JP7252606B2 - 乳酸菌検出プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法 - Google Patents
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乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61株(NITE P-92)(以下、「乳酸菌H61株」という。)は、老化実験用のマウスを用いた試験から、骨密度の減少や潰瘍発生などの老化抑制効果を有することが報告(特許文献1)されている。また、乳酸菌H61株の加熱処理菌体を摂取することにより、50~60歳代の肌への保湿効果を向上することも報告(非特許文献1)されている。さらに、乳酸菌H61株またはその抽出物は、メラニン産生抑制効果、育毛・発毛効果と脱毛抑制効果を有することも報告(特許文献2)されている。このように、乳酸菌H61株は、様々な健康効果を有する機能性乳酸菌である。
しかしながら、RFLP法やRAPD法は何れも定量性がなく、RFLP法は高精度であるものの工程が複雑で時間がかかること、RAPD法は迅速な検出が可能であるものの、使用する機器により結果が異なり再現性に問題があった。また、生菌であれば純粋培養により菌体を増やし、遺伝子レベルの解析を行うことは容易であるが、死菌の場合、質の高いDNAを調製することは困難という問題もあった。
1.配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号2または3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセット。
2.1.記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、H61株検出用キット。
3.以下の工程を含む、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株の検出方法。
(1)1.記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
(2)工程(1)で得られた核酸断片を検出する工程
4.配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号2の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号4の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
5.配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号5で表されるポリヌクレオチド。
なお、本発明における乳酸菌H61株とは、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(寄託番号:NITE P-92)株を意味する。
まず、乳酸菌H61株の完全長ゲノム配列を、第3世代シーケンサーであるPacBio RSII(デジタルバイオロジー社製)を用いて決定した。このゲノム配列と、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌4株(全ゲノム配列解読済み:MG1363株、SK11株、NZ9000株、Scaffoldsレベルでのゲノム配列解読済み:JM1株)を比較して、タンパク質をコードするコーディングシーケンス(CDS)を検索し、相同性の認められない領域を検出した。これらの領域の核酸配列を、NCBI(National Center for Biotechnology Information)でBLAST検索し、全細菌種に対しても相同性の認められない領域を絞り込んだ。これらの配列から、GC含量が40%以上になるような領域の250bpから350bpの長さのPCR産物が得られるPCRプライマーを作成した。標準株であるラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスATCC 19257株、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門保有のラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌10株、および亜種ラクティス菌8株とH61株から調製したゲノムDNAを鋳型に用いて、当該プライマーによるPCRを行ない、H61株のみ相当する鎖長のPCR産物が得られ、他の菌株のDNAを鋳型に用いてもPCR産物は得られないプライマーセットを選抜した。
本発明のプライマーセットは、下記表1に示す、配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号2または3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるものである。
例えば、本発明のプライマーセットは、使用目的や条件によっては、必ずしも配列番号1~3の塩基配列と100%の相同性を有している必要はなく、目的とする領域のプライマーの5’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的DNA断片を適宜増幅させることは可能である。
詳しくは、乳酸菌H61株の検出に際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位(配列番号1~3の塩基配列)を使用し、かつ、そのような配列でしかアニーリングしないPCR条件を選択すればよい。その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号1~3の塩基配列とは数塩基異なる配列を使用し、かつ、それでもアニーリングするようなPCR条件を選択することができる。
本発明のプライマーセットを用いて、試料に含まれる被検菌の染色体DNAを鋳型とするPCRを行い、増幅産物の有無を決定することにより、試料中の乳酸菌H61株を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なPCRの反応が起こると、乳酸菌H61株の染色体DNA内の、対となる各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域(標的領域)が増幅される。
したがって、本発明のプライマーセットを用いて増幅産物が得られれば、被検菌は乳酸菌H61株であると同定されるか、または、被検菌に乳酸菌H61株が含まれていると判定される。
また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。例えば、配列番号1および配列番号2、または配列番号1および3の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌H61株検出用プライマーセットを用いた場合、被検菌に乳酸菌H61株が含まれていれば、通常は各々343bp、251bpの増幅産物が得られる。
本発明のオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌H61株検出用プライマーセットを用いた場合に得られる、請求項4に特定する343bpの増幅産物である配列番号4の塩基配列を含むポリヌクレオチドを下記図1に、請求項5に特定する251bpである配列番号5の塩基配列を含む増幅産物のポリヌクレオチドを下記図2に示す。図1、2中の下線は、乳酸菌H61株の特異的検出のための本発明のプライマーセットが、ハイブリダイズする部位を示す。
配列番号1~5の塩基配列は、乳酸菌H61株に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をDNAプローブとしたFISH法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。
なお、本発明において、乳酸菌H61株の検出とは、試料中に乳酸菌H61株が存在するか否かを検出すること、および、被検菌が単一種である場合には、同被検菌が乳酸菌H61株であるか否かを同定することを含む。
死菌であれば、試料からそのままDNAを調製してPCRに用いてもよく、また生菌であれば、試料からコロニー分離等により被検菌体を分離して、被検菌体からDNAを調製してからPCRに供してもよい。これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、一般的に乳酸菌のゲノムDNA調製に用いるような、細胞壁をLysozymeなどの酵素で分解またはビーズなどで物理的に破壊したのちに、市販の抽出キット(DNeasy Blood&Tissue kit(QIAGEN社製)、Isogenなど)を使用することが可能であり、特に限定されるものではない。
本発明の乳酸菌H61株の検出方法は、(1)本発明のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と、(2)工程(1)で得られた核酸断片を検出する工程を含むものである。
本発明の検出方法として、具体的には、例えば、PCR法、FISH法、サザンハイブリダイゼーションやドットハイブリダイゼーション等を挙げることができる。中でも、PCR法が好ましい。
このうち、PCR法による乳酸菌H61株の検出方法では、本発明のプライマーセットを用いる以外は、通常用いられるDNAポリメラーゼ等のPCR試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
PCRに用いるDNAポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、ExTaq(タカラバイオ社製) 、KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)、KOD-plus-ポリメラーゼ(東洋紡社製)等が好ましい。
PCR反応条件については、用いるDNAポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等により適宜設定すればよいが、サイクル条件であれば「90~98℃で5~30秒(熱変性・解離)→56℃で5~30秒(アニーリング)→65~80℃で30~60秒(合成・伸長)」を1サイクルとして合計20~40サイクル行う条件が好ましい。この場合、鋳型DNAとプライマーの量比は、10~30ngのゲノムDNA量に対し、各プライマーを0.24μM程度が好ましい。
PCRにより得られる増幅産物の有無またはその大きさは、通常の核酸の検出法によって、決定することができる。例えば、アガロース電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやSYBRGreenIで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。PCR産物をサイクルシーケンスした後、DNAシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無を確認することができる。また、リアルタイムPCR法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
<実施例1:乳酸菌H61株の検出1>
(1)供試菌株
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス株を8株(Lcl1~Lcl8)と、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス株を13株(Lcc1~Lcc11、乳酸菌H61株、標準株ATCC 19257株)、ラクトバシラス・デキストリニカス株を1株(Lb11)使用した。
この実施例においては、簡便なのでキットを使用しているが、他のDNA調製方法により調製してもよい。精製したDNAを使った方がPCRの再現性が良く好ましい。
(a)MRS液体培地で供試菌株を一晩培養した。
(b)DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN社製)のグラム陽性細菌のDNA調製プロトコールに従い、DNAを調製した。詳細は以下のとおりである。
(b-1)培養液1mL(OD 600nm 1.0程度の濁度)を8000rpmで5分間遠心分離し、集菌した。この上清は廃棄した。
(b-2)180μLのリシス溶液(2×TE (20mM Tris-HCl、 2mM EDTA)1mLに20mgリゾチーム、12μL Triton X-100を加えて調製)を、上記の集菌した菌体に加え、懸濁後、37℃、30分間インキュベートした。
(b-3) インキュベート後の上記懸濁液に25μLのProteinase Kと200μLのBuffer ALを加え、混合後、56℃で30分間インキュベートした。
(b-4)これに、200μLの100%エタノールを加えた。
(b-5)上記(b-4)の溶液をスピンカラムに添加し、8000rpmで1分間遠心分離して、DNAをカラムに吸着させた。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
(b-6)カラムを新しいチューブにセットし、Buffer AW1 500μLを添加し、8000rpmで1分間遠心分離した。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
(b-7)カラムを新しいチューブにセットし、Buffer AW2 500μLを添加し、14000rpmで2分間遠心分離した。
(b-8)カラムを1.5mLのマイクロチューブにセットし、Buffer AE 200μLを添加し、8000rpmで1分間遠心分離した。
(b-9)得られたDNAを含む溶出液のOD260nmの吸光度を測定し、DNA濃度(OD260×50μg/mL)を決定し、これを鋳型DNA溶液とした。
上記(2)において得た供試菌株のDNA溶液を鋳型とし、配列番号1および配列番号3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用い、PCR反応試薬キットであるExTaq(タカラバイオ社製)の方法にしたがってPCR反応を行った。PCR反応液の総量を25μLとすると、キット付属の10xExTaq緩衝液2.5μL、dNTP mixture 2.0μL、20μM プライマー各0.3μL、鋳型DNA10~20ng、ExTaq DNAポリメラーゼ0.75Uを含む反応液0.15μLを、GeneAmp PCR System 9700(アプライドバイオシステム社製)を用いて、98℃で10秒の予備加熱後、変性を98℃で10秒、アニーリングを56℃で30秒、伸長を72℃で60秒のサイクルを35サイクル行った。
PCR反応によって得られたPCR産物を、1.8%アガロースゲルで100V、30分電気泳動した。次に、アガロースゲルを臭化エチジウム(0.5μg/mL)で染色後、青色LEDライト下でPCR産物の増幅を示すバンドを観察した。結果を表2と図2に、実施例2の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して251bp(配列番号1および配列番号3のプライマーを用いた場合)のPCR産物が増幅されたものを「+」、プライマーと反応しなかったものを「-」と表す。
供試菌株から調製したゲノムDNAを鋳型とし、配列番号1および配列番号2の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用いたこと以外は、すべて実施例1と同様に行った。
結果を表2に、実施例1の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して343bp(配列番号1および配列番号2のプライマーを用いた場合)のPCR産物が増幅されたものを「+」、プライマーと反応しなかったものを「-」と表す。
(1)供試菌株と培養条件
乳酸菌H61株(異なる2つの保存ロット1、2を使用)を、MRS液体培地10mLで菌を一晩培養した。
(2)加熱処理条件とDNAの抽出
(2-1)一晩培養した培養液を8000rpmで1分間遠心分離して集菌し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回菌体を洗浄した。
(2-2)菌体にPBSを加えてOD600nmの吸光度が1および5になるように調製した。
(2-3)OD6005の菌体懸濁液0.5mLをマイクロチューブ2本にとり、1本は100℃で30分間煮沸、もう1本は121℃で15分間オートクレーブ処理を行った。
(2-4)OD6001の菌体懸濁液1.0mLをマイクロチューブ2本にとり、1本は100℃で30分間煮沸を行った。もう1本は生菌からのDNA調製に用いた。
(2-5)上記(2-3)、(2-4)により処理済みの菌体を、遠心分離により集菌し、上記実施例1の「乳酸菌DNAの調製種特異的PCR用のDNA調製」と同様の方法でDNA調製を行った。
(2-6)得られたDNAを鋳型に用いて、上記実施例1の「PCR反応」と同様の方法でPCRを行った。
結果を表3と図4に示す。
表3と図4中の試験番号1~4は上記保存ロット1、試験番号5~8は上記保存ロット2の乳酸菌H61株である。また、試験番号1、5は生菌から調製した乳酸菌H61株のDNA、試験番号2、6はOD6005に調製し100℃で30分間加熱した乳酸菌H61株から調製したDNA、試験番号3、7はOD6001に調製し100℃で30分間加熱した乳酸菌H61株から調製したDNA、試験番号4、8はOD6005に調製し121℃で15分間オートクレーブ処理した乳酸菌H61株から調製したDNAである。
Claims (5)
- 配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号2または3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセット。
- 請求項1記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、H61株検出用キット。
- 以下の工程を含む、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株の検出方法。
(1)請求項1記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
(2)工程(1)で得られた核酸断片を検出する工程 - 配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号2の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号4で表されるポリヌクレオチド。
- 配列番号1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号3の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H61(NITE P-92)株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号5で表されるポリヌクレオチド。
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