KR101347100B1 - 단독의 또는 ｐｋｃ 억제제와 배합된 ｐｋｃ 활성화제의 장기 기억 향상을 위한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 장기 기억을 강화시키기에 충분한 단백질의 합성을 자극하는데 충분한 방식으로 단백질 키나제 C(PKC)를 PKC 활성화제와 접촉시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PKC를 하향조절하기에 충분한 방식으로 단백질 키나제 C(PKC)를 PKC 활성화제와 접촉시키는 방법을 제공한다.
단백질 키나제 C, PKC, PKC 활성화제, 기억 강화, 인지 장애

Description

단독의 또는 ＰＫＣ 억제제와 배합된 ＰＫＣ 활성화제의 장기 기억 향상을 위한 용도{Use of a PKC activator, alone or combined with a PKC inhibitor to enhance long term memory}
발명의 우선권
본 출원은 2005년 7월 29일에 출원된 미국 가특허원 제60/703,501호 및 2005년 10월 21일에 출원된 제60/728,753호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 기억력 향상 및 세포 증식 장애의 치료에 유용한 단백질 키나제 C의 상향조절 및 하향조절 방법에 관한 것이다.
인지에 영향을 미치는 각종 장애 및 질환이 존재한다. 인지는 일반적으로 다음과 같은 적어도 3가지의 상이한 요소를 포함하는 것으로 기술될 수 있다: 주의력, 학습력 및 기억력. 이러한 각각의 요소 및 이의 개별적 수준은 피험자의 전반적 인지능력 수준에 영향을 미친다. 예를 들어, 알쯔하이머병 환자는 전반적 인지 상실 및 이로 인한 각각의 상기 특징의 악화로 고통을 받으며, 이 질환과 흔히 관련되는 것은 기억 상실이다. 다른 질환에서, 환자는 인지의 다른 특징들과 보다 주로 관련되는 인지 손상으로 고통받는다. 예를 들어, 주의력 결핍성 과잉행동 장애(ADHD)는 주의력 상태를 유지하는 개체의 능력에 초점을 맞춘 것이다. 기타 병태에는 기타 신경계 질환, 노화, 및 암 치료와 같이 지능에 유해한 영향을 미칠 수 있는 병태의 치료와 관련되는 일반적 치매, 발작/허혈 및 정신 지체가 포함된다.
장기 기억을 위한 단백질 합성의 필요는 각종 기억 패러다임에 대해 수십년에 걸쳐 입증되었다[참조: Agranoff et al., (1967) Science 158: 1600-1601; Bergold et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3788-3791; Cavallaro et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 13279-16284; Crow et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 4490-4494; Crow el al.(1999) J. Neurophysiol. 82: 495-500; Epstein et al., (2003) Neurobiol. Learn. Mem. 79: 127-131; Ezzeddine et al., (2003) J. Neurosci. 23: 9585-9594; Farley et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2016-2020; Flexner et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 369-374; Hyden et al., (1970) Proc. Natl. Acad. Sci. 65: 898-904; Nelson et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 269-273; Quattrone et al., (2001) Proc. Natl. Acad Sci. 98: 11668-11673; Zhao et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 34893-34902; Zhao et al., (2000) FASEB J. 14: 290-300]. 플렉스너(Flexner)는 훈련 패러다임에 이은 임계시간 간격 동안 억제가 발생하는 경우 단백질 합성의 약물 유도 억제(예를 들어, 5-프로필우라실 또는 아니소마이신에 의함)가 장기 기억을 차단함을 최초로 밝혀내었다[참조: Flexner et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 369-374]. 단백질 합성이 이러한 임계적 시기 전에 또는 이러한 시기 후의 임의의 시간에 억제되는 경우, 장기 기억에 대한 영향은 존재하지 않는다. 기억 강화에 필수적인 단백질의 동정, 이의 조절 기전 및 장기 기억의 강화에서 이들의 역할은 여전히 의문으로 남아있다.
다양한 종에서, 장기 연상 기억의 형성은 신경막에 대한 단백질 키나제 C(PKC) 이소자임의 전좌 및 이에 따른 활성화에 좌우되는 것으로 또한 밝혀졌다. 초기에, 이들 PKC 이소자임은, 칼슘과 보조 인자, 예를 들면, 디아실글리세롤의 배합물에 의해 활성화되는 경우, 외부 신경세포막 및 내부 소기관, 예를 들면, 소포체의 막의 내부 면과 안정한 결합을 달성한다. PKC 활성화는 몰러스크(mollusk) 헤르미센다(Hermissenda)의 단일 동정 타입 B 세포[참조: McPhie et al., (1993) J. Neurochem. 60: 646-651], 래빗의 순막 조건화를 포함한 다양한 포유동물의 연합 학습 프로토콜[참조: Bank et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 1988-1992; Olds et al., (1989) Science 245: 866-869], 랫트의 공간 미로 학습[참조: Olds et al., (1990) J. Neurosci. 10: 3707-3713] 및 파플로프의 조건화에 대한 랫트의 후각 판별 학습[참조: Nelson et al., (1990) Science 247: 1479-1483]에서 발생하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 칼렉시틴(calexcitin)[참조: Nelson et al., (1990) Science 247: 1479-1483], PKC의 알파 이소자임의 고친화성 기질은 파브로프 조건화 의존 방식으로 단일 동정 타입 B 세포에서 양적으로 증가하고 인산화된다[참조: Kuzirian el al., (2001) J. Neurocytol. 30: 993-1008].
각각의 PKC 동종효소(isoenzyme)가 생물학적 과정에서 상이하며 때로는 상반되는 역활을 한다는 증거는 증가하고 있으며, 이는 약리학적 개발에 대한 2가지 방향을 제공한다. 하나는 PKC의 특이적(바람직하게는 동종효소 특이적) 억제제의 설계이다. 이러한 접근법은 촉매적 도메인이 PKC의 동종형태 특이성에 대한 주요 원인이 되는 도메인이 아니라는 사실에 의해 복잡하게 된다. 다른 접근법은 동종효소 선택적이고 조절 부위 지시된 PKC 활성화제를 개발하는 것이다. 이러한 접근법은 반대되는 생물학적 효과를 갖는 다른 신호 전달 경로의 효과를 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 대안으로, 급성 활성화 후에 PKC의 하향조절을 유도함으로써, PKC 활성화제는 장기 길항작용을 유발할 수 있다.
연합 기억 프로토콜 후, 특정한 뇌 영역에서 증가된 막 분획과 PKC의 결합은 수일 동안 잔존할 수 있다[참조: Olds et al., (1989) Science 245: 866-869]. 이들 발견과 일치되게, 강력한 PKC 활성화제인 브리오스타틴(bryostatin)의 투여는 랫트의 공간 미로 학습을 개선시킨다[참조: Sun et al., (2005) Eur. J. Pharmacol. 512: 45-51]. 또한, PKC 활성화제인 브리오스타틴의 임상 시험에 의해, PKC 활성화 효과는 약물 전달의 간헐적 스케줄에 의해 향상될 수 있는 것으로 제안되었다[참조: Marshall et al., (2002) Cancer Biology & Therapy 1: 409-416]. 하나의 PKC 활성화제, 브리오스타틴, 매크롤리드 락톤은 나노몰 이하의 농도에서 PKC를 활성화시킨다[참조: Talk et al., (1999) Neurohiol. Learn. Mem. 72: 95-117]. 포르볼 에스테르 및 내인성 활성화제 DAG와 유사하게, 브리오스타틴은 PKC 내의 Cl 도메인에 결합하고, 막에 대한 전좌를 야기한 후, 하향조절을 야기한다.
비종양성 PKC 활성화제인 브리오스타틴은 초기 PKC 활성화 후 연장된 하향조절을 야기하는 것으로 알려진 용량(25㎍/m2 내지 120㎍/m2)으로 암 치료를 위해 사람에서 광범위한 시험으로 사용된다[참조: Prevostel et al., (2000) Journal of Cell Science 113: 2575-2584; Lu et al., (1998) Mol. Biol. Cell 18: 839-845; Leontieva et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:5788-5801]. PKC의 브리오스타틴 활성화는 또한 최근에 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 분해하여 사람 섬유아세포부터 비독성 단편 가용성 전구체 단백질(sAPP)을 유발하는 α-세크레타제를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Etcheberrigaray et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 11141-11146]. 브리오스타틴은 또한 랫트의 공간 미로 임무의 학습 및 기억 보존[참조: Sun et al., (2005) Eur. J. Pharmacol. 512: 45-51], 래빗의 수막 패러다임의 학습[참조: Schreurs and Alkon, unpublished], 예비 보고서에서 헤르미센다 조건화[참조:Scioletti et al., (2004) Biol. Bull. 207: 159]를 개선시킨다. 따라서, PKC의 최적 활성화는 정상 및 질환 상태에서 인지에 영향을 주는 다수의 분자 기전에서 중요하다.
PKC의 하향조절 없이 상향조절을 달성하기 어렵기 때문에, 반대로 하향조절을 최소화하면서 PKC를 상향조절하는 방법은 PKC 활성화와 관련되어 관찰되는 인지 이점을 향상시키는데 필요하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 이러한 요구를 만족시키고, 알쯔하이머병 및 기타 신경퇴행성 질병의 임상학적 치료를 크게 개선시킬 뿐만 아니라 예방학적으로도 인지적 향상을 개선시킨다. 당해 방법 및 조성물은 또한 α-세크레타제의 조절을 통한 인지 상태를 치료하고/치료하거나 향상시킨다.
발명의 요약
본 발명은 장기 기억을 강화하는데 충분한 단백질의 합성을 자극하는데 충분한 방식으로 단백질 키나제 C를 PKC 활성화제와 접촉시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, PKC 활성화제는 매크로사이클릭 락톤이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 벤조락탐이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 피롤리딘온이다. 바람직한 양태에서, 매크로사이클릭 락톤은 브리오스타틴이다. 보다 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17 또는 -18이다. 가장 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 매크로사이클릭 락톤은 네리스타틴이다. 바람직한 양태에서, 네리스타틴은 네리스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 접촉은 PKC를 활성화시킨다. 하나의 양태에서, 접촉은 PKC의 양을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 접촉은 PKC의 합성을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 접촉은 칼렉시틴의 양을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 접촉은 실질적으로 PKC의 후속적인 하향조절을 야기하지 않는다.
하나의 양태에서, 접촉은 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 규칙적인 간격으로 반복된다. 또 다른 양태에서, 간격은 1주 내지 1개월, 1일 내지 1주, 또는 1시간 미만 내지 24시간이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1주 내지 1달이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1일 내지 1주이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1시간 미만 내지 24시간이다.
하나의 양태에서, 접촉은 고정 기간 동안 유지된다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 24시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 12시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 6시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 6시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 4시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정 기간은 2시간 미만이다. 바람직한 양태에서, 고정 기간은 약 1 내지 12시간이다. 보다 바람직한 양태에서, 고정 기간은 약 2 내지 6시간이다. 가장 바람직한 양태에서, 고정 기간은 약 4시간이다.
하나의 양태에서, 접촉은 1일 이상의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1일 내지 1개월의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1일 내지 1주 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1주 내지 1개월 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1 내지 6개월 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1개월 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 접촉은 1개월 이상 기간 동안 반복된다.
본 발명은 PKC를 하향조절하기에 충분한 방식으로 PKC 활성화제를 단백질 키나제 C와 접촉시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, PKC 활성화제는 매크로사이클릭 락톤이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 벤조락탐이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 피롤리딘온이다. 바람직한 양태에서, 매크로사이클릭 락톤은 브리오스타틴이다. 보다 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18이다. 가장 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 매크로사이클릭 락톤은 네리스타틴이다. 바람직한 양태에서, 네리스타틴은 네리스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 접촉은 PKC의 합성을 자극하지 않는다. 또 다른 양태에서, 접촉은 PKC의 합성을 실질적으로 자극하지 않는다. 또 다른 양태에서, 접촉은 PKC의 양을 감소시킨다. 또 다른 양태에서, 접촉은 PKC의 양을 실질적으로 감소시킨다. 또 다른 양태에서, 접촉은 칼렉시틴의 합성을 자극하지 않는다.
하나의 양태에서, 지속 기간 동안 접촉된다. 하나의 양태에서, 지속 기간은 1시간 미만 내지 24시간이다. 또 다른 양태에서, 지속 기간은 1일 내지 1주이다. 또 다른 양태에서, 지속 기간은 1주 내지 1개월이다. 또 다른 양태에서, 지속 기간은 1시간 미만 내지 12시간이다. 또 다른 양태에서, 지속 기간은 1시간 미만 내지 8시간이다. 또 다른 양태에서, 지속 기간은 1시간 미만 내지 4시간이다. 바람직한 양태에서, 지속 기간은 약 4시간이다.
하나의 양태에서, 접촉은 PKC의 지속적 하향조절을 야기한다.
본 발명은 PKC 분해를 억제하는 단계를 추가로 포함하는, 장기 기억을 강화하는데 충분한 단백질의 합성을 자극하는데 충분한 방식으로 PKC 활성화제를 단백질 키나제 C와 접촉시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 분해는 유비퀴틴화를 통해 수행된다. 또 다른 양태에서, 분해는 락타시스틴에 의해 억제된다. 또 다른 양태에서, PKC는 사람이다.
본 발명은 장기 기억을 강화하는데 충분한 단백질의 합성을 자극하는데 충분한 방식으로 PKC 활성화제를 단백질 키나제 C와 접촉시키는 방법에 관한 것으로, 상기 PKC 활성화제는 상기 PKC 활성화제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 형태로 제공된다.
하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 PKC 억제제를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 말초 조직에서 PKC를 억제하는 화합물이다. 본원에서 "말초 조직"이란 뇌 이외의 조직을 의미한다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 말초 조직에서 우선적으로 PKC를 억제하는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 환자에게 PKC 활성화제의 투여와 관련된 근육통을 감소시키는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 PKC 활성화제로 치료된 환자에서 발생하는 근육통을 감소시키는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 PKC 활성화제의 허용량을 증가시키는 화합물이다. 특히, PKC 억제제는, 예를 들면, 이로써 제한되지는 않지만 비타민 E, 비타민 E 유사물질 및 이들의 염; 칼포스틴 C; 티아졸리딘디온; 루복시스타우린; 및 이들의 배합물을 포함한다. 본원에서, "비타민 E"는 α-토코페롤(5,7,8-트리메틸토콜); β-토코페롤(5,8-디메틸토콜; δ-토코페롤(8-메틸토칼); γ-토코페롤(7,8-디메틸토콜); 및 이들의 염 및 유사물질을 의미한다.
도 1은 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 차선적으로 훈련되었지만 브리오스타틴으로 처리된 동물들이 모두 장기 기억을 획득하였음을 나타낸다.
도 2는 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 빛과 회전의 무작위 연출이, 브로오스타틴 여부와 관계없이, 조건 반응을 형성하지 않았음을 나타낸다.
도 3은 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 2일 연속 4시간 동안 브리오스타틴에 노출된 후, 3일째에 2회의 훈련 이벤트(TE)를 수행한 동물이 6일 이상의 장기 기억을 획득함을 입증하였음을 나타낸다.
도 4는 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 2일 연속 4시간 동안 브리오스타틴에 노출된 후, 3일째에 2회의 훈련 이벤트(TE)를 수행한 동물이 6일 이상의 장기 기억을 획득함을 입증하였음을 나타낸다.
도 5는 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 브리오스타틴에 8 내지 20시간 노출시킨 다음, 2 TE의 수행이 브리오스타틴에 4시간 노출 후 달성되는 바와 동일한 기억을 획득하기에 충분하지 않았음을 나타낸다.
도 6은 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시하고, 브리오스타틴 1.0ng/㎖ 이상에 대한 노출이 장기 기억의 획득을 억제함을 나타낸다.
도 7은 장기 기억 획득에 대한 브리오스타틴 및 아니소마이신의 영향을 도시하고, 브리오스타틴에 대한 4시간의 1회 노출과 함께 2회의 TE의 수행이 수시간 지속되는 장기 기억을 야기하고, 이는 브리오스타틴 노출 동안 아니소마이신이 존재하는 경우 완전이 제거됨을 나타낸다.
도 8은 브리오스타틴 및 락타시스틴의 영향을 도시하고, 락타시스틴이 브리오스타틴의 1회 노출(이후 2회의 TE)에 의해 야기된 단기 기억을 수일 동안 지속되는 장기 기억으로 변화시킴을 나타낸다.
도 9는 칼렉시틴에 대한 PKC 활성화의 영향을 도시한다.
도 10a는 칼렉시틴 면역염색에 대한 브리오스타틴 및 훈련 이벤트의 영향을 도시한다. 도면은 칼렉시틴이 다수의 훈련 이벤트와 함께 타입 B 세포 내에서 증가하였음을 나타낸다.
도 10b는 면역염색에서 도시된 바와 같이 브리오스타틴 단독 칼렉시틴의 영향을 도시한다.
도 11a은 2일 연속 4시간 브리오스타틴 노출 후 24시간에 2회의 훈련 이벤트 수행의 칼렉시틴 강도에 대한 영향을 도시한다. 도면은 2일 연속 4시간 브리오스타틴 노출 후 24시간에 TE 수행이 장기 기억 강화와 관련된 양까지 칼렉시틴 수치를 증가시키는데 필요함을 나타낸다.
도 11b는 칼렉시틴에 대한 브리오스타틴 노출 후 아니소마이신 첨가의 영향을 도시한다. 도면은 아니소마이신 후 2회의 TE 및 3일 동안 4시간 브리오스타틴 노출이 칼렉시틴 면역염색을 감소시키지 않음을 나타낸다.
도 12는 세포질 분획 중의 히스톤 인산화로 측정된, PKC 활성에 대한 4시간 브리오스타틴 반복 노출의 영향을 도시한다. 도면은 2일 연속 브리오스타틴 노출이 대조군 또는 기준선 수치보다 현저하게 높은 PKC 활성을 야기함을 나타낸다.
도 13은 막 분획 중의 히스톤 인산화로 측정된, PKC 활성에 대한 4시간 브리오스타틴 반복 노출의 영향을 도시한다. 도면은 2일 연속 브리오스타틴 노출이 대조군 또는 기준선 수치보다 현저하게 높은 PKC 활성을 야기함을 나타낸다.
도 14는 PKC 활성에 대한 아니소마이신의 영향을 도시한다. 도면은 각각의 3일 연속 브리오스타틴 노출 동안에 아니소마이신의 존재가 세포질 분획과 막 분획 둘 다에서 PKC의 활성을 감소시킴을 나타낸다.
도 15는 해마상융기 뉴런의 막 결합 PKC에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시한다. 도면은 30분 동안 브리오스타틴의 1회 활성화 용량(0.28 nM)에 대한 배양된 해마상융기 뉴런의 노출이 세포질에서 미립자 분획으로 PKC의 단기 전좌(약 60%)가 야기된 후 연장된 하향조절이 발생함을 나타낸다. 제1 노출 후 4시간 이하의 제2 노출은 브리오스타틴 1회 노출 후 4시간에서 발견된 하향조절을 현저하게 감소시킨다.
도 16은 PKC 활성에 대한 브리오스타틴 반복 노출의 영향을 도시한다. 도면은 2 내지 4시간 지연 후 제2 노출이 30분의 브리오스타틴 1회 노출에 의해 야기된 현저한 하향조절을 제거하고, 제2 노출이 제1 노출 후 4시간까지 지연되는 경우, 활성이 기준선 보다 증가되어 2시간 이하 후 전달된 제2 노출과 비교하여 현저하게 큰 정도로 증가함을 나타낸다.
도 17은 단백질 합성에 대한 브리오스타틴의 영향을 도시한다. 랫트 IGF-IR 세포를 1 내지 72시간 범위의 항온처리 시간 동안 0.28nM 브리오스타틴으로 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, [35S]메티오닌(9.1μCi)을 최소량으로 가한 후, 방사능라벨의 분석을 수행하였다. 뉴런 회수 마지막 30분 전에 [35S]메티오닌의 혼입에 의해 측정된 결과, 0.28 nM 브리오스타틴에 대한 30분 1회 노출은 총 단백질 합성을 증가시켰는데, 브리오스타틴 노출 후 79시간 동안 60%까지 증가하였지만, PKC 억제제 Ro-32-0423의 존재하에 현저하게 덜 증가하였다.
1. 정의
본원에서, "상향조절함" 또는 "상향조절"은 증가된 전사, 번역 및/또는 전사정보 또는 단백질 생성물의 증가된 안정성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 기전을 통해, 기저 상태에 비하여 제제, 예를 들면, PKC 단백질 또는 전사정보의 양과 활성을 증가시킴을 의미한다.
본원에서, "하향조절함" 또는 "하향조절"은 감소된 전사, 번역 및/또는 전사정보 또는 단백질 생성물의 감소된 안정성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 기전을 통해, 기저 상태에 비하여 제제, 예를 들면, PKC 단백질 또는 전사정보의 양과 활성을 감소시킴을 의미한다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분과 배합될 수 있고, 배합된 후 활성 성분을 대상체에 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물, 화합물 또는 용매를 의미한다. 본원에서 "약제학적으로 허용되는 담체"는, 이로써 제한되지는 않지만, 부형제; 계면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 또는 붕해제; 결합제; 윤활제; 보존제; 생리학적 분해성 조성물, 예를 들면, 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 윤활제; 완충제; 염; 증점제; 충전재; 항산화제; 안정화제; 약제학적으로 허용되는 중합성 또는 소수성 물질; 및 당해 분야에 공지되고, 예를 들면, 본원에 참조로써 인용되는 문헌[참조: Genaro, ed.(1985) Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa.]에 기재된 기타 성분 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 당해 분야에 공지되거나 이후 약리학 분야에서 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 연합시키는 단계 및, 필요한 경우, 생성물을 목적하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형하거나 포장하는 단계를 포함한다.
본원에서 제공되는 약제학적 조성물의 설명이 원칙적으로 사람에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것임에도 불구하고, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에 대한 투여에 적합한 것으로 당업자에게 이해될 것이다. 조성물을 다양한 동물에 대한 투여에 적합하게 하기 위해 사람에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물을 개질하는 것은 잘 이해되고, 숙련된 수의학 약리학자는 단지 일반적인 실험으로 이러한 개질을 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 의도되는 피험자는, 이로써 제한되지는 않지만, 사람 및 기타 영장류 및 기타 포유류를 포함한다.
2. 알쯔하이머병
알쯔하이머병은 뇌내의 특정 뉴런 소집단의 광범위한 손실과 함께 가장 일반적인 증상인 기억 상실을 동반한다[참조: Katzman(1986) New England Journal of Medicine 314: 964]. 알쯔하이머병은 신경병리학적 변화와 관련하여 잘 특성화되어 있다. 그러나, 비정상이 말초 조직에서 보고된 바 있는데, 이는 알쯔하이머병이 가장 두드러진 중추신경계의 병리학을 갖는 전신 장애라는 가능성을 뒷받침한다[참조: Connolly(1998) Review, TiPS Col. 19: 171-77]. 유전적 기원과 1번, 14번 및 21번 염색체에 대한 알쯔하이머병의 연관성에 대해서는 다음 문헌을 참조한다[참조: St. George-Hyslop et al., (1987) Science 235: 885; Tanzi et al., Review, Neurobiology of Disease 3:159-168; Hardy(1996) Acta Neurol Scand: Supplement 165: 13-17].
알쯔하이머병을 앓는 개체는 진행성 기억력 손상, 언어와 시공간적 기술 상실 및 행동 결함을 특징으로 한다[참조: McKhann et al., (1986) Neurology 34: 939-944]. 알쯔하이머병을 앓는 개체의 인지 손상은 대뇌 피질, 해마, 전뇌 기저부 및 기타 뇌 영역에 위치하는 신경 세포의 퇴행의 결과이다. 부검시에 수득된 알쯔하이머병 뇌의 조직학적 분석은 퇴행성 뉴런의 세포체 및 축색돌기내의 신경섬유농축체(NFT), 세포외 신경성(노인성) 플라크 및 병에 걸린 뇌 영역의 일부 혈관 내부 및 주위의 아밀로이드 플라크의 존재를 입증하였다. 신경섬유농축체는 쌍을 이룬 나선형 필라멘트로도 지칭되는, 나선형 방식으로 쌍을 이룬 섬유(직경 약 10nm)를 함유하는 비정상적 섬유상 구조물이다. 신경성 플라크는 퇴행성 신경 말단(축색돌기와 수상돌기 둘다)에 위치하며 아밀로이드 단백질 섬유의 코어 화합물을 함유한다. 요약하면, 알쯔하이머병은 주로 세포골격 단백질로 이루어진 세포내 신경섬유농축체, 및 세포외 실질 및 뇌혈관 아밀로이드를 포함하는 특정한 신경병리학적 특징에 의해 특성화된다. 추가로, 당해 분야에는 알쯔하이머병 환자, 정상적인 노년층, 및 기타 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 베르니케-코르사코프, 또는, 예를 들어, 미국 특허 제5,580,748호 및 제6,080,582호에 추가로 기재되어 있는 정신분열증을 앓는 사람들을 구별하는 방법이 현재 존재한다.
뉴런 손실 및 질환의 근본적 병인을 유발하는 세포상 변화는 조사중에 있는 반면, APP 대사의 중요성은 익히 확립되어 있다. 알쯔하이머병 환자의 뇌에서의 생리학 또는 병태생리학에서 역활을 하는 것으로 일관적으로 확인되는 두 단백질은 β-아밀로이드 및 타우[참조: Selkoe(2001) Physiological Reviews. 81:2]이다. β-아밀로이드 단백질 대사의 결함 및 비정상적 칼슘 항상성 및/또는 칼슘 활성화된 키나제에 관한 논의는 다음 문헌을 참조한다[참조: Etcheberrigaray et al., Alzheimer's Reports Vol. Nos. 3, 5 & 6 pp 305-312; Webb et al., (2000) British Journal of Pharmacology 130: 1433-52].
알쯔하이머병은 변화된 단백질 이화작용을 특징으로 하는 뇌 장애이다. 변화된 단백질 인산화는 알쯔하이머병에서 발견되는 세포내 신경섬유농축체의 형성에 연루되었다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 가공은 이후에 응집하여, 노인성 또는 알쯔하이머병(AD) 플라크로서 알려진 AD의 특징적인 아밀로이드 침착물을 형성하는 단편의 생성을 결정한다. 알쯔하이머병의 병리학의 중심적인 특징은 플라크 내의 아밀로이드 단백질의 침착이다. 따라서, APP 가공은 AD에서 초기의 주요 병태생리학적 현상이다.
3가지의 선택적 APP 가공 경로가 확인되었다. 이전에 명명된 "정상적" 가공은 잔기 Lys16(또는 Lys16과 Leu17 사이; APP770 명명법)에서 Aβ 서열 내의 APP를 절단하여, 거대 N-말단 외부도메인(ectodomain) 및 소형 9kDa 막 결합형 단편인 비아밀로이드형성 단편들을 생성하는 효소의 참여를 포함한다. 아직 완전히 확인되지 않은 상기 효소는 α-세크레타제로서 공지되어 있다. 2개의 추가 세크레타제가 APP 가공에 참여한다. 하나의 선택적 경로는 Met671과 Asp672 사이의 Aβ 도메인 외부에서 (β-세크레타제에 의한) APP의 분해 및 엔도솜-리소좀 시스템의 참여를 포함한다. 추가의 분해 부위는 Aβ 펩타이드의 39번째 아미노산 이후에 원형질막내의 Aβ 부분의 카복실 말단이다. 세크레타제(γ) 작용은 전체 Aβ 서열과 약 6kDa의 세포 부착형 단편을 함유하는 세포외 아미노산 말단을 생성시킨다. 따라서, β및 γ 세크레타제에 의한 가공은 잠재적 아밀로이드형성 단편을 생성시키는데, 이는 이들 단편이 완전한 Aβ 서열을 함유하기 때문이다. 몇가지 유형의 증거는 모든 선택적 경로가 소정의 시스템내에서 발생하며 가용성 Aβ가 "정상 생성물"일 수 있음을 나타냈다. 그러나, CSF와 혈장내의 순환성 Aβ의 양이 "스웨덴식(Swedish)" 돌연변이를 보유한 환자에서 상승된다는 증거도 있다. 게다가, 이러한 돌연변이 또는 APP717 돌연변이로 형질감염된 배양 세포는 다량의 Aβ를 분비한다. 보다 최근에는, 기타 APP 돌연변이 및 PS1과 PS2 돌연변이의 보유자는 상승된 양의 특정 형태, 즉 긴(42개 내지 43개 아미노산) Aβ를 분비하는 것으로 나타났다.
따라서, 모든 선택적 경로가 정상적으로 일어날 수 있다해도, 불균형을 선호하는 아밀로이드형성 가공이 가족성 AD 및 아마도 산발성 AD에서 일어난다. 이러한 증진된 아밀로이드형성 경로는 결국에는 AD 환자의 뇌에서 원섬유 및 플라크 형성을 유도한다. 따라서, 비아밀로이드형성 α-세크레타제 경로를 선호하는 개입은 APP 가공의 균형을 잠재적 독성 Aβ 펩타이드와 비교해 sAPP의 상대량을 증가시키는 추측상 비병원성 과정으로 효과적으로 이동시킨다.
PKC 동종효소는 생화학적, 생물리학적 및 행동학적 효능의 독특한 상관관계를 입증할 수 있도록 피험자에게 적용하여 인지능력을 개선시킬 수 있도록 하는 중요하고 특이적인 속독 제한적 분자 표적을 제공한다.
추가로, 정상적 및 비정상적 기억력과 관련하여, K+와 Ca2+ 채널 둘 다는 기억 저장 및 회수에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[참조: Etcheberrigaray et al., (1992) Proc. Natl Acad. Sci. 89: 7184; Sanchez-Andres et al., (1991) Journal of Neurobiology 65: 796; Collin et al., (1988) Biophysics Journal 55: 955; Alkon et al., (1985) Behavioral and Neural Biology 44: 278; Alkon(1984) Science 226: 1037]. 이러한 관찰은 알쯔하이머병 환자에서 거의 보편적인 기억 상실 증상과 연관하여 알쯔하이머병 병리학의 가능한 부위로서의 칼륨 채널의 기능과 인지에 미치는 PKC 조절의 효과에 관한 조사를 유도하였다.
3. 단백질 키나제 C 및 알쯔하이머병
PKC는 비수용체 세린-트레오닌 단백질 수용체의 가장 큰 유전자 계열 중 하나로서 확인되었다. 80년대 초반에 니시즈카(Nishizuka) 및 동료들[참조: Kikkawa et al., (1982) J Biol. Chem. 257: 13341]에 의해 PKC가 발견되고 PKC가 포르볼 에스테르에 대한 주요 수용체[참조: Ashendel et al., (1983) Cancer Res., 43: 4333]로서 확인된 이래로, 다수의 생리학적 신호전달 기전은 상기 효소에 기인하는 것으로 사료되어 왔다. PCK에 대한 집중적 관심은, 그 형성이 성장 및 분화 인자의 작용에 의한 인지질 전환과 결부되는 작동인자(effector)인 칼슘 및 디아실글리세롤(및 이의 포르볼 에스테르 모사체)에 의해 시험관내에서 활성화되는 PKC의 독특한 능력으로부터 유래한다.
PCK 유전자 계열은 바람직하게는 다음의 4가지 하위그룹으로 분류되는 11개의 유전자로 이루어진다: (1) 고전적 PKCα, β1, β2(β1 및 β2는 동일한 유전자가 교대로 스플라이싱된 형태이다) 및 γ, (2) 신규 PKCδ, ε, η 및 θ, (3) 비정형 PKCζ, λ, η및 ι및 (4) PKCμ. PKCμ는 신규 PKC 동종형태와 유사하지만 추정상의 트랜스막 도메인을 갖다는 점에서 상이하다[참조: Blohe et al., (1994) Cancer Metast. Rev. 13: 411 ; Ilug et al., (1993) Biochem J. 291: 329; Kikkawa et al., (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 31]. α, β1, β2 및 γ 동종형태는 Ca2+, 인지질 및 디아실글리세롤 의존적이며 PKC의 고전적 동종형태를 나타내는 반면, 다른 동종형태는 인지질 및 디아실글리세롤에 의해 활성화되지만 Ca2+에 의존적인 것은 아니다. 모든 동종형태는 5개의 가변(V1 내지 V5) 영역을 포함하며, α, β및 γ 동종형태는 고도로 보존된 4개(C1 내지 C4)의 구조적 도메인을 함유한다. PKC α, β및 γ 를 제외한 모든 동종형태는 C2 도메인이 결여되어 있으며 λ, η 및 동종형태는 디아실글리세롤이 결합하는 C1 내의 2개의 시스테인 풍부 아연 핑거(zinc finger) 도메인 9개가 또한 결여되어 있다. C1 도메인은 또한 모든 동종형태 간에 고도로 보존되어 있으며 당해 효소의 불활성 입체형태를 생성하는 기질 결합 부위를 차단함으로써 자동조절 기능을 제공하는 가성기질(pseudosubstrate) 서열을 함유한다[참조: House et al., (1987) Science 238: 1726].
이러한 구조적 특징으로 인해, 다양한 PKC 동종형태는 생리학적 자극에 반응하는 신호 전달(signal transduction)[참조: NNishizuka(1989) Cancer 10: 1892] 및 종양 전환 및 분화[참조: Glazer, Protein Kinase C, J.F. Kuo, ed., Oxford U. Press(1994) at pages 171-198]에 있어 고도로 특수화된 역활을 하는 것으로 사료된다. 공지된 PCK 조절인자에 대해서는 다음 문헌을 참조한다[참조: PCT/US97/08141, 미국 특허 제5,652,232호; 제6,043,270호; 제6,080,784호; 제5,891,906호; 제5,962,498호; 제5,955,501호; 제5,891,870호 및 제5,962,504호].
PCK가 신호 전달에서 하는 중심적 역활의 견지에서, PKC는 APP 가공의 조절에 대한 흥미로운 표적인 것으로 증명되었다. 예를 들어, 포르볼 에스테르는 PKC 활성화를 통해 분비된 비아밀로이드형성 가용성 APP(sAPP)의 상대량을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 포르볼 에스테르에 의한 PKC의 활성화는 APP 분자의 직접적 인산화를 초래하는 것으로 보이지 않는다. 정확한 작용 부위에 상관없이, 포르볼 유도된 PKC 활성화는 α-세크레타제의 비아밀로이드형성 경로를 증진시키거나 선호하도록 한다. 따라서, PKC 활성화는 유해하지 않은 sAPP의 생산에 영향을 주고 심지어 유익한 sAPP를 생산하기 위한 흥미로운 접근법이며 동시에 Aβ 펩타이드의 상대량을 감소시킨다. 그러나, 포르볼 에스테르는 종양 촉진 활성으로 인해 최후의 약물 개발에 적합한 화합물이 아니다[참조: Ibarreta et al., (1999) NeuroReport Vol. 10, No. 5&6, pp 1034-40].
본 발명의 발명자들은 또한 단백질 키나제 C의 활성화가 알쯔하이머병(AD) 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 α-세크레타제 가공을 선호하여 비아밀로이드형성 가용성 APP(sAPP)의 생성을 초래함을 관찰하였다. 따라서, 아밀로이드형성 A1-40 및 A1-42(3)의 상대적 분비량이 감소된다. 이는 APP 및 프레세닐린 AD 돌연변이를 발현하는 섬유아세포 및 기타 세포가 증가된 양의 전체 Aβ 및/또는 증가된 비의 A1-42(3)/A1-40를 분비하기 때문에 특히 중요한 것이다. 흥미롭게도, PKC 결손은 AD 뇌(α 및 β 동종형태) 및 AD 환자의 섬유아세포(α 동종형태)에서 발견되었다.
연구에 의해, α, β 및 γ 동종형태에 대한 선택성이 개선된 기타 PKC 활성화제(즉, 벤조락탐)가 sAPP 분비를 기저 수준 이상으로 증진시키는 것으로 나타났다. 벤조락탐 처리된 AD 세포에서의 sAPP 분비는 또한 대조군 벤조락탐 처리된 섬유아세포에 비해 다소 높았으며, 10μM BL 처리 후에 현저한 sAPP 분비 증가만을 나타냈다. 스타우로스포린(PKC 억제제)은 대조군 및 AD 섬유아세포 둘다에서 벤조락탐의 효과를 제거하지만, 관련 화합물은 PC12 세포에서 약 3배의 sAPP 분비를 유발하는 것으로 추가로 보고되었다. 본 발명의 발명자들은 브리오스타틴이 종양을 촉진하지 않으며 이미 II기 임상 시험중에 있기 때문에 비아밀로이드형성 APP 가공을 선호하는 PKC 활성화제로서의 브리오스타틴의 사용이 특히 치료학적 가치가 있음을 밝혀냈다.
알쯔하이머머병(AD) 환자의 섬유아세포의 변화 중에서 PKC의 변화 뿐만 아니라 칼슘 조절과 칼륨(K+) 채널의 변화도 포함된다. PKC 활성화는 TEA 유도된 [Ca2+] 상승으로 측정된 바에 의하면 정상 K+ 채널 기능을 복구시키는 것으로 나타났다. 추가의 패치 클램프 데이터는 113pS K+ 채널 활성의 복구에 미치는 PKC 활성화제의 효과를 증명한다. 따라서, PKC 활성화제에 기초한 K+ 채널의 복구는 AD 병태생리학의 조사에 관한 접근법으로서 확립되었으며, AD 치료제에 대한 유용한 모델을 제공한다[참조: 전문이 본원에서 참조로 인용되는 계류중인 출원 제09/652,656].
PKC를 자극하도록 작용하는 매크로사이클릭 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류)이 특히 관심대상이다. 브리오스타틴류 화합물 중에서, 브리오스타틴-1은 PKC를 활성화시키는 것으로 나타났고 종양 촉진 활성이 없는 것으로 증명되었다. PKC 활성화제로서의 브리오스타틴-1은 브리오스타틴-1의 용량 반응 곡선이 이상성(biphasic)이기 때문에 특히 유용하다. 또한, 브리오스타틴-1은 PKCα, PKCδ 및 PKCε을 포함한 PKC 동종효소의 차별적 조절을 나타낸다. 브리오스타틴-1은 동물 및 사람에서 독성과 안정성 시험중에 있으며 항암제로서 활발히 연구되고 있다. 연구에서 브리오스타틴-1의 사용은 사람에서의 주요 부작용이 근육통인 것으로 결정되었으며 최대 용량이 40mg/m2로 제한되었다. 본 발명의 sAPP 분비의 급격한 증가를 유발하기 위해 0.1nM의 브리오스타틴-1의 농도를 사용하였다. 브리오스타틴-1은 단독의 비히클 및 10,000배 높은 농도에서 사용된 다른 PKC 활성화제인 벤조락탐(BL)과 비교하였다. 브리오스타틴은 최근 항암제로서 임상 시험 중에 있다. 브리오스타틴은 PKC의 조절 도메인에 결합하여 효소를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 브리오스타틴은 PKC의 이소자임 선택적 활성화제의 예이다. 브리오스타틴 이외의 화합물들이 PKC를 조절하는 것으로 밝혀졌다[참조: 예를 들면, 본원에 참조로서 인용되는 WO 제97/43268호].
매크로사이클릭 락톤, 특히 브리오스타틴-1은 미국 특허 제4,560,774호(본원에 전문이 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 매크로사이클릭 락톤 및 이의 유도체는 당해 분야의 다른 문헌, 예를 들어, 미국 특허 제6,187,568호, 미국 특허 제6,043,270호, 미국 특허 제5,393,897호, 미국 특허 제5,072,004호, 미국 특허 제5,196,447호, 미국 특허 제4,833,257호 및 제4,611,066호(각각 본원에 전문이 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 상기 특허들에는 각종 화합물과, 소염제 또는 항종양제로서의 용도를 포함한 매크로사이클릭 락톤에 대한 각종 용도가 기재되어 있다. 브리오스타틴류 화합물에 대한 다른 논의는 문헌[참조: Szallasi et al., (1994) Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts, Journal of Biological Chemistry 269(3): 2118-24; Zhang et al., (1996) Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1, an Activator of Protein Kinase C, Cancer Research 56: 802-808; Hennings et al, (1987) Bryostatin 1, an Activator of Protein Kinase C, inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin, Carcinogenesis 8(9): 1343-46; Varterasian et al., (2000) Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia, Clinical Cancer Research 6: 825-28; and Mutter et al., (2000) Review Article: Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins, Bioorganic & Medicinal Chemistry 8: 1841-1860(각각 본원에 참조로서 인용된다)]에서 찾아볼 수 있다.
근육통은 PKC 활성화제의 허용량을 제한하는 주요 부작용을 갖는다. 예를 들면, 브리오스타틴-1을 사용하는 II상 임상 시험에서, 근육통은 모든 치료된 환자의 10 내지 87%에서 발견된다[참조: Clamp et al., (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 673-683]. 3주 동안 주 1회 20㎍/m2 용량이 허용되고, 이는 근육통 또는 기타 부작용과 관련이 없다[참조: Weitman et al., (1999) Clinical Cancer Research 5: 2344-2348]. 또 다른 임상 연구에서, 8주 동안 주 1회 투여된 브리오스타틴-1 25㎍/m2이 최대 허용량이었다[참조: Jayson et al., (1995) British J. of Cancer 72(2): 461-468]. 또 다른 연구는 50㎍/m2(1시간, 6주 동안 매 2주 마다 1회씩 투여되는 정맥내 주입)이 최대 허용량인 것으로 보고된다[참조: Prendville et al., (1993) British J. of Cancer 68(2): 418-424]. 보고된 근육통은 브리오스타틴-1의 반복된 치료로 누적되었고, 초기 주입 후 수일 동안 발달하였다. 환자 삶의 질에 대한 근육통의 해로운 영향은 브리오스타틴-1 치료 중지에 대한 원인이었다. 브리오스타틴 유발된 근육통의 원인은 불명확하다.
국립 암 연구소는 근육통의 등급을 매기기 위해 일반적인 독성 범위를 확립하였다. 특히, 기준은 5개의 카테고리 또는 등급으로 나뉜다. 0급은 근육통이 없는 것이다. 1급 근육통은 진통제 약물을 필요로 하지 않는 온화하고 적은 통증이다. 1급 근육통에서, 환자는 온전히 걸을 수 있다. 2급 근육통은 통증 또는 필요한 진통제가 일부 기능에 지장을 주지만 일상 생활의 활동에 지장을 주지 않는 온화한 통증을 특징으로 한다. 3급 근육통은 통증 또는 필요한 진통제가 일상 생활의 활동에 심각하게 지장을 주는 심각한 통증과 관련된다. 4급 근육통은 무능력해지는 것이다.
본 발명의 조성물은 환자에게 투여되는 PKC 활성화제의 허용량을 증가시키고/거나 말초 조직에서 PKC의 활성화를 감소시켜 PKC 활성화와 관련된 부작용을 완화시킨다. 특히, PKC 억제제는 말초 조직에서 PKC를 억제하거나, 말초 조직에서 우선적으로 PKC를 억제한다. 비타민 E는, 예를 들면, 당뇨병 랫트의 대동맥 및 상승된 포도당 수치에 노출된 배양된 랫트 평활근 세포에서 디아실글리세롤-단백질 키나제 C 활성화를 정상화시키는 것으로 나타났다[참조: Kunisald et al., (1994) Diabetes 43(11): 1372-1377]. 온화하게 발달한 알쯔하이머병을 겪고 있는 환자에서 비타민 E(2000 IU/일) 치료의 이중맹검에서, 비타민 E 치료는 치사율과 사망률을 감소시키지만, 인지 능력을 개선시키지 않는 것으로 밝혀졌다[참조: Burke et al., (1999) Post Graduate Medicine 106(5): 85-96].
브리오스타틴류를 포함한 매크로사이클릭 락톤은 본래 불굴라 네리티나 엘(Bugula neritina L.)로부터 유래된다. 매크로사이클릭 락톤, 특히 브리오스타틴류에 대한 다수의 용도가 공지되어 있으나, 매크로사이클릭 락톤과 인지 증진 사이의 관련성은 아직 공지되어 있지 않다.
본 발명에서 사용될 수 있는 화합물의 예에는 매크로사이클릭 락톤(즉, 브리오스타틴류 및 네리스타틴류 화합물)이 포함된다. 이들 화합물의 특정 양태는 실시예 및 상세한 설명에 기재되어 있으며, 참조문헌에 기재된 화합물들 및 이들의 유도체도 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 매크로사이클릭 락톤 화합물 및 이의 유도체, 특히 브리오스타틴류는 조합 합성 기술로 다루기가 쉬우므로 당해 화합물의 라이브러리를 생성시켜, 조성물의 효능 및 안정성을 포함하나 이에 제한되지 않는 약리학적 파라메터를 최적화시킬 수 있다. 추가로, 이러한 라이브러리를 검정하여, α-세크레타제 및/또는 PKC를 바람직하게 조절하는 구성원을 결정할 수 있다.
브리오스타틴의 합성 유사물질도 또한 본 발명에 포함된다. 특히 이들 유사물질은 브리오스타틴과의 NMR 분광학적 비교 및 다양한 정도의 PKC 결합 친화력에 의해 측정된 결과, C1-, C19-, C26-산소 인지 도메인의 배향성을 보유하고 있다. 미국 특허 제6,624,189호(본원에 참조로서 인용된다)에 공지되고 기재되어 있는 브리오스타틴 유사물질도 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 미국 특허 제6,624,189호의 화학식 I의 종류(컬럼 3, 열 35-66) 및 미국 특허 제6,624,189호의 화학식 II 내지 VII 및 1998a 및 1998b의 종류(컬럼 8, 열 28-60)에 기재된 브리오스타틴 유사물질은 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 PKC 활성화제이다.
인지능력 또는 일반 인지의 특정한 특징을 통해 개선된 전반적 인지를 위한 치료방법의 개발이 여전히 요구된다. 또한, 특정 질환 상태 또는 인지 장애와 관계없이 인지 증진을 개선시키기 위한 방법의 개발이 여전히 요구된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 이러한 요구를 충족시키며 알쯔하이머병 및 기타 신경퇴행성 질환에 대한 임상 치료를 매우 개선시킬 뿐만 아니라 개선된 인지 증진을 제공한다. 당해 방법 및 조성물은 또한 α-세크레타제의 조절을 통해 인지 상태의 치료 및/또는 증진을 제공한다.
실시예 1: 행동 약리학
브리오스타틴 노출 - 실험을 시작하기 전에 헤르미센다 크라시코르니스(Hermissenda Crassicornis) 표본을 15°의 천공된 50㎖들이 원뿔형 원심분리기 튜브 중에서 3일 동안 인공 해수(ASW) 중에 유지하였다. 해양 이끼벌레 불굴라 네리티나(Bugula neritina)로부터 정제한 브리오스타틴을 EtOH 중에 용해시키고 ASW 중에서 최종 농도로 희석하였다. 동물을 4시간 동안 ASW 중의 브리오스타틴과 항온처리한 다음, 정상 ASW로 헹구었다. 선택된 실험을 위하여, 락타시스틴(lOμM) 또는 아니소마이신을 ASW에 가하였다.
헤르미센다의 행동과 생화학에 대한 브리오스타틴의 영향은 각 개체 동물이 거주하는 길이가 8cm이고 직경이 1cm인 시험 튜브 내에 배쓰 배지에 약물을 첨가함으로써 산출하였다.
실시예 2: 면역염색법
실험적 처리 및 시험 후, 동물들의 목을 빠르게 베고, 중추신경계(CNS)를 제거한 다음, 20mM 트리스 완충된(pH 8) 천연 해수(NSW; 0.2μm 마이크로포어 여과) 중의 4% 파라-포름알데히드 중에 고정시켰다. 그 다음, CNSs를 폴리에스테르 왁스(20)에 삽입하고, 절개하고(6μm), 아비딘 결합된 마이크로퍼옥시다제에 결합된 바이오티닐화된 2차 항체(ABC 방법, 벡터)를 사용하여 면역염색하였고, 여기서 아미노에틸카바졸(AEC)을 색원체로서 사용하였다. 오징어 시신경엽으로부터 추출한 전장 칼렉시틴 단백질로부터의 1차 다클론 항체(설계된 25U2)를 래빗에서 키웠다. 회색조 강도 측정을 B-광수용체의 국한성 세포질 영역 상의 디지털 포토마이크로그래프로부터 동일한 배경 영역(비염색 뉴로파일)을 뺌으로써 수행하였다.
실시예 3: 단백질 키나제 C 분석
세포를 1mM EGTA, 1mM PMSF 및 50mM NaF를 함유하는 10mM 트리스-HCl pH 7.4 완충액 lOO㎕ 중에서 초음파 처리(5초, 25W)로 균질화시켰다. 균질액을 폴리알로머 원심분리기 튜브로 옮기고, 10분 동안 4°에서 100,000xg으로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 즉시 드라이 아이스로 냉동시켰다. 미립자 분획을 동일한 완충액 lOO㎕ 중에서 초음파 처리하여 재현탁하고, -80°에서 저장하였다. PKC를 측정하기 위하여, 세포질 또는 입자 분획 lO㎕를 15분 동안 37°에서 1OμM 히스톤, 4.89mM CaCl2, 1.2㎍/㎕ 포스파티딜-L-세린, 0.18㎍/㎕ 1.2-디옥타노일-sn-글리세롤, 10mM MgCl2, 20mM HEPES(pH 7.4), 0 내지 8mM EDTA, 4mM EGTA, 4% 글리세롤, 8㎍/㎖ 아프로티닌, 8㎍/㎖ 류펩틴 및 2mM 벤즈아미딘의 존재하에 항온처리하였다. 0.5μCi [γ32-P]ATP를 가하고, 32P-인단백질 형성을 이전에 기재된 바와 같이 포스포셀룰로오스에 대한 흡착으로 측정하였다(25). 당해 분석을 약간 수정하여 헤르미센다 중추신경계 균질액 또는 배양된 포유류 신경 균질액에 사용하였다.
실시예 4: 세포 배양
랫트 해마상융기 H19-7/IGF-IR 세포(ATCC)를 폴리-L-라이신 피복된 플레이트 상에 놓고, 35°에서 DMEM/10% FCS 중에서 약 50%의 범위가 수득될 때까지 성장시켰다. 그 다음, 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 10ng/㎖를 함유하는 N2 배지 5㎖로 배지를 교체하여 뉴런 표현형으로 분화를 유도하고, 39℃에서 T-25 플라스크에서 성장시켰다(26). 다양한 농도의 브리오스타틴(0.01 내지 1.0nM)을 수용액 1O㎕ 중에 가하였다. 특정한 간격 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하고, 살짝 긁어서 제거하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리로 회수하였다.
실시예 5: 행동 조건화
헤르미센다의 파블로프 조건화는 무조건 자극인 궤도 쉐이킹과 중성 자극인 빛의 반복 쌍(pairing)을 포함한다[참조: Lederhendler et a(24) and Epstein et ah(6)]. 회전/진탕 자극은 평형포 유모 세포를 흥분시켜 다음의 무조건 반응을 유도한다: 발을 지지하는 표면에 대한 부착 또는 "밀착"을 수반하는, 발이라 불리는 근육 밑면의 활발한 수축. 조건화 전에, 빛은 발의 연장을 수반하는 약한 양성 주광성을 유발한다. 충분한 빛-회전 쌍 후, 빛은 더 이상 주광성을 유발하지는 않지만, 대신 다음의 새로운 반응을 도출한다(24): 무조건 자극에 의해서만 이전에 유발된 "밀착" 및 발의 단축(도 1). 따라서, 무조건 자극인 회전 또는 궤도 진탕의 의미는 조건 자극으로 옮겨지고, 빛 유발된 발 수축-발 길이의 음성적 변화에 의해 명백해진다. 빛에 대한 이러한 조건 반응은 수주 동안 지속될 수 있고, 무작위한 빛 및 회전에 의해서 야기되지 않으며, 자극 특이적이고, 포유류 파블로프 조건화의 기타 정의된 특성을 공유한다.
실시예 6: 연상 기억의 브리오스타틴 유도된 연장
헤르미센다의 파블로프 조건화는 학습된 조건 반응을 점진적으로 보다 오래 지속적으로 기억시키는 잘 정의된 훈련 파라미터를 갖는다. 빛과 궤도 진탕으로 짝지어진("방법" 참조) 2개의 훈련 이벤트(2 TE)는, 예를 들면, 약물 치료없이 약 7분 동안 지속되는 학습된 조건 반응(빛 유발된 발 수축 또는 단축)을 유도한다. 4 내지 6회의 훈련 이벤트(4 내지 6 TE)는 수시간 동안 지속되는 조건 반응을 유도하지만, 훈련 약 1일 후 사라진다. 9회의 TE는 수일 및 종종 2주 이하 동안 지속되는 장기 연상 기억을 야기한다.
훈련 전에 암순응 동안(10분) 브리오스타틴(0.25ng/㎖)을 가하고 4시간 동안 유지하거나, 브리오스타틴을 가하지 않고(NSW 대조군), 동물을 4 및 6쌍의 CS/US 훈련 이벤트(TE)의 차선적인 방식으로 훈련시키고, 9쌍의 TE 및 NSW를 양성 대조군으로서 제공하였다. 모든 동물을 4시간 동안 CS 단독으로 시험한 다음, 24시간 간격으로 시험하였다. 차선적으로 훈련되었지만 브리오스타틴으로 처리된 동물들은 모두 장기 기억 보유를 획득한 것으로 나타났다(n = 8 내지 16 동물/조건/실험; ANOVA, p<0.01)
2 TE + 브리오스타틴은 장기 기억 보유를 야기하고(브리오스타틴 없이는 수 분임과 비교), 4 TE + 브리오스타틴은 기억 보유를 24시간 이상으로 확장시키고(도 1), 6 TE + 브리오스타틴은 1주 이상 지속되는 기억 보유를 야기하였다.
브리오스타틴 없는(NSW) 무작위의 짝지어진 CS/US 훈련 이벤트(TE)는 4시간 동안 시험된 경우 LTM을 유발하거나 CR을 유발하지 않았다. 6 TE 조건화 전(10분 암순응 동안) 및 그 후 4시간 동안 적용된 브리오스타틴(NSW 중의 0.25ng/㎖)은 양성 CR을 유발하였고(발 수축; 길이의 음성 변화), 따라서 LTM이 확립되었음을 나타낸다. 훈련 전(암순응 동안) 적용되는 경우, 길항제 Ro-32는 6 TE + 브리오스타틴의 영향을 차단하고, 즉 동물은 정상적인 주광성에 의해 연장된다(양성 길이 변화)(n = 4 내지 8 동물/조건/실험; ANOVA 변화, p<0.01). 빛과 회전의 무작위 제시는, 브리오스타틴 유무와 관계없이 조건 반응, 즉 빛 유발된 발 수축을 야기하지 않는다(도 2). 따라서, 훈련 도중 및 훈련 직후의 브리오스타틴은 차선적인 훈련 시험으로 기억 보유를 연장시켰다.
실시예 7: 훈련 수일 전 브리오스타틴에 대한 예비 노출은 기억 획득을 향상시킨다.
예비 측정(15, 17)은 신경막과 학습 유도된 PKC의 연합(즉, 전좌)가 지속될 수 있음을 나타냈다. 래빗 순막 조건화, 랫트 공간 미로 학습, 미로 학습 및 랫트 후각 판별 학습은 모두 훈련 후 수일 동안 지속되는 PKC 전좌를 수반함을 밝혀냈다. 헤르미센다 조건화는 훈련 후 1일 이상 동안 단일의 동정가능한 타입 B 세포에 국한될 수 있는 PKC 전좌에 의해 관찰되었다(15).
이미 기재한 바와 같이, 훈련 동안 및 훈련 후 4시간 동안 브리오스타틴에 대한 노출은 6 내지 8분 내지 수시간 동안 2 TE에 의해 야기된 기억 보유를 향상시킨다. 그러나, 훈련 전날 뿐만 아니라 2 TE일에 브리오스타틴에 대한 4시간 노출은 훈련 후 1일 이상 기억력을 연장시켰다. 2쌍의 CS/US 훈련 이벤트와 커플링된 동물의 2일 연속 4시간 브리오스타틴 노출(0.25ng/㎖)이 CS 단독으로 시험되는 경우 6일 이상의 장기 기억 보유를 야기하는 것이 CR(체장 수축)에 의해 입증되었다 (n = 16 동물/조건; ANOVA, p<0.01)(도 3).
동물들에게 3일 연속 4시간 브리오스타틴을 노출(0.25ng/㎖)시킨 다음, 1일 후 2 TE를 수행함은 훈련 후 96시간 동안 측정한 결과 장기 기억 보유(LTR)를 입증하였다. 노출되지 않은 동물(도 3과 동일)은 임의의 행동 변화를 나타내지 않았다(CS 시험에 대해 CR 없음). 아니소마이신(ANI)(1㎍/㎖)을 즉시 투여하고 훈련 후 4시간 동안 동물에게 3일 브리오스타틴 치료를 받도록 한 것은 장기 기억 보유를 방해하지 않았다. 따라서, 훈련 후에 첨가된 경우, 일반적으로 ANI에 의해 차단되는 LTR을 유도하는데 필수적인 단백질의 합성에 대한 필요성은 3일 브리오스타틴 치료에 의해 없어졌다(n = 16 동물/조건; ANOVA, p<0.01). 4시간 간격의 브리오스타틴에 대한 3일째 노출은 유사하게 향상된 파블로프 조건 반응의 기억 보유를 유발하였다(도 4). 상기 결과는 브리오스타틴에 대한 2일 연속 간격 노출이 PCK 활성화 및 가능하게는 장기 기억에 중요한 단백질 합성을 유발하는 동시에 후속적인 PKC 하향조절을 최소화한다는 견해를 지지한다. 당해 견해는 보다 연장된 간격, 즉 8 내지 20시간의 브리오스타틴 노출 후, 2 TE(도 5)가 그 자체로는 이전 연속된 일들의 4시간 노출에 의해 달성되는 것과 동일한 기억 보유를 야기하는데 충분하지 않다는 관찰에 의해서도 추가로 지지되었다. 본 실험에서, 훈련에 대한 20시간 브리오스타틴(0.25ng/㎖) 노출의 영향을 관찰하였다. 차선적인 2쌍의 TE 조건화 방식으로, 기억 보유는 48시간 내에 사라진다. 4쌍의 TE 조건화와 브리오스타틴에 대한 2O시간 예비 노출의 기억 보유는 지속되었다(n = 8 동물/조건; 48시간에서 ANOVA, p< 0.01). 충분히 연장된 브리오스타틴 노출(예: 8 내지 12시간)은 기타 세포계에서 PKC 활성화를 보상하고 PKC 합성을 증가시킬 수 있는 PKC 하향조절 연장을 유발하는 것으로 알려져 있다.
유사하게, 충분히 증가된 농도의 브리오스타틴은 또한 아마도 PKC 하향조절로 인해 결국 기억 보유를 차단시킨다(도 6). 50ng/㎖ 미만의 브리오스타틴 농도는 차선적인(4 TE) 훈련 조건하에 획득과 기억 보유를 증가시킨다. 이들 농도는 9쌍의 TE하에 기억 보유 성능에 대한 영향을 입증하지 못했다. 그러나, 모든 훈련 조건을 시험한 결과, 1.0ng/㎖ 이상의 농도는, 아마도 PKC 하향조절을 통해, 획득과 행동 기억 보유를 억제시켰다(n = 16 동물/조건).
실시예 8: 브리오스타틴에 대한 예비 노출은 훈련 동안 단백질 합성의 필요성을 미연에 방지한다.
동물을 2쌍의 훈련 이벤트(TE)를 받게 한 다음, 4시간 후 기억 보유에 대해 시험하였다. 브리오스타틴(0.25ng/㎖)을 훈련 10분 전에 암순응 기간 동안 NSW 중에서 동물에 적용하고, 4시간 후 행동 조건화의 보유를 입증하였다(발 수축(CR) 및 체장 단축). NSW 대조군 동물 및 훈련 전 브리오스타틴으로 처리된 후 훈련 직후 아니소마이신(1.0㎍/㎖)으로 처리된 동물들은 정상적인 양성 주광성으로 발 연장을 갖는 CR을 나타내지 않았다(n = 12 동물/조건/실험, 양방향 ANOVA 통계, p<0.01). 2 TE와 함께 브리오스타틴에 대한 단일 4시간 노출은 수시간 지속되는 장기 기억 보유를 야기하고, 이러한 장기 기억은 아미소마이신이 브리오스타틴과 함께 존재하는 경우 모두 제거되었다(도 7). 아니소마이신의 유사한 차단 효과는 또한 6 TE + 브리오스타틴에서 관찰되었다. 그러나, 브리오스타틴에 대한 반복된 간단한 노출은 PKC, 칼렉시틴 및 기타 기억 단백질의 순 합성을 증가시키고, 따라서 PKC 하향조절이 충분히 최소화되는 경우 파블로프 조건화 동안 및 조건화 후 새로운 합성에 대한 필요성이 제거된다. 단백질 합성은 각각 3일 전에 먼저 브리오스타틴에 4시간 동안 노출된 동물의 2 TE 직후 아니소마이신으로 4시간 동안 차단되었다. 당해 경우, 단백질 합성의 아니소마이신 유도된 차단은 수일 동안 지속되는 기억 보유를 방지하지 않았다(도 4). 대조적으로, 동일한 4시간 아니소마이신 처리는 9 TE에 의해 야기된 기억 보유를 모두 제거하였고, 훈련 요법은 일반적으로 기억 보유 1 내지 2주 전에 선행되었다(27). 최종적으로, 아니소마이신을 매회 수반하는 브리오스타틴에 대한 3일 연속 4시간 노출 후 다음날에 2 TE 수행은 장기 기억을 제거하였다.
실시예 9: 프로테아좀 억제에 대한 예비 노출은 기억에 대한 브리오스타틴 영향을 향상시킨다.
PKC 및 기타 기억 관련 단백질의 신규한 합성을 향상시키거나 연장시키는 또 다른 수단은 단백질 분해에 관련된 경로를 차단함으로써 제공된다. 이들 중 하나인 유비퀴틴-프로테아좀 경로(28 내지 30)는 PKC의 α-이소자임의 주요 분해 경로로 알려져 있다. PKC-α의 분해는 프로테아좀 억제제인 락타시스틴 20μM 내지 50μM에 의해 대부분 방지되는 것으로 이미 밝혀져 있다.
동물을 동시에 4시간 동안 브리오스타틴(0.25ng/㎖) 및 락타시스틴(10μ/M)으로 접종시킨 다음, 24시간 후 2쌍의 CS/US 훈련 이벤트(TE)로 조건화시킨다. 동물을 후속적으로 훈련 후 4시간에 CS 단독으로 시험한 다음, 24시간 간격으로 수행한다. 조건화된 행동의 보유는 배합된 브리오스타틴/락타시스틴 치료에 의해 계속되었고, 행동의 보유는 브리오스타틴 단독 처리된 동물에서 24시간 후 사라졌다. 락타시스틴 단독 처리된 동물은 행동 훈련의 획득 또는 보유를 나타내지 않았다(데이터 그래프 없음)(n = 28 동물, 배합된 브리오스타틴/락타시스틴; n = 20, 브리오스타틴 단독; n = 16, 락타시스틴 단독). 락타시스틴은, 당해 경우, 브리오스타틴 1회 노출(이후 2 TE)에 의해 야기된 단기 기억을 수일 동안 지속되는 장기 기억으로 변화시켰다(도 8).
실시예 10: PKC 활성화에 의한 칼렉시틴 면역염색
최근에, 칼렉시틴의 면역염색 라벨은 헤르미센다 조건화의 획득 및 보유 동안 단일의 동정가능한 타입 B 세포에서 증가하였음을 보여주었다(20). 다수의 이전 결과들은 저분자량의 칼슘 및 GTP 결합 단백질인 칼렉시틴이 헤르미센다 조건화 동안 PKC 이소자임에 대한 기질임을 시사하였다(19). 현재 일부 동물종에서 완전하게 서열분석되고 기타 종에서 유사한 단백질과 현저한 상동성을 갖는 것으로 나타난(31) 칼렉시틴은 헤르미센다 파블로프 조건화 동안 및 그 후 인산화의 변화를 겪는다. 이는 또한 PKC의 알파-이소자임에 대한 높은 친화성 기질이면서 베타 및 감마 기질에 대한 낮은 친화성 기질이다(19).
마이크로그래프(A, B)는 칼렉시틴 다클론 항체인 25U2로 면역라벨링된 헤르미센다 눈으로부터 대표적인 조직 절편을 도시한다. 양성 칼렉시틴 면역염색은 브리오스타틴(B) 투여 유무하에 페어링된 CS/UCS 연상 조건화를 실시한 동물의 B 세포 광수용체(*B 세포)에서 발생하였다. 두 자극(훈련 이벤트, TE)의 무작위 제시는 행동 변화를 야기하지 못하거나 상기 정상적인 배경 수치의 칼렉시틴에서의 상승을 유발하지 못했고(A); 기저 막 및 렌즈 염색은 척추동물의 다클론 항체를 사용하는 것과 관련된 인위적 결과이다. 염색 강도에서의 차이를 측정하고 회색조(0 내지 256; B 세포 세포질 - 조직 배경)로서 기록하였다. 그래프(C)는 9회의 무작위 TE(좌측 바)로 조건화된 헤르미센다와 PKC 효능제인 브리오스타틴(0.25ng/㎖)에 연속일 동안 2회 노출로 처리된 후 2쌍의 TE로 연합 조건화된 동물에 대한 강도를 나타낸다. 2 TE와 커플링된 브리오스타틴의 2회 노출로부터의 PKC 활성화는 현저하게 칼렉시틴을 9쌍의 TE 및 강화된(장기) 기억과 관련된 수치를 증가시켰다(n = 4 내지 8 동물/조건/복제; 시험 비교, p<0.01).
칼렉시틴 면역염색은 광 전정 신경돌기의 시냅스 영역 내의 보우톤(bouton)을 용해시키는데 충분히 예민하다(D). 화살표는 간재 뉴런(a), 반대측 뉴런으로부터의 축색돌기(b) 및 추정상 광수용체로부터의 신경돌기의 말단 보우톤(c) 사이의 수상분지 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 10μm; CPG, 뇌체측 신경절(도 9, 10).
당해 조건화 유도된 칼렉시틴 라벨의 증가는 단백질의 실질적인 양을 증가시키는 것으로 나타나는데, 이는 면역염색 항체가 인산화된 형태 및 인산화되지 않은 형태의 단백질 둘 다와 반응하기 때문이다. 동일한 각각의 타입 B 세포에서 전좌하는 것으로 이전에 나타낸 PKC는 칼렉시틴 라벨에서 조건화 유도된 증가를 명백하게 유발하는데, 이는 특정한 PKC 차단제인 Ro-32가 타입 B 세포에서 학습 및 학습 특이적인 칼렉시틴 증가를 방지하기 때문이다(상기 참조). 미처리 및/또는 무작위 대조군 훈련 프로토콜은 작은 분획의 훈련 유도된 칼렉시틴(CE) 면역염색을 야기한다(도 9).
브리오스타틴 없는 무작위 훈련(4 TE)은 배경 보다는 약간 높은 강도의 측정값을 수득하였다. 브리오스타틴 투여는 훈련 패러다임 둘 다에서 칼렉시틴 수치를 증가시켰다. 무작위 훈련의 경우, 본원에서 경우와 같이 CS 및 US의 간헐적 중복(페어링)이 존재할 때, CE에서 약간의 증가(2.0 증가)가 발생할 수 있음은 예상되지 않는다. 그러나, 칼렉시틴 수치는 페어링된 훈련으로 4.3배 이상 증가하였다(평균 ± SE, N=5 동물/치료, 4RTE = 무작위 대조군, 무작위 빛 및 회전으로 4회 시험; 6PTE = 페어링된 시험, 빛 및 회전의 쌍으로 6회, 6PTE-0Bry 대 6PTE-0.25Bry: p<O.001; 4RTE-0.25Bry 대 6PTE-0.25Bry; p<O.001(t 검정)). 차선적인 훈련 이벤트(4 내지 6 TE)를 사용하는 경우, CE 면역염색(도 1OA)은 상승의 중간 수치에 도달하였다. 이들 차선적인 방식은 24시간 이상 지속되는 기억 보유를 야기하기에는 불충분하였다. 상기 기술한 바와 같이, 6 TE의 훈련 동안 투여된 브리오스타틴은 장기 기억 보유를 유도하였다(1주 이상). 또한, 브리오스타틴 + 6 TE는 9 TE 후 관찰된 것에 필적하는 CE 면역염색을 유도하였다.
저용량(0.1 내지 0.25ng/㎖)의 브리오스타틴은 2, 4 또는 6회의 훈련 시험 후 현저하게 기억을 향상시켰다. 6 TE에 의한 파블로프 조건화는 브리오스타틴이 있는 경우 수일 지속되는 기억을 야기하지만, 브리오스타틴이 없는 경우 단지 수시간 지속되는 기억을 야기하였다. 당해 기억 향상은 아니소마이신 또는 PKC 억제제인 Ro-32에 의해 차단된다. 비록 1주 이상 동안 기억이 지속되더라도, CE 면역염색이 9 TE 후 24시간 크게 감소되는 것은 매우 중요하다. 그러나, 보다 지속적인 CE 면역염색은 최소 훈련(2 TE) 전 수일 동안 브리오스타틴 반복 노출로부터 야기된다.
각 1, 2 및 3일의 각각 4시간 동안 브리오스타틴 단독(연상 조건화 없이) 투여는, 브리오스타틴 노출의 각 기간 후 24시간에 측정한 경우, 헤르미센다의 B-광수용체 내의 칼렉시틴의 수치를 증가시켰다. 4시간 동안 브리오스타틴 1회 노출 후 24시간에, CE 면역염색은 증가하지 않았다(도 10B). 브리오스타틴 2회 노출 후 24시간에, 각 2일 연속의 1은 보다 큰 잔여 CE 면역염색을 나타내었다. 브리오스타틴 3회 노출에 이은 2쌍 훈련 이벤트(빛 및 궤도 진탕) 후의 칼렉시틴의 수치는 연상 조건화 유발된 행동 변화에 대한 보유 일수에서 현저한 길이를 수반하는 매우 높은 수치를 야기하였다 (n = 16 동물/조건: ANOVA, p<0.01). 이러한 3개의 노출 다음날 2 TE의 경우, 24시간 후의 CE 면역염색은 9 TE 직전에 이미 관찰된 수치에 도달하였다 (도 10B). 따라서, 3일의 4시간 브리오스타틴 노출 후 최소 훈련(2 TE)에 이은 CE 면역염색은 훈련 시험이 단독으로 수행되는 경우보다 오래 지속되는 것으로 나타났다. 신규하게 합성된 칼렉시틴의 이러한 지속은 브리오스타틴에 의해 유도된 단백질 합성 향상을 나타내는 생화학적 관찰과 일치한다.
2일 연속 4시간 동안 브리오스타틴에 대한 노출의 24시간 후, 2-훈련 이벤트(2 TE)는 장기 기억 강화와 관련된 양까지 칼렉시틴의 수치를 증가시키는데 필요하다. 전형적으로, 2-TE와 브리오스타틴 2회 노출은 보유를 1주 이상 증가시킨다(n = 16 동물/조건; t 검정, p<0.01). 브리오스타틴에 대한 3일 연속 4시간 노출에 의한 준비 자극은 강화된 기억에 필요한 칼렉시틴의 수치를 유도할 것이다. 2쌍의 훈련 이벤트 직후 첨가된 아니소마이신은 당해 칼렉시틴 수치를 감소시키지 않고, 강화된 기억은 수일 동안 지속된다(N = 8 동물/조건; t 검정, p>0.05, ns)(도 11A, B).
브리오스타틴 + 훈련 직후의 PKC의 Ro-32 억제는 장기 기억 유도를 방해하지 않지만, 훈련 + 브리오스타틴 동안의 상기 억제는 기억 강화를 방해하는 것이 주목할 만하다. 대조적으로, 브리오스타틴 유무하에 훈련 동안의 아니소마이신은 장기 기억을 방지하지 않고, 브리오스타틴 유무하에 훈련 후의 아니소마이신은 기억 형성을 완전히 차단하였다. 따라서, 훈련 동안의 PKC의 활성화는 장기 기억에 필요한 단백질 합성에 선행한다. 따라서, 일단 PKC 활성화가 충분한 수치로 유도되면, 필요한 단백질 합성은 불가피한 결과이다. 결과적으로, 훈련 수일 전의 브리오스타틴 유도된 PKC 활성화는 최소 훈련 시험으로도 장기 기억을 유발하기에 충분하다. 또한, 이러한 후자의 장기 기억은 훈련 후의 단백질 합성(및 수일 전의 PKC 활성화)을 필요로 하지 않는다. 다시, 사전 PKC 활성화는 후속적인 장기 기억 형성에 필요한 단백질 합성을 야기하는데 충분하였다. 브리오스타틴 유도된 PKC 활성화 및 조건화 시험에 의해 합성 유도된 단백질 중 하나는 면역염색 라벨링에 의해 입증된 바와 같이 칼렉시틴이다. 기타 단백질은 PKC 자체이다.
실시예 11: PKC 활성에 대한 브리오스타틴의 영향
브리오스타틴은 세포막 분획과의 PKC 연합을 증가시킴으로써 PKC를 일시적으로 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 다양한 연상 기억 패러다임은 또한 신경막과의 PKC 연합을 증가시키는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자들은 헤르미센다의 브리오스타틴에 대한 반복 노출(즉, 4시간 노출, 정확히는 훈련 프로토콜에 따름)이 또한 연장된 PKC 활성화를 유도할 가능성을 시험하였다.
손상되지 않은 헤르미센다를 기재된 조건("행동 약리학")하에 수일 동안 연속적으로 브리오스타틴(0.28nM)에 4시간 간격으로 노출시켰다. 그 다음, 분리된 식도주변 신경계에서의 히스톤 인산화("방법" 참조)를 세포질 분획에서 측정하였다. 브리오스타틴 2회 노출 중 2회째 후 10분 및 24시간 둘 다에서 측정한 PKC 활성은 기준선 수치보다 현저하게 증가하였다(각각의 측정에서 N = 6)(도 12, 13). 따라서, 분획 둘 다에서 PKC의 양은 명백하게 증가하였지만, 세포질 분획 중의 PKC에 대한 막 중의 PKC의 비율은 증가하지 않았다. 이러한 결과는 브리오스타틴 예비 노출이 학습 자체와 상이한 영향을 PKC에 야기함을 입증한다. (전좌를 통한) 초기 활성화 후, 상기 브리오스타틴 영향은 거의 PKC의 합성 증가로 인한 것이고, 브리오스타틴에 의해 유도된 칼렉시틴의 증가된 수치와 일치하지만, 브리오스타틴 반복 노출과 직접적으로 관련되지는 않는다.
도 12 및 13과 같지만, 각각 브리오스타틴(0.25ng/㎖) 노출과 함께 아니소마이신(1.0ng/㎖)을 첨가한다. 아니소마이신은 3일 동안 연속적으로 브리오스타틴에 노출된 후 헤르미센다 식도주변 신경계로부터의 세포질 분획과 막 분획 둘 다에서 PKC 활성을 현저하게 감소시킴을 주목한다(각각의 측정에서 N = 3, p<0.01)(도 14).
브리오스타틴에 대한 반복 노출의 생화학적 결과를 추가로 실험하기 위하여, 랫트 해마상융기 뉴런을 온도 감수성 tsA5CSV40 거대 T 항원의 레트로바이러스 형질도입에 의해 무한증식하도록 한 후에 연구하였다(25). 이들은 N2 배지(26) 중의 염기성 섬유아세포 성장 인자에 의해 유도되는 경우 뉴런 표현형을 갖도록 분화되고, PKC를 포함한 뉴런 단백질을 정상적으로 전량 발현한다.
배양된 해마상융기 뉴런의 단일 활성화 용량의 브리오스타틴에 대한 30분 동안의 노출에 의해 세포질로부터 미립자 분획으로 PKC의 단기 전좌를 야기한 다음(약 60%), 연장된 하향조절을 후속적으로 수행하였다(도 15). 초기 PKC 활성화 및 후속적인 하향조절은 상기 기재된 바와 같고, 막 및 세포질에서의 PKC 활성 측정에 의해 확인되었다. 배양된 해마상융기 뉴런의 브리오스타틴에 대한 30분 동안 제1 노출 후, 30분 동안 제2 노출(30분 내지 8시간 범위의 간격)은 보다 빠르게 재결합되는 막 결합 PKC를 야기하였다. 따라서, 2 내지 4시간 지연 후 제2 노출은 단일 브리오스타틴 노출이 야기한 현저한 하향조절을 제거하였다(도 16). 세포질 분획에서, PKC 활성에 대한 현저한 변화는 브리오스타틴 노출 후 처음 4시간 내에 검출되지 않았다. 대조적으로, 세포를 2시간 내에 브리오스타틴에 2회 노출시키는 경우, 제2 노출에 대한 반응으로 PKC 활성의 현저한 감소가 존재하였다. 그러나, 제2 노출이 제1 노출 후 4시간까지 지연되는 경우, 활성은 기준선 보다 증가하고, 이는 2시간 이하 후 전달된 제2 노출과 비교하여 현저하게 큰 정도이다(도 16).
이러한 결과들은 PKC의 초기 브리오스타틴 활성화에 이은 하향조절(28 내지 30)이 PKC 이소자임(뿐만 아니라 상기 기재된 칼렉시틴)의 (새로운 단백질 합성을 통한) 합성을 증가시킨다. 사실, 뉴런 회수 전에 마지막 1/2시간에서 35S-메티오닌의 혼입에 의해 측정된 결과, 0.28nM 브리오스타틴에 대한 30분 단일 노출은 총 단백질 합성을 증가시키며(도 17), 브리오스타틴 노출 후 79시간 동안 60%까지 증가시켰다. 이러한 브리오스타틴에 의해 유도된 단백질 합성의 연장되고 충분한 증가는 PKC 억제제 Ro-32가 또한 존재하는 경우 부분적적으로 차단되었다(도 17).
풍부한 관찰은 충분한 브리오스타틴 유도된 PKC 활성화가 필연적으로 점진적인 PKC 활성화 및 후속적인 하향조절을 야기함을 나타낸다. 충분한 용량의 브리오스타틴(1.0ng/㎖ 이상)은 실질적으로 파블로프 조건화를 억제시킨다. 이는 고농도의 브리오스타틴에 의한 행동 결과를 특징으로 하는 PKC 하향조절에 의한 것이다. 브리오스타틴에 의해 유도된 PKC 활성화는 2가지 상이한 경로에 의해 하향조절되는 것으로 나타났다. 포르볼 에스테르에 의해 유도된 기전은 유비퀴틴화 및 프로테오좀 경로를 통한 후속적인 단백질 분해와 관련된다. 포르볼 에스테르에 의해 유도되지 않는 하향조절의 두번째 기전은 소포 구획을 통한 이동 및 포스페이트 PPl 및 PP2A에 의해 매개된 분해와 관련된다. PKC 활성화제의 농도 및/또는 지속기간이 충분한 경우, PKC 분해 경로는 PKC 합성을 새로 자극하는 PKC 결핍을 야기하고, PKC 합성은 불활성화 및 하향조절을 보상할 수 없고, 이로 인해 이용가능한 PKC의 고갈을 95% 이상 야기한다.

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  22. 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제 및 PKC 억제제를 포함하고, 상기 PKC 활성화제가 매크로사이클릭 락톤이고 상기 PKC 억제제가 Ro-32-0432이며, 매크로사이클릭 락톤이 Ro-32-0432 투여 전에 투여되는, 장기 기억 강화용 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 매크로사이클릭 락톤이 브리오스타틴인 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 브리오스타틴이 브리오스타틴-1, 브리오스타틴-2, 브리오스타틴-3, 브리오스타틴-4, 브리오스타틴-5, 브리오스타틴-6, 브리오스타틴-7, 브리오스타틴-8, 브리오스타틴-9, 브리오스타틴-10, 브리오스타틴-11, 브리오스타틴-12, 브리오스타틴-13, 브리오스타틴-14, 브리오스타틴-15, 브리오스타틴-16, 브리오스타틴-17 및 브리오스타틴-18로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 브리오스타틴이 브리오스타틴-1인 약제학적 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 상기 매크로사이클릭 락톤이 네리스타틴인 약제학적 조성물.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매크로사이클릭 락톤의 투여가 PKC 합성을 증가시키는 약제학적 조성물.
  28. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매크로사이클릭 락톤의 투여가 칼렉시틴의 양을 증가시키는 약제학적 조성물.
  29. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매크로사이클릭 락톤의 투여가 PKC의 실질적 하향 조절을 일으키지 않는 약제학적 조성물.
  30. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKC 억제제가 말초 조직에서 PKC를 억제하는 약제학적 조성물.
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