KR101351805B1 - 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 정량적 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Listeria monocytogenes 검출용 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물, 이를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 키트 및 이 조성물을 이용하여 Listeria monocytogenes를 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하면 종래의 24~48시간의 오랜 배양 시간 후 동정하는 것에 비하여 매우 빠른 시간에 오염여부를 진단 할 수 있어 신속한 진단을 효과적으로 수행 할 수 있다. 또한 다양한 식품에 대하여 각각 정량용 표준곡선을 작성하여 이들 식품군에 L. monocytogene가 검출 되었을 때 검체의 양이 어느정도 인지 계산 할 수 있는 정량적 검사가 가능하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 다른 균종 뿐만 아니라 동일한 리스테리아균으로부터 L. monocytogenes를 감별 할 수 있는바 특이적인 검출 및 진단이 가능하다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하면 종래의 24~48시간의 오랜 배양 시간 후 동정하는 것에 비하여 매우 빠른 시간에 오염여부를 진단 할 수 있어 신속한 진단을 효과적으로 수행 할 수 있다. 또한 다양한 식품에 대하여 각각 정량용 표준곡선을 작성하여 이들 식품군에 L. monocytogene가 검출 되었을 때 검체의 양이 어느정도 인지 계산 할 수 있는 정량적 검사가 가능하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 다른 균종 뿐만 아니라 동일한 리스테리아균으로부터 L. monocytogenes를 감별 할 수 있는바 특이적인 검출 및 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 Listeria monocytogenes 검출용 프라이머 세트에 관한 발명이다. 보다 상세하게는 본 발명은 Listeria monocytogenes 을 검출하기 위하여 제작한 프라이머 세트, 이를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물 및 단계희석한 시료에 대해 실시간 PCR을 수행하여 작성한 표준곡선을 이용하여 Listeria monocytogenes 를 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
최근 현대인들의 식생활이 서구화되고 젊은 층 중심의 소비구조로 변화하면서 편의식 및 즉석식품의 수요가 증대되고 있는데, 햄, 소시지, 분쇄 가공육, 육포와 같은 가공제품은 대표적인 즉석식품의 예이다. 이러한 축산가공품은 풍부한 영양소와 많은 수분을 함유하고 있어서 저온 유통과정 중에 미생물 증식에 의해 부패가 쉽게 일어날 수 있을 뿐만 아니라, 분쇄 또는 혼합과정에서 미생물의 오염에 의한 안전성 문제가 제기될 수 있다
특히, Listeria monocytogenes는 인수공통전염병의 원인체 중 하나로 우유나 치즈 등과 같은 축산식품을 통해 사람에게 전염될 수 있어서, 최근 전세계적으로 주목받고 있는 병원성 식중독균 중 하나이다. Listeria monocytogenes에 감염되어 리스테리아증이 발생하면 사망율이 약 30% 정도로 매우 높다. 특히 사람 감염의 경우 영유아, 장기이식환자, 림프종, AIDS 환자 등 면역력이 약하거나 면역부전인 사람이 감염되기 쉽고 패혈증, 뇌염 및 수막염을 유발하기도 한다.
Listeria monocytogenes가 감염되는 주된 원인은 Listeria monocytogenes에 오염된 식품을 직접섭취하는 것으로 알려져 있다. 원재료인 축산물에 존재하기도 하고, 바로 먹을 수 있는 식품의 가공과정 도중에 오염되어 유통되기도 한다. Listeria monocytogenes는 특정 식품이 아니라 매우 다양한 식품에 오염될 수 있는데, 현재 리스테리아가 검출된 식품만 해도 치즈, 우유 등 유제품, 생 채소, 코울 슬로우, 닭고기나 핫도그 등의 가공육제품등 광범위 하다. 또한, 안전한 재료를 구입하였더라도 음식을 조리하는 과정에서도 오염될 가능성이 있다. 특히 축산물과 생 채소 등의 식품을 같이 조리하는 과정에서 교차오염이 발생하여 문제를 일으키는 경우가 많다.
Listeria monocytogenes는 다른 병원성 균과는 달리 저온에서도 성장이 가능한 특성을 가지고 있으며, 37℃에서 성장한 균보다 4℃에서 성장한 균의 병원성이 더 강한 것으로 알려져 있다. 이러한 균의 특성으로 인해 가정에서 안전하다고 생각되는 냉장보관 중인 음식이나 냉장 식품과 저장 식품에도 Listeria monocytogenes에 의한 식중독이 발생할 수 있다.
현재 식품에서 Listeria monocytogenes의 검출규격은 우리나라뿐만 아니라 미국, 호주 등의 국가에서도 25g의 식품샘플에서 불검출을 기준으로 하고 있다. 이에 각 나라의 검사기관에서는 천천히 자라는 Listeria monocytogenes의 특성을 고려한 예비 증균법을 기초로 한 검출법을 사용하고 있다. 그러나 이러한 배지 검출법은 보통 음성의 결과가 나오기까지 최소한 5일의 기간이 필요하며 양성의 경우 7-8일을 필요로 하는 등 시간이 많이 소모되는 단점이 있다.
상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여 본 출원의 발명자들은 빠른 시간 내에 적은 양의 시료로도 정확한 Listeria monocytogenes검출이 가능한 방법의 개발을 위하여 예의 노력한 결과 Listeria monocytogenes를 검출할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용하여 시료에 원인체를 정량적으로 분석할 수 있는 분석방법을 개발하기에 이르렀다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 Listeria monocytogenes 검출용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물을 제공함에 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 키트를 제공함에 있다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 Listeria monocytogenes를 정량적으로 분석하는 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 의 프라이머 및 서열번호2의 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 이루어진 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 바람직하게는 본원 발명의 Listeria monocytogenes 검출용 조성물은 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'말단 및 3'말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black hole quencher-1,2,3 (BHQ-1,2,3)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 Listeria monocytogenes를 정량적으로 분석하는 방법으로서,
(1) 상기 조성물에 10배씩 단계 희석한 시료를 혼합하여 유전자 분석 시료를 준비하는 단계;
(2) 단계(1)의 유전자 분석 시료에 대하여 실시간 PCR을 수행하여 PCR산물을 수득하는 단계;
(3) 단계(2)의 PCR 산물을 정량하여 표준곡선을 수득하는 단계; 및
(4) 상기 표준곡선을 이용하여, 시료로부터 추출한 균의 DNA를 정량하는 단계;
를 포함하는 분석 방법을 제공한다. 상기 시료는 바람직하게는 축산물, 유제품, 채소, 축산가공품으로 이루어진 그룹에서 선택된 것이다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하면 종래의 24~48시간의 오랜 배양 시간 후 동정하는 것에 비하여 매우 빠른 시간에 오염여부를 진단 할 수 있어 신속한 진단을 효과적으로 수행 할 수 있다. 또한 다양한 식품에 대하여 각각 정량용 표준곡선을 작성하여 이들 식품군에 L. monocytogene가 검출 되었을 때 검체의 양이 어느정도 인지 계산 할 수 있는 정량적 검사가 가능하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 다른 균종 뿐만 아니라 동일한 리스테리아균으로부터 L. monocytogenes를 감별 할 수 있는바 특이적인 검출 및 진단이 가능하다.
도 1은 L. monocytogenes ATCC 19115 표준균주를 배양한 후 105 cfu/㎖ 부터 100 cfu/㎖ 까지 단계희석한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시한 결과이다. (A)는 증폭곡선을 나타내며, 2∼3 × 105 cfu/㎖부터 2∼3 × 100 cfu/㎖ 일정한 간격의 증폭곡선을 볼 수 있다. (B)는 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 도 (C)는 단계희석 별 L. monocytogenes를 oxford agar(OX agar)상에 plating하여 균 수를 센 결과 이다. 100 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었으며 아래의 균 수 counting 결과 약 2 cfu/g까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
도 2는 햄에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 3은 햄 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 3 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 4는 소시지에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 5는 소시지 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 3 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 6은 분쇄가공육에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 7은 분쇄가공육 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 8은 육포에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 9는 육포 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 10은 L. monocytogenes 배양액에 대하여 평판배양법을 이용하여 균 수를 센 결과와 배양액 단계희석 후 각 희석액을 햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포에 접종시킨 후 평판배양법을 이용하여 균 수를 센 결과를 비교한 것이다. 약 6～11배 정도의 차이가 났으며 10g의 각 샘플에 접종된 것이므로 균 수의 변화는 일정함을 알 수 있다.
도면 11은 L. monocytogenes 6주 (ATCC 15313, ATCC 19111, ATCC 19113, ATCC 19114, ATCC 19115) (도면 왼쪽), L. innocua 1주 (ATCC 33090), L. ivanovii 1주 (ATCC 700402), L. seeligeri 1주 (ATCC 35967), L. muttayi 1주 (ATCC 25401) (도면 오른쪽)에 대하여 상기 방법으로 real time PCR을 수행한 결과이다. L. monocytogenes 균종 이외에는 전혀 증폭되지 않음을 확인하였다.
도면 12는 국내 축산가공품에서 분리한 L. monocytogenes 분리주 13주에 대하여 상기 방법으로 real time PCR을 수행한 결과이다. 모든 분리주에서 증폭됨을 확인하였다.
도면 13은 Listeria monocytogenes ATCC 19111 (serotype 1), ATCC 19112 (serotype 2), ATCC 19113 (serotype 3a), ATCC 19114 (serotype 4a), ATCC 19115 (serotype 4b)를 각각 1 cfu/㎖에 대하여 DNA 추출하여 특이 프라이머 및 프루브 세트로 real time PCR을 실시한 증폭곡선 사진으로 1 cfu/㎖ 검출한계 여부를 실험한 사진이다. 각 Listeria monocytogenes의 서로 다른 혈청형에 대하여 모두 1 cfu/㎖까지 검출할 수 있음을 확인하였다.
도 2는 햄에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 3은 햄 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 3 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 4는 소시지에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 5는 소시지 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 3 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 6은 분쇄가공육에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 7은 분쇄가공육 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 8은 육포에 L. monocytogenes 희석액 (105 cfu/㎖부터 100 cfu/㎖ 까지)을 접종한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 102 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 9는 육포 접종액을 3시간 배양한 후 DNA를 추출하여 real time PCR을 실시하고 본 실험을 3회 수행한 후 Ct 결과값들의 평균값에 대하여 표준곡선을 작성한 결과이다. 101 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었다.
도면 10은 L. monocytogenes 배양액에 대하여 평판배양법을 이용하여 균 수를 센 결과와 배양액 단계희석 후 각 희석액을 햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포에 접종시킨 후 평판배양법을 이용하여 균 수를 센 결과를 비교한 것이다. 약 6～11배 정도의 차이가 났으며 10g의 각 샘플에 접종된 것이므로 균 수의 변화는 일정함을 알 수 있다.
도면 11은 L. monocytogenes 6주 (ATCC 15313, ATCC 19111, ATCC 19113, ATCC 19114, ATCC 19115) (도면 왼쪽), L. innocua 1주 (ATCC 33090), L. ivanovii 1주 (ATCC 700402), L. seeligeri 1주 (ATCC 35967), L. muttayi 1주 (ATCC 25401) (도면 오른쪽)에 대하여 상기 방법으로 real time PCR을 수행한 결과이다. L. monocytogenes 균종 이외에는 전혀 증폭되지 않음을 확인하였다.
도면 12는 국내 축산가공품에서 분리한 L. monocytogenes 분리주 13주에 대하여 상기 방법으로 real time PCR을 수행한 결과이다. 모든 분리주에서 증폭됨을 확인하였다.
도면 13은 Listeria monocytogenes ATCC 19111 (serotype 1), ATCC 19112 (serotype 2), ATCC 19113 (serotype 3a), ATCC 19114 (serotype 4a), ATCC 19115 (serotype 4b)를 각각 1 cfu/㎖에 대하여 DNA 추출하여 특이 프라이머 및 프루브 세트로 real time PCR을 실시한 증폭곡선 사진으로 1 cfu/㎖ 검출한계 여부를 실험한 사진이다. 각 Listeria monocytogenes의 서로 다른 혈청형에 대하여 모두 1 cfu/㎖까지 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 서열번호 1 (LMinlAF)의 프라이머 및 서열번호2 (LMinlAR)의 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
서열번호 1의 프라이머 LMinlAF는 Listeria monocytogenes internalin A forward를 의미한다.
서열번호 2의 프라이머 LMinlAR은 Listeria monocytogenes internalin A reverse를 의미한다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “검출”은 시료에서 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 리스테리아균으로부터 Listeria monocytogenes 를 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 프라이머를 이용하여 미생물을 검출하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 핵산 증폭 방법에 따라 실시할 수 있다. 일 예로 1) 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 반응 조성물에 DNA 중합효소를 혼합하는 단계, 2) 상기 1) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA를 첨가하는 단계, 3) 상기 2) 단계에서 제조된 검체 DNA를 포함하는 반응액에 대하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 과정으로 수행할 수 있다.
핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 브루셀라균의 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄일 때, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머로 이루어진 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물을 제공한다.
Listeria monocytogenes 검출용 조성물에는 상기의 프라이머 세트 이외에, 중합효소, Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP을 포함할 수 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 (즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 50℃ 내지 75℃이고 보다 바람직하게는 55℃ 내지 70℃이고, 가장 바람직하게는 65℃ 내지 68℃이다.
본 발명의 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리 (또는 정제)는 증폭과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다.
또한, 바람직하게는 본원 발명의 Listeria monocytogenes 검출용 조성물은 서열번호 3의 프로브 (LMinlAP)를 추가로 포함할 수 있다.
서열번호 3의 LMinlAP는 Listeria monocytogenes internalin A probe를 의미한다.
본 발명에서 “프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'말단 및 3'말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black hole quencher-1,2,3 (BHQ-1,2,3)일 수 있으며, 이에 한정 되는 것은 아니다.
프로브의 5'말단 및 3'말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것 일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'말단의 형광물질 에너지에 의해 5'말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5' 말단의 형광물질이 유리되면서 3'말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 Listeria monocytogenes를 정량적으로 분석하는 방법으로서,
(1) 상기 조성물에 10배씩 단계 희석한 시료를 혼합하여 유전자 분석 시료를 준비하는 단계;
(2) 단계(1)의 유전자 분석 시료에 대하여 실시간 PCR을 수행하여 PCR산물을 수득하는 단계;
(3) 단계(2)의 PCR 산물을 정량하여 표준곡선을 수득하는 단계; 및
(4) 상기 표준곡선을 이용하여, 시료로부터 추출한 균의 DNA를 정량하는 단계;
를 포함하는 분석 방법을 제공한다.
상기 시료는 바람직하게는 축산물, 유제품, 채소, 축산가공품으로 이루어진 그룹에서 선택된 것일 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<
실시예1
>
Listeria
monocytogenes
배양액으로부터
DNA
분리
L. monocytogenes ATCC 9115 표준균주를 BHI broth 5㎖에 접종한 후 37 ℃에서 24~48시간 배양하면 약 1X109 CFU (colony forming unit)/㎖이 되며, 15㎖용 튜브에 멸균증류수 9㎖씩 분주한 후 배양액 1㎖을 덜어 각 튜브마다 1㎖씩, 10배씩 단계 희석하여 최종 100까지 희석하였다. 또한 정확한 균수 계산을 위하여 101과 102에 해당하는 샘플에 대하여 평판배양법을 이용하여 균수를 측정하였다. 희석액 중 105부터 100까지의 튜브에서 1㎖씩 덜어 에펜도르프 튜브에 분주하여 배양액 DNA 추출에 사용하였다. 나머지 희석액은 햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포에 인위적으로 오염시켰다.
<
실시예2
> 정량적
real
time
PCR
을 위한
L.
monocytogenes
인공접종 실험 및
DNA
추출
햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포에서 각각 10g씩 6개 준비하여 필터 기능이 있는 stomacher bag에 잘게 분쇄하여 넣었다. L. monocytogenes 배양에 사용되는 fraser broth 49㎖을 각 bag에 분주한 후 위의 단계 희석액을 105부터 100까지 각 식품군 샘플 6개에 1㎖씩 인공 접종시킨 후 stomacher에서 1분간 균질화 시켰다. 균질화 시킨 각 샘플을 100㎖용 배양병에 모두 분주한 후 각각 1㎖씩 덜어 DNA 추출에 사용하고 나머지는 37 ℃에서 3시간 동안 배양한 후 다시 1㎖씩 덜어 DNA 추출에 사용하였다. 상기 실험은 신뢰성 확보를 위하여 3회 실시하였다.
모든 DNA 추출은 ABI사의 Prepseq rapid spin sample preparation kit (with proteinase K)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 분리하였다.
또한 각 식품군 별 접종액의 균수와 접종 전 배양액의 균수를 서로 비교하기 위하여 접종액에 대하여 10배씩 단계별로 희석한 후 마지막 희석액 및 바로 전 단계의 희석액에 대하여 1㎖씩 2회 덜어내어 평판배양법을 적용하여 균수를 측정하였다.
<
실시예3
> 정량적
real
time
PCR
프라이머
및
프루브
제작
L. monocytogenes와 다른 Listeria 종을 감별할 수 있는 부위를 선정하고 프라이머 및 프루브 제작 프로그램을 이용하여 프라이머와 프루브를 제작하였다. L. monocytogenes의 표면단백질 유전자 중 하나인 internalin A (inlA) 유전자에 대하여 ABI사가 제공하는 Primer Express software v2.0을 이용하여 프라이머 및 프루브를 제작하고 프라이머 및 프루브를 각각 LMinlAF, LMinlAR, LMinlAP로 명명하였다. 또한 프루브는 5‘ 부분에 FAM dye를, 3’쪽에 TAMRA dye를 붙여 제작하였다.
<
실시예
4>
L.
monocytigenes
배양액 및 접종액
DNA
에 대한
real
time
PCR
실시
L. monocytogenes 배양액 (105 ～100 cfu/ml)과 이에 대한 각 식품군별 접종액 및 3시간 배양후의 접종액 DNA에 대하여 제작한 프라이머 및 프루브를 이용하여 real time PCR을 실시하였다. 전체 30㎕ 반응액으로서 real time PCR 전용 96 well에 DNA template 12㎕, 각 프라이머 500nM, 프루브 230nM, TaqMan realtime PCR master mix (ABI) 15㎕를 분주하였다. Real time PCR은 95℃에서 10분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 95℃에서 15초간 변성(denaturation), 60℃에서 60초간 어닐링 (annealing) 시키는 과정을 45회 반복하였다.
배양액 및 각 식품군 접종액 및 3시간 접종액에 대한 DNA 추출 실험을 3회에 걸쳐 수행하였으므로, 추출한 모든 샘플에 대하여 real time PCR도 3회 실시하였다.
<
실시예
5> 각 식품군별 표준곡선 작성 및 검출한계 확인
L. monocytogenes 배양액 단계 희석액 및 각각의 식품군 (햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포)에 대한 접종액을 대상으로 real time PCR 실시하였으며 이를 기초하여 표준곡선을 작성하였다. 각 표준곡선의 threshold cycle 값 (Ct값)에 대하여 3회 실시한 결과값의 평균값을 최종 Ct값으로 정하였다.
표준균주에 대하여 단계희석 한 뒤 DNA를 추출하여 PCR을 실시한 증폭곡선 결과는 도1의 (A)에서 나타내고 있으며 표준곡선은 도1의 (B)에서 나타내고 있다. 도 (C)는 단계희석 별 L. monocytogenes를 oxford agar(OX agar)상에 plating하여 균 수를 센 결과 이다. 100 cfu/㎖까지 검출됨을 알 수 있었으며 아래의 균 수 counting 결과 약 2 cfu/g까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
검출한계는 각각의 식품군에서 접종직후와 접종 후 3시간 배양한 결과를 비교하여 어느 정도의 cfu/g까지 검출가능한지 비교하였다. 햄의 경우 접종직후엔 102 cfu/g까지 검출이 가능하였고 3시간 배양 후에는 3 cfu/g까지 검출이 가능하였다 (도 2, 3).
소시지의 경우에는 접종직후엔 101 cfu/g까지 검출이 가능하였으며 3시간 배양후에는 햄과 마찬가지로 3 cfu/g까지 검출 가능하였다 (도 4, 5).
분쇄육의 경우에는 접종직후엔 102 cfu/g까지 검출이 가능하였고 3시간 배양 후에는 101 cfu/g까지 검출이 가능하였다 (도 6, 7).
육포의 경우에는 분쇄육과 비슷하게 접종직후엔 102 cfu/g까지 검출 가능하였으나 3시간 배양 후에는 101 cfu/g까지 검출이 가능하였다 (도 8, 9).
<
실시예
6>평판배양법과
real
time
PCR
의 비교
L. monocytogenes 배양액에 대하여 10배씩 단계희석한 후 102 cfu/㎖ 와 101 cfu/㎖에 해당하는 tube에서 각각 1㎖씩 2회 덜어내어 L. monocytoenes 동정용 배지인 Oxford 배지 각 2장씩에 분주 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 또한 각 식품군 (햄, 소시지, 분쇄가공육, 육포)에 접종시킨 후 위와 같은 방법으로 평판 배양하였다.
배양액과 접종액의 균 수 변화를 비교한 결과 각 배양액의 희석액에서 약 6～11배정도 희석되었음을 확인할 수 있었다(도 10).
<
실시예
7> 교차반응 (
Cross
reactivity
)을 통한
real
time
PCR
의 특이성 확인
프라이머 및 프루브를 사용한 real time PCR의 Listeria 종에 대한 특이성을 확인하기 위해 L. monocytogenes 6주 (ATCC 15313, ATCC 19111, ATCC 19113, ATCC 19114, ATCC 19115) (도11 왼쪽), L. innocua 1주 (ATCC 33090), L. ivanovii 1주 (ATCC 700402), L. seeligeri 1주 (ATCC 35967), L. muttayi 1주 (ATCC 25401) (도11의 오른쪽)에 대하여 상기 방법으로 real time PCR을 수행하였다. 그 결과 L. monocytogenes 균종 이외에는 전혀 증폭되지 않음을 확인하였다. (도 11)
또한 국내 축산가공품에서 분리된 L. monocytogenes 분리주 13개에 대하여 본 real time PCR법을 적용한 결과 모두 증폭되었으며 L. monocytogenes 진단에 용이함을 알 수 있었다. (도 12)
<
실시예
8>
Listeria
monocytogenes
검출 감도의 확인
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트에 따른 Listeria monocytogenes 검출 감도를 확인하기 위하여 서로 다른 혈청형에 대하여 real time PCR을 수행하였다.
Listeria monocytogenes ATCC 19111 (serotype 1), ATCC 19112 (serotype 2), ATCC 19113 (serotype 3a), ATCC 19114 (serotype 4a), ATCC 19115 (serotype 4b)를 각각 1 cfu/㎖에 대하여 DNA 추출하여 특이 프라이머 및 프루브 세트로 real time PCR을 실시한 증폭곡선 사진으로 1 cfu/㎖ 검출한계 여부를 실험한 사진이다. 각 Listeria monocytogenes의 서로 다른 혈청형에 대하여 모두 1 cfu/㎖까지 검출할 수 있음을 확인하였다 (도13).
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 5'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black hole quencher-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것을 특징으로 하는 Listeria monocytogenes 검출용 조성물.
- 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 Listeria monocytogenes 검출용 키트.
- Listeria monocytogenes를 정량적으로 분석하는 방법으로서,
(1) 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 검출용 조성물에 10배씩 단계희석한 시료를 혼합하여 유전자 분석 시료를 준비하는 단계;
(2) 단계(1)의 유전자 분석 시료에 대하여 실시간 PCR을 수행하여 PCR산물을 수득하는 단계;
(3) 단계(2)의 PCR 산물을 정량하여 표준곡선을 수득하는 단계; 및
(4) 상기 표준곡선을 이용하여, 시료로부터 추출한 균의 DNA를 정량하는 단계;
를 포함하는 분석 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 시료는 축산물, 유제품, 채소, 축산가공품으로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110068386A KR101351805B1 (ko) | 2011-07-11 | 2011-07-11 | 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 정량적 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110068386A KR101351805B1 (ko) | 2011-07-11 | 2011-07-11 | 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 정량적 검출방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130007815A KR20130007815A (ko) | 2013-01-21 |
| KR101351805B1 true KR101351805B1 (ko) | 2014-01-16 |
Family
ID=47838121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110068386A KR101351805B1 (ko) | 2011-07-11 | 2011-07-11 | 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 정량적 검출방법 |
Country Status (1)
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| KR (1) | KR101351805B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102474956B1 (ko) * | 2022-06-03 | 2022-12-06 | 주식회사 세니젠 | 리스테리아 속 균주와 리스테리아 모노사이토제니스를 동시 구분 검출할 수 있는 리얼-타임 pcr 키트 |
-
2011
- 2011-07-11 KR KR1020110068386A patent/KR101351805B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of Medical Microbiology, Vol. 55, pp. 645-659 (2006.12.31.) * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20130007815A (ko) | 2013-01-21 |
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