KR101322367B1

KR101322367B1 - Ｌｅａ 유전자를 이용해 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR101322367B1
Application number: KR1020110070261A
Authority: KR
Inventors: 김둘이; 변명옥; 김범기; 서미혜; 신동진; 한세연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-10-28
Also published as: KR20130009279A

Abstract

본 발명은 건조 저항성 단백질의 세포내 수준을 증가시켜 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 건조 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 건조 저항성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

Description

ＬＥＡ 유전자를 이용해 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법{Method for enhancing drought stress resistance of plant using LEA gene}

본 발명은 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법, 건조 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 건조 저항성이 향상된 식물에 관한 발명이다.

식물은 이동성이 거의 없으므로 생존과정에 직면하는 여러 종류의 환경 스트레스를 회피하는 능력이 동물에 비해 현저히 떨어지므로, 대부분의 식물은 저온, 염, 및 건조와 같은 스트레스에 스스로 내성을 발휘할 수 있는 다양한 방어기작을 가진다. 최근 식물의 스트레스에 대한 반응이나 방어기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 식물의 스트레스와 관련된 많은 유전자들이 탐색되고 그 기능이 밝혀지고 있다. 이러한 연구를 통해 밝혀진, 식물 스트레스에 대한 내성을 가진 유전자는 궁극적으로 식물이나 작물에 미치는 환경 스트레스에 저항성을 부여하는데 유용한 유전자원으로 활용될 수 있다.

이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 건조 저항성 유전자를 이용하여 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법, 이러한 유전자를 이용하여 건조 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 건조 저항성이 향상된 형질전환 식물을 제공하는 데에 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 증가시켜 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물의 건조 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 식물에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 건조 저항성 식물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터, 및 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 건조 저항성이 향상된 형질전환체를 제공한다.

이하. 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질(이하, LEA 단백질도 동일한 의미로 칭한다)에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 건조에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 LEA 단백질의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 LEA 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 단백질과 융합으로 만들어진　융합 단백질　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 LEA 단백질과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 LEA 단백질의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

상기 LEA 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 상기 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 LEA 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 목적 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 목적 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 목적 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 목적 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준 증가는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가를 위해서 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 이를 형질전환함으로써 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 116,718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 예컨대 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 유전체(genome)을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기, 조건에 목적 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 RD29A 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게, 환경 스트레스 유도성 프로모터, 더 더욱 바람직하게 건조 스트레스 유도성 프로모터를 사용할 수 있으며, 예컨대 RD29A 프로모터를 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 감자 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(아그로박테리움tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 프로모터의 하류에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한 것이고, 더욱 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 연결한 것이며, 또는 바람직하게 상기 프로모터는 유도성 RD29A 프로모터이다.

가장 바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 도 2에 도시된 pBINRD29A 벡터이다.

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 건조 저항성이 향상된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한, 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 식물은 감자, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 잔디, 사탕수수, 오차드그래스, 옥수수, 및 양파 등의 식물일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 재조합 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 감자에 접종하여 형질전환체를 제작하였다.

본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 LEA 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 이를 감자에 형질전환시켜 LEA의 세포내 발현 수준을 증가시켰다. 그리고 LEA의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, LEA 유전자를 과발현시킴으로써 식물체가 건조 스트레스에 대해 저항성을 가질 수 있음을 확인하였다(도 5 참고).

본 발명에 따른 건조 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 건조 저항성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

도 1은 스트레스 처리에 따른 LEA 유전자 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 감자 형질전환용 pBINRD29A 벡터를 도시한 것이다.
도 3은 StLEA 유전자가 삽입된 StLEA 유전자 과발현 형질전환체를 도시한 것이다.
도 4는 LEA 유전자 형질전환체의 RT-PCR에 의한 LEA 유전자 발현 양상을 분석한 것이다.
도 5는 LEA 유전자가 삽입된 감자 형질전환체의 건조 저항성을 보여주는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1-1. 감자 유래 StLEA 유전자의 염기서열 분석

실시예 1-1. StLEA 유전자 클로닝

감자(Solanum tuberosum)의 잎에서 total RNA를 추출하고 Sprint RT Complete-OligodT (Clontech)를 이용하여 first-strand cDNA를 합성하였다.

RT-PCR에 의해 LEA 유전자를 증폭하기 위해, sense primer LEA-S : 5'-ATGGCTCGTTTTTTCTCTAACTCT-3' (서열번호 3)와 antisense primer LEA-AS: 5'-TCAGTTGCTTCCAGATCTGTTCTTC-3' (서열번호 4)를 합성하여 rTaq polymerase(Takara사)와 함께 PCR 반응액에 넣고 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. RT-PCR을 위해, 95℃에서 10 분간 변성한 후 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 25회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% agarose에 전기영동 한 후 LEA 유전자로 추정되는 밴드를 agarose gel에서 잘라내어 QIAquick gel extraction kit를 이용하여 정제한 후 클로닝에 이용하였다.

실시예 1-2. Topo 2.1 vector에 클로닝

실시예 1-1에서 수득한 유전자를 Topo 2.1 vector(Invitrogen 사, TOPO TA Cloning kit)에 클로닝하고 X-gal이 첨가된 LB배지에 plating하여 얻어진 화이트 콜로니를 선발하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 그 결과 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석에 이용하였다.

실시예 1-3. 염기서열 분석에 의한 StLEA 유전자 확인

ABI 3700 sequencer를 이용하여 염기서열 분석한 후, NCBI의 BLAST 검색에 의해 StLEA 유전자임을 확인하였다.

실시예 2. LEA 유전자의 발현 특성을 분석하기 위하여 스트레스 처리 후 RT-PCR에 의한 발현 양상 분석

MS(Murashige & Skoog)배지 처리 및 0.1mM ABA, 저온(4℃), 염(250mM NaCl), 건조(20% PEG) 스트레스 조건하에서, 30 min, 3 hrs, 12hrs, 24hrs, 48hrs, 5-day 동안 스트레스를 지속한 경우의 LEA 유전자의 발현 양상을 확인하였다. RT-PCR 반응은 실시예 1에서와 동일한 조건 하에서 수행되었다.

그 결과, 건조 스트레스 조건 하에서(도 1의 5번 레인), PEG 처리후 12시간 까지는 발현량이 점차 증가하다가 48시간 째 약간 발현양이 감소하였지만 5일째 다시 발현량을 유지함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 LEA 유전자가 건조 스트레스에 대해 저항성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 3. 건조 저항성 LEA 유전자 형질전환체 제작

실시예 3-1. LEA 유전자의 형질전환용 벡터 제작

pBIN121의 상용 벡터에 애기장대에서 분리된 RD29A 프로모터를 삽입한 pBINRD29A 벡터에 감자에서 분리된 LEA 유전자를 연결하여 Binary vector를 완성하였다 (도 2).

실시예 3-2. 아그로박테리움( Agrobacterium ) 형질전환

LEA 유전자가 삽입된 binary vector를 아그로박테리움 (LBA4404)에 형질전환하기 위하여 freeze와 thaw를 2-3번 반복한 후, 37℃의 heat shock방법에 의해 형질전환(transformation)한 후 밤새도록 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에 두었다가 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 감자에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

실시예 3-3. 아그로박테리움을 이용한 감자 형질전환

감자 형질전환체를 얻기 위하여 2일간 MS 배지에서 배양하고 있던 감자 절간과 YEP 배지에서 배양한 아그로박테리움 형질전환된 유전자들을 함께 MS 액체배지에서 30분간 배양한 후 cefotaxime과 Kanamycine이 첨가된 MS 고체배지에 옮겨 7일간 배양하였다. 다시 캘러스 유도 배지에 옮겨 7일간 배양한 후 1/5 Kanamycine이 첨가된 새로운 MS 배지에서 7일간 배양하였다. 슈팅(shooting) 유도를 위해 2주마다 새로운 배지에 옮겨 2번 반복하여 옮긴 후 슈팅(shooting) 후 발근이 되면 계대배양하여 StLEA 유전자가 삽입된 StLEA 유전자 과발현 형질전환체를 확보하였다.

실시예 4. LEA 유전자 과발현 형질전환체의 건조 저항성 확인

LEA 유전자 과발현 형질전환체임을 확인하기 위해, RT-PCR에 의해 형질전환체의 LEA 유전자 삽입 여부를 확인하였다(도 4).

LEA 유전자의 과발현 형질전환체임이 확인된 약 7 Line에 건조 스트레스를 처리한 후에 LEA 유전자 과발현 형질전환체가 건조 저항성을 가지는지 확인하였다. 보다 구체적으로, 22℃ 배양실에서 3주간 계대 배양하고 3-5일간 순화시킨 후 온실에서 3주간 다시 재배하여 약 20cm 정도 키운 후 실험하였는바, 약 25℃ 정도의 온실에서 원예용 화분에 충분히 물을 주어 약 300-350g이 되도록 무게를 맞추고 건조시키기 시작하여 화분 무게가 약 150g 정도(약 건조 처리 3주 후임)에서 시든 정도를 확인하여 저항성을 확인하였다.

그 결과, 스트레스 저항성이 강한 것으로 알려진 식용 감자 ‘수미’와 ‘벡터(pBINRD29A)가 삽입된 감자’는 3주 건조 처리 후 시들었지만 LEA 유전자가 삽입된 형질전환체는 생존함으로써 건조 저항성을 나타냈다 (도 5 좌측). 또한, 3주 건조 처리 후 다시 물을 공급한 결과 ‘수미’와 ‘벡터(pBINRD29A)가 삽입된 형질전환체’는 생존하지 못하는 반면 LEA 유전자가 삽입된 형질전환체는 다시 생존함을 확인할 수 있었다(도 5 우측).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 증가시켜 감자의 건조 저항성을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 감자의 건조 저항성을 향상시키는 것에 특징이 있는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질을 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 감자에 형질전환하거나, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 감자의 세포에 도입하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것에 특징이 있는 방법.
제3항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 RD29A(Response to Dehydration 29A) 프로모터인 것에 특징이 있는 방법.
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프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 감자에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 건조 저항성 감자 제조방법.
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서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 건조 저항성이 향상된 형질전환 감자.