KR101228974B1

KR101228974B1 - A thermostable H2O forming NADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus and a preparation method thereof

Info

Publication number: KR101228974B1
Application number: KR1020110000284A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 제야 마리무투; 김태수
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-01-03
Filing date: 2011-01-03
Publication date: 2013-02-01
Also published as: KR20120078962A

Abstract

본 발명은 본 발명은 내열성이며 물을 생성하는 NADH 산화효소 (H₂O forming NADH oxidase), 그 효소 생산방법 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 물을 생성하는 NADH 산화효소를 생산하는 균을 검색하고 그 중 락토바실러스 람노수스 균을 선별하여 물을 생성하는 NADH 산화효소에 생산최적배지에서 배양한 후 물을 생성하는 NADH 산화효소를 정제한 다음 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 상기 정제 효소의 정제도 및 분자량을 측정한 뒤 상기 효소의 활성에 미치는 반응 최적 온도 및 반응 최적 pH를 조사한 후 상기 효소의 기질농도에 따른 반응속도를 조사하고 상기 효소의 활성부위의 특성을 조사하기 위하여 각종 조효소를 첨가하여 효소 활성을 측정함으로써 물을 생성하는 NADH 산화효소의 생산 수율이 우수한 생산조건을 얻을 수 있어 부산물을 생성하지 않고 NAD⁺를 재생하는데 매우 뛰어난 효과가 있다.The present invention relates to a heat-resistant, water-producing NADH oxidase (H ₂ O forming NADH oxidase), the method for producing the enzyme and its use, and more specifically to the bacteria producing water-producing NADH oxidase Lactobacillus rhamnosus bacteria were screened and cultured in a production-optimized medium on NADH oxidase that produces water, and purified NADH oxidase that produces water was then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. After determining the degree of purification and molecular weight of the purified enzyme and the reaction temperature and the reaction optimum pH on the activity of the enzyme, the reaction rate according to the substrate concentration of the enzyme and the characteristics of the active site of the enzyme In order to measure the enzyme activity by adding various coenzymes, it is possible to obtain production conditions with excellent yield of NADH oxidase producing water. To reproduce the NAD ⁺ without creating a product has a very good effect.

Description

락토바실러스 람노수스 유래 내열성물 생성 ＮＡＤＨ 산화효소 및 그 생산 방법{A thermostable H2O forming NADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus and a preparation method thereof}A thermostable H2O forming NADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus and a preparation method according to Lactobacillus rhamnosus.

본 발명은 내열성이며 물을 생성하는 NADH 산화효소 (H₂O forming NADH oxidase), 그 효소 생산방법 및 그 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a heat resistant and water-producing N ₂ O forming NADH oxidase, a method for producing the enzyme and its use.

생화학적으로 산화환원 반응은 비대칭 반응에서 주요할 뿐만아니라 광학적 순도를 가지는 화학물질이나 의약학에서 주목하고 있는 분야이다. 이러한 반응에는 NAD(P)⁺ 또는 NAD(P)H와 같은 비싼 조효소가 필요로 하기 때문에 산업적인 응용이 어려운 실정이다. 경제적인 측면을 고려하였을 때 이러한 조효소를 재생하여 연속적으로 사용하는 것이 필요하다. 보통 조효소의 재생 방법에는 효소 반응을 할 때 화학적, 전기화적, 광촉매적 물질을 첨가하거나 효소를 첨가하여 달성이 된다. 효소를 사용하여 조효소 재생 방법에는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째 방법은 효소와 화학첨가물을 넣어 재생하는 방법이고, 두 번째 방법은 두 개의 효소를 넣어 조효소를 재생하는 방법이다. 두 번째 방법이 조효소를 재생하기에 보편적인 방법이다. NAD(P)H를 재생하기 위한 방법으로는 Formate dehydrogenase와 glucose dehydrogenase를 이용한 방법이 잘 알려져 있으나, 이러한 반응들은 부산물이 생성되어 효소 반응 시 불순물을 생성하게 된다. 하지만 물을 생성하는 NADH 산화효소를 사용하면 부산물로 물만 생성되기 때문에 더욱더 경제적 가치가 있다.
Biochemically, redox reactions are not only important in asymmetric reactions, but also in the field of chemicals and pharmaceuticals with optical purity. These reactions require expensive coenzymes such as NAD (P) ⁺ or NAD (P) H, which makes industrial applications difficult. Considering the economic aspect, it is necessary to regenerate and use these coenzymes continuously. Usually, regeneration of coenzyme is accomplished by adding chemical, electrochemical and photocatalytic substances or adding enzyme during enzymatic reaction. There are two methods of coenzyme regeneration using enzymes. The first method involves regenerating enzymes and chemical additives, and the second method regenerates coenzymes by adding two enzymes. The second method is a common way to regenerate coenzymes. Formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase are well known methods for regenerating NAD (P) H. However, these reactions produce byproducts and produce impurities during enzyme reactions. However, using NADH oxidase, which produces water, is more economical because only water is produced as a by-product.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 고활성 물을 생성하는 NADH 산화효소의 유전자를 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above problems and the necessity of the above, and the first object of the present invention is to provide a gene of NADH oxidase that produces a highly active substance.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 물을 생성하는 NADH 산화효소를 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a NADH oxidase that produces water expressed from the gene.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a recombinant expression vector comprising the gene of the NADH oxidase producing the water.

본 발명의 네 번째 목적은 형질 전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.It is a fourth object of the present invention to provide all the transforming strains including the transformed recombinant E. coli.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질 전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 물을 생성하는 NADH 산화효소를 제공하는 것이다.A fifth object of the present invention is to provide a NADH oxidase that produces a recombinant using transformed recombinant E. coli.

본 발명의 여섯 번째 목적은 재조합 물을 생성하는 NADH 산화효소의 생산 최적화방법을 제공하는 것이다.A sixth object of the present invention is to provide a method for optimizing the production of NADH oxidase producing recombinants.

본 발명의 일곱 번째 목적은 내열성 물을 생성하는 NADH 산화효소를 이용하여 물을 제외한 부산물을 생성하지 않고 NADH 및 NAD+를 재생하는데 있다. A seventh object of the present invention is to regenerate NADH and NAD + using NADH oxidase which produces heat resistant water without generating by-products except water.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 물을 생성하는 NADH 산화효소를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a water-producing NADH oxidase.

본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 락토바실러스 람노수스는 물을 생성하는 NADH 산화효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the Lactobacillus rhamnosus is preferably NADH oxidase that produces water, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소는 NADH를 산화하여 NAD+를 생성하는 것이 바람직하고, 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 효소 단백질 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적인 조효소의 재생을 위한 모든 변이 단백질을 포함한다.In one embodiment of the present invention, the water-producing NADH oxidase preferably oxidizes NADH to produce NAD +, and the water-producing NADH oxidase is only an enzyme protein of amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1. As well as all variant proteins for the regeneration of coenzymes for the purposes of the present invention through mutations such as one or more substitutions, deletions, inversions, translocations, etc. in these proteins.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소는 유전자 코드 디제너러시를 고려하여 서열번호 2의 염기서열과 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 상동성을 가지는 것이 바람직하다. In another embodiment of the present invention, the NADH oxidase producing water is preferably 80%, more preferably 85%, even more preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in consideration of the genetic code degeneracy. Preferably 90%, most preferably 95% homology.

또, 본 발명에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 물을 생성하는 NADH 산화효소를 코딩하는 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 2의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 물을 생성하는 NADH 산화효소를 코딩하는 변이 물을 생성하는 NADH 산화효소 본 발명에 관한 물을 생성하는 NADH 산화효소유전자에 포함된다.In addition, the present invention includes a NADH oxidase gene that generates water encoding a NADH oxidase that generates water having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the gene sequence thereof includes the sequence represented by SEQ ID NO: 2. Also included in the NADH oxidase gene producing water according to the present invention is a NADH oxidase which produces a variant encoding the NADH oxidase which produces the above-mentioned mutants obtained by mutating the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2. .

또한 본 발명은 락토바실러스 람노수스에서 유래한 유전자, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pET28을 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector pET28 comprising a NADH oxidase gene that produces a gene derived from Lactobacillus rhamnosus, preferably water having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 발현벡터는 도 1에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the expression vector preferably has a cleavage map as described in FIG. 1, but is not limited thereto.

또한, 본 발명에는, 상기 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 물을 생성하는 NADH 산화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 물을 생성하는 NADH 산화효소의 제조방법이 포함된다.In addition, the present invention includes a recombinant vector containing the NADH oxidase gene that produces the water, and a transformant transformed by the recombinant vector. The present invention also includes a method for producing NADH oxidase for producing water, wherein the transformant is cultured to separate NADH oxidase for producing water from the obtained culture.

또한 본 발명은 NADH 기질에 상기 본 발명의 효소를 처리하여 NADH를 산화하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of oxidizing NADH by treating the NADH substrate with the enzyme of the present invention.

또 본 발명은 상기 본 발명의 내열성 효소를 이용하여 조효소를 재생할 때 물을 제외한 부산물을 생성하지 않는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method that does not produce by-products except water when regenerating the coenzyme using the heat-resistant enzyme of the present invention.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 NADH 산화효소 유전자는 락토바실러스 람노수스의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. The NADH oxidase gene of the present invention is isolated from the cells of Lactobacillus rhamnosus. First, chromosomal DNA is obtained from a strain having a NADH oxidase gene that produces water.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 락토바실러스 람노수스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 락토바실러스 람노수스 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 락토바실러스 람노수스의 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진다. Next, a polymerase chain reaction (PCR) is carried out using the designed oligonucleotide as a primer, the chromosomal DNA of the Lactobacillus rhamnosus strain as a template, and the Lactobacillus rhamnosus gene is partially amplified. The PCR amplified fragment thus obtained has a homology close to 100% to the NADH oxidase gene that produces the water of Lactobacillus rhamnosus.

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, NADH 산화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 2에는 본 발명의 물을 생성하는 NADH 산화효소의 유전자의 염기서열을 서열번호 1에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다.DNA fragments containing the NADH oxidase gene can be obtained by recovering the plasmid from the E. coli selected by the above method using an alkaline method (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 161, 1994). After the nucleotide sequence is determined by the above method, it is possible to obtain the entire gene of the present invention by hybridizing with the DNA fragment prepared by digestion of the DNA fragment having the nucleotide sequence with a restriction enzyme as a probe. SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the gene of the NADH oxidase producing water of the present invention, SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence encoded by the gene.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a 벡터를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.The transformed microorganism of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector. For example, when a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector according to the present invention is capable of autonomous replication in the host and, at the same time, contains a promoter and a DNA containing a NADH oxidase gene that generates water and transcription. It is preferable to have a structure required for expression of the termination sequence. Although the pET28a vector was used as an expression vector used in the present invention, any expression vector satisfying the above requirements can be used.

본 발명에 관한 물을 생성하는 NADH 산화효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 물을 생성하는 NADH 산화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.The production of a water-producing NADH oxidase according to the present invention involves culturing a transformant obtained by transforming a host with a recombinant vector having a gene encoding the same, and producing the gene product in a culture (cultured cell or culture supernatant). It is performed by generating and accumulating NADH oxidase which produces phosphorus, and obtaining an enzyme from the culture.

물을 생성하는 NADH 산화효소의 취득 및 정제는, 균체 또는 상청액을 원심분리로 회수하여, 균체파쇄, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다. Acquisition and purification of NADH oxidase which produces water can be performed by recovering the cells or supernatant by centrifugation, by cell alone, by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, or the like.

본 발명자는 높은 수율로 물을 생성하는 NADH 산화효소를 제조할 수 있는 효소를 개발하고자 락토바실러스 람노수스으로부터 물을 생성하는 NADH 산화효소의 유전자를 클로닝 하였다The present inventors cloned the gene of NADH oxidase which produces water from Lactobacillus rhamnosus to develop an enzyme capable of producing NADH oxidase which produces water with high yield.

전기 유전자를 삽입한 재조합 균주에 의해 NADH를 산화할 수 있으며, 조효소인 NADH와 NAD⁺를 재생하는데 있어서 물을 제외한 부산물을 생성하지 않는 목적으로 사용할 수 있다. NADH can be oxidized by the recombinant strain inserted with the above gene, and can be used for the purpose of not generating by-products except water in regenerating the coenzymes NADH and NAD ⁺ .

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 물을 생성하는 NADH 산화효소는 다음의 특징을 갖는다: (1) 최적 온도가 65℃; (2) 최적 pH가 5.8 ; (3) 분자량이 약 49 kDa; (4)메탈이온이 물을 생성하는 NADH 산화효소 활성에 큰 영향을 주지 않지만, 1 mM Hg² ⁺, Co² ⁺의 존재 시 그 활성이 저해된다 ; (5) 조효소로는 FAD가 10μM 존재 시 높은 활성을 나타내며 50℃에서 48시간 동안 효소의 활성이 지속되었으며, 효소의 열에 대한 안정성이 30℃에서 80℃까지 증가하였을 뿐만아니라 효소의 활성이 1.8% 증가하였다.The NADH oxidase producing water of the present invention has the following characteristics: (1) the optimum temperature is 65 ° C; (2) an optimum pH of 5.8; (3) the molecular weight is about 49 kDa; (4) the metal ions do not have a significant effect on the NADH oxidase activity to produce water, 1 mM Hg ² ^+, the presence of Co ² ^+, its activity is inhibited; (5) The coenzyme showed high activity in the presence of 10 μM of FAD, and the enzyme activity was continued for 48 hours at 50 ° C, and the heat stability of the enzyme increased from 30 ° C to 80 ° C and the enzyme activity was 1.8%. Increased.

본 발명에서 얻어진 락토바실러스 람노수스 유래 물을 생성하는 NADH 산화효소의 K_m 값은 7.7 μM, k _cat _/K_m 값은 1.3210⁶S^-1M^-1, V_max 값은 263 μM^- ¹으로서 k _cat /K _m은현재 보고된 재조합 및 물을 생성하는 NADH 산화효소 중 가장 높은 활성을 보인다.The K _m value of the NADH oxidase producing Lactobacillus rhamnosus derived from the present invention is 7.7 μM, k _cat _/ K _m The value is 1.3210 ⁶ S ^-1 M ^-1 , V _max The value is 263 μM ^- ^{1 where} k _cat / K _m is It shows the highest activity among the currently reported recombination and water producing NADH oxidase.

본 발명에서 분리한 락토바실러스 람노수스 유래 물을 생성하는 NADH 산화효소는 조효소인 NAD⁺를 재생하는데 이용될 수 있고, 종래 조효소를 재생하는 효소보다 효율이 높을 뿐만 아니라 물을 제외한 부산물을 생성하지 않으므로 의약품 합성 산업, 화학물질 생산 산업, 기능성 첨가물 산업에 있어 다양한 용도에 적용될 수 있다.
The NADH oxidase that produces Lactobacillus rhamnosus-derived products isolated from the present invention can be used to regenerate coenzyme NAD ⁺ , and is more efficient than enzymes regenerating conventional coenzymes and does not produce by-products except water. It can be applied to various applications in the pharmaceutical synthesis industry, chemical production industry and functional additives industry.

도 1은 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 물을 생성하는 NADH 산화효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도이다.
도 2는 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 물을 생성하는 NADH 산화효소의 SDS-PAGE 젤 사진 및 그래프이다.
도 3(a)는 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 NADH 산화효소의 pH에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 3(b)는 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 NADH 산화효소의 온도에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 NADH 산화효소의 온도에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.도에서 ■: 30 ^oC; ▲: 40 ^oC; ○: 50 ^oC; ▽: 60 ^oC; ◆: 70 ^oC;

: 80 ^oC를 나타낸다.
도 5는 락토바실러스 람노수스 균주로부터 유래된 NADH 산화효소의 조효소에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 6는 Non-linear fitting plot에 의한 산화효소의 K_m 및 V_max값을 결정한 결과를 나타난 그래프이다.1 is a view showing a method for producing an expression vector comprising the NADH oxidase gene to produce water derived from Lactobacillus rhamnosus strain.
2 is a SDS-PAGE gel photograph and graph of NADH oxidase producing water derived from Lactobacillus rhamnosus strain.
Figure 3 (a) is a graph showing the reaction activity according to the pH of the NADH oxidase derived from Lactobacillus rhamnosus strain.
Figure 3 (b) is a graph showing the reaction activity according to the temperature of the NADH oxidase derived from Lactobacillus rhamnosus strain.
Figure 4 is a graph showing the stability to the temperature of the NADH oxidase derived from Lactobacillus rhamnosus strain. In the Figure: ■ : 30 ^o C; ▲: 40 ^o C; ○ : 50 ^o C; ▽ : 60 ^o C; ◆ : 70 ^o C;

: 80 ^° C.
5 is a graph showing the reaction activity according to the coenzyme of NADH oxidase derived from Lactobacillus rhamnosus strain.
6 is a graph showing the results of determining the K _m and V _max values of the oxidase by a non-linear fitting plot.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through non-limiting examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention and the scope of the present invention is not to be construed as limited by the following examples.

실시예Example 1: 물을 생성하는 1: to generate water NADHNADH 산화효소의 유전자 Oxidase gene 클로닝Cloning

락토바실러스 람노수스 (ATCC No. 53103 )를 37℃에서 3일간 배양하고, 원심분리(8000 Xg, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 락토바실러스 람노수스 물을 생성하는 NADH 산화효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머1 F-5-CGGGATCCATGCTGATGAAAGTTGTCG-3' (서열번호 3)와 프라이머2 R-5-GCGAATTCCACCGCTGAGTTGTCTGC-3(서열번호 4)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 락토바실러스 람노수스에서 증폭된 물을 생성하는 NADH 산화효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다. Lactobacillus rhamnosus (ATCC No. 53103) was incubated at 37 ° C for 3 days and centrifuged (8000 Xg, 10 minutes) to obtain cells. The genomic DNA was isolated from the cells obtained previously, and primer 1 F-5-CGGGATCCATGCTGATGAAAGTTGTCG-3 '(SEQ ID NO. R-5-GCGAATTCCACCGCTGAGTTGTCTGC-3 (SEQ ID NO: 4) was produced and PCR was performed. The nucleotide sequence was analyzed by inserting a gene containing a NADH oxidase that produces amplified water from a PCR product, namely, Lactobacillus rhamnosus, into a pGEM T-easy vector.

실시예Example 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 2: Preparation of Recombinant Expression Vectors and Recombinant Strains

실시예 1에 따른 베타글루코시다아제를 암호화하는 유전자를 이용하여, 물을 생성하는 NADH 산화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a(Qiagen, USA)의 BamH I과 EcoR I 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3) (Novagen Madison, WI)에 형질 전환시켰다(도 1).In order to express a large amount of water-producing NADH oxidase in Escherichia coli using the gene encoding betaglucosidase according to Example 1, the Bam H I and Eco RI sites of the expression vector pET28a (Qiagen, USA) After inserting the enzyme gene, E. coli BL21 (DE3) (Novagen Madison, WI) was transformed (Fig. 1).

실시예Example 3: 재조합 물을 생성하는 3: to produce recombinant NADHNADH 산화효소의 발현 및 순수 분리 Expression and Pure Separation of Oxidase

상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다. 상기 실시예2의 방법으로 발현시킨 재조합 물을 생성하는 NADH 산화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen, USA)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 재조합 물을 생성하는 NADH 산화효소를 순수 분리하였다 (도 2).The recombinant strain prepared in Example 2 was inoculated in LB medium and incubated at 37 ° C. for 24 hours to confirm the protein expressed on the SDS-PAGE gel. In order to purify the NADH oxidase that produces the recombinant product expressed by the method of Example 2, the recombinant strain culture solution was centrifuged (8000xg, 10 minutes) to collect only the cells, and then subjected to sonication to disrupt the cell wall of E. coli, The precipitate was removed by centrifugation at 20,000 × g for 20 minutes to obtain a supernatant. After the supernatant was obtained, column chromatography was finally performed using a Ni-NTA column (Qiagen, USA) to purely separate the NADH oxidase producing the recombinant product (FIG. 2).

실시예Example 4-1: 최적 4-1: Optimal pHpH

본원 발명 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 효소 반응액을 pH 4.6-8.0까지의 각 완충용액을 사용하여 40℃에서 기질과 반응시킨 후 활성을 측정하였다. 사용 완충용액은 20 mM 소디움 아세테이트/아세트산 완충액 (pH 4.0-6.0), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0-8.0) 및 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0-9.0)을 각각 사용하였다. 실험결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 pH 5.8에서 효소활성이 가장 우수하였다 (도 3a). In order to investigate the effect of pH on the activity of the NADH oxidase producing water of the present invention, the enzyme reaction solution was reacted with a substrate at 40 ° C. using each buffer solution up to pH 4.6-8.0, and then the activity was measured. The buffer used was 20 mM sodium acetate / acetic acid buffer (pH 4.0-6.0), 20 mM phosphate buffer (pH 6.0-8.0) and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0), respectively. Experimental results, as shown in Figure 3 was the best enzyme activity at pH 5.8 (Fig. 3a).

실시예Example 4-2: 최적 온도 4-2: optimum temperature

본원 발명 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성에 최적 온도를 측정하기 위하여, 물을 생성하는 NADH 산화효소를 20 mM 인산 완충액 (pH 7.2)에서 1 시간 동안 25℃에서 70℃에서 반응시키면서, 일정간격으로 시료를 채취하여 잔존 활성을 측정하였다. 효소의 잔존 활성은 시료를 채취하여 환원당을 이용한 DNS법으로 측정하였다. 본 발명의 물을 생성하는 NADH 산화효소는 65℃에서 최적온도가 형성되었고, 반응 온도를 25℃에서 70℃로 유지하였을 때 활성은 25% 밖에 차이가 나지 않았다 (도 3b).In order to determine the optimal temperature for the activity of the NADH oxidase producing water of the present invention, the water-producing NADH oxidase is reacted in 20 mM phosphate buffer (pH 7.2) for 1 hour at 25 ℃ to 70 ℃, a certain interval The sample was taken and the residual activity was measured. Residual activity of the enzyme was measured by the DNS method using a reducing sugar taken samples. The NADH oxidase producing water of the present invention had an optimum temperature formed at 65 ° C., and the activity was only 25% different when the reaction temperature was maintained at 25 ° C. to 70 ° C. (FIG. 3B).

실시예Example 4-3: 금속이온의 효과 4-3: Effect of Metal Ions

순수 정제된 물을 생성하는 NADH 산화효소에 최종농도 0.1 mM의 BaCl₃, CaCl₂, CoCl₂, CuSO₄, FeSO₄, HgCl₂, KCl, MgCl₂, MnCl₂, ZnCl₂와 함께 5분 동안 20 mM 인산 완충액(pH7.3)에서 효소를 전 배양한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 결과적으로 여러 금속이온이 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났지만, 1 mM Hg² ⁺, Co² ⁺의 존재 하에는 85%, 79%의 상당한 활성저해가 일어났다.NADH oxidase producing pure purified water with 20 mM BaCl ₃ , CaCl ₂ , CoCl ₂ , CuSO ₄ , FeSO ₄ , HgCl ₂ , KCl, MgCl ₂ , MnCl ₂ , ZnCl ₂ at a final concentration of 20 mM After pre-incubation of the enzyme in mM phosphate buffer (pH7.3), the residual activity of the enzyme was measured. As a result, several metal ions did not appear to have a significant effect on the activity of water-producing NADH oxidase, but in the presence of 1 mM Hg ² ⁺ , Co ² ⁺ , significant inhibition of 85% and 79% occurred.

실시 예 4-3; 물을 생성하는 Example 4-3; To generate water NADHNADH 산화효소에 대한 저해제의 영향 조사 Investigate the Effect of Inhibitors on Oxidase

본원 발명 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성부위의 특성을 조사하기 위해 각종 조효소 첨가에 따른 효소의 활성을 검토하였다. 각 0.001 mM에서 0.5 mM의 FAD의 존재 시에 효소활성에 미치는 영향은 도 5에서 나타난 바와 같이 바와 같이 저해를 받는 것으로 나타났으며, 10 μM의 FAD 존재 시에 효소 활성에 미치는 영향은 도 5에서 나타난 바와 같이 물을 생성하는 NADH 산화효소의 활성이 50℃에서 48시간 동안 효소의 활성이 지속되었으며, 효소의 열에 대한 안정성이 30℃에서 80℃까지 증가하였을 뿐만 아니라 효소의 활성이 1.8% 증가하였다.
In order to investigate the properties of the active site of the NADH oxidase producing water of the present invention, the activity of the enzyme according to the addition of various coenzymes was examined. The effect on enzyme activity in the presence of 0.5 mM FAD at 0.001 mM was shown to be inhibited as shown in FIG. 5, and the effect on enzyme activity in the presence of 10 μM FAD was shown in FIG. 5. As shown, the activity of water-producing NADH oxidase continued for 48 hours at 50 ° C, and the heat stability of the enzyme increased not only from 30 ° C to 80 ° C but also by 1.8%. .

실시예Example 4-4: 물을 생성하는 4-4: to generate water NADHNADH 산화효소의 동역학적 매개변수 Kinetic Parameters of Oxidase

다양한 농도의 NADH (1 - 800 mM)를 기질로 하여 50, pH 5.6 (20 mM 아세테이트 완충액)에서 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정하였다 (도 6). 락토바실러스 람노수스부터 유래된 물을 생성하는 NADH 산화효소의 NADH에 대한 K_m 값은 7.7μM, k _cat _/K_m 값은 1.3210⁶S^-1M^-1, V_max 값은 263μM ^- ¹으로 결정되었다. k _cat _/K_m 값은 현재까지 보고된 재조합 해당 효소 중 가장 높은 물을 생성하는 NADH 산화효소의 전환속도 및 촉매 활성에 해당한다.Kinetic parameters were determined by nonlinear regression analysis at 50, pH 5.6 (20 mM acetate buffer) using various concentrations of NADH (1-800 mM) as substrate (FIG. 6). The K _m value for NADH of NADH oxidase producing water derived from Lactobacillus rhamnosus was 7.7 μM, k _cat _/ K _m The value is 1.3210 ⁶ S ^-1 M ^-1 , V _max The value 263μM ^- was determined to be ^one. k _cat _/ K _m The value corresponds to the conversion rate and catalytic activity of the NADH oxidase that produces the highest water of the recombinant glycolytic enzymes reported to date.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A thermostable H2O forming NADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus and a preparation method thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Thr His Ala Gly Thr Phe Ala Thr 1 5 10 15 Gln Gln Ile Leu Thr Asp His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu 20 25 30 Arg Asn Asn Asn Leu Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Trp Val 35 40 45 Gly Asp His Val Ser Asp Pro Asp Lys Met Phe Tyr Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn Met Gln Met Glu His Asp Val Leu 65 70 75 80 Asn Ile Asp Pro Ala Thr Lys Thr Val Glu Val Lys Asp Leu Lys Thr 85 90 95 Gly Thr Val Thr Thr Asp Thr Tyr Asp Lys Leu Val Tyr Thr Thr Gly 100 105 110 Ser Thr Pro Ile Ile Pro Asn Ile Pro Gly Ile His Asp Ser Asn Val 115 120 125 Tyr Leu Cys Lys Asn Trp Ser Asp Ala Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ile Lys Ser Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ala 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Gln Phe Ala Leu Thr Asp Lys Glu Val Thr Leu Ile 165 170 175 Asp Gly Leu Pro Arg Val Leu Ala Lys Asn Phe Asp Ala Thr Ile Thr 180 185 190 Asp Arg Val Glu Lys Leu Tyr Thr Asp His Gly Val His Leu Ala Leu 195 200 205 Asn Glu Met Val Thr Glu Phe Ala Gln Ala Asp Gln Gly Ile Lys Val 210 215 220 Thr Thr Asn Lys Gly Asp Tyr Thr Ala Asp Ile Ala Ile Leu Cys Thr 225 230 235 240 Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Asp His Leu Asp Thr Leu 245 250 255 Pro Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Ala Tyr Met Gln Thr Ser Asp Pro 260 265 270 Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Thr Ala Thr Val His Tyr Asn Pro Thr 275 280 285 Gly Lys Asn Asp Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly 290 295 300 Ile Leu Val Gly Lys Asn Ile Met Thr Pro Thr Glu Lys Tyr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gln Ser Ser Ser Ala Val Glu Leu Phe Asp His Ala Ile Ala Ala 325 330 335 Ser Gly Leu Thr Val Glu Gly Ala His Ala Arg Gly Leu Glu Leu Asp 340 345 350 Ser Val Thr Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Pro Asp Phe Met Leu Thr Thr 355 360 365 Thr Pro Val Leu Cys Ser Leu Thr Trp Asp Pro Lys Thr His Glu Val 370 375 380 Lys Gly Gly Ala Phe Phe Ser Lys His Asp Ile Ser Gln Ser Ala Asn 385 390 395 400 Val Ile Ser Leu Ala Ile Gln Thr His Met Thr Ile Glu Thr Leu Ala 405 410 415 Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Gln Pro Ile Asn Trp 420 425 430 Val Asn Ala Val Ala Met Ala Ala Val Ala Lys Ala Lys Lys Lys Thr 435 440 445 Thr Thr Pro Val Ala 450 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 2 atgaagattc ttgtcattgg tgctacccat gccggtacat ttgcaaccca gcagattcta 60 accgaccatc cagatgcaga ggttactgtc tacgaacgca ataacaacct gtccttcctc 120 tcgtgcggca ttgctttgtg ggttggtgat catgtcagtg acccggataa aatgttctat 180 tccagtcccg aagcactcgc taaactcggt gctaatatgc aaatggaaca tgacgtgctc 240 aatattgatc cagcaactaa aacagttgaa gtcaaggatc taaaaaccgg aaccgttact 300 accgatactt atgacaaatt agtctacaca accggatcga cgccaatcat tccaaatatt 360 cccggtattc acgattcaaa cgtctactta tgcaaaaatt ggtccgacgc caagacgcta 420 aaagatctgg ccccgtccat taaaagcgcc attgtcatcg gtgcaggcta catcggtgca 480 gaattagccg aacaatttgc gttaaccgac aaagaagtca cgttaatcga tggacttcca 540 cgggttttgg cgaaaaactt tgacgccact atcacggatc gcgttgaaaa gctttacacc 600 gatcacgggg ttcacttggc actcaatgag atggttaccg agttcgcaca agctgatcag 660 ggtatcaagg ttacaaccaa taaaggcgac tataccgcgg atattgcaat tttatgtacc 720 ggcttccgtc cgaacacgga tctgctaaag gaccatctgg acaccctgcc taatggcgct 780 gtcataacaa atgcatatat gcagaccagt gaccccgaca ttttcgctgc tggtgatacc 840 gctaccgtcc actataatcc gactggcaaa aatgactaca tcccgcttgc gaccaacgca 900 gtccgtcagg gcattcttgt tggtaaaaat atcatgaccc ccacggaaaa atacctggga 960 acacaatcta gctcggctgt tgaacttttt gatcacgcca ttgcggcaag cggcctaacg 1020 gtggaaggcg ctcacgcacg tggacttgag cttgatagtg tcacgatcga acaggattat 1080 cgtcccgatt tcatgttaac cacaacgccg gtgctctgca gcctgacatg ggatcccaag 1140 acgcacgaag ttaaaggagg tgcctttttc tccaagcacg atatcagcca aagcgctaat 1200 gtcatttcgc tagcgatcca gacccacatg acgatcgaaa cacttgcgat ggttgacatg 1260 ctcttccaac ctaacttcga tcagccgatt aactgggtaa acgccgtagc tatggcggca 1320 gttgccaagg ctaaaaagaa aacgacaaca ccggtagcc 1359 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgggatccat gctgatgaaa gttgtcg 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcgaattcca ccgctgagtt gtctgc 26 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A thermostable H2O forming NADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus and a preparation method <160> 4 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Thr His Ala Gly Thr Phe Ala Thr 1 5 10 15 Gln Gln Ile Leu Thr Asp His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu 20 25 30 Arg Asn Asn Asn Leu Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Trp Val 35 40 45 Gly Asp His Val Ser Asp Pro Asp Lys Met Phe Tyr Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn Met Gln Met Glu His Asp Val Leu 65 70 75 80 Asn Ile Asp Pro Ala Thr Lys Thr Val Glu Val Lys Asp Leu Lys Thr 85 90 95 Gly Thr 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Gly Lys Asn Ile Met Thr Pro Thr Glu Lys Tyr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gln Ser Ser Ser Ala Val Glu Leu Phe Asp His Ala Ile Ala Ala 325 330 335 Ser Gly Leu Thr Val Glu Gly Ala His Ala Arg Gly Leu Glu Leu Asp 340 345 350 Ser Val Thr Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Pro Asp Phe Met Leu Thr Thr 355 360 365 Thr Pro Val Leu Cys Ser Leu Thr Trp Asp Pro Lys Thr His Glu Val 370 375 380 Lys Gly Gly Ala Phe Phe Ser Lys His Asp Ile Ser Gln Ser Ala Asn 385 390 395 400 Val Ile Ser Leu Ala Ile Gln Thr His Met Thr Ile Glu Thr Leu Ala 405 410 415 Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Gln Pro Ile Asn Trp 420 425 430 Val Asn Ala Val Ala Met Ala Ala Val Ala Lys Ala Lys Lys Lys Thr 435 440 445 Thr Thr Pro Val Ala 450 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 2 atgaagattc ttgtcattgg tgctacccat gccggtacat ttgcaaccca gcagattcta 60 accgaccatc cagatgcaga ggttactgtc tacgaacgca ataacaacct gtccttcctc 120 tcgtgcggca ttgctttgtg ggttggtgat catgtcagtg acccggataa aatgttctat 180 tccagtcccg 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tggacttgag cttgatagtg tcacgatcga acaggattat 1080 cgtcccgatt tcatgttaac cacaacgccg gtgctctgca gcctgacatg ggatcccaag 1140 acgcacgaag ttaaaggagg tgcctttttc tccaagcacg atatcagcca aagcgctaat 1200 gtcatttcgc tagcgatcca gacccacatg acgatcgaaa cacttgcgat ggttgacatg 1260 ctcttccaac ctaacttcga tcagccgatt aactgggtaa acgccgtagc tatggcggca 1320 gttgccaagg ctaaaaagaa aacgacaaca ccggtagcc 1359 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgggatccat gctgatgaaa gttgtcg 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcgaattcca ccgctgagtt gtctgc 26

Claims

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NADH에 NADH 산화효소를 처리하여 물을 생성하면서 NADH의 NAD+로 산화에 있어서,
NADH에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 NADH 산화효소를 처리하여 NADH의 NAD+로 전환속도를 개선하는 방법.In the oxidation of NADH to NAD +, while NADH is treated with NADH oxidase to generate water,
A method for improving the conversion rate of NADH to NAD + by treating NADH with NADH oxidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

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