크릴레이트를 첨가하여 온도반응성 생체적합 생분해성 펜타블록 코폴리머를 생성하도록 사용될 수 있다.
실시예 6 - 다중블록 코폴리머 합성 - PGS-CTA
폴리(글리세롤-코-세바신)산의 히드록실기가 산 또는 산 클로라이드 형태의 연쇄 전달제를 이용하여 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1에 대해 상술한 바와 같은 RAFT 연쇄 전달제로 기능화될 수 있다. 예를 들어, 폴리(글리세롤-코-세바신)산의 히드록실기가 온도반응성 탄성중합 네트워크를 형성할 수 있는 그라프트 코폴리머를 생성하기 위해 올리고 (에틸렌 글리콜 메틸 메타크릴레이트)를 이용한 RAFT를 통해 기능화될 수 있다.
재료 1
폴리(글리세롤-코-세바신산);
S-(티오벤조일)-티오글리콜릭산 연쇄 전달제(CTA) 또는 다른 산 CTA;
상기 CTA를 활성화시키기 위한 디시클로헥실 카보디이미드(DCC); 및
베이스 촉매로서 DMAP.
방법 1
1. 0.5g PGS(~1.95mmol 히드록실기)를 5mL 무수 디클로로메탄에 용해하였다.
2. PGS내 히드록실기와 대비하여 등몰의 DCC(0.402g) 및 PGS와 대비하여 과량의 CTA(0.414g)를 둥근 바닥 플라스크에 교반하면서 첨가하였다. 그 다음 PGS내 히드록실기와 대비하여 0.1몰의 DMAP를 첨가하였다.
3. 상기 플라스크를 진공하에 1시간동안 두었다.
4. 진공을 아르곤으로 대체하였다.
5. DCC, CTA 및 DMAP를 용해하기 위해 무수 디클로로메탄을 상기 플라스크에 첨가하였다.
6. 단계 1에서 용해된 PGS 폴리머를 상기 플라스크에 적가하고, 실온에서 밤새 교반하였다(300rpm).
7. 그 결과 형성된 용액을 250mL 에틸 에테르에 침전시켰다.
8. 산물을 여과지를 통해 진공 여과하고, 침전물을 건조하였다.
재료 2
폴리(글리세롤-코-세바신산)
DJS-CP 티오벤조일 티오글리콜릭산 클로라이드-1 또는 다른 산 클로라이드 연쇄 전달제; 및
베이스 촉매로서 트리에틸아민
방법 2
1. 1mL 무수 디클로로메탄에 용해된 100mg 건조 PGS를 슈렌크 플라스크에 넣었다. 그 다음, 트리에틸아민(산 클로라이드와 등몰)을 첨가하였다.
2. 그 혼합물을 불활성 가스하에서 0℃로 냉각하였다.
3. DJS-CP-티오벤조일-티오글리콜릭산 클로라이드-1(폴리머 히드록실기의 원하는 기능화에 대비하여 2x mol/mol의 산 클로라이드)를 서서히 첨가하였다.
4. 반응은 실온에 이르게 하고 24시간동안 반응시켰다.
5. 그 용액을 여과하여 트리에틸아민 염을 제거하였다.
6. 여과액을 에틸 에테르에서 침전시켜 미반응 산 클로라이드 및 트리에틸아민을 제거하였다.
7. 침전물을 여과 후 진공건조하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 이러한 공정은 S-티오벤조일-티오글리콜릭산 연쇄 전달제로 기능화된 CP-PGS-CTA 폴리(글리세롤-코-세바신산)을 생성하였다.
실시예 7 - 시험관내 및 생체내에서 시험된 주입가능한 하이드로겔
시험관내에서 시험된 주입가능한 하이드로겔
수용해성 폴리머 화합물은 생리학적 조건하에서 신속히 겔화하며 또한 조정가능한 팽창 특성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 폴리머 화합물은 다음과 같이 포함하였다:
1. 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트(ETTMP1300). CAS 345352-19-4. MW 1300g/mol. Bruno Bock GmbH, Marchacht, Germany.
2. 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트(ETTMP700). CAS 345352-19-4. MW 700g/mol, Bruno Bock GmbH, Marschacht, Germany.
3. 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA400). CAS 26570-48-9. MW 400g/mol. Polysciences, Warrington, PA, USA.
4. 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA400). CAS 26570-48-9. MW 4000g/mol. Polysciences, Warrington, PA, USA.
제형
ETTMP1300 및 ETTMP700은 3 티올 작용기를 함유한다. PEGDA400 및 PEGDA400은 2 아크릴레이트 작용기를 함유한다. 상기 화합물들은 티올 및 아크릴레이트 작용기가 등몰이 되도록 혼합되었다. 그 다음, 상기 화합물들을 PBS pH 7.4(Gibco, Carlsbad, CA)에 용액내 20, 25, 30w/v% 총 폴리머로 용해하였다. 어느 조합의 아크릴레이트 및 티올 함유 폴리머가 사용될 수 있다. 하지만, 보다 높은 분자량의 아크릴레이트가 보다 큰 팽창을 일으킨다. 팽창을 감소시키기 위해, 보다 낮은 분자량의 아크릴레이트(예, PEGDA400와 유사한 분자량을 갖는)가 이용될 수 있다.
졸에서 겔로의 전환 속도
다른 농도의 폴리머 및 염수 용액(ETTMP1300/PEGDA400) 200마이크로리터를 1.5mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 어두운 곳에서 37℃에서 배양하거나 22℃ 실온에 두었다. 표 3은 졸이 겔로 변하는 전환 속도를 나타낸 것이며, 이는 용액이 더 이상 흐르지 않을 경우 일어난 것으로 간주하였으며, 튜브를 수동적으로 위로 아래로 돌리거나 흔들어서 모니터하였다(그룹당 3시료).
PBS pH 7.4에서 티올-아크릴레이트 농도에 따른 전환 속도
온도
농도(w/v%) 22℃ 37℃
20 11시간 후 겔화되지 않았음 25분
25 25분 15분
30 15분 10분
팽창성 시험
1.5mL 겔(n=6)을 37℃에서 경화하였으며, 질량 및 부피를 측정하고, 후속적으로 37℃, 300mL PBS pH 7.4에 넣고 7일간 평형화되도록 하였다.
팽창 비는 평형시 하이드로겔의 부피 대 경화 후 하이드로겔의 초기 부피의 비로 정의될 수 있다. 다른 유익한 측정은 초기 하이드로겔 폴리머 중량퍼센트 대 평형 하이드로겔 폴리머 중량퍼센트의 비이다. 초기 폴리머 중량퍼센트는 제형에 의해 검출된다. 평형 폴리머 중량퍼센트는 평형 후 하이드로겔 습 질량을 측정함으로써 검출된다. 후속적으로, 하이드로겔을 동결건조하고, 건조 질량을 측정한다. 평형 폴리머 중량퍼센트는 건조 질량 대 습 질량의 비로 나타내어진다. 이를 초기 폴리머 중량퍼센트와 비교하면 또한 팽창 지수가 주어진다. 하이드로겔의 전환 및 분해 정도는 평형 후 건조 질량을 하이드로겔에 첨가된 초기 폴리머 질량과 비교함으로써 모니터될 수 있다.
생체내에서 시험된 주입가능한 하이드로겔
ETTMP1300 및 PEGDA400의 25w/v% 용액은 두 스톡 용액으로부터 혼합에 의해 제조되었다: 바이얼 1, 3.28mL PBS에 용해된 1720mg ETTMP1300; 바이얼 2, 4.21mL PBS에 용해된 794mg PEGDA400. 스톡 용액을 멸균 여과하고(0.2μm Supor membrane Acrodisc syringe filter, PALL life science), 멸균 조건하에서 별도의 200μL 분액으로 파이펫팅하였다.
좌상 손상은 250g 래트를 대상으로 Infinite Horizon 충격기(250kdynes)를 이용하여 마취하에서(이소플루란) T8에서의 척수를 라미넥토미에 의해 노출시켜 수행되었다.
6시간(4마리) 또는 3일(4마리)에, 래트들을 재마취시키고, 척수를 좌상 크기로 재노출시켰다. 뇌고정 프래임을 이용하여, 5μL 염수 및 15μL의 티올-아크릴레이트 겔 용액(PBS에 ETTMP1300 및 PEGDA400를 함유하는 두 200μL 분액의 혼합에 의해 형성됨)이 적재된 25μL 주사기(Hamilton 1802RN, 26게이지 블런트 니들)를 (경막의 등 안쪽 표면으로부터 측정된)외상의 에피센터에 척수내로 1.1mm 삽입하였다. 겔은 5분에 걸쳐 3μL/분의 속도로 주입되었다. 주사기 제거시 겔이 겔이 제거되지 않도록 주사기에 겔의 부착을 방지하기 위해 주사기내에 추가 염수가 제공되었다. 분액들을 혼합한 후 남은 하이드로겔은 실온에서 약 20분에 경화되었다. 척수내부의 겔은 7분이하에 완전히 경화된 것으로 추정되었다. 주사기 제거시, 소량의 잔존 겔이 주사후 5-7분에 관찰되었다.
래트는 Basso Beattie Bresnahan(BBB) 스코어링을 이용하여 손상을 받았지만 주사받지 않은 대조군과 함께 14일의 기간에 걸쳐 기능에 대해 모니터된다. 2주 후, 래트를 안락사시키고, 손상의 크기 및 특성(헤마톡실린 및 에오신 염색) 뿐만 아니라 염증 마커(GFAP, Iba1 면역조직화학)를 평가하기 위한 조직 분석용으로 척수를 수집하였다.
실시예 8 - 메틸프레드니솔론 마이크로파티클
제조
단일 뱃치의 단일 에멀젼 마이크로파티클(~250mg)을 제조하기 위한 방법은 다음과 같다.
용액 제조
간단한 오염 예방책으로서, 모든 비이커를 에탄올 및 아세톤으로 세척한다. 증류 탈이온수를 이용하여 0.25중량% 폴리(비닐 알코올)(PVA) 및 0.5M 소디움 클로라이드(NaCl)를 함유하는 800mL 수용액을 제조한다. 용해를 돕기위해 핫 플래이트를 이용하여 고형분을 용해하고, 그 용액을 실온으로 냉각한다(또는 균질화는 거품을 발생시킬 수 있다). 1리터 0.5M 소디움 클로라이드 용액을 제조한다. 450mg 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)(Boehringer Ingelheim RG502H, MW 11,600g/mol)를 칭량하고 1.1mL 메틸렌 클로라이드(DCM)에 용해한다. 500mg 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트(MPss)를 칭량하고, 400μl 메탄올에 용해한다. 메틸렌 클로라이드와 메탄올 용액을 혼합한다.
균질화
중간 크기의 헤드를 갖는 호모게나이저를 물, 아세톤 그리고 다시 물로 세척하여 준비한다. 보다 작은 호모게나이저 헤드를 800mL PVA/NaCl 용액에 넣고, 속도를 6500rpm으로 설정한다. 혼합된 PLGA/DCM/MPss/메탄올 혼합물을 유리 파이펫으로 주입하고 20초간 균질화한다. 헤드를 꺼내어 물로 세정한다. 균질화 용액(약 800mL)을 1리터 0.5M NaCl 용액에 붓는다. 자성 바를 이용하여 교반 플래이트상에서 1시간동안 400rpm으로 교반한다.
여과, 세척 및 동결건조
교반된 1.8리터 용액을 진공 및 에틸 아세테이트 필터를 통해 여과하여 PVA 및 DCM을 제거한다. 증류수로 필터를 세정하고 마이크로파티클을 수집한다. 현탁된 마이크로파티클을 50mL 팔콘 튜브에 붓는다. 그 튜브를 1500rcf에서 3분간 원심분리한다. 상층물을 증류 탈이온수로 대체하고, 마이크로파티클을 재현탁시킨다. 이를 3회 반복한다. 최종 원심분리 단계 후, 상층물을 제거하고, 이를 5mL 증류 탈이온수에 재현탁시킨다. 현탁물을 액체질소가 담긴 팔콘 튜브에서 동결건조하고, 동결건조기에서 mTorr 진공하에 둔다. 건조된 마이크로파티클을 에펜도르프 튜브에 분액하고, 전기 빔 멸균(3mRad)을 위해 포장한다.
시험관내에서 티올-아크릴레이트 하이드로겔에 현탁된 마이크로파티클에서 메틸프레드니솔론의 방출
방출 시험 셋업
마이크로파티클은 16mg의 메틸프레드니솔론 PLGA 마이크로파티클(상기한 바와 같이 제조된)을 160μL의 25w/v%의 티올-아크릴레이트 하이드로겔 용액으로 보텍싱하여 하이드로겔에 현탁되었다. 50μL의 현탁액을 15mL 팔콘 튜브에 3회 파이펫팅하였으며, 겔은 튜브의 바닥에서 경화되었다. 10mL PBS를 상기 튜브에 하이드로겔의 상부에 첨가하고, 튜브를 밀봉하고, 이를 37℃ 오비탈 쉐이커의 상부에 놓았다. 일반적인 시간 간격으로 14일에 걸쳐, 300μL 분액을 상층물로부터 수집하였다.
HPLC에 의한 약물 방출의 분석
하이드로겔-마이크로파티클 디폿으로부터 메틸프레드니솔론의 방출 속도는 다양한 시점에 취해진 시료를 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석함으로써 측정되었다.
238nm UV 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템이 사용되었다. Atlantis dC18 5μm 4.6mm x 250mm 컬럼(Waters, Ireland)이 사용되었다. 이동상은 1mL/분의 흐름 속도에서 아세토니트릴, 물 및 포름산(60:40:1 부피비)을 함유하였다. 주입량은 5μL이었다. 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트는 이러한 조건하에서 8.4분의 체류시간을 가졌다. 피크 영역에 기초한 스탠다드 곡선은 0.9997의 r-제곱값을 갖는 선형 적합도로 85-2.66μg/mL의 기하학적으로 희석된 6 시료를 이용하여 생성되었다.
50μL 하이드로겔내에 5mg 마이크로파티클을 함유한 3개의 하이드로겔-마이크로파티클에 기초한 방출 곡선을 도 8에 나타내었다.
실시예 9 - 정신적 척수 외상의 치료를 위한 투여량
래트 척수에서, 15μL의 하이드로겔을 좌상 손상의 경막내 골수내 에피센터내로 주입하는 것이 실현가능하였다. 실시예 8의 제형(25w/v%의 티올-아크릴레이트 하이드로겔 용액 + 1.5mg 메틸프레드니솔론 함유 마이크로파티클)에 기초하여, 이는 1-2주에 걸쳐 조절된 방식으로 방출된 15μg의 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트의 투여량에 상응한다. 임상 셋팅시, 래트에서 척수 T8에서의 직경이 2.8mm인대 비해 인간 척수의 직경이 약 10mm인 사실에 기초하여, 150μL의 하이드로겔을 동일한 충격으로 인간 척수 손상내로 주입하는 것이 실현가능하다. 이는 2차 손상의 시간 코스도중에 손상 부위에 직접 방출되는 150μg의 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트의 투여량에 상응한다.
실시예 10 - 말초 신경 치료
정신적외상 또는 만성 퇴행(예, 신경 루트 충격)에 의해 야기되는 말초 신경에 대한 손상에 기인한 염증의 경우에, 손산 부위에 근접하게 하이드로겔을 주입하는 것이 실현가능하다. 이러한 경우에, 투여량은 염증 부위를 감싸는 이용가능한 공간에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1mL의 하이드로겔이 신경에 인접하게 주입될 수 있다면, 1-2주에 걸쳐 방출되는 1mg 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트의 투여량이 투여될 수 있다.
본 발명은 상기 특정 구현으로 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 정의되고, 상기 상세한 설명 및/또는 첨부된 도면으로 나타낸 본 발명의 정신 및 범위내에 있는 모든 변형들을 포함하는 것으로 의도된다.

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  31. 1) 온도반응성 하이드로겔을 형성하는 생리적 조건하에서 졸을 겔로 전환하는 하나 이상의 폴리머 및 2) 하나 이상의 치료제를 포함하는 매트릭스를 포함하며,
    상기 하나 이상의 폴리머는 4000g/mol이하의 수 평균 분자량을 가지며, 그리고 에톡실레이티드 트리메틸올프로판 트리-3-메르캅토프로피오네이트 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트를 포함하며, 그리고
    상기 하나 이상의 치료제는 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론의 약학적으로 허용되는 염, 및 덱사메타손의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상 타입의 스테로이드를 포함하며, 그리고
    여기서 상기 매트릭스는 시간 경과에 따라 척수 외상 부위에 상기 스테로이드를 방출하도록 형성되는, 시간 경과에 따라 2차 외상을 일으키는 척수 외상을 치료하기 위한 약물 전달용 조성물.
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  36. 제 31항에 있어서, 상기 온도반응성 하이드로겔은 생분해성이며, 상기 하이드로겔 성분은 생분해성이거나 생체적합성이면서 배설가능하며, 또는 상기 하이드로겔은 생분해성 성분 및 생체적합성이면서 배설가능한 성분의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  37. 제 31항에 있어서, 상기 매트릭스는 파티클을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 파티클은 마이크로파티클, 나노파티클 또는 마이크로파티클과 나노파티클의 조합물인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 파티클은 생분해성 폴리머, 배설가능한 생체적합성 폴리머, 또는 생체적합성이면서 배설가능한 성분을 포함하는 생분해성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  40. 제 37항에 있어서, 상기 파티클은 폴리에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  41. 제 37항에 있어서, 상기 파티클은 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드; 및 폴리(카르복시페녹시 프로판)-코-세바신산으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  42. 제 37항에 있어서, 상기 파티클은 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)를 포함하는 마이크로파티클인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  43. 제 31항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 NOS 또는 NO 생성의 인히비터, 항산화제 또는 항산화제들, 스핀 트랩 및 페록시니트라이트 스캐빈저, 및 이들의 어느 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  44. 제 31항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 항산화제 또는 항산화제들, 템폴 (4-히드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실), 요산, 미노시클린, MnTBAP, 및 이들의 어느 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  45. 제 31항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 미노시클린 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  46. 제 31항에 있어서, 상기 매트릭스는 상기 하나 이상의 치료제 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 기능화되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  47. 삭제
  48. 제 37항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 온도반응성 하이드로겔, 파티클 또는 온도반응성 하이드로겔과 파티클 모두에 용해 또는 분산되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 다수의 치료제이며, 하나 이상의 상기 다수의 치료제는 하이드로겔에 용해 또는 분산되며, 하나 이상의 다른 하나의 상기 다수의 치료제는 파티클에 용해 또는 분산되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  50. 삭제
  51. 제 37항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 NOS 또는 NO 생성의 인히비터, 항산화제 또는 항산화제들, 스핀 트랩, 페록시니트라이트 스캐빈저, NOS 또는 NO 생성의 인히비터의 약학적으로 허용되는 염, 및 이들의 어느 약학적으로 허용되는 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  52. 제 37항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 미노시클린 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  53. 제 38항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 상기 마이크로파티클에 용해 또는 분산되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  54. 제 38항에 있어서, 상기 하이드로겔 및 마이크로파티클 중 하나 또는 둘 모두는 상기 하나 이상의 치료제로 기능화되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
  55. 제 31항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 비타민 C, 비타민 E, 비타민 E의 약학적으로 허용되는 염 또는 비타민 C의 약학적으로 허용되는 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
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