KR101291042B1 - 헤스페리딘을 포함하는 알코올성 간질환 예방용 조성물 - Google Patents

헤스페리딘을 포함하는 알코올성 간질환 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라보노이드를 함유하는 알코올성 간질환 예방용 조성물에 관한 것으로서 좀 더 자세하게는 글리코사이드(glycoside)를 글리코실화(glycosylation) 및 가수분해 처리하여 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 알코올성 간질환 예방 조성물은 고순도로 추출하여 나리루틴의 쓴맛을 저감시키고 헤스페리딘의 수용성이 증가된 알코올성 간질환 예방 약학조성물 및 식품조성물을 제공할 수 있다.

Description

헤스페리딘을 포함하는 알코올성 간질환 예방용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING ALCOHOLIC LIVER DISEASE COMPRISING HESPERIDIN}
본 발명은 플라보노이드를 함유하는 알코올성 간질환 예방용 조성물에 관한 것이다.
플라보노이드는 여러 생리 활성을 지니고 있는데, 항산화 활성, 항균 활성, 항바이러스 활성, 항염 활성, 항암 활성 등을 지니고 있으며, 또한 혈장의 저밀도 지질의 산화를 억제하여 동맥경화를 예방하는 효과를 지니고 있기도 하다. 플라보노이드는 그 종류가 수천 가지에 이르는데, 중요한 플라보노이드로는 플라보놀(flavonol), 플라본(flavone), 플라바온(flvaone), 플라바논(flavanone), 플라바놀(flavanol), 앤소사이아니딘(anthocyanidin), 아이소플라본(isoflavone), 디하이드로플라본(dihydroflavonl) 및 찰콘(chalcone) 등이 있다. 나리루틴, 나리게닌, 헤스페레딘 등이 플라바논(flavanone) 화합물에 속한다. 더욱이 의약분야에서는 새로운 플라보노이드 물질이 추출됨에 따라 치료대상 질환이 다양해져서 간질환, 당뇨병, 류마티스관절염, 각종 암, 진통, 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 동맥경화 등 혈관계 질환, 심근관련 질환, 스트레스, 우울증 등에 약리활성이 있음이 밝혀졌다.
한편, 감귤류 과피에서 유래한 플라보노이드는 각종 약리활성작용, 예를 들어 심장순환기 질환과 관련된 지질대사 개선효과, 항암 및 항바이러스 작용 등을 가진 것으로 알려져 있다. 특히, 감귤류 과피에 존재하는 헤스페리딘(hesperidin) 및 헤스페레틴(hesperetin)은 모세혈관 강화, 투과성(permeability) 감소, 혈압 강하, 혈중 콜레스테롤 강하, 항혈소판 응집(antiplatelet aggregation), 항염증 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있고(Meyer, O. C.,Angiology,45, 579-584(1994); Struckmann J. R., et al.,Angiol.,45, 419-428(1994); Matsubara, Y., et al.,Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal.,52, 318-327(1994, Mar.); Galati E. M., et al.,Farmaco.,51(3), 219-221(1996, Mar.); Monforte MT., et al.,Farmaco.,50(9), 595-599(1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Chung, M. I., et al.,Chin. Pharm. J.(Taipei).,46, 429-437(1994, Nov.); Galati, E. M., et al.,Farmaco.,40(11), 709-712(1994, Nov.); and Emim J. A., et al.,J. Pharm. Pharmacol.,46(2), 118-122(1994)), 이외의 각종 바이오플라보노이드(bioflavonoid)는 항산화, 혈압강하, 항암 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있으며(Saija, A., et al.,Free Raical Biol. Med.,19, 481-486(1995); Matsubara, Y., et al.,Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal.,52, 318-327(1994, Mar.); Galati E. M., et al.,Farmaco.,51(3), 219-221(1996, Mar.); Felicia V., et al.,Nutr. Cancer,26, 167-181(1996); EP 0352147 A2(1990.1.25); and Kaul, T. N., et al.,J. Med. Virol., 15, 71-79(1985)), 또한 나린진(naringin) 및 나린제닌(naringenin)은 콜레스테롤 강하, 항암 및 항위궤양(알콜로부터 보호) 작용을 한다고 알려져 있다(Monforte MT., et al.,Farmaco.,50(9), 595-599(1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Felicia V., et al.,Nutr. Cancer,26, 167-181(1996); EP 0352147 A2(1990.1.24); and Martin M. J., et al.,Pharmacol.,49, 144-150(1994)).
본 발명자들은 감귤류 과피 유래 플라보노이드가 가수분해 또는 글리코실화 되면 간기능 개선에 좀 더 획기적인 효능을 보인다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명의 목적은 플라보노이드를 고순도로 추출하여 알코올성 간질환 예방 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 일 구체예에서 플라보노이드를 글리코실화(glycosylation) 또는 가수분해하여 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 플라보노이드는 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 및 나리루틴으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 글리코실화는 당 기질 및 당 전이 효소 CGTase(Cyclodextrin glucanotransferase)를 첨가하여 유도한 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 당 기질은 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)인 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 가수분해는 헤스페리디나아제(hesperidinase) 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 가수분해하는 경우에 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 또는 나린제닌-7-O-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 글리코실화하는 경우에 G-나루리틴 또는 G-헤스페리딘 인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 글리코실화(glycosylation)되거나 가수분해된 플라보노이드 유도체를 포함하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 및 나리루틴으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 가수분해하는 경우에 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 또는 나린제닌-7-O-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 글리코실화하는 경우에 G-나루리틴 또는 G-헤스페리딘 인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 대 나린제닌-7-O-글루코사이드은 4:1인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, G-나루리틴 대 G-헤스페리딘은 4:1인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 글리코실화(glycosylation)되거나 가수분해된 플라보노이드 유도체를 포함하는 알코올성 간질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 플라보노이드 유도체는 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진, 나린제닌 및 나리루틴으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 가수분해하는 경우에 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 또는 나린제닌-7-O-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 플라보노이드 유도체는 글리코실화하는 경우에 G-나루리틴 또는 G-헤스페리딘 인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 대 나린제닌-7-O-글루코사이드은 4:1인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, G-나루리틴 대 G-헤스페리딘은 4:1인 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 알코올성 간질환 예방 조성물은 고순도로 추출하여 나리루틴의 쓴맛을 저감시키고 헤스페리딘의 수용성이 증가된 알코올성 간질환 예방 약학조성물 및 식품조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 플라보노이드를 글라이코실화하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 플라보노이드를 가수분해하는 과정을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 플라보노이드의 추출
제주산 무농약 감귤(학명: Citrus unshiu)을 (주)일해를 통하여 구입하여 과피를 분리한 후, 50℃ 드라이오븐에서 건조하여 그린더(grinder)로 분쇄하였으며 실험에 이용될 때까지 -18℃이하에서 보존하였다. 건조한 감귤과피 분말에 30배 용량(w/v)의 70% 에탄올을 첨가하여 초음파기기(ultrasonic processor, VCX-750, sonic&materials,Inc.)를 이용하여 30 ℃에서 10분간 추출하였다. 추출 후 원심분리(8000rpm, 10분)하여 고형분과 상등액을 분리 하였으며, 추출액에 동량의 헥산(hexane)을 첨가하여 카로테노이드(carotenoids)등의 지용성 성분을 제거하였다. 지용성 성분이 제거 후 40℃에서 회전 농축기(rotary evaporator)를 이용해 70% 에탄올이 남지 않도록 농축하였다.
실시예 2. 헤스페리딘 ( hesperidin ) 및 나리루틴(narirutin)의 분리
실시예 1의 용매를 제거하고 남은 추출물은 물로 재추출하여 수용성의 나리루틴을 용출하였으며, 여기서 불용성인 헤스페리딘을 분리하여 얻었다. 분리된 헤스페리딘은 증류수를 넣어 현탁시킨 후 NaOH를 첨가하여 pH 11.3으로 조정한 후, 건고 된 고형물을 완전히 녹였다. 다시 HCl을 첨가하여 pH 7.0으로 조정하고 12 ℃로 냉각하여 여과하였다. 여과하고 남은 고형분을 얻어 동결건조하여 감귤과피 90% 이상의 순도를 가진 헤스페리딘 추출물을 얻었다. 나리루틴이 용해되어 있는 물추출물에 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 에틸아세테이트층과 물층을 분리하였다. 얻어진 에틸아세테이트층의 용매를 감압농축기로 제거, 동결건조하여 약 70% 순도의 나리루틴 추출물을 얻었다.
실시예 3. 헤스페리딘 나리루틴의 체내이용성 증진을 위한 효소처리
플라보노이드는 주로 식물체에 글리코사이드(glycoside)의 형태로 결합되어 있는데, 나리루틴은 아글리콘(aglycon)인 나린제닌(naringenin)에 C7 위치에 루티노즈(rutinose)가 결합되어 있고 헤스페리딘(hesperidin)은 아글리콘(aglycon)인 헤스페레틴(hesperetin)에 루티노즈가 C7 위치에 결합되어 있다. 감귤껍질로부터 얻은 헤스페리딘은 특히 in vitro 실험에서 항산화, 지방저감화 효과, 항염증 효과 등을 보고한 결과가 있으나 배당체의 경우에는 수용성 아니어서 식품에 적용하기 힘들며 체내흡수를 위하여서도 어느정도 수용화가 이루어져야 한다는 단점이 있다. 한편 나리루틴은 수용성이어서 식품적용에 유리하나 지나치게 쓴맛이 강하여 어떠한 형태든지 쓴맛감소를 위한 처리가 필요하기 때문에 효소를 이용한 두 가지 실험을 시행하였다. 우선, 용해도 향상을 통해 식품소재 이용을 용이하게 하기 위하여 당 전이 반응(glycosylation)을 유도 시켰고, 두 번째로 헤스페리디나아제(hesperidinase)를 이용해 루티노즈에서 람노스를 제거하는 반응(derhamnosylation)을 실시하였다.
3-1. 헤스페리딘 나리루틴의 글리코실화
감귤 과피로부터 얻은 헤스페리딘과 나리루틴의 수용화 및 체내흡수력의 증진을 위하여 사이클로덱스트린과 CGTase를 이용하여 글리코실화 플라보노이드(glycosylated flavonoid)를 제조하였다. 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘과 나리루틴 추출물 각각 1g을 1L의 증류수에 현탁시킨 후 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin)을 3g가하고 70 ℃로 가온하여 베타-사이클로덱스트린을 용해시켰다. 헤스페리딘 추출물의 경우 베타-사이클로덱스트린으로 포접된 헤스페리딘함유액에 HCl을 첨가하여 pH 4.9기 되게 조정하고 12 ℃ 냉각후 여과하였다. 냉각하여 생긴 침전물을 여과하여 제거하고 여액을 얻었다. 얻어진 여액에 15% NaOH용액을 첨가하여 pH 5.5로 조정한 후 사이클로덱스트린 전이효소(CGTase)의 일종인 토루자임(Toruzyme®)을 0.1ml 첨가하여 60℃로 하루밤 동안 당전이 반응을 유도하였다. 나리루틴 추출물의 경우 수용성의 성질을 가지고 있기 때문에 pH조절을 통한 용해도 증가 과정은 생략되었으며 토루자임을 1ml 첨가하여 60℃에서 3시간 동안 반응시켜 당전이 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 후 반응액은 90℃ 이상의 온도로 5분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 다공성 흡착수지인 앰버라이트(Amberite) XAD-7HP를 이용하여 당전이 반응에 이용되지 않고 남은 사이클로덱스트린을 제거하였다.
3-2. 헤스페리딘 나리루틴의 가수분해( derhamnosylation )
헤스페리딘, 나리루틴 추출물의 체내흡수력 증진을 위한 방법으로 헤스페리디나아제를 이용한 효소반응 생성물을 제조하였다. 헤스페리딘 추출물 1mg/ml의 농도로 pH 3.8로 조정된 DW에 용해시킨 후 효소 0.0625mg/ml의 헤스페리디나아제와 반응하였다. 또한 나리루틴 추출물의 경우 2mg/ml의 농도로 pH 3.8로 조정된 DW에 용해시킨 후 효소 0.0625mg/ml의 헤스페리디나아제와 반응하여 결과물을 얻었다(헤스페레틴-7-O-글루코사이드 및 나린제닌-7-O-글루코사이드). 효소반응은 각각 40 ℃에서 1h반응 시킨 후 얻어졌으며 반응이 끝난 후 반응액은 90 ℃ 이상의 온도로 5분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다.
실시예 4. 헤스페리딘 나리루틴의 알코올성 간질환 억제 효능 측정
본 실험을 통해 얻어진 헤스페리딘과 나리루틴 추출물, 당화과정을 통해 얻어진 G-헤스페리딘과 G-나리루틴 및 효소 처리된 헤스페리딘과 나리루틴의 체내흡수정도에 따른 알콜성 간질환 억제 효능을 알아보기 위해 세군으로 나누어 지방간 생성 억제 동물 실험을 진행하였다. 각각 처리된 헤스페리딘과 나리루틴의 추출물은 4:1의 비율로 혼합되어 동물실험에 사용되었다. 
  1) 동물식이
  동물실험에 사용된 식이는 미국영양학회(American Institute of Nutrition, AIN)가 추천하는 액체형 지방간 유도 식이[중앙실험동물(주)]를 사용하였다. 이 Lieber-DeCarli 식이는 지방간을 효과적으로 유도하기 위해서 옥수수유를 첨가하여 지방의 함량이 상향 조정되었다. 이 액체 식이는 기본적으로 1kcal/mL 농도로 열량을 함유하며, 이 열량은 41.36%가 지방에서 나오며, 4.8%가 탄수화물, 18.07%가 단백질 그리고 실험군의 경우, 36%가 에탄올에서 공급하도록 조성되었다. 각 실험군에 대하여 최종적으로 조성된 식이표는 다음 표 1과 같다.
구성 요소 Amount (g/L)
대조군 에탄올 에탄올 +
플라보노이드
에탄올 +
G-플라보노이드
에탄올 +
D-플라보노이드
카세인 41.4 41.4 41.4 41.4 41.4
L-시스틴 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
DL-메티오닌 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
옥수수유 15.7 15.7 15.7 15.7 15.7
올리브유 28.4 28.4 28.4 28.4 28.4
홍화유 2.7 2.7 2.7 2.7 2.7
말토오스 덱스트린 99.2 8.7 8.7 8.7 8.7
셀룰로스 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
미네랄 혼합물 8.8 8.8 8.8 8.8 8.8
비타민 혼합물 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
콜린 비타레이트 (Choline Bitarrate) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
잔탄검 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
에탄올(mL) - 41 41 41 41
Dried sample - - 60 60 60
2) 동물사육
실험에 사용된 동물은 8주령(체중 279.2 ± 6.9g) 수컷 스프라그-다우리 랫트 (Harlan Sprague Dawley, Inc, (주)중앙실험동물)를 구입하여 6주 동안 동물사육실(실내온도 22 ± 2℃, 상대습도 55 ± 5%, 12 h light-dark cycle)에서 개인별 cage로 자유롭게 공급된 증류수와 표준식이로 Lieber-DeCarli 액체식이 공급 시까지 사육을 하였다. 체중에 따른 난괴법으로 9마리씩 4군으로 나누어, 약 7일 동안 Lieber-DeCarli 액체 표준식이에 적응시켰다. Lieber-DeCarli 액체 표준식이만 공급받는 동물군을 대조군으로 하였으며, 대조군 표준식이의 탄수화물(maltose dextrin) 대신에 에탄올에 의한 열량 보충으로 대조군과 열량적으로 같은 액체식이를 공급받는 동물군을 에탄올군(ethanol), 당화처리된헤스페리딘, 나리루틴 추출물군, 효소처리된 헤스페리딘, 나리루틴 추출물군으로 하였다. 이러한 조건 하에서 Lieber-DeCarli 액체식이가 매일 70 mL씩 6주 동안 모든 동물군에 실험이 끝날 때까지 공급되었다.
3) 체중 증가량 측정과 혈청 및 조직 시료 채취
동물의 체중 변화량을 측정하기 위해서 매주 각 동물의 체중을 정해진 시간에 6 주에 걸쳐 측정하였다. 그리고 혈액의 각종 지방의 변화를 측정하기 위해서 안구혈액채취법 (retroorbital sinus bleeding)을 이용, Lieber-DeCarli 액체식이가 공급하기 직전(0 주)에, 그리고 3 주 째, 그리고 마지막으로 동물을 희생시키면서 6 주 째 시점에서 혈액을 모든 동물에서 채취하였다. 채취된 혈액은 혈액응고 시간을 가진 후에 원심분리기(2,000 x g for 10 min)를 이용, 혈청시료를 분리하였다. 분리된 혈청으로 즉각 HDL-콜레스테롤을 분석하였으며, 나머지 혈청은 기타 성분 분석 시까지 -70℃에 보관하였다. 혈액 채취 시에는 약 12시간 절식되었으며, 이때 물만 공급되었다. 6주 째, 혈액 채취 직후, 당화, 효소 처리에 따른 헤스페리딘, 나리루틴 추출물의 투여가 장기 무게에 미치는 영향을 측정하기 위해서 각 동물의 주요 장기를 적출하였다.
4) 혈청 지방 및 지방간 주요 표지자( biomarkers ) 분석
혈청의 중성지방(triglycerides) 농도는 효소비색법을 이용한 kit(아산제약)을 사용해서, 발색을 시킨 후에 500 nm에서 흡광도를 측정, 양을 계산하였다. Non HDL-콜레스테롤 계산은 총 콜레스테롤에서 HDL-콜레스테롤을 뺀 값으로 계산되었다. 혈청 중에 존재하는 GOT와 GPT의 농도 측정은 효소비색법(Reitman-Frankel법)을 이용한 kit((주)아산제약)을 이용, 혈청시료 0.10 mL에 조제한 반응시약을 첨가하여 흡광도를 측정하였으며, 표준 GOT 또는 GPT 농도는 표준곡선용 시액을 이용하여 시료와 동일한 조건에서 발색시켜 흡광도를 측정, 농도를 계산하였다(아산제약 Manual, (주)아산제약).
5) 간 조직 사진촬영을 통한 분석( hepatic histology )
지방간 증상 정도 측정을 위한 간조직 사진촬영은 영남대학교 의과대학 해부학실에서 이루어졌다. 6주째 각 동물군에서 평균 체중에 가장 근접한 한 동물의 간을 조직 분석에 이용되었다. 간조직은 먼저 급동결된 후 약 5-10㎛ 두께로 절편되었다. 절편된 조각은 헤파톡시린, 에오신, 오일 레드 O 시약으로 염색하였다.
6) 간 지질의 추출 및 간 조직의 알파-토코페롤(α- tocopherol )과 총 콜레스테롤 측정
간 지질은 약 500 mg 균질화된 간 시료로부터 클로로포름: 메탄올(v/v, BHT 151.3 μmol /L) 혼합 유기용매 방법으로 추출하였으며, 유기용매 제거 후(N-EVAPTM 111, Organomation Associates Inc., MA, USA), 총지방량(total lipid)을 측정하였다. 추출된 간조직 지방을 직접 이용, 질소농축기로 40℃의 조건에서 유기용매를 증발시키고 클로로포름:메탄올 혼합물(1:5, v/v) 500 μL를 넣어 균질화 시킨 후 HPLC 분석하였다. 사용된 HPLC 컬럼은 40°C로 유지된 역상 컬럼(Alltima C18, 5 μm, 4.6 x 150 mm, Alltech Associates, Inc., IL, USA)으로, Beckman System Gold software(Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA)을 겸비한 장치에 연결되었다. 이동상은 100% 메탄올(2 mL/min)이었고 UV 295 nm에서 분석되었다.
7) 통계처리 및 결과 처리
실험의 결과들은 평균치와 표준편차(means ± SD)로 나타내었고, SPSS 패키지 프로그램 소프트웨어(package program software)를 이용하여 ANOVA로 검증한 후, p < 0.05 수준에서 던칸의 멀티플 레인지 테스트(Duncan's multiple range test)로 비교, 분석하였다.
실시예 5. 헤스페리딘 나리루틴의 알코올성 간질환 억제 효능 측정 결과
1) 체중증가 측정 결과
알콜성 지방간 생성유도 식이인 Liber-DeCali를 식이로 섭취시킨 SD rat을 이용하여 6주간 실시한 결과 알콜이 함유되지 않은 Liber-DeCarli식이를 섭취한 군(normal)에서보다 알콜을 함유한 식이를 섭취한 군에서 체중이 초기부터 낮아지기 시작하였으며 플라보노이드의 섭취는 체중저하에 별다른 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다.
2) 혈청 지방 및 지방간 주요 표지자( biomarkers ) 분석 결과
6주 동안 플라보노이드의 공급이 간 조직 손상과 관련된 지방간의 혈청 표지자인 GOT와 GPT, ALP, GTP 등의 농도변화에 미치는 영향은 표 2에 나타내었으며, 공통적으로 에탄올 섭취군에서 간손상 정도가 가장 심하였다. 플라보노이드를 알콜과 같이 섭취한 군들에서는 유의적으로 이들 지표농도가 에탄올만 섭취한 군에 비해 낮았으며, 특히 G-플라보노이드와 플라보노이드-7-glc 섭취군에서 플라보노이드 섭취군에 비해 간 손상정도가 미약한 경향을 보여, 플라보노이드의 변형공정이 간조직의 손상 완화시키는 효능이 있는 것으로 사료된다(표 2). 
Serum biomarker 대조군 에탄올 플라보노이드 G-플라보노이드 플라보노이드-7-glc
GOT, U/L 38.18±5.58d 90.52±9.35a 54.78±9.84b 51.15±10.62bc 43.01±6.20cd
GPT, U/L 6.79±2.12c 29.93±8.06a 27.29±5.17a 18.09±3.50b 18.13±3.78b
ALP, K-A 30.15±4.0b 46.88±8.87a 38.86±8.31ab 31.52±5.18b 30.34±4.0b
GTP, U/L 2.14±0.46b 4.72±1.47a 3.84±0.92ab 3.43±0.79ab 3.49±0.49ab
3) 간 조직 사진촬영을 통한 분석( hepatic histology )
에탄올 섭취군에서는 붉은색으로 염색된 지방구(lipid droplets)의 형성이 선명히 관찰되었으며, 헤스페리딘과 나리루틴을 에탄올과 같이 섭취한 군에서는 에탄올군에 비해 지방구 형성이 아직 활발히 일어나지 않고 있는 것으로 관찰 되었다. 글리코실화 공정을 거친 플라보노이드 섭취군에서는 아직 지방구의 형성이 관찰되지 않은 상태였으며, 더함노시데이션(derhamnosidation) 공정을 거친 플라보노이드를 섭취한 군에서는 지방구의 형성이 관찰되었지만 에탄올군에 비해 지방구의 크기가 감소하였음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 앞의 간조직의 지방함량이나 지방산 함량의 비교에서 알 수 있었듯이 글리코실화나 de-rhamnosidation공정은 플라보노이드의 알콜성 지방간 생성 억제효능의 개선에 유용하게 활용될 수 있는 공정으로 간주된다.
4) 간 지질의 추출 및 간 조직의 α- tocopherol 과 총 콜레스테롤 측정
G-헤스페리딘/나리루틴과 헤스페리틴/나리제닌-7-glc의 섭취가 알콜성 지방간 형성에 미치는 영향을 알아본 결과는 표 과 같다. 실험결과 대조군과 비교하였을 때 비록 간의 무게는 감소하지만 에탄올 식이군의 간조직에서 총콜레스테롤, 총 지질 함량이 유의적으로 증가하는 것으로 관찰되었다(P < 0.05). 또한 에탄올과 플라보노이드를 동시에 식이한 군과 에탄올 식이군을 비교하였을 때 플라보노이드를 섭취함으로서 총콜레스테롤에는 큰 유의적 차이가 없었지만, 총 지질의 함량은 현저히 감소함을 알 수 있었다. 에탄올과 함께 플라보노이드 무처리군을 동시에 섭취하였을 때 보다 글리코실화 처리한 플라보노이드 또는 de-rhamnosidation 처리한 플라보노이드를 섭취하였을 때, 간지질 함량이 유의적으로 감소하여 이들 변형공정을 통하여 제조된 헤스페리딘과 나리루틴이 알콜성 지방간 형성억제에 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
Figure 112012088306439-pat00001
표 4는 간조직의 지방층에 존재하는 지방산 함량을 나타내고 있다. 앞의 간지질 함량에서 알 수 있듯이, 콜레스테롤과 TG, 인지질에 구성원으로 존재하는 지방산의 함량이 통상 다이어트 식이군에 비해 알콜식이군에서는 현저히 증가함을 알 수 있었다. 그리고 대체적으로 헤스페리딘과 나리루틴을 에탄올과 같이 투여한 군 보다 글리코실화나 de-rhamnosidation의 공정을 거친 플라보노이드를 섭취한 그룹에서 이들 지방산의 함량이 저하됨을 알 수 있었다.
Figure 112012088306439-pat00002
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

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  4. 헤스페레틴-7-O-글루코사이드 및 나린제닌-7-O-글루코사이드를 각각 4:1의 중량비로 포함하는 알코올성 간질환 예방 및 치료용 약학조성물.
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