KR101317131B1 - 정제된 브롬화 수소산을 이용한 폴리펩타이드류의 혼합물의제조방법 - Google Patents

정제된 브롬화 수소산을 이용한 폴리펩타이드류의 혼합물의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 균일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드류의 혼합물을 얻는 개량된 방법을 제공하며, 여기서 얻어진 폴리펩타이드류의 혼합물은 브롬화 티로신을 0.3% 미만으로 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만으로 포함한다.
트리플루오로아세틸 폴리펩타이드, 알라닌, 글루탐산, 티로신

Description

정제된 브롬화 수소산을 이용한 폴리펩타이드류의 혼합물의 제조방법{PROCESS FOR PREPARATION OF MIXTURES OF POLYPEPTIDES USING PURIFIED HYDROBROMIC ACID}
이 출원을 통해 다양한 공보가 그들의 전문 인용에 의해 참조된다. 이들 공보의 그들의 전체의 개시내용은 본 명세서에 있어서 본 발명이 속하는 기술 상황을 더욱 충분히 설명하기 위해 본 출원에 참조로 원용한다.
반드시 글라티라머 아세테이트(GA: glatiramer acetate)와 동일한 아미노산 서열을 지닌 것이 아닌 폴리펩타이드류(polypeptides)의 혼합물은 상표명 Copaxone®로 시판되고 있고, L-글루탐산, L-알라닌, L-티로신 및 L-라이신을 각각 평균 몰분율 0.141, 0.427, 0.095 및 0.338로 함유하는 폴리펩타이드류의 아세트산염을 포함한다. Copaxone®의 평균 분자량은 4,700 내지 11,000 달톤 사이이다("Copaxone", Physician's Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115). 화학적으로, 글라티라머 아세테이트란 L-알라닌, L-라이신, L-티로신, 아세테이트(염)를 지닌 L-글루탐산 폴리머를 지칭한다. 그의 화학식은 다음과 같다:
(Glu, Ala, Lys, Tyr) x ·XCH3COOH
(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)x·XC2H4O2
CAS - 147245-92-9
("Copaxone", Physician's Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115).
글라티라머 아세테이트는 다발 경화증이 재발-완화되고 있는 환자의 재발 빈도의 경감을 위해 승인되어 있다. 다발 경화증은 자가면역질환으로 분류되어 왔다. 글라티라머 아세테이트는 또한 다른 자가면역질환(R. Aharoni 등의 미국 특허 공개 공보 제 2002/0055466 A1호), 염증성 비-자가면역질환(V. Wee Yong 등의 미국 특허 공개 공보 제 2005/0014694 Al호; 및 Young 등에 의한 2002년 6월 20일자 공개된 미국 특허 공개 공보 제 2002/0077278 Al호)의 치료에 이용해서, 원발성 신경계 손상을 수반할 수 있는 속발성 변성을 방지하거나 억제하는 것이 개시되어 있다(M. Eisenbach-Schwartz 등의 미국특허 공개 공보 제 2003/0004099 Al호; 및 Eisenbach-Schwartz의 2002년 3월 28일자로 공개된 미국 특허 공개 공보 제2002/0037848 Al호). 또한, 글라티라머 아세테이트는 탈수초(demyelination)와 관련된 질환(2001년 12월 27일자 간행된 PCT 국제 특허 공보 WO 01/97846호(Moses 등))뿐만 아니라 면역 매개 질환(예를 들어, 2003년 2월 4일자 간행된 미국 특허 등록 공보 제 6,514,938 Bl호(Gad 등); 2001년 8월 23일자 간행된 PCT 국제 공개공보 WO 01/60392호(Gilbert 등); 및 2000년 5월 19일자 간행된 PCT 국제 공개 공보 WO 00/27417호(Aharoni 등))의 치료용으로 개시되어 있다.
상기 특허문헌에 상세히 기재된 바와 같은 제조 방법은 보호된 폴리펩타이드류를 아세트산 중 33% 브롬화 수소산과 반응시키는 것을 포함한다(Konfino 등에 의한 1998년 9월 1일자 간행된 미국 특허 공보 제 5,800,808호). 이 탈보호 반응은 글루타메이트 잔기의 5-카복실레이트로부터 감마 벤질 보호기를 제거하고, 상기 폴리머를 더 작은 폴리펩타이드류로 분해시켜 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드를 형성한다(Konfino 등에 의한 1998년 9월 1일자 간행된 미국 특허 공보 제 5,800,808호). 7,000±2,000 달톤의 적절한 평균 분자량을 지닌 GA를 얻는 데 필요한 시간은 반응온도와 보호된 글라티라머 아세테이트의 분자량 프로파일에 의존한다(Konfino 등에 의한 1998년 9월 1일자 간행된 미국 특허 공보 제 5,800,808호). 탈보호는 20℃ 내지 28℃ 사이의 온도에서 일어난다(Konfino 등에 의한 1998년 9월 1일자 간행된 미국 특허 제 5,800,808호). 시험 반응은 적절한 분자량 프로파일의 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류를 얻기 위해 주어진 온도에서 요구되는 반응시간을 결정하는 상이한 시간 주기에서 매 배취(batch)마다 수행된다(Konfino 등에 의한 1999년 11월 9일자 간행된 미국 특허 공보 제 5,981,589호). 반응에 필요한 시간은 예를 들어 10시간 내지 50시간의 범위이다(Konfino 등에 의한 1999년 9월 1일자 간행된 미국 특허 공보 제 5,800,808호). 또한, 미국 특허 공보 제 5,981,589호, 제 6,048,898호, 제 6,054,430호, 제 6,342,476호, 제 6,362,161호 및 제 6,620,847호도 GA를 포함하는 폴리펩타이드류의 혼합물 제조용의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개량된 제조방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각각 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드류의 혼합물의 배취가 아세트산 내 브롬화 수소산 용액(a solution of hydrobromic acid in acetic acid)으로 탈보호되는 과정 동안, 유리 브롬을 0.5% 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 것을 포함하는 것을 개량점으로 한다.
본 발명은 또한 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각각 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드의 혼합물의 배취가 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호되는 과정 동안, 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 것을 포함하는 것을 개량점으로 한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각각 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드류의 혼합물을 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호하는 단계를 포함하고, 상기 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만, 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함한다.
본 발명은 상기에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 트리플루오로아세틸 생성물 및 담체(carrier)를 포함하는 것인 조성물도 제공한다.
본 발명은 또한 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 브롬화 티로신을 단지 0.1% 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함한다. 본 발명은 또한 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물 및 담체를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 폴리펩타이드류의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 상기 방법은
a) 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 N-트리플루오로아세틸 라이신의 N-카복시안하이드라이드류(N-carboxyanhydrides)를 중합하여 보호된 폴리펩타이드류의 혼합물을 형성하는 단계;
b) 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 상기 보호된 폴리펩타이드류를 탈보호화하여 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 형성하는 단계(여기서 상기 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함함);
c) 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 수성 피페리딘과 반응시켜 폴리펩타이드류의 수성 혼합물 용액을 형성하는 단계(여기서 각 폴리펩타이드는 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어짐); 및
d) 폴리펩타이드류의 혼합물을 정제하는 단계를 포함한다.
또, 본 발명은
a) 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 N-트리플루오로아세틸 라이신의 N-카복시안하이드라이드류를 중합해서 보호된 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계;
b) 보호된 글라티라머 아세테이트를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호하여 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계(여기서 상기 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함함);
c) 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 수성 피페리딘과 반응시켜 글라티라머 아세테이트의 용액을 형성하는 단계; 및
d) 글라티라머 아세테이트를 정제하는 단계를 포함하는, 글라티라머 아세테이트를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은
a) 글라티라머 아세테이트를 가수분해해서 가수분해물을 얻는 단계;
b) 상기 가수분해물을 크로마토그래피 컬럼을 통해 용리시키는 단계;
c) 상기 가수분해물 중의 브로모티로신의 레벨을 측정하는 단계;
d) 브로모티로신 및 글라티라머 아세테이트의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
e) 상기 b) 단계의 컬럼을 통해 상기 샘플 용액을 용리시키는 단계; 및
e) 글라티라머 아세테이트 중의 브롬화 티로신의 백분율을 산출하는 단계를 포함하는, 글라티라머 아세테이트 샘플 중의 브롬화 티로신의 백분율을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 글루탐산, 알라닌, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 폴리펩타이드류의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 약제학적 조성물에 내포(inclusion)시키기에 적합한 소정의 백분율의 브롬화 티로신을 지니고,
균일하지 않은 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드류의 혼합물의 배취를 얻는 단계(여기서 각 폴리펩타이드는 글루탐산, 알라닌, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어짐);
이하의 a) 내지 f)를 포함하는 프로세스에 의해 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 측정하는 단계;
이와 같이 해서 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.3% 미만인 경우에만 상기 배취를 상기 약제학적 조성물에 내포시키는 단계를 포함한다:
a) 상기 배취를 가수분해해서 가수분해물을 얻는 단계;
b) 상기 가수분해물을 크로마토그래피 컬럼을 통해 용리시키는 단계;
c) 상기 가수분해물 중의 브로모티로신의 레벨을 측정하는 단계;
d) 브로모티로신 및 상기 배취의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
e) 상기 b) 단계의 컬럼을 통해 상기 샘플 용액을 용리시키는 단계; 및
f) 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 산출하는 단계.
발명의 상세한 설명
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각 폴리펩타이드가 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드류의 혼합물의 배취를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호시키는 과정에서, 유리 브롬을 0.5% 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 것을 포함하는 것을 개량점으로 한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 개량점은 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 것을 포함한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각 폴리펩타이드가 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드류의 혼합물의 배취를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호시키는 과정에서, 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 것을 포함하는 것을 개량점으로 한다.
본 발명은 또한 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 각각 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신을 주성분으로 하는 폴리펩타이드류의 혼합물을 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호하는 단계를 포함하고, 상기 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.1% 미만 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.05% 미만 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.01% 미만 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.001% 미만 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 포함하지 않는다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 함유하지 않는다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트("TFA GA")이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 10% 내지 36% 함유한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 16% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 18% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 20% 내지 37%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 20% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 22% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 24% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 25% 내지 35%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 26% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 28% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 30% 내지 34%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 30% 내지 33%; 또는 아세트산 내 브롬화 수소산을 32% 내지 33% 함유한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 33% 함유한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 16% 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 유리 브롬을 제거하기 위해서 브롬 스캐벤저(bromine scavenger)에 의해 전처리되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 브롬 스캐벤저는 페놀이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 비금속성 반응기 중에서 생성된다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 유리-코팅된(glass-lined) 또는 테플론 코팅된(Teflon lined) 반응기 중에서 제조된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상(color)은 2000 APHA 미만이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 1000 APHA 미만이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 700 APHA 미만이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 500 APHA 미만이다.
본 발명은 상기에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 트리플루오로아세틸 생성물도 제공한다.
본 발명은 또한 상기에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 트리플루오로아세틸 생성물 및 담체를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고, 브롬화 티로신을 단지 0.1% 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 2000 달톤 내지 40,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 4000 달톤 내지 18,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 4000 달톤 내지 13,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 13,000 달톤 내지 19,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 13,500 달톤 내지 18,500 달톤의 평균 분자량을 가진다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 7,000 ±2,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 7,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 14,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 4,700 내지 11,000 달톤의 평균 분자량을 가진다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 함유한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 함유한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 함유한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물은 금속 이온 불순물을 함유하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 혼합물 및 담체를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 각 폴리펩타이드가 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 폴리펩타이드류의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물을 얻는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 원하는 평균 분자량을 갖고,
a) 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 N-트리플루오로아세틸 라이신의 N-카복시안하이드라이드류를 중합해서 보호된 폴리펩타이드류의 수성 혼합물을 형성하는 단계;
b) 보호된 폴리펩타이드류를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호시켜 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 수성 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 함유함);
c) 트리플루오로아세틸 폴리펩타이드류의 수성 혼합물을 수성 피페리딘과 반응시켜 폴리펩타이드류의 수성 혼합물 용액을 형성하는 단계(여기서, 각 폴리펩타이드는 알라닌, 글루탐산, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어짐); 및
d) 폴리펩타이드류의 수성 혼합물을 정제하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 혼합물 중의 평균 몰분율은 글루탐산 0.129 내지 0.159; 알라닌 0.392 내지 0.462; 티로신 0.086 내지 0.100; 및 라이신 0.300 내지 0.374이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 혼합물 중의 평균 몰분율은 글루탐산이 0.141, 알라닌이 0.427, 티로신이 0.093, 라이신이 0.337이다.
본 발명은 또한
a) 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 N-트리플루오로아세틸 라이신의 N-카복시안하이드라이드류를 중합하여 보호된 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계;
b) 보호된 글라티라머 아세테이트를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호시켜 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계(여기서, 이 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함함);
c) 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 수성 피페리딘과 반응시켜 글라티라머 아세테이트의 용액을 형성하는 단계; 및
d) 글라티라머 아세테이트를 정제하는 단계를 포함하는 글라티라머 아세테이트를 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 d) 단계의 생성물에 대해서는 더욱 한외여과를 실시해서 분자량이 5000 달톤 미만인 폴리펩타이드 종들을 제거한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 10% 내지 36% 함유한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 16% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 18% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 20% 내지 37%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 20% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 22% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 24% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 25% 내지 35%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 26% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 28% 내지 33%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 30% 내지 34%; 아세트산 내 브롬화 수소산을 30% 내지 33%; 또는 아세트산 내 브롬화 수소산을 32% 내지 33% 함유한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 33% 함유한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 아세트산 내 브롬화 수소산을 16% 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 유리 브롬을 제거하기 위해서 브롬 스캐벤저에 의해 전처리되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 브롬 스캐벤저는 페놀이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 비금속성 반응기 중에서 생성된다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 유리-코팅된 또는 테플론 코팅된 반응기 중에서 제조된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 2000 APHA 미만이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 1000 APHA 미만이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 700 APHA 미만이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 500 APHA 미만이다.
본 발명은 또한
a) 글라티라머 아세테이트를 가수분해해서 가수분해물을 얻는 단계;
b) 상기 가수분해물을 크로마토그래피 컬럼을 통해 용리시키는 단계;
c) 상기 가수분해물 중의 브로모티로신의 레벨을 측정하는 단계;
d) 브로모티로신 및 글라티라머 아세테이트의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
e) 상기 b) 단계의 컬럼을 통해 상기 샘플 용액을 용리시키는 단계; 및
f) 글라티라머 아세테이트 중의 브롬화 티로신의 백분율을 산출하는 단계를 포함하는, 글라티라머 아세테이트의 샘플 중의 브롬화 티로신의 백분율을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 각 폴리펩타이드가 글루탐산, 알라닌, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어지고, 모두가 동일한 아미노산 서열을 지니는 것은 아닌 폴리펩타이드류의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 약제학적 조성물에 내포시키는 데 적합한 소정의(즉, 미리 결정된) 백분율의 브롬화 티로신을 가지고, 상기 방법은
균일하지 않은 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드류의 혼합물의 배취를 얻는 단계(여기서 각 폴리펩타이드는 글루탐산, 알라닌, 티로신 및 라이신으로 실질적으로 이루어짐);
이하의 a) 내지 f)를 포함하는 프로세스에 의해 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 측정하는 단계; 및
이와 같이 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.3% 미만인 경우에만 배취의 약제학적 조성물에 내포시키는 단계를 포함한다:
a) 상기 배취를 가수분해해서 가수분해물을 얻는 단계;
b) 상기 가수분해물을 크로마토그래피 컬럼을 통해 용리시키는 단계;
c) 상기 가수분해물 중의 브로모티로신의 레벨을 측정하는 단계;
d) 브로모티로신 및 상기 배취의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
e) 상기 b) 단계의 컬럼을 통해 상기 샘플 용액을 용리시키는 단계 ; 및
f) 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 산출하는 단계.
일 실시형태에 있어서, 상기 배취는 상기와 같이 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.2% 미만인 경우에만 약제학적 조성물에 내포시키는 데 적합하다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 배취는 상기와 같이 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.1% 미만인 경우에만 약제학적 조성물에 내포시키는 데 적합하다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드류의 혼합물은 글라티라머 아세테이트("GA")이다.
용어
본 출원에서 사용하는 바와 같은 용어 "평균 분자량"이란 혼합물이 HPLC 겔투과 컬럼 상에서 분자량에 의해 분리될 경우 최고 상대 비율(즉, 피크 최대치)로 혼합물에 존재하는 폴리펩타이드류 종의 분자량을 의미한다. 이 값은 예를 들어 검정(calibrated) 컬럼 상의 체류 시간으로부터; 또는 규정된 서열 및 분자량의 코크로마토그래피적 공중합체 표지(cochromatographed copolymer marker)의 위치와 피크 위치 간의 상관으로부터 등의 각종 방법에 의해 얻을 수 있다. 광 산란 등에 의해 평균 분자량을 구하는 기타 방법이 이용될 수 있으며, 피크 최대치로부터 얻어진 값에 실질적으로 상응할 것이다.
본 발명에 의한 폴리펩타이드 혼합물로는 4종의 활성 아미노산 유도체(이들 중 2종은 보호된 L-글루탐산 및 L-라이신), 즉, L-글루탐산(L-Glu), L-알라닌(L-Ala), L-티로신(L-Tyr) 및 L-라이신(L-Lys)(이들 중 2종은 보호됨, 즉, 5Bz-글루타메이트 유도체 및 6N-TFA-라이신 유도체)을 특정 비율로 화학적으로 반응시킴으로써 제조된 합성 폴리펩타이드류의 아세트산염을 예시할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 용어 "혼합물"이란 일반적으로 L-글루탐산, L-알라닌, L-티로신 및 L-라이신을 포함하는 "본 발명의 폴리펩타이드류의 혼합물"을 의미하며, 이들 두 용어는 모두 제조 프로세스로부터 잔류 불순물을 포함하는 것을 의미한다.
각 아미노산 잔기의 몰분율 범위는 L-Glu 0.129 내지 0.153, L-Ala 0.392 내지 0.462, L-Tyr 0.086 내지 0.100 및 L-Lys 0.300 내지 0.374이다.
반응이 100% 완료되지 못하므로, 실질적으로 모든 불순물이 제거되더라도, 소량이 남을 수 있다. 이러한 불순물은 이하의 3가지 유형일 수 있다:
● 보호기의 불완전한 제거로부터 유래하는 5-BZ-L-글루타밀 및/또는 N6-TFA-L-라이실 잔기 등의 보호된 아미노산 잔기인 구조 관련 물질. 또한, 본 발명의 분자의 폴리펩타이드 혼합물은 HBr/아세트산 시약 중의 유리 브롬의 존재에 의한 제조 과정에서 형성된 브롬화 L-티로실 잔기를 포함할 수 있다.
동정된(identified) 구조 관련 불순물의 분자 구조는 관여하는 단량체, 즉, 출발 재료로부터 유래될 수 있다.
이들 동정된 불순물은 상기 불순물 자체의 유도체 혹은 일부인 특정 참조 표준에 대한 비교에 의해 (화학변환 후) 정량화된다: 즉,
- 잔류 트리플루오로아세틸 화합물(불화물로서 표현됨)
- 잔류 벤질화 글루타밀 잔기(벤질 브로마이드로 표현됨)
- 잔류 브롬화 티로실 잔기(브로모티로신으로 표현됨)
● 미동정 관련 물질(RP-HPLC에 의해 결정됨): 이들은 유사한 구조를 지닌 동일한 근원(origin)의 작은 분자량 크기의 폴리펩타이드류이다. 이들 물질은 가능하게는 유사한 반응 인자를 지니며, 각 불순물의 농도(%)는 본 발명의 피크 면적의 폴리펩타이드 혼합물에 대한 % 피크 면적으로서 산출될 수 있다.
불순물의 특성은 L-트립토판 표준에 대한 그들의 상대 크로마토그래피 체류시간(RRT)에 근거한 것이다.
● 잔류 용매인 1,4-다이옥산, 잔류 피페리딘 및 중금속 등의 사양(specification)에 있어서 커버되는 잔류 용매 및 무기 불순물.
검토
유리 브롬
GA 등의 폴리펩타이드류의 혼합물의 제조방법에 있어서, 아세트산 중 33% 브롬화 수소산은 보호된 GA를 탈보호하는 데 이용된다. 예를 들어, GA에 대한 제조과정의 전개 동안, 트리플루오로아세틸 GA(TFA GA) 중 및 GA 중의 티로신 잔기의 일부가 브롬화된 것으로 확인되었다. 이 불순물은 실시예에서 상세하게 설명되는 분석 절차를 이용해서 단리 및 동정되었다. 상기 티로신 잔기는 브롬과 반응해서 2-브로모티로신 또는 3-브로모티로신을 포함하는 모노-브로모티로신 부분(moiety)을 형성하는 것으로 확인되었다.
더욱 조사 후, 본 발명자들은 브롬화 티로신 불순물이 HBr/아세트산 중 유리 브롬을 통해서 GA에 도입된 것을 발견하였다. 유리 브롬은 공급사로부터 입수된 33% HBr/아세트산에 존재하였고 제조과정에서 사용되었다.
33% HBr/아세트산 중 유리 브롬의 레벨을 감소시키기 위해서 대책을 취하였다. 예를 들어, 브롬 스캐벤저에 의한 HBr/아세트산의 전처리는 HBr/아세트산 용액으로부터 유리 브롬의 일부를 제거하는 데 효과적이었다.
HBr 정제 과정에서 사용된 브롬 스캐벤저의 하나는 페놀이었다. 페놀 외에도, 중아황산 나트륨 등의 기타 환원제도 사용될 수 있다. 페놀은 브롬을 지닌 그 자체 및 그의 반응 생성물(브로모페놀)이 보호된 GA 등의 보호된 폴리펩타이드류, TFA GA 등의 TFA 폴리펩타이드류 및 GA 등의 폴리펩타이드류와 본질적으로 비반응성이고, 이들은 정제 과정 동안 GA의 용액으로부터 제거하기 용이하기 때문에 브롬 스캐벤저로서 선정되었다. 마찬가지로, 임의의 브롬 스캐벤저제는 브롬을 지닌 그 자체 및 그의 반응생성물이 보호된 GA 등의 보호된 폴리펩타이드류, TFA GA 등의 TFA 폴리펩타이드류 및 GA 등의 폴리펩타이드류와 반응하지 않고 최종 정제 과정 동안 용이하게 제거가능한 조건하에서 이용될 수 있다.
금속 불순물
GA는 2개의 약제학적 제형, 즉, 동결건조분말 및 프리필드 시린지(pre-filled syringe)로 시판되고 있다. 상품명 Copaxone® 주사액으로 시판되고 있는 시린지는 일반적으로 맑은 용액을 함유한다. 보존 설명서에는 시린지를 냉장보관하도록 되어있다. 그러나, Copaxone® 프리필드 용액의 수용액에서 적색이 검출되었다. 상기 용액 중의 색상의 원인은 알려져 있지 않았다.
상기 용액이 실온에서 12 내지 24시간 유지된 경우 발색되었다.
금속 장치 속에서의 HBr의 제조는 HBr 중에 금속성 이온 불순물을 미량 남기는 것으로 판정되었다. HBr이 이후 보호된 GA와 혼합될 경우, HBr 중의 금속성 이온 불순물은 TFA GA 및 GA에 의해 킬레이트화되었다. 이들 TFA GA 및 GA/금속 착물은 착색에 기여하였다.
그 결과, 예를 들어 GA 생성물에 있어서 순도를 확보하기 위해 취한 다른 대책은 33% HBr/아세트산 용액의 제조를 위해 비금속 반응기를 이용하는 것이었다. HBr/아세트산 용액의 제조에 이용되는 반응기는 예를 들어 나중에 GA의 순도에 영향을 미칠 수도 있는 불순물의 형성을 방지하기 위해 유리 코팅되어(glass-lined) 있다. HBr 용액과 금속의 접촉을 방지하기 위해서, 사용된 배관 부품은 테플론 코팅되어(Teflon lined) 있다. 마찬가지로, 다른 유형의 비반응성의 내산성 비금속 장치는 HBr/아세트산 용액 중의 미량 금속 이온의 형성을 방지하는 데 이용될 수 있다. HBr/아세트산 용액의 제조용의 비금속 장치의 이용은 GA로부터 적색을 제거하는 데 성공적이었다. 비금속 장치가 HBr/아세트산 용액의 제조에 이용될 경우, 상기 용액은 본질적으로 금속 이온이 없었고, 적색의 GA가 형성되지 않는 결과가 얻어졌다.
또한, HBr/아세트산의 모든 배취의 색상은 보호된 GA를 탈보호하는 데 이용되기 전에 불순물의 레벨을 결정하기 위해 측정된다. HBr 용액 중의 금속 이온 불순물의 레벨이 시각적 분석(visual analysis)에 의해 결정될 수 있는 것이 확인되었다. 2000 APHA 이하의 색상을 가진 HBr 용액은 적색 없이 글라티라머 아세테이트를 생성하는 것으로 보였다.
이하 본 발명을 예시하지만, 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실험에 관한 상세
실시예 1 - TFA GA 중 및 GA 중의 브롬화 티로신 부분에 대한 HBR /아세트산 중의 브롬 농도의 영향
TFA-GA 및 GA 중의 브롬화 티로신 부분 불순물의 레벨에 대한 브롬화 수소산/아세트산 중의 유리 브롬의 영향을 결정하기 위하여, 아세트산 내 브롬화 수소에 다양한 양의 브롬을 혼입시켰다. 실험에 있어서, 브롬 스캐벤저로 전처리되어 있지 않은 HBr을 제조과정에서 이용하였다. 다양한 레벨의 브롬 불순물(HBr/아세트산 용액의 백분율로서 측정됨)을 첨가하였다. TFA GA 중 및 GA 중 브롬화 티로신 부분 불순물의 레벨은 TFA GA 및 GA를 그의 아미노산 성분으로 가수분해한 후, HPLC를 이용하여 TFA GA 및 GA와 관련해서 브로모티로신의 양을 결정함으로써 측정하였다.
과정
표준 용액의 제조
2 ㎍/㎖ 브로모티로신을 함유하는 표준용액은 증류수를 이용해서 제조하였다. 아미노산 표준 원액은 이하의 아미노산을 이용해서 제조하였다:
L-Glu 약 100 ㎎
L-Ala 약 130 ㎎
L-Tyr 약 75 ㎎
L-Lys HCl 약 200 ㎎
아미노산을 물에 용해시키고, 5 N NaOH를 수 방울(few drops) 첨가하고, 물을 첨가해서 최종 체적 25 ㎖로 하였다.
가수분해
글라티라머 아세테이트 10 ㎎ 및 TFA GA 10 ㎎을 5 ㎖ 가수분해 바이알(hydrolysis vial)에 각각 독립적으로 칭량해 넣었다. 5 ㎖ 가수분해 바이알에 아미노산 표준 원액 0.5 ㎖을 첨가함으로써 음성 대조용 바이알을 준비하였다. 각 바이알에 물 0.5 ㎖와, 페놀 1%를 함유하는 진한 HCl 0.5 ㎖를 첨가하였다. 이들 바이알을 N2 분위기하 110℃에서 24시간 가열하였다. 다음에, 이들 샘플을 실온까지 냉각시켰다. 상기 각 가수분해물을 5 ㎖ 용적의 플라스크에 옮기고, 증류수로 용적을 채웠다.
크로마토그래피
브로모티로신 표준 및 상기 각 가수분해물을 4:95:1 비율의 아세토니트릴:물:아세트산의 용리액을 이용하는 HPLC 컬럼을 통해서 독립적으로 용리시켰다. 상기 컬럼에 UV 검출기 및 데이터 기록 시스템을 장착하였다. 상기 아미노산 표준을 음성 대조군으로서 사용해서 글라티라머 아세테이트 가수분해물 중의 어느 피크가 브로모티로신에 해당하는지를 결정하였다.
데이터 분석
TFA GA 및 GA 샘플 각각에 있어서의 브롬화 티로신 부분의 백분율을 다음과 같이 산출하였다:
P = 브로모티로신 표준의 순도(백분율)
As = 브로모티로신 표준 피크의 면적
Ap = 각 샘플에서의 브로모티로신 피크의 면적
Cs = 브로모티로신 표준의 농도(㎍/㎖)
Cp = 글라티라머 아세테이트(또는 TFA GA)의 농도
% 브롬화 티로신 = p*(Ap/As)*(Cs/Cp)
표 1은 TFA 글라티라머 아세테이트 중 및 글라티라머 아세테이트 중의 브롬화 티로신 부분의 레벨에 대한 유리 브롬의 영향을 나타내고 있다.
<브롬화 티로신 부분의 레벨에 대한 유리 브롬의 영향>
브롬(%) 브롬화 티로신(%)
TFA 글라티라머 글라티라머 아세테이트
브롬 무첨가 0.1 0.2
0.5 0.7 1.2
1 1.2 2.2
5 4 데이터 없음
결과
상기 실시예로부터, HBr의 브롬에 의한 혼입은 브롬을 첨가하지 않은 표준 반응에 대해서, TFA GA 중 및 GA 중의 브롬화 티로신 부분의 높은 레벨을 초래하는 것을 알 수 있다. 브롬을 첨가하지 않은 경우, HBr은 브롬 스캐벤저로 처리되지 않았으므로, 일부의 유리 브롬은 여전히 이용가능하고 GA 및 TFA GA의 브롬화 티로신 부분 혼입은 여전히 입증되었다.
브롬화 티로신 부분 불순물의 레벨이 0.2% 미만인 GA를 제조하기 위해서, HBr 중의 유리 브롬의 레벨은 브롬 스캐벤저의 첨가에 의해 낮출 필요가 있다.
실시예 2 - 아세트산 용액 중 33% HBR 의 제조
유리 코팅된 반응기를 아세트산으로 세정하고 나서, 비웠다. 아세트산 1013 ㎏을 상기 반응기에 첨가하였다. 상기 아세트산을 10 내지 20℃의 온도에서 유지하였다. 상기 반응기 속에 HBr 가스 522 ㎏을 도입하면서 상기 용액을 혼합하였다. 상기 가스를 도입한 후, 상기 용액을 추가로 30분간 혼합하였다. 상기 용액을 검사해서, HBr 함량이 33%인지의 여부를 판정하였다.
실시예 3 - 페놀을 브롬 스캐벤저로서 사용한 HBR /아세트산 용액의 정제
아세트산 중 33% HBr 용액을 유리 코팅된 반응기에 부었다. 페놀을 칭량하여 1 내지 100의 중량비로 상기 HBr 용액에 첨가하였다. 다음에, 상기 용액을 12 내지 24시간 교반하였다. 이어서, 정제된 HBr 용액을 보호된 글라티라머 아세테이트에 첨가하였다. HBr과 보호된 GA와의 반응은 TFA GA를 형성하였다. TFA GA는 피페리딘과 반응해서 GA를 형성하였다.
실시예 4 - 다양한 배취 중의 브롬화 티로신의 레벨
글라티라머 아세테이트의 다양한 배취 중의 브롬화 티로신 부분의 레벨을 실시예 1에 기재된 방법을 이용해서 측정하였다.
제조방법 GA의 배취 번호 브롬화 티로신 부분 농도
종래 방법 A 0.15
B 0.19
C 0.14
D 0.15
E 0.32
신규의 방법 X 검출되지 않음
Y 검출되지 않음
Z 검출되지 않음
결과
실시예 2에 기재된 바와 같은 신규의 방법을 이용해서 제조되고, 실시예 3에서와 마찬가지로 페놀에 의해 처리된 HBr은 브롬 및 금속성 불순물이 없었다. 따라서, 제조된 글라티라머 아세테이트는 실질적으로 브롬화 티로신 부분을 함유하지 않았다.
외부 공급원(종래 방법)으로부터 제공된 HBr은 불순물을 가졌고, 따라서 이것을 이용해서 제조된 글라티라머 아세테이트는 페놀이 티로신 스캐벤저로서 사용된 경우에도 브롬화 티로신 부분 불순물도 지녔다.
실시예 5 - 색상 결정
HBr/아세트산 용액의 색상은 표준 시각적 색상 결정 수법을 이용해서 결정하였다.
APHA(The American Public Health Association) 색상지표는 각 APHA 단위가 백금-코발트(PtCo)의 500 ppm 원액의 희석액에 의거하고 있는 싱글 넘버 황색 지수(single number yellowness index)이다(http://www.hunterlab.com/appnotes/an11 96 br2 . pdf에서 입수할 수 있는 HunterLab, APHA Bac㎏round, Applications Note, Insight on Color, November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16.). APHA 측정은 제어된 양의 포타슘 클로로플라티네이트(potassium chloroplatinate) 및 염화 제일코발트를 함유하는 PtCo 표준과 상기 용액과의 시각적 비교에 의해 결정하였다. 각 넘버 단위는 용액의 리터당의 백금 1 ㎎(ppm)과 등가이다. 상기 표준 및 대응하는 측정은 그들의 ppm 측정에 따라 지정되었고, 즉, No. 20 APHA 표준은 백금 20 ppm을 함유하고(http://pubs.acs.org/reagent demo / sec b002 . html에서 입수할 수 있는 American Chemical Society, General Directions and Procedures: Measurement of Physical Properties), 증류수는 0의 APHA 값을 갖고, 상기 원액은 500 ppm의 APHA값을 지닌다(http://www.hunterlab.com/appnotes/an11 96 br2 . pdf에서 입수할 수 있는 HunterLab, APHA Bac㎏round, Applications Not, Insight on Color, November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16). APHA 측정은 당업계에 잘 알려진 다양한 기구에 의해 수행될 수 있다.
APHA 색상 표준 "500" 및 APHA 색상 표준 "1000"을 제조하였다. 즉, APHA 색상 표준 "500"은 증류수 중의 포타슘 클로로플라티네이트 K2PtCl6(금속 백금 50 ㎎에 상당함) 1.246 g 및 결정화 염화 제일코발트 CoCl2-6H2O(금속 코발트 약 250 ㎎에 상당함) 1.00 g을 진한 HCl 100㎖에 의해 용해시키고, 증류수에 의해 1000 ㎖까지 희석시켰다.
APHA 색상 표준 "1000"은 증류수 중의 포타슘 클로로플라티네이트 K2PtCl6 2.492 g 및 결정화 염화 제일코발트 CoCl2-6H2O 2.00 g을 진한 HCl 200㎖에 의해 용해시키고, 증류수에 의해 1000 ㎖까지 희석시켰다.
이하의 배취를 전술한 바와 같은 비금속 장치를 이용해서 제조하였다. 이들 샘플은 흰색 배경에 대해 수직으로 10O ㎖ 비색관(Nessler Tube)을 봄으로써 상기 색상 표준에 대해 시각적으로 색상 검사를 행하였다.
배취 번호 색상(APHA)
M <500
N <500
P 700
Q 350
R <300
HBr/아세트산의 이들 배취의 색상은 이들에 브롬 및 금속 이온 불순물이 실질적으로 없는(즉, 함유되어 있지 않은) 것을 나타내었다. 색상이 2000 APHA 미만이었으므로, 이들 배취에는 실질적으로 금속 이온 불순물이 없는 것으로 여겨졌다.

Claims (62)

  1. 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 수득하기 위한 방법으로서, 해당 방법 동안, 각 폴리펩타이드가 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 이루어진 해당 폴리펩타이드의 혼합물의 배취(batch)가 아세트산 내 브롬화 수소산 용액(a solution of hydrobromic acid in acetic acid)에 의해 탈보호되며,
    유리 브롬(free bromine)을 0.5% 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  2. 제1항에 있어서, 유리 브롬을 제거하기 위해서 브롬 스캐벤저(bromine scavenger)로 상기 브롬화 수소산 용액을 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 함유하지 않은 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상(color)은 2000 APHA 미만인 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 1000 APHA 미만인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  12. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 700 APHA 미만, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  13. 제3항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 500 APHA 미만인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 비금속성 반응기 속에서 생산된 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 코팅된(glass-lined) 또는 테플론 코팅된(Teflon lined) 반응기 속에서 제조된 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 수득방법.
  16. 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
    각 폴리펩타이드가 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 이루어진 폴리펩타이드류의 혼합물을 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호시키는 단계를 포함하되,
    상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 함유하지 않은 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 2000 APHA 미만인 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  24. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 1000 APHA 미만인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  25. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 700 APHA 미만인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  26. 제16항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 500 APHA 미만인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 비금속성 반응기 속에서 생산된 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 코팅된 또는 테플론 코팅된 반응기 속에서 제조된 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트의 혼합물의 제조방법.
  29. a) 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 N-트리플루오로아세틸 라이신의 N-카복시안하이드라이드류를 중합하여 보호된 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계;
    b) 상기 보호된 글라티라머 아세테이트를 아세트산 내 브롬화 수소산 용액에 의해 탈보호해서 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 형성하는 단계;
    c) 상기 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 수성 피페리딘과 반응시켜 글라티라머 아세테이트의 용액을 형성하는 단계; 및
    d) 상기 글라티라머 아세테이트를 정제하는 단계를 포함하되,
    상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.5% 미만 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법..
  32. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 포함하는 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 금속 이온 불순물을 함유하지 않은 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법..
  36. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 2000 APHA 미만인 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 1000 APHA 미만인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 700 APHA 미만인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액의 색상은 500 APHA 미만인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  40. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 비금속성 반응기 속에서 생산된 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  41. 제29항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 코팅된 또는 테플론 코팅된 반응기 속에서 제조된 것인, 글라티라머 아세테이트의 제조방법.
  42. 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트를 포함하는 것인 조성물로서, 해당 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트는 브롬화 티로신을 단지 0.1%, 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  43. 글라티라머 아세테이트를 포함하는 것인 조성물로서, 해당 조성물은 브롬화 티로신을 단지 0.1%, 그리고 금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 500 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  45. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 100 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  46. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 30 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  47. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 20 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  48. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 10 ppm 미만 포함하는 것인 조성물.
  49. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물은 금속 이온 불순물을 함유하지 않는 것인 조성물.
  50. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물의 색상은 2000 APHA 미만인 것인 조성물.
  51. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물의 색상은 1000 APHA 미만인 조성물.
  52. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물의 색상은 700 APHA 미만인 조성물.
  53. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 조성물의 색상은 500 APHA 미만인 조성물.
  54. 제42항 또는 제43항에 있어서, 4,700 달톤 내지 11,000 달톤의 평균 분자량을 지니는 것인 조성물.
  55. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트.
  56. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 글라티라머 아세테이트.
  57. 약제학적 조성물에의 내포(inclusion)가 허용가능한 미리 결정된 백분율의 브롬화 티로신을 지니는 글라티라머 아세테이트를 함유하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    글라티라머 아세테이트의 배취를 얻는 단계;
    이하의 a) 내지 f) 단계를 포함하는 공정에 의해 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 측정하는 단계; 및
    측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.3% 미만인 경우에만 상기 배취를 상기 약제학적 조성물에 내포시키는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조방법:
    a) 상기 배취를 가수분해시켜 가수분해물을 얻는 단계;
    b) 상기 가수분해물을 크로마토그래피 컬럼을 통해 용리시키는 단계;
    c) 상기 가수분해물 중의 브로모티로신의 레벨을 측정하는 단계;
    d) 브로모티로신 및 상기 배취의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
    e) 상기 b) 단계의 컬럼을 통해 상기 샘플 용액을 용리시키는 단계; 및
    f) 상기 배취 중의 브롬화 티로신의 백분율을 산출하는 단계.
  58. 제57항에 있어서, 상기 배취는 상기 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.2% 미만인 경우에만 상기 약제학적 조성물에의 내포가 허용가능한 것인, 약제학적 조성물의 제조방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 배취는 상기 측정된 브롬화 티로신의 백분율이 0.1% 미만인 경우에만 상기 약제학적 조성물에의 내포가 허용가능한 것인, 약제학적 조성물의 제조방법.
  60. 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트 혼합물을 수득하기 위한 방법으로서, 해당 방법 동안, 각 폴리펩타이드가 알라닌, γ-벤질 글루타메이트, 티로신 및 트리플루오로아세틸 라이신으로 이루어진 해당 폴리펩타이드의 혼합물의 배취(batch)가 아세트산 내 브롬화 수소산 용액(a solution of hydrobromic acid in acetic acid)에 의해 탈보호되며,
    금속 이온 불순물을 1000 ppm 미만 포함하고, 유리 브롬(free bromine)을 0.5% 미만 포함하는 아세트산 내 브롬화 수소산 용액을 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트 혼합물의 수득방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 아세트산 내 브롬화 수소산 용액은 유리 브롬을 0.1% 미만 포함하는 것인, 트리플루오로아세틸 글라티라머 아세테이트 혼합물의 수득방법.
  62. 글라티라머 아세테이트 샘플에서 브롬화 티로신의 백분율을 분석하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 가수분해 산물을 얻기 위하여 글라티라머 아세테이트를 가수분해하는 단계;
    b) 크로마토그래피 칼럼을 통하여 상기 가수분해 산물을 용출하는 단계;
    c) 상기 가수분해 생성물 중의 브롬화 티로신의 수준을 측정하는 단계;
    d) 글라티라머 아세테이트 및 브롬화 티로신의 아미노산 성분의 샘플 용액을 제조하는 단계;
    e) 단계 b)의 컬럼을 통하여 상기 샘플 용액을 용출하는 단계; 및
    f) 글라티라머 아세테이트 중의 브롬화 티로신의 백분율을 계산하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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