KR101325057B1 - A nadh oxidase mutant improved in stability and activity - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 물을 생성하는 NADH 산화효소의 돌연변이체 및 이를 이용하여 효소의 안정성과 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 돌연변이에 의해 효소 활성이 개량된 물을 생성하는 NADH 산화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 NADH 산화효소의 돌연변이체 및 개량된 NADH 산화효소를 이용하여 조효소인 NAD(P)+를 재생하는데 이용하는 것이다. The present invention relates to a mutant of a water-producing NADH oxidase and a method of increasing the stability and activity of the enzyme using the same. More particularly, the NADH oxidase producing water with improved enzyme activity by mutation, It is used to regenerate the coenzyme NAD (P) + using a nucleic acid molecule encoding, a vector containing the nucleic acid molecule, a transformant containing the vector, a mutant of the NADH oxidase and an improved NADH oxidase. .
일반적으로 생화학적으로 산화환원 반응은 비대칭 반응에서 주요할 뿐만아니라 광학적 순도를 가지는 화학물질이나 의약학에서 주목하고 있는 분야이다. 그러나 이러한 반응에는 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H와 같은 비싼 조효소가 필요로 하기 때문에 산업적인 응용이 어려운 실정이다. 경제적인 측면을 고려하였을 때 이러한 조효소를 재생하여 연속적으로 사용하는 것이 필요하다. 보통 조효소의 재생은 효소 반응 시에 화학적, 전기적, 광촉매적 물질을 첨가하거나 효소를 첨가하여 달성이 된다. 효소를 사용한 조효소 재생에는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째 방법은 효소와 화학첨가물을 넣어 재생하는 것이고, 두 번째 방법은 두 개의 효소를 넣고 커플링시켜 조효소를 재생하는 방법이다. 두 번째 방법이 조효소를 재생하는 보편적인 방법이다. NAD(P)+ 및 NAD(P)H를 재생하기 위한 방법으로는 Formate dehydrogenase와 glucose dehydrogenase를 이용한 방법이 잘 알려져 있으나, 이러한 반응들은 부산물이 생성되어 효소 반응 시 불순물을 생성하게 된다. 하지만 물을 생성하는 NADH 산화효소를 사용하면 부산물로 물만 생성되기 때문에 더욱더 경제적 가치가 있다.In general, biochemically, redox reactions are not only important in asymmetric reactions, but also in the field of chemicals and pharmaceuticals having optical purity. However, these reactions require expensive coenzymes such as NAD (P) + or NAD (P) H, which makes industrial applications difficult. Considering the economic aspect, it is necessary to regenerate and use these coenzymes continuously. Regeneration of coenzymes is usually accomplished by adding chemical, electrical and photocatalytic substances or adding enzymes during the enzyme reaction. There are two ways to regenerate coenzyme using enzymes. The first method is to regenerate enzymes and chemical additives, and the second method is to recover the coenzyme by coupling two enzymes. The second method is a universal method of regenerating coenzymes. As a method for regenerating NAD (P) + and NAD (P) H, formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase are well known. However, these reactions generate byproducts and produce impurities during enzyme reactions. However, using NADH oxidase, which produces water, is more economical because only water is produced as a by-product.
관련특허로 대한민국특허공개번호 제1020090096511호, 'ＮＡＤＨ 또는 ＮＡＤＰＨ의 존재 하에 산화환원효소/탈수소화효소를 이용한 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의한 세콜 유도체의 제조 방법'에는 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 관한 것으로, 상기 세코디온 유도체는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소효소를 이용하여 환원된다. 본 발명에서, 세코디온 유도체는 반응 배치에 ≥ 10 g/L의 농도로 사용되며, 산화환원효소/탈수소효소에 의해 형성되는 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP는 계속적으로 재생된다고 기재되어 있다. As a related patent, Korean Patent Publication No. 1020090096511, "Method of producing a secolic derivative by enantioselective enzymatic reduction of secodion derivatives using oxidoreductase / dehydrogenase in the presence of NADH or NADPH, has secodion. A method for enantioselective selective enzymatic reduction of derivatives, wherein the secodion derivatives are reduced using oxidoreductase / dehydrogenase in the presence of NADH or NADPH as cofactors. In the present invention, secodione derivatives are used in the reaction batch at a concentration of ≧ 10 g / L and it is described that the oxidized cofactor NAD or NADP formed by oxidoreductase / dehydrogenase is continuously regenerated.
또 다른 관련특허로 대한민국특허공개번호 제1020090023541호, '조효소의 전기화학적 재생 방법'에는 전기화학적 조효소 재생방법에 있어서, 금속산화물 전극에 직접 전자를 전달하여 조효소가 산화되거나, 금속산화물 전극으로부터 직접 전자를 전달받아 조효소가 환원되고, 상기 조효소는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide. NAD+), 환원형 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form. NADH), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 인산염 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. NADP+), 환원형 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 인산염 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form. NADPH), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (flavin adenine dinucleotide. FAD+), 및 환원형 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (flavin adenine dinucleotide, reduced form. FADH2)로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 금속산화물 전극은 금속을 양극산화하고, 상기 양극산화된 금속을 소둔하거나, 유리 전극에 금속을 코팅하고, 상기 코팅된 금속을 열처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 전기화학적 조효소 재생방법이 기재되어 있다.In another related patent, Korean Patent Publication No. 1020090023541, "Electrochemical Regeneration Method of Coenzyme" includes an electrochemical coenzyme regeneration method, in which a coenzyme is oxidized by directly transferring electrons to a metal oxide electrode, or directly from a metal oxide electrode. The coenzyme is reduced and the coenzyme is nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +), reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (nicotinamide adenine dinucleotide) adenine dinucleotide phosphate.NADP +, reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form (NADPH), flavin adenine dinucleotide (FAD +), and reduced flavin adenine dinucleotide (flavin) adenine d inucleotide, reduced form.FADH2), the metal oxide electrode is prepared by anodizing a metal, annealing the anodized metal, coating a metal on a glass electrode, and heat-treating the coated metal. An electrochemical coenzyme regeneration method is described.
본 발명의 목적은 고가의 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H의 조효소를 재생시키는 작용을 하는 화농연쇄상구균 유래의 물을 생성하는 NADH 산화효소(SpNOX)를 실제 산업효소로 활용하기 위해서 효소의 안정성 및 활성을 부분특이적 돌연변이법을 통하여 개량하는 것이다. It is an object of the present invention to utilize NADH oxidase (SpNOX), which produces water from P. aureus, which acts to regenerate expensive NAD (P) + or NAD (P) H coenzymes, as an actual industrial enzyme. It is to improve the stability and activity through the partial specific mutagenesis.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 개량된 NADH 산화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the gene of the improved NADH oxidase.
본 발명의 세 번째 목적은 개량된 유전자가 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 형질전환 균주를 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a transformed strain comprising recombinant E. coli transformed with the improved gene.
본 발명의 네 번째 목적은 개량된 효소가 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 재조합 NADH 산화효소를 제공하는 것이다.A fourth object of the present invention is to provide a recombinant NADH oxidase using recombinant E. coli transformed with the improved enzyme.
본 발명의 다섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 효소의 안정성 및 활성에 영향을 미치는 잔기를 제시하는 것이다.
The fifth object of the present invention is to propose residues that affect the stability and activity of the enzyme using the enzyme.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 NADH 산화효소의 126, 184, 및 278번째 라이신 잔기 중 하나의 잔기가 아르기닌으로 치환된 돌연변이체 NADH 산화효소를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a mutant NADH oxidase in which one residue of the 126, 184, and 278 lysine residues of the NADH oxidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is substituted with arginine.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 화농 연쇄상 구균으로부터 유래된 것이 바람직하나 화학적 합성법이나 유전공학적인 방법 등을 통하여 얻어진 효소도 본 발명의 보호범위에 포함된다.In one embodiment of the present invention, the enzyme is preferably derived from purulent streptococci, but enzymes obtained through chemical synthesis or genetic engineering methods are also included in the protection scope of the present invention.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9 중 하나의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등을 통하여 본 발명이 목적하고자하는 효과를 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.In another embodiment of the present invention, the mutant enzyme preferably has an amino acid sequence of one of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 one or more substitutions, deletions, inversions or translocations, etc. in these sequences All the mutants that can achieve the desired effect through the present invention are also included in the protection scope of the present invention.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체 NADH 산화효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the mutant NADH oxidase of the present invention.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10 중 하나의 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등을 통하여 본 발명이 목적하고자하는 효과를 달성할 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.In one embodiment of the present invention, the gene is preferably one having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10, but the present invention through one or more substitutions, deletions, inversions or translocations to these sequences All mutants capable of achieving this desired effect are also included in the scope of protection of the present invention.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene of the present invention.
또 본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 숙주에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하고 그 형질전환체로부터 상기 본 발명의 돌연변이체 효소를 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method of producing a transformant by transforming the recombinant vector of the present invention into a host, and from the transformant to produce a mutant enzyme of the present invention.
또 본 발명은 상기 본 발명의 NADH 산화효소의 돌연변이체를 이용하여 조효소인 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 도 11과 같이 재생시키는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for regenerating the coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H using the mutant of the NADH oxidase of the present invention as shown in FIG.
이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명은 본 발명의 상기 NADH 산화효소를 이용하여 활성에 중요성을 갖는 몇몇 잔기를 제시함으로써, 효소의 고활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공한다.The present invention provides a basis for identifying high activity determinants of enzymes by presenting several residues of importance for activity using the NADH oxidase of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 돌연변이 NADH 산화효소를 이용하여 안정성 및 고활성을 갖는 NADH 산화효소를 제공하고 이는 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H 등의 조효소를 재생시키는데 이용될 수 있다.The present invention also provides a NADH oxidase having stability and high activity using the mutant NADH oxidase of the present invention, which can be used to regenerate coenzymes such as NAD (P) + or NAD (P) H.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
서열번호 6, 8 및 10은 본 발명의 변이된 NADH 산화효소 유전자의 염기서열을, 서열번호 5, 7 및 9는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 물을 생성하는 NADH 산화효소 활성을 가지는 한, 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또, 본 발명의 유전자는 서열번호 5, 7 및 9로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.SEQ ID NOs: 6, 8 and 10 show the nucleotide sequence of the mutated NADH oxidase gene of the present invention, SEQ ID NOs 5, 7 and 9 represent the amino acid sequence encoded by the gene. As described above, as long as the polypeptide having the amino acid sequence has NADH oxidase activity that generates water, there may be a mutation, deletion, addition or the like with respect to one or several amino acids. The gene of the present invention also includes decondensers encoding the same polypeptides differing only in degenerate codons, in addition to those having a nucleotide sequence encoding the amino acids represented by SEQ ID NOs: 5, 7, and 9. Variations such as deletion, substitution, and addition can be introduced by site mutation introduction methods (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 811, 1994).
본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명에 관한 재조합벡터는 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, NADH 산화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET-28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.The transformed microorganism of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector. For example, when a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector according to the present invention is capable of autonomous replication in the host, and at the same time, expresses a promoter, DNA containing a NADH oxidase gene, and transcription termination sequence. It is preferable to have a necessary structure. As the expression vector used in the present invention, pET-28a was used, but any expression vector satisfying the above requirements can be used.
프로모터는, 숙주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.Any promoter that can be expressed in a host can be used. For example, the promoter can be used in E. coli, such as trp promoter, trc promoter, tac promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter, T3 promoter, Derived promoter can be used. As a method of introducing recombinant DNA into bacteria, the calcium chloride method, electroporation method and the like described above can be used.
재조합벡터에는 발현의 억제, 증폭, 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 가진 것도 가능하다.Recombinant vectors contain signals for the purpose of suppressing, amplifying, or inducing expression, fragments for expression suppression, markers for selection of transformants, resistance genes for antibiotics, or signals for secretion out of cells. It is also possible to have a gene to encode.
본 발명에 관한 변이된 물을 생성하는 NADH 산화효소의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 NADH 산화효소를 축적시켜, 배양물로부터 NADH 산화효소를 취득함으로써 행하여진다.Production of a NADH oxidase producing a mutated water according to the present invention, for example, by culturing a transformant obtained by transforming the host with a recombinant vector having a gene encoding the same, and culture (culture culture or Cultured supernatant) to accumulate NADH oxidase, which is a gene product, and obtain NADH oxidase from the culture.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.As a method of culturing the transformant of the present invention, a conventional method used for culturing a host may be used.
또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 카나마이신을 유도물질로서 사용할 수 있다.In addition, when the promoter cultures the microorganism transformed using an inducible expression vector, an inducer suitable for the type of promoter may be added to the medium. For example, isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and kanamycin can be used as inducers.
변이된 NADH 산화효소의 취득 및 정제는, 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.Acquisition and purification of the mutated NADH oxidase is carried out by centrifugation of the cells or supernatant from the culture, followed by cell disruption, extraction, affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration, or the like alone or as appropriately combined. Can be.
얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다. Confirmation that the obtained purified substance is the target enzyme can be performed by a conventional method, for example, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, western blotting or the like.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 NADH 산화효소의 생산과 균체 내에의 축적 및 균체로부터 NADH 산화효소의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.Incidentally, the culture of the transformant using the microorganism as a host, the production of the NADH oxidase by the transformant, the accumulation in the cells and the recovery of the NADH oxidase from the cells are not limited to the above methods.
본 발명에서는 효소의 안성성 및 활성을 향상시키는 중요 잔기를 제시하고자 화농연쇄상구균으로부터 물을 생성하는 NADH 산화효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주를 사용하여 효소의 안정성 및 활성에 역할을 갖는 몇몇 잔기를 제시하였다. 돌연변이 NADH 산화효소는 조효소인 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 재생시킴에 있어서 고활성 및 고안정성을 나타내었다. In the present invention, a gene of NADH oxidase that produces water from Streptococcus was cloned in order to present important residues that enhance enzyme stability and activity. Recombinant strains with the insertion of these genes were used to suggest several residues that play a role in the stability and activity of the enzyme. Mutant NADH oxidase showed high activity and high stability in regenerating the coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H.
본 발명에서 얻어진 화농연쇄상구균 유래 물을 생성하는 NADH 산화효소를 이용하여 높은 활성을 가지는 잔기를 치환한 변이체인 SpNOX K126R, SpNOX K184R, SpNOX K278R의 pH에 따른 효소의 활성을 확인한 결과 도 2에 보여지는 것과 같이 야생형 균주의 효소보다 활성이 증가한 것을 볼 수 있다. As a result of confirming the activity of the enzyme according to the pH of SpNOX K126R, SpNOX K184R, SpNOX K278R which is a variant having a high activity residue using NADH oxidase to produce a pyogenic streptococcus derivative obtained in the present invention is shown in Figure 2 As losing, it can be seen that the activity increased than the enzyme of the wild type strain.
본 발명은 여러 변이체를 이용하여 효소의 안정성을 증가시키는 동시에 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 기존의 물을 생성하는 NADH 산화효소의 안정성과 효소활성을 증가시켜 조효소인 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 효율적으로 재생시킬 수 있다.The present invention was found to increase the activity of NADH oxidase that produces water while increasing the stability of the enzyme using several variants. This increases the stability and enzyme activity of the NADH oxidase that produces the existing water can efficiently regenerate the coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H.
생화학적으로 산화환원 반응은 비대칭 반응에서 주요할 뿐만아니라 광학적 순도를 가지는 화학물질이나 의약학에서 주목하고 있는 분야이다. 이러한 반응에는 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H와 같은 비싼 조효소가 필요로 하기 때문에 산업적인 응용이 어려운 실정이다. 따라서 고가의 조효소인 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 안정적, 고활성으로 재생할 수 있는 효소가 요구된다. Biochemically, redox reactions are not only important in asymmetric reactions, but also in the field of chemicals and pharmaceuticals with optical purity. These reactions require expensive coenzymes such as NAD (P) + or NAD (P) H, which makes industrial applications difficult. Therefore, there is a need for an enzyme capable of regenerating expensive coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H stably and with high activity.
본 발명은 화농연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes) 유래의 물을 생성하는 NADH 산화효소의 잔기를 돌연변이 시킴으로써 효소의 활성을 증가시키는 개량된 효소를 개발함에 있다. 또한 상기 NADH 산화효소의 돌연변이체 및 개량된 NADH 산화효소를 이용하여 고가의 조효소인 NAD(P)+ 또는 NAD(P)H를 효율적으로 재생시킬 수 있다.
The present invention is a Streptococcus It is to develop an improved enzyme that increases the activity of the enzyme by mutating the residue of NADH oxidase that produces water from pyogenes . In addition, by using the mutant of NADH oxidase and the improved NADH oxidase, expensive coenzyme NAD (P) + or NAD (P) H can be efficiently regenerated.
도 1은 화농연쇄상구균주로부터 유래된 야생형 물을 생성하는 NADH 산화효소(이하,'SpNOX'라고도 함) 및 변이체인 K126R, K184R, K278R의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 2는 화농연쇄상구균주로 부터 유래된 물을 생성하는 NADH 산화효소 및 변이체인 SpNOX K126R, SpNOX K184R, SpNOX K278R의 pH에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 야생형 균주의 SpNOX의 염기서열을 나타낸 그림.
도 4는 Sp NOX K126R-단백질의 아미노산 서열을 나타낸 그림.
도 5는 Sp NOX K126R의 염기서열을 나타낸 그림.
도 6은 Sp NOX K184R-단백질의 아미노산 서열을 나타낸 그림.
도 7은 Sp NOX K184R의 염기서열을 나타낸 그림.
도 8은 Sp NOX K278R-단백질의 아미노산 서열을 나타낸 그림.
도 9는 Sp NOX K278R의 염기서열을 나타낸 그림.
도 10은 야생형 균주의 SpNOX의 아미노산 서열을 나타낸 그림.
도 11은 아라비톨 탈수소효소 (HjLAD)와 동시반응을 통하여 SpNOX에 의하여 NAD+가 재생되는 반응식을 나타낸 그림이다. 1 is a SDS-PAGE gel photograph of NADH oxidase (hereinafter, also referred to as 'SpNOX') and variants K126R, K184R, and K278R to produce wild-type water derived from P. aureus strains.
Figure 2 is a graph showing the reaction activity according to the pH of NADH oxidase and variants SpNOX K126R, SpNOX K184R, SpNOX K278R to produce water derived from purulent Streptococcus strains.
Figure 3 shows the nucleotide sequence of SpNOX of the wild type strain.
Figure 4 shows the amino acid sequence of Sp NOX K126R-protein.
Figure 5 shows the nucleotide sequence of Sp NOX K126R.
6 shows the amino acid sequence of Sp NOX K184R-protein.
7 shows the nucleotide sequence of Sp NOX K184R.
8 shows the amino acid sequence of Sp NOX K278R-protein.
9 shows the nucleotide sequence of Sp NOX K278R.
10 shows the amino acid sequence of SpNOX of wild type strains.
Figure 11 is a diagram showing the reaction of NAD + by SpNOX through the simultaneous reaction with arabitol dehydrogenase (HjLAD).
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
실시예Example 1: 물을 생성하는 1: Water producing NADHNADH 산화효소의 유전자 Oxidase gene 클로닝Cloning
화농연쇄상구균 (KCTC 3208, 한국생명공학연구원 미생물자원센터, 한국)을 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 화농연쇄상구균의 물을 생성하는 NADH 산화효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 SpNOX F5′-GGATCCATGAGTAA AATCGTTGTTG-3′(서열번호 1), SpNOX R 5′-CTCGAGCTAGTCTTTGGCACCAAG-3’(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 화농연쇄상구균에서 증폭된 물을 생성하는 NADH 산화효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 3).
Purulent Streptococcus (KCTC 3208, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea) was incubated at 37 ° C and centrifuged (8000 g, 10 minutes) to obtain cells. The genomic DNA is isolated from the cells obtained previously, and the primers SpNOX F5'-GGATCCATGAGTAA AATCGTTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 1), SpNOX R, using the nucleotide sequence of the gene encoding the NADH oxidase producing water of P. aureus 5'-CTCGAGCTAGTCTTTGGCACCAAG-3 '(SEQ ID NO: 2) was produced and PCR was performed. The nucleotide sequence was analyzed by inserting a PCR product, that is, a gene containing NADH oxidase that produces water amplified from P. aureus (PSE) into the pGEM T-easy vector (SEQ ID NO: 3).
실시예Example 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 2: Preparation of Recombinant Expression Vectors and Recombinant Strains
실시예 1에 따른 물을 생성하는 NADH 산화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET-28a (Novagen, 독일)의 BamH과 XhoI부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
BamH and XhoI of the expression vector pET-28a (Novagen, Germany) were used to express the water-producing NADH oxidase in large amounts in E. coli using the gene encoding the water-producing NADH oxidase according to Example 1. The enzyme gene was inserted into the site and transformed into E. coli BL21 (DE3) (NEB, UK).
실시예Example 3: 재조합 물을 생성하는 3: to produce recombinant NADHNADH 산화효소의 발현 및 순수 분리 Expression and purification of oxidase
상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 1).The recombinant strains recovered in Example 2 were inoculated into LB medium and cultured at 37 ° C for 24 hours, and proteins expressed on SDS-PAGE gels were identified (FIG. 1).
상기 실시예 2의 방법으로 발현시킨 재조합 NADH 산화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA Super flow 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 재조합 NADH 산화효소를 순수 분리하였다.
In order to purify the recombinant NADH oxidase expressed by the method of Example 2, the recombinant strain culture solution was centrifuged (8000xg, 10 minutes) to collect only the cells, and then sonicated to break the cell wall of E. coli, and 20 to 20,000
실시예Example 4: 4: NADHNADH 산화효소의 고활성 High activity of oxidase 변이체Mutant 제작 making
실시예Example 4-1: 효소의 안정성을 가지게 하는 4-1: Enzyme Stability 잔기의Residue 확인 Confirm
상기 실시예 3에서 순수 분리한 NADH 산화효소를 이용하여 고활성에 관련된 잔기를 탐색하기 위해 Discovery studio 3.1의 분자역학적(molecular mechanics) 방법을 통하여 효소의 안정성에 영향을 미치는 것으로 분석된 잔기인 126, 161, 182, 184, 241, 265, 278, 374, 393, 455 번째 위 라이신을 아르기닌으로 치환한 후 돌연변이 에너지(Kcal/mol) 값을 야생 효소의 값과 비교하였다. 돌연변이 에너지는 그 값이 낮을수록 효소가 안정한 것으로 알려져 있다. K126R, K184R, K278R 변이효소가 SpNOX 야생 효소보다 효소의 안정성이 높은 것으로 나타났으며, 따라서 K126, K184, K278 잔기를 돌연변이의 목적 잔기로 선정하였다.
In order to search for residues related to high activity using purely isolated NADH oxidase in Example 3, the residues analyzed to affect the stability of enzymes through the molecular mechanics method of Discovery studio 3.1, 126, The 161, 182, 184, 241, 265, 278, 374, 393, 455th gastric lysine was replaced with arginine and the mutation energy (Kcal / mol) value was compared with that of wild enzyme. It is known that the lower the mutation energy, the more stable the enzyme. K126R, K184R, and K278R mutants were found to have higher enzyme stability than SpNOX wild enzymes. Therefore, K126, K184, and K278 residues were selected as target residues of the mutation.
실시예Example 4-2: 4-2: Lys126Lys126 , , Lys184Lys184 , , Lys278Lys278 변이체의Mutant 활성도 비교 Activity comparison
상기 실시예 5-1에서와 같이 효소의 안정성에 영향을 주는 잔기 중 돌연변이 에너지가 낮은 잔기인 126번째, 184번째, 278번째 위치의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였다. 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하여 제작하였다. SpNOX K126R, SpNOX 184R, SpNOX 278R 변이체와 야생형 균주의 효소 돌연변이 효소인 그리고 기존에 연구된 효소의 활성과 비교하였다. 활성비교는 pH 7 조건에서 실시하였다. 표 1에 나타난 바와 같이 돌연변이 효소가 야생형 균주의 효소나 기존에 연구된 효소보다 약 2~3배 활성이 높다는 것을 알 수 있었다. As in Example 5-1, lysine residues at positions 126, 184 and 278, which are residues with low mutation energy among residues affecting the stability of the enzyme, were replaced with arginine. Variants were constructed using a site-directed mutagenesis kit (Stratagene, USA). The activity of the enzymes mutant and previously studied enzymes of the SpNOX K126R, SpNOX 184R, SpNOX 278R variants and wild type strains was compared. Activity comparison was performed at pH 7 conditions. As shown in Table 1, the mutant enzyme was found to be about 2 to 3 times higher activity than the enzyme of the wild type strain or the previously studied enzyme.
실시예Example 4-3: 4-3: Lys126Lys126 , , Lys184Lys184 , , Lys278Lys278 변이체의Mutant pHpH 에 따른 활성도Activity according to
상기 실시예 5-2에서와 같이 효소의 안정성에 영향을 주는 잔기 중 돌연변이 에너지가 낮은 잔기인 126번째, 184번째, 278번째 위치의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였다. 도 2에 나타난 바와 같이 K126R, K184R, K278R 변이체가 pH 변화에 따른 활성을 확인하였을 때 야생 효소보다 효소의 활성이 약 2~3 배 증가하는 것을 알 수 있다.As in Example 5-2, lysine residues at positions 126, 184, and 278, which are residues with low mutation energy among residues affecting the stability of the enzyme, were replaced with arginine. As shown in Figure 2, when the K126R, K184R, K278R variants confirmed the activity according to the pH change it can be seen that the activity of the enzyme is increased by about 2-3 times than the wild enzyme.
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Non-Patent Citations (2)
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| Bioorg Med Chem Lett., Vol. 22, No. 5, pages 1931-1935 (2012.03.01.) * |
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