KR101290803B1 - 단일 스트로를 이용한 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식 방법 - Google Patents

단일 스트로를 이용한 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식 방법 Download PDF

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KR101290803B1
KR101290803B1 KR1020120031959A KR20120031959A KR101290803B1 KR 101290803 B1 KR101290803 B1 KR 101290803B1 KR 1020120031959 A KR1020120031959 A KR 1020120031959A KR 20120031959 A KR20120031959 A KR 20120031959A KR 101290803 B1 KR101290803 B1 KR 101290803B1
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허영태
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 세포동결용 스트로를 이용하여 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식을 통합하여 행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 스트로에 해동액을 충전하고 이 해동액과 거리를 두어 수정란이 적하되도록 함으로써, 수정란의 동결, 해동 및 이식 과정 모두가 하나의 스트로를 이용하여 가능케 하고, 수정란의 동결, 해동 및 이식 과정을 하나의 스트로를 이용하여 가능하므로 번거로운 과정이 간결하게 진행되어 시간 및 비용을 절감할 수 있으며, 수정란의 동결 및 해동이 짧은 시간안에 이루어져 동결 및 해동으로 인한 수정란의 손상을 줄여 이식 후 산자율을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 매우 간단한 구조의 스트로를 이용하여 간소화된 절차로 수정란의 이식이 가능하므로, 수정란 이식 현장에서 고가의 현미경의 사용이나 숙련된 기술자의 도움 없이 수정란 이식을 행할 수 있는 이점이 있다.

Description

단일 스트로를 이용한 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식 방법{Method for Freezing, Thawing and Transferring of Mammalian Fertilized Embryo Using Single General Straw}
본 발명은 스트로(straw)를 이용하여 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 세포 동결용 스트로를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 동결하고, 해동 및 이식을 통합하여 행할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 포유동물 수정란의 동결은 항동해제가 첨가된 고장액을 제1단계 내지 제3단계의 단계별로 처리하여 수분을 제거하고, 전자현미경 구리 그리드(electron copper grid) 표면에 적하, OPS에 주입 장착, 얇은 필름으로 구성된 crytop 제품에 수정란을 함유한 동결액을 마이크로리터 수준의 최소 용량으로 적하하는 등의 방법으로 실시한다. 또한, 동결된 수정란의 해동은 해동 수조에 동결 용기를 침지하거나, 일정한 농도와 온도의 고장액에 단계별로 침지하여 수행한다. 또한, 동결 및 해동된 수정란을 대리모에 이식하기 위해서는 융해된 수정란을 다시 이식용 플라스틱 스트로(embryo transfer plastic straw)에 장착하여 실시하기 때문에 동결, 해동 및 이식의 복잡한 과정을 수행하여 하며, 이를 위해 숙련된 전문인력의 기술과 멸균 환경, 고가의 현미경, 항온 수조, 다양한 수정란 보존 기구 등의 부수적인 시설과 장비들이 필수적으로 요구된다. 따라서, 비록 우수한 유전형질의 수정란을 다수 확보하여 동결 보존하였을지라도, 이러한 복잡한 동결 및 해동과정, 전문인력의 부족, 고가의 시설 및 장비의 필요성으로 인해 농가에서 쉽게 동결 수정란을 대리모에 이식하기에는 제약이 따른다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0123340호에는 스트로 형태의 이식기구에 수정란을 흡인한 후 대리모의 난관에 이식하는 방법이 개시되어 있으나, 이 방법에는 수정란의 동결과 이식시에 동결된 수정란을 해동시키는 과정을 위해 스트로를 사용하는 방법에 대해서는 개시하고 있지 않다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0874875호에는 이식용 스트로내에서 공기층과 수정란층 등의 구역별로 나누어 수정란을 장착하고, 특히 상기 스트로내의 특정 구역에 수정란의 착상을 돕기 위해 착상증진물질을 흡인시킨 후 이를 사용하여 수정란을 이식하는 방법이 개시되어 있으나, 스트로를 이용한 동결 방법에 대해서는 개시되어 잇지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0123340호 대한민국 등록특허 제10-0874875호
본 발명자들은 수정란의 동결, 해동 및 이식의 간편성, 신속성 및 비용 절감을 위해 하나의 용기를 사용하여 포유류 수정란의 동결, 해동 및 이식을 모두 통합하여 행할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 세포 동결용 스트로에 해동액과 함께 수정란을 일정한 위치에 적하시켜 액체질소에 동결시키고, 수정란 이식 시에 상기 스트로를 액체질소로부터 꺼내어 체온을 이용하여 해동시켜 이식에 곧 바로 사용할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 스트로를 이용한 포유동물의 수정란의 동결, 해동 및 이식을 통합하여 행하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식하는 방법을 제공한다: (a) 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 동결 전처리하는 단계; (b) 동결 전처리된 포유동물 수정란을 스트로(straw)에 적하(loading)하는 단계로서, 스트로 말단 - 면사심지 - 공기층 - 해동액 - 수정란 포함 동결액 - 스트로 말단의 순서로 적하하는 단계; (c) 포유동물 수정란 적하된 스트로를 액체질소에 침지하여 동결시키는 단계; (d) 동결된 스트로를 액체질소로부터 분리하여 체온을 이용하여 해동하는 단계; 및 (e) 해동된 스트로를 이용하여 포유동물 수정란을 이식하는 단계.
본 발명자들은 수정란의 동결, 해동 및 이식의 간편성, 신속성 및 비용 절감을 위해 하나의 용기를 사용하여 포유류 수정란의 동결, 해동 및 이식을 모두 통합하여 행할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 세포 동결용 스트로에 해동액과 함께 수정란을 일정한 위치에 적하시켜 액체질소에 동결시키고, 수정란 이식 시에 상기 스트로를 액체질소로부터 꺼내어 체온을 이용하여 해동시켜 이식에 곧 바로 사용할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세하게 설명한다.
단계 (a): 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 동결 전처리하는 단계
포유동물의 수정란을 스트로에 적하하기에 앞서 먼저 동결 전처리를 행한다. 동결전 처리는 동결에 앞서 수정란 세포내의 수분 제거와 삼투압 평형, 고장액에 노출전 저장액에 노출하여 고장액 접촉 충격을 줄이기 위함이며, 또한 동결시 세포내 수분 동결에 의해 발생되는 수정란 세포의 손상을 최소화하기 위해 행한다. 수정란의 동결 전처리는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있으며, 예컨대, 에틸렌글리콜 및 DMSO를 포함하는 용액하에서 수정란을 일정시간 노출시켜 삼투압에 의해 수정란 세포내의 수분을 제거하여 행한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면 7.5%의 에틸렌글리콜 및 7.5%의 DMSO를 포함하는 전처리 용액에 노출시키는 제1차 전처리 및 제1차 전처리한 수정란을 추가로 15%의 에틸렌글리콜 및 15%의 DMSO를 포함하는 용액에 노출시키는 제2차 전처리의 2단계로 행한다.
상기 제1차 전처리시에 전처리 용액에 노출시키는 시간은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 1-20분, 보다 바람직하게는 3-15분, 보다 더 바람직하게는 5-10분, 가장 바람직하게는 7분이다. 상기 제2차 전처리시에 용액에 노출시키는 시간은 바람직하게는 10초-5분, 보다 바람직하게는 30초-3분, 보다 더 바람직하게는 40초-2분이며, 가장 바람직하게는 1분이다.
본 발명의 방법에 적용될 수 있는 포유동물의 수정란은 인간을 제외한 포유동물의 수정란이며, 예를 들어 돼지, 양, 개, 소, 염소, 말, 쥐 등의 동물의 수정란을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (b): 동결 전처리된 포유동물 수정란을 스트로( straw )에 적하( loading)하는 단계로서, 스트로 말단 - 면사심지 - 공기층 - 해동액 - 수정란 포함 동결액 - 스트로 말단의 순서로 적하하는 단계
상기 단계 (a)를 거쳐 동결 전처리한 포유동물 수정란을 스트로(straw)에 적하한다.
본 발명에서 사용되는 수정란 적하용 스트로는 0.25㎖ 세포동결용 스트로, 0.5㎖ 세포동결용 스트로, GMP 스트로 또는 OPS 스트로를 사용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 0.25㎖ 세포동결용 스트로를 사용한다.
상기 스트로는 EO(Ethylene Oxide) 가스, 고압, 자외선 또는 감마광선을 이용하여 멸균하여 사용한다. 본 발명에서 사용되는 스트로는 바람직하게는 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 한쪽 말단 내부에 면사심지(1)가 내포되어 있다.
스트로의 내부로 공기층(2) 및 해동액(3)의 흡인은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 행할 수 있으며, 예를 들어 튜버쿠린 시린지(tuberculin syringe, 1 ㎖)를 스트로의 면사심지가 내포된 쪽의 일 말단에 장착하여 공기 및 해동액을 흡인하여 행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명에서 스트로는 0.25㎖ 세포동결용 스트로를 사용한다.
상기 스트로의 면사심지 내부에는 스트로 파우더가 충진되어 있으며, 스트로의 면사심지가 내포된 쪽의 일 말단에 장착된 주사기를 사용하여 0.25㎖ 스트로의 경우 약 0.5 - 1.5cm 길이에 해당하는 용량의 해동액을 흡인하여 면사심지 안쪽에 충진되어 있는 스트로 파우더에 흡수시킬 수 있다. 이 경우 해동액을 흡수한 스트로 파우더는 면사심지 내부에서 부피가 팽창되고 견고하게 굳게 되어 스트로의 말단이 밀봉되는 효과를 얻는다.
상기 해동액은 0.1 - 1 M 농도의 수크로오스를 포함하는 10% FBS (Fetal Bovine Serum)이 첨가된 PBS(Phosphate buffered saline)이다. 상기 해동액 내의 수크로오스의 농도는 보다 바람직하게는 0.1 - 0.5 M, 보다 더 바람직하게는 0.1 - 0.3 M이다.
이어서, 스트로의 면사심지로부터 0.5 - 1.5 cm 길이의 공기층(2)이 형성되도록 공기층을 흡인하고, 상기 공기층으로부터 5 - 8cm 길이, 보다 바람직하게는 6 - 7cm 길이를 차지하도록 해동액(3)을 흡인하여 충전시킨다.
상기 해동액은 상술된 바와 같이 10% FBS 및 수크로오스가 첨가된 PBS(Phosphate buffered saline)이며, 해동액내의 수크로오스의 농도는 바람직하게는 0.1 - 1 M, 보다 바람직하게는 0.1 - 0.5 M, 보다 더 바람직하게는 0.1 - 0.3 M이다.
해동액을 스트로에서 동결난자의 근접한 위치에 적하함으로써, 동결된 수정란이 융해되는 때에 동결전 수분이 제거된 수정란에 수분을 신속하게 공급할 수 있어 융해되는 수정란의 회복을 용이하게 한다.
마지막으로, 수정란을 포함하는 동결액(4)을 스트로의 입구(5)로부터, 1 - 4cm 떨어진 위치, 보다 바람직하게는 1 - 3 cm 떨어진 위치, 보다 더 바람직하게는 1 - 2 cm 떨어진 위치에 오도록 적하한다. 또한, 상기 수정란을 포함하는 동결액(4)은 해동액(3)으로부터 바람직하게는 1 - 4cm, 보다 바람직하게는 1 - 3 cm, 보다 더 바람직하게는 1 - 2 cm 떨어져 위치하도록 적하한다.
스트로 입구에 수정란을 적하하는 방법은 Pasture pipette을 이용하여 행할 수 있다.
수정란을 포함하는 동결액은 당업계에 공지되어 있는 수정란 동결용 용액을 적합하게 변형시켜 사용할 수 있으며, 예를 들어, 15% 에틸렌글리콜, 7.5% DMSO 및 10% FBS를 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline)을 사용할 수 있다.
적하되는 수정란 포함 동결액의 양은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 0.1 - 10㎕, 보다 바람직하게는 0.2 - 5㎕이며, 보다 더 바람직하게는 0.3 - 3㎕이며, 가장 바람직하게는 1 ㎕이다. 본 발명에서 수정란 포함 동결액의 부피가 매우 적으므로, 동결과 융해가 신속하게 일어나 동결 및 융해로 인한 수정란의 손상이 최소화된다.
적하되는 동결액에 포함되는 수정란의 개수는 어떠한 포유동물의 수정란인지에 따라 달라질 수 있으며, 예컨대 생쥐의 수정란인 경우 10개 내외, 소의 수정란인 경우 2-3개의 수정란이 적하되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 해동액 및 수정란 포함 동결액이 적하가 완료된 스트로의 구성은 도 2에 모식적으로 나타난 바와 같다.
단계 (c): 포유동물 수정란 적하된 스트로를 액체질소에 침지하여 동결시키는 단계
수정란 적하가 완료된 스트로를 액체질소에 침지시켜 동결시킨다. 액체질소에 동결시키는 방법은 스트로를 수직으로 세운 후 면사심지 부분이 먼저 액체질소에 접촉되도록 한 후 스트로의 50% 가량을 액체질소에 약 5초간 침지한다. 이후, 스트로 전체를 액체질소에 수평으로 침지한다. 본 발명의 스트로에는 소량의 동결액에 수정란이 포함되어 있어 수정란의 동결이 신속하게 이루어짐으로써 동결로 인한 수정란의 손상을 최소화할 수 있다.
단계 (d): 동결된 스트로를 액체질소로부터 분리하여 체온을 이용하여 해동하는 단계
수정란을 이식에 사용하기 위해, 동결된 스트로를 액체질소로부터 꺼내어 체온을 이용하여 해동한다. 본 발명에서 동결된 스트로의 해동은 특별한 형태의 항온수조나 기구 등의 도움 없이 체온을 이용하여 행하며, 바람직하게는 동결 스트로를 손으로 잠시 동안 쥐어 해동시킨다. 스트로의 해동시에 항온수조와 같은 특별한 기구가 필요하지 않으므로, 후속단계인 수정란의 이식을 간편하고 신속하게 진행할 수 있으며, 숙련된 전문가의 도움 없이도 수정란 이식을 용이하게 완료할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면 수정란을 포함하는 동결액이 소량이므로 동결 및 해동이 신속하게 이루어져 동결 및 해동으로 인한 수정란의 손상을 최소화하여 산자의 발생율을 크게 향상시킬 수 있다.
단계 (e): 해동된 스트로를 이용하여 포유동물 수정란을 이식하는 단계
수정란의 이식은 해동된 스트로를 이식기에 장착하여 행한다. 상기 이식기는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 시린지(syringe) 타입의 이식기를 스트로의 면사심지쪽 말단에 끼우고 수정란의 이식 작업을 행할 수 있다.
본 발명은 세포동결용 스트로를 이용하여 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식을 통합하여 행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이점은 다음과 같다.
(i) 본 발명의 방법은 스트로에 해동액을 충전하고 이 해동액과 거리를 두어 수정란이 적하되도록 함으로써, 수정란의 동결, 해동 및 이식 과정 모두가 하나의 스트로를 이용하여 가능케 한다.
(ⅱ) 본 발명의 방법에 의하면 수정란의 동결, 해동 및 이식 과정을 하나의 스트로를 이용하여 가능하므로 번거로운 과정이 간결하게 진행되어 시간 및 비용을 절감할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 방법에 의하면 수정란의 동결 및 해동이 짧은 시간 안에 이루어져 동결 및 해동으로 인한 수정란의 손상을 줄여 이식 후 산자율을 크게 향상시킬 수 있다.
(ⅳ) 특히, 본 발명의 방법에 의하면 상술된 바와 같이 매우 간단한 구조의 스트로를 이용하여 간소화된 절차로 수정란의 이식이 가능하므로, 수정란 이식 현장에서 고가의 현미경의 사용이나 숙련된 기술자의 도움 없이 수정란 이식을 행할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 수정란의 동결, 해동 및 이식 방법에 사용되는 스트로(straw)의 구조를 보여주는 도면이다.
도 2는 해동액 및 수정란을 포함하는 동결액이 스트로에 흡인되어 적하된 형태를 보여주는 도면이다. 1: 면사심지, 2: 공기층, 3: 해동액(융해액), 4: 수정란을 포함하는 동결액, 5: 스트로입구 이다.
도 3은 소 수정란의 동결전 처리에 따라 수정란이 탈수되고 세포의 형태가 변화되는 모습을 관찰한 사진이다.
도 4는 스트로에 수정란의 적하 및 동결 처리하는 과정을 보여준다. 패널 1은 시린지를 스트로에 결합하여 해동액(융해액)을 스트로에 장착하는 과정으로서, 면사심지를 융해액으로 적시고 융해액을 충전하기 위해 중간에 공기층을 흡인하여 형성한다. 패널 2는 면사심지에서 약 0.5cm 가량의 공기층을 만든 후 융해액을 6cm 가량 충전한 모습을 보여준다. 패널 3은 스트로 앞부분의 빈공간에 Pasture pipette을 이용하여 수정란이 포함된 1μl의 동결액을 적하시키는 모습이다. 패널 4는 스트로에 적하된 수정란이 포함된 동결액을 현미경으로 확대하여 관찰한 사진이다. 패널 5는 수정란 적하를 완료한 사진이다. 패널 6은 액체질소에 스트로를 침지하는 모습을 보여주는 사진이다.
도 5는 수정란 이식을 위해 상기 동결된 스트로를 액체질소에 꺼내어 손을 사용하여 동결된 수정란을 융해시키는 모습을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 수정란의 동결전처리
소의 수정란을 7.5% 에틸렌글리콜(EG, ethylene glycole), 7.5% DMSO 및 10% FBS를 포함하는 PBS(phosphate buffered saline)에 7분간 노출시키고, 이어서 15% 에틸렌글리콜, 15% DMSO, 및 10% FBS를 포함하는 PBS에 1분간 노출시켜 수정란의 수분을 제거하였다. 이와 같은 동결전 처리에 따라 수정란이 탈수되고 세포의 형태가 변화되는 모습을 관찰하였으며, 수정란의 동결전 처리가 적절하게 수행되었음을 확인하였다(도 3 참조).
실시예 2 : 스트로에 수정란의 적하 및 동결 처리
0.25㎖ 세포동결용 스트로에 동결전 처리한 소의 수정란을 적하하였다. 먼저, 튜버쿠린 시린지(tuberculin syringe, 1 ㎖)를 스트로의 면사심지가 내포된 쪽의 일 말단에 장착하고, 시린지를 이용하여 동결 해동액(융해액)을 흡인하여 스트로에 적하하였다(도 4의 패널 1 참조). 구체적으로, 동결 해동액을 스트로 길이 약 1 cm로 흡인하여 면사심지를 적셨다. 이어서, 면사심지로부터 약 0.5cm 가량 떨어져 공기층을 형성시키도록 공기를 흡인한 후에 동결 해동액을 약 6cm 가량 길이의 양으로 적하하였다. 도 4의 패널 2에는 면사심지에서 약 0.5cm 가량의 공기층이 공기층을 적하한 후 융해액을 6cm 가량 길이로 충전한 모습을 보여준다.
이어서, 면사심지 반대편 말단 스트로의 입구 부분의 빈 공간에 Pasture pipette을 이용하여 소 수정란이 포함된 1μl의 동결액을 적하시켰다(도 4의 패널 3 참조). 도 4의 패널 4는 스트로에 적하된 수정란이 포함된 동결액을 현미경으로 확대하여 보여주는 사진이다. 수정란의 적하가 완료된 스트로(도 4의 패널 5)를 액체질소에 침지시켜 동결시켰다(도 4의 패널 6 참조).
실시예 3 : 동결된 스트로의 융해
수정란 이식을 위해 액체질소에서 동결된 스트로를 꺼내어 스트로 전체를 손으로 감싸 체온을 이용하여 융해시켰다(도 5 참조).
실시예 4 : 동결 수정란의 생존율 및 배아 이식율
상기 본 발명의 방법에 의해 융해된 수정란의 생존율과 이식 후 산자 생산율을 측정하였다. 아래의 표 1에 스트로에 적하한 해동액의 수크로오스 농도에 따른 동결된 수정란의 해동시 생존율을 측정한 결과와 배아 이식율(embryo transfer)을 측정한 결과를 나타내었다.
해동액의 수크로오스 농도에 따른 동결 수정란의 생존율 및 산자 생산율
수크로오스
농도
동결 수정란
개수
해동 수정란
개수
회수율(%) 생존율(%) 배아 이식율(%)
1 M 63 63 58(92.06) 34(58.62) 12(19.05)
0.5 M 59 59 56(94.91) 21(37.5) 14(23.73)
0.3 M 71 71 64(90.10) 35(54.68) 16(22.53)
0 M(PBS) 71 71 70(98.59) 25(35.7) 10(14.08)
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 수정란의 동결, 해동 및 이식 방법:
    (a) 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 동결 전처리하는 단계;
    (b) 동결 전처리된 포유동물 수정란 및 해동액을 스트로(straw)에 적하(loading)하는 단계로서, 스트로 말단 - 면사심지 - 공기층 - 해동액 - 수정란 포함 동결액 - 스트로 말단의 순서로 적하하는 단계;
    (c) 포유동물 수정란 적하된 스트로를 액체질소에 침지하여 동결시키는 단계;
    (d) 동결된 스트로를 액체질소로부터 분리하여 체온을 이용하여 해동하는 단계; 및
    (e) 해동된 스트로를 이용하여 포유동물 수정란을 이식하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 포유동물 수정란의 동결 전처리는 수정란을 에틸렌글리콜 및 DMSO을 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline)에 노출시켜 행하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 해동액은 0.1 - 1 M의 수크로오스를 포함하는 PBS (Phosphate buffered saline)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 동결액은 에틸렌글리콜, DMSO 및 FBS(Fetal Bovine Serum)을 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 스트로는 O.25㎖ 세포 동결용 스트로인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 스트로에서 상기 공기층은 0.5 - 1.5cm 길이를 차지하도록 적하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 스트로에서 상기 해동액은 5 - 8cm 길이를 차지하도록 적하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 스트로에서 상기 수정란 포함 동결액은 상기 해동액으로부터 1 - 4cm 떨어진 위치에 0.1 - 10㎕의 부피로 적하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 체온을 이용한 해동은 상기 동결된 스트로를 손으로 쥐어 해동하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 인간을 제외한 포유동물의 수정란은 돼지, 양, 개, 소, 염소, 말, 또는 쥐의 수정란인 것을 특징으로 하는 방법.
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