RU141452U1 - Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих - Google Patents
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих Download PDFInfo
- Publication number
- RU141452U1 RU141452U1 RU2013151446/10U RU2013151446U RU141452U1 RU 141452 U1 RU141452 U1 RU 141452U1 RU 2013151446/10 U RU2013151446/10 U RU 2013151446/10U RU 2013151446 U RU2013151446 U RU 2013151446U RU 141452 U1 RU141452 U1 RU 141452U1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- straw
- embryos
- vitrification
- liquid nitrogen
- oocytes
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих, состоящее из носителя открытого типа - полусоломинки, изготовленной путем отрезания косым срезом протяженностью около 1 см примерно половины соломинки для криоконсервации объемом 0,25 мл, стандартной затычки к ней (plug) и защитного чехла, изготовленного из соломинки для криоконсервации объемом 0,5 мл, отличающееся тем, что противоположный срезу открытый конец полусоломинки закрывают ее стандартной затычкой, непосредственно под которой в стенках полусоломинки прокалывают сквозное отверстие, а на расстоянии 1-2 см от затычки участок полусоломинки расплющивают в поперечном направлении.
Description
Криоконсервация эмбрионов широко используется как в промышленном скотоводстве в технологии трансплантации эмбрионов, так и для сохранения генетического потенциала исчезающих и редких пород. Объектами криоконсервации являются ооциты и эмбрионы не только коров, но и других сельскохозяйственных животных (свиньи, овцы, лошади). Методы криоконсервации широко применяются при работе с ооцитами и эмбрионами человека в клиниках, занимающихся экстракорпоральным оплодотворением. При этом эмбрионы коров нередко являются модельными объектами для апробации методик, разрабатываемых для эмбрионов человека (Kuwayama et al., 2005; Huang et al., 2007).
В настоящее время в целях криоконсервации все большее распространение получает метод витрификации, основанный на сверхбыстром охлаждении объекта, предварительно обработанного в растворах с высокой концентрацией криопротекторов. Признается, что витрификация является более щадящим и, соответственно, более эффективным по сравнению с программируемым медленным замораживанием методом криоконсервации, особенно при работе с такими высоко чувствительными к низким температурам объектами, как ооциты и получаемыми in vitro эмбрионы крупного рогатого скота.
Возможность проведения витрификации определяют три важнейших фактора:
1. Достижение максимально возможной скорости охлаждения объекта, порядка 15000-30000°C/мин.
2. Использование среды с высокой вязкостью, которая определяется концентрацией и свойствами отдельных веществ-криопротекторов (CP). Чем выше концентрация CP в среде, тем выше температура перехода в стекловидное тело (the glass transition temperature, Tg), за счет чего снижается возможность возникновения ядер льда (the chance of ice nucleation) и кристаллизации. Различные CP обладают различной способностью к проникновению через клеточные мембраны, цитотоксичностью, Tg.
3. Минимальный объем витрифицируемого объекта, менее 1 мкл.
Ультрабыстрое охлаждение и последующее отогревание основывается на прямом контакте объекта в минимальном объеме раствора криопротекторов с жидким азотом на этапе витрификации и со средой на этапе отогревания. Для достижения этих целей было разработано несколько моделей носителей с открытой поверхностью, из которых наиболее широко применяются устройства Cryotop®, Cryoleaf™, криопетли, сеточки для электронной микроскопии, полусоломинки (hemi-straw, HS) (Saragusty, Arav, 2011), которые позволяют контролировать нанесение капли минимального объема (1 мкл и меньше). Кроме того при использовании этих носителей достигается очень высокая скорость охлаждения за счет прямого контакта объекта с жидким азотом и высокая скорость нагревания, так как объект после извлечения из жидкого азота прямо погружается в раствор для отогревания. В свою очередь, использование минимальных объемов в сочетании с максимальной скоростью охлаждения позволяет снизить концентрацию криопротекторов в растворе витрификации и, соответственно, их цитотоксическое воздействие на эмбрионы. В целом показатели выживаемости эмбрионов при использовании разных носителей с открытой поверхностью получаются схожими, нет какого-то носителя, который давал бы достоверно лучшие результаты, чем остальные (Elnahas et al., 2010). Поэтому выбор носителя для витрификации зачастую зависит от его доступности, стоимости и удобства применения в условиях конкретной лаборатории. Cryotop®, Cryoleaf™, криопетли изготовляются фирмами-производителями. Они доступны для покупки, однако их стоимость очень высока. Модель полусоломинки (hemi-straw, HS) с контейнером была предложена Vanderzwalmen et al. (2000), а затем использовалась в нескольких модификациях (Liebermann, Tucker, 2002, 2004; Rao et al., 2012). При этом для изготовления системы HS использовались соломинки, разработанные и применяемые для криоконсервации биологического материала, то есть не токсичные, пригодные для использования в условиях сверх низких температур, не дорогие и вполне доступные.
Задача настоящей полезной модели - создание более надежного и удобного в использовании устройства для витрификации ооцитов и ранних эмбрионов млекопитающих.
ПРОТОТИП ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Прототипом нашей модели устройства для витрификации полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота являлась система полусоломинок, HS.
1. Модель полусоломинки (hemi-straw, HS) была предложена Vanderzwalmen et al. (2000), и в авторском варианте она действительно готовилась путем продольного среза протяженностью около одного сантиметра соломинки для криоконсервации объемом 0,25 мл (mini straw) с ее открытого конца (Vanderzwalmen et al., 2003). Полученная в результате среза открытая внутренняя поверхность полусоломинки позволяла размещать ооциты или эмбрионы в минимальном количестве (0,3 мкл) раствора для витрификации (vitrification solution, VS). Полусоломинку с находящимися на конце эмбрионами в VS немедленно опускали в жидкий азот. Затем при помощи пинцетов HS помещали в находящуюся в жидком азоте соломинку объемом 0,5 мл (medium straw), как в контейнер, и закрывали ее пробкой. Для отогревания эмбрионов HS под азотом при помощи пинцетов вытаскивали из соломинки-контейнера и ее конец с эмбрионом тут же помещали в раствор для отогревания.
2. В варианте Liebermann, Tucker (2002, 2004) открытый конец соломинки на 0,25 мл обрезали острым скальпелем наискосок таким образом, чтобы получился срез протяженностью около 1 см. Ооциты или эмбрионы в минимальном объеме VS помещают на самый кончик открытой внутренней поверхности среза соломинки. Соломинка с эмбрионом на конце среза немедленно опускается вертикально в жидкий азот и помещается в просвет находящейся в жидком азоте соломинки на 0,5 мл, как в контейнер. Соломинка, служащая контейнером, закрывается ее маркированной цветом затычкой (plug).
3. Rao et al. (2012) готовили носитель-полусоломинку также путем косого среза протяженностью около 1 см открытого конца соломинки на 0,25 мл. Эту соломинку вводили в среднюю соломинку на 0,5 мл с наружным диаметром 2,8 мм таким образом, что открытый конец HS мог двигаться внутрь и наружу этого чехла во время витрификации и нагревания. Судя по приведенной в работе фотографии, фиксация носителя в просвете соломинки на 0,5 мл достигалась за счет расплющивания небольшого участка полусоломинки, хотя описание не приводится.
СУЩНОСТЬ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих готовили из соломинок объемом 0,25 (mini straws) и 0,5 мл (medium straws), разработанных и применяемых для криоконсервации и хранения биологического материала в жидком азоте, и стандартных затычек (plugs; разного цвета для маркировки) к соломинкам на 0,25 мл.
Порядок изготовления устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Соломинку на 0,25 мл с открытого конца закрывают ее стандартной затычкой. При этом узкая часть затычки плотно входит в просвет соломинки примерно на 0,5 см, а широкая часть выступает за пределы соломинки примерно на 4 см и в дальнейшем служит ручкой при работе с устройством.
2. Держа в одной руке ручку-затычку, лезвием безопасной бритвы делают косой срез соломинки протяженностью около 1 см таким образом, чтобы отрезалась примерно половина соломинки. Отрезанную часть соломинки с фильтром выбрасывают. Внутренняя поверхность кончика среза оставшейся полусоломинки в дальнейшем служит для размещения эмбриона в минимальном количестве среды витрификации.
3. Вблизи затычки инъекционной иглой со шприцом на 1 мл прокалывают стенки полусоломинки насквозь. Шприц в данном случае служит удобной ручкой для инъекционной иглы.
4. На расстоянии 1-2 см от затычки полусоломинку расплющивают в поперечном направлении для образования блока фиксации. При использовании запаивателя CAS SNT-200 в режиме 0,5 стенки соломинки расплющиваются на небольшом протяжении, но ее просвет не запаивается.
5. При использовании носитель-полусоломинка с витрифицированным эмбрионом непосредственно в жидком азоте вставляется в соломинку на 0,5 мл и фиксируется в ней за счет узла фиксации - расплющенного участка. Таким образом, соломинка на 0,5 мл выполняет роль защитного чехла для носителя-полусоломинки.
6. В собранном виде модель представляет собой устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих.
Перечень фигур:
На рисунке 1 изображена схема устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих.
На рисунке 2 изображены исходные материалы для сборки устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих и устройство в сборе.
Схема проведения витрификации полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота при использовании устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Ванночку с жидким азотом помещают на столе рядом со стереомикроскопом.
2. На дно ванночки помещают соломинку на 0,5 мл, которая будет использована в качестве защитного чехла, и гоблет диаметром 13 мм (goblet; стандартный пластиковый цилиндр диаметром 9-13 мм, используемый для размещения соломинок при хранении в жидком азоте).
3. В жидкий азот помещают анатомический пинцет, оставляя его ручку выше уровня азота у края ванночки.
4. Эмбрион эквилибрируют в растворах с разной концентрацией криопротекторов в соответствии с принятым протоколом.
5. Эмбрион выдерживают в витрификационном растворе (vitrification solution, VS) в течение 20-30 секунд
6. Берут подготовленный носитель-полусоломинку, используя в качестве ручки наружную часть затычки.
7. Под стереомикроскопом эмбрион в минимальном количестве VS помещают на самый кончик среза на внутреннюю поверхность полусоломинки.
8. Незамедлительно кончик полусоломинки с эмбрионом в микрокапле VS опускают в жидкий азот.
9. При медленном покачивании продолжают опускать носитель вертикально в жидкий азот до уровня затычки.
10. При помощи пинцета берут соломинку на 0,5 мл, находящуюся в жидком азоте, и удерживают ее ниже уровня азота.
11. Носитель с эмбрионом вводят в просвет соломинки-чехла до упора ручки-затычки в верхний край соломинки-чехла.
12. Носитель-полусоломинку в защитном чехле, т.е. устройство для витрификации, с витрифицированным эмбрионом под азотом помещают в гоблет.
13. Для хранения гоблет размещают в жидком азоте в канистре в сосуде Дьюара.
Схема проведения отогревания эмбрионов, витрифицированных при использовании устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Ванночку с жидким азотом помещают на столе рядом со стереомикроскопом.
2. В ванночку с жидким азотом помещают 2 анатомических пинцета, оставляя их ручки выше уровня азота у края ванночки.
3. Устройство с витрифицированным эмбрионом, хранящимся в сосуде Дьюара, вместе с гоблетом переносят в жидком азоте и помещают в ванночку с жидким азотом.
4. При помощи пинцета устройство извлекают из гоблета, удерживая его ниже уровня жидкого азота.
5. Удерживая пробку-затычку одним пинцетом, извлекают соломинку-носитель из соломинки-чехла, которую придерживают вторым пинцетом.
6. Сохраняя соломинку-носитель под жидким азотом, переводят ее в вертикальное положение ручкой-затычкой вверх.
7. Не торопясь поднимают носитель вертикально, сохраняя только его нижний кончик с витрифицированным эмбрионом ниже уровня жидкого азота.
8. Быстро извлекают носитель из жидкого азота полностью и незамедлительно опускают его кончик с витрифицированным эмбрионом в чашку Петри, содержащую 3 мл среды отогревания TS при температуре 39°C.
9. При легком покачивании носителя эмбрион высвобождается в среду TS. В среде TS эмбрион выдерживают в течение 1 минуты.
10. Эмбрион проводят через систему растворов для разбавления и отмывания от криопротекторов в соответствии с принятым протоколом.
11. Отогретые эмбрионы помещают в предварительно эквилибрированную среду mSOF на культивирование. Через 24 и 48 часов в возрасте 8 и 9 D определяют количество живых эмбрионов, а также достигших стадии вылупляющейся и вылупившейся бластоцисты.
ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
РАБОЧИЕ РАСТВОРЫ
Среды были приготовлены на основе маточных растворов компонентов [Whittingham, 1971], хранящихся при 4 или -20°C. Перед использованием во все рабочие среды и растворы был добавлен гентамицин в количестве 40-50 мкг/мл. Дозревание ооцитов проводили в среде 199 с добавлением 0.66 мМ Na пирувата, 1 мМ L-глутамина, 0.6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл гонадотропина хорионического, 5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона, 1 мкг/мл эстрадиола-17β и 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS). Манипуляции с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами на воздухе проводили в модифицированной среде TALP-HEPES [Bavister, Yanagimachi, 1977] (ТН). Для оплодотворения использовали модифицированную среду TALP-Fert [Parrish et al., 1986, 1988] (TF). Приготовленные среды ТН и TF хранили при -20°C. Аликвоты сред размораживали однократно и использовали в течение недели. Аликвоты растворов РНЕ [penicillamine, hypotaurine, epinephrine; Bavister, 1989] и гепарина хранились при -20°C и размораживались непосредственно перед использованием. Культивирование эмбрионов проводили в среде mSOF [Tervit et al., 1972].
РАСТВОРЫ ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ И ОТОГРЕВАНИЯ ЭМБРИОНОВ
Базовый раствор для проведения витрификации эмбрионов составляла среда ТН с добавлением 20% FCS, обозначение ТН20.
1. Раствор для эквилибрации эмбрионов (equilibration solution, ES) состоял из ТН20 с добавлением 7,5% этиленгликоля (EG) и 7,5% DMSO.
2. Раствор для витрификации эмбрионов VS состоял из ТН20 с добавлением 15% EG, 15% DMSO и 0,5 М сахарозы.
3. Раствор для отогревания эмбрионов (thawing solution, TS) состоял из ТН20 с добавлением 1 М сахарозы.
4. Раствором для разбавления 1 (dilution solution 1, DS1) являлась среда ТН20, содержащая 0,5 М сахарозы
5. Раствором для разбавления 2 (DS2) являлась среда ТН20, содержащая 0,25 М сахарозы.
6. В качестве раствора для отмывания (washing solution, WS) использовалась базовая среда ТН20.
ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА IN VITRO
Яичники крупного рогатого скота получали на мясокомбинате и доставляли в лабораторию при температуре 26-30°C в течение 3-5 часов. Дозревание ооцитов проводили в CO2-инкубаторе при температуре 38.5°C в течение 22-23 часов. Для оплодотворения использовали криоконсервированное семя быка. Для выделения фракции подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред разбавления и криоконсервации семени, использовали метод swim up. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводили в течение 18-20 часов в CO2-инкубаторе при температуре 38,5°C. Полученные зиготы были освобождены от клеток кумулюса на Vortex в растворе гиалуронидазы и поставлены на культивирование в среде mSOF в атмосфере 5,6% CO2, 5,7% O2, 88,7% N2 в течение 7-12 дней. День постановки на оплодотворение считали нулевым (D 0).
ПРОВЕДЕНИЕ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Ванночку с жидким азотом помещали на столе рядом со стереомикроскопом. Для витрификации эмбрионы в возрасте 7 дней на стадии бластоцисты и расширенной бластоцисты последовательно проводили через растворы при комнатной температуре:
1. Отмывание 1 (WS) 3-5 минут
2. Отмывание 2 (WS) 3-5 минут
3. Эквилибрация (ES) 3-5 минут
4. Витрификация (VS) 20-30 секунд
Эмбрион в минимальном объеме VS помещали на кончик носителя и тут же опускали его в жидкий азот. При медленном покачивании продолжали опускать носитель вертикально в жидкий азот до уровня затычки. При этом жидкий азот заполняет полусоломинку, вытесняя воздух, который выходит через отверстия, сделанные иглой в стенках полусоломинки под затычкой. Затем носитель помещали в находящуюся в жидком азоте соломинку-защитный чехол, удерживая ее пинцетом. Полученный комплекс для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих с витрифицированным эмбрионом крупного рогатого скота помещали в гоблет и переносили для хранения в сосуд Дьюара.
ОТОГРЕВАНИЕ ВЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ
Гоблет с устройством для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих с витрифицированным эмбрионом крупного рогатого скота извлекали из сосуда Дьюара и в термосе с жидким азотом переносили в ванночку с жидким азотом, находящуюся на столе рядом со стереомикроскопом. Непосредственно в жидком азоте при помощи пинцетов снимали защитный чехол с полу соломинки-носителя. Удерживая за пробку-затычку, полусоломинку-носитель медленно поднимали вертикально, оставляя только его кончик с верифицированным эмбрионом ниже уровня жидкого азота. При этом просвет соломинки освобождается от жидкого азота и заполняется воздухом, который входит через отверстия в стенках под затычкой, тогда как верифицированный эмбрион все еще находится в жидком азоте. Затем быстро извлекали носитель из жидкого азота полностью, и незамедлительно опускали его кончик с витрифицированным эмбрионом в чашку Петри, содержащую 3 мл среды отогревания TS при температуре 39°C. В этом растворе эмбрион выдерживали в течение 1 минуты, после чего последовательно проводили через растворы для разбавления и отмывания от криопротекторов при комнатной температуре. Общая схема отогревания верифицированных эмбрионов крупного рогатого скота:
1. Отогревание (TS) 1 минута
2. Разбавление 1 (DS1) 3-5 минут
3. Разбавление 2 (DS2) 3-5 минут
4. Отмывание 1 (WS) 3-5 минут
5. Отмывание 2 (WS) 3-5 минут
Отогретые эмбрионы помещали в предварительно эквилибрированную среду mSOF на культивирование. Через 24 и 48 часов в возрасте 8 и 9 D, соответственно, определяли количество живых эмбрионов, а также достигших стадии вылупляющейся и вылупившейся бластоцисты.
ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Пример 1. Для апробации устройства вначале была проведена витрификация и отогревание бластоцист без помещения верифицированных эмбрионов на хранение в сосуд Дьюара. Отобрали 6 расширенных семидневных бластоцист хорошего качества и витрифицировали их, помещая по одной на полусоломинку-носитель. После выдержки в жидком азоте в течение 10-15 мин эмбрионы провели через систему растворов для отогревания и отмывания и поставили на культивирование в среде mSOF. Через 24 часа культивирования из 6 верифицированных бластоцист живыми были 4 (66,7%), из них 3 бластоцисты вышли из блестящей оболочки, еще одна находилась на стадии вылупления. Таким образом, процедуру витрификации и отогревания успешно перенесли 2/3 эмбрионов, при этом все выжившие эмбрионы при культивировании развивались нормально.
Пример 2. В следующем опыте для витрификации отобрали 6 эмбрионов в возрасте 7 суток: 3 на стадии расширенной бластоцисты, 1 на стадии бластоцисты, 2 на стадии ранней бластоцисты. Так как все эмбрионы были одного возраста, можно предположить, что их качество убывало от стадии расширенной до стадии ранней бластоцисты. Эмбрионы после витрификации и хранения в течение трех дней в жидком азоте были отогреты и поставлены на культивирование. Через 24 часа живыми были все 6 эмбрионов (100%). Более того, к этому времени все эмбрионы достигли стадии вылупляющейся бластоцисты, в том числе 1 бластоциста вышла из блестящей оболочки. В возрасте 9 суток живыми оставалось 5 эмбрионов (83,3%), в том числе 2 бластоцисты вышли из блестящей оболочки, остальные 3 эмбриона остановились в развитии на стадии вылупляющейся бластоцисты.
Пример 3. В последующих 2-х опытах было витрифицировано 15 бластоцист, которые были отогреты после хранения в жидком азоте от 4 до 11 дней. Через 24 часа после отогревания живыми были 100% витрифицированных бластоцист (15/15). В возрасте 9 суток 86,7% эмбрионов (13/15) оставались живыми, из них 69% бластоцист (9/13) достигли стадии вышедшей из блестящей оболочки бластоцисты.
Таким образом, при использовании разработанного устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих эмбрионы в процессе витрификации, хранения в жидком азоте и отогревания не теряются. Через 24 часа после отогревания и постановки на культивирование живыми оказываются до 100% полученных in vitro витрифицированных эмбрионов крупного рогатого скота. При последующем культивировании около 61% выживших эмбрионов достигают стадии вылупившейся из блестящей оболочки бластоцисты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих является простым в изготовлении и удобным при использовании. Для изготовления устройства используются соломинки объемом 0,25 (a French mini straw) и 0,5 мл (a French medium straw), применяемые для хранения биологического материала в жидком азоте, и стандартные затычки (plugs, разного цвета для маркировки) к соломинкам объемом 0,25 мл. Стандартная затычка к соломинке объемом 0,25 мл узкой частью, длина которой составляет около 6 мм, плотно входит и очень крепко удерживается в просвете соломинки. Выступающая часть затычки прочная, имеет длину около 4 см, диаметр 3 мм. Благодаря этому наружная часть затычки представляет собой удобную ручку, как при изготовлении носителя, так и на всех этапах витрификации и отогревания эмбрионов, включая погружение и извлечение носителя из жидкого азота. Цельно пластиковая затычка примерно в 3 раза тяжелее полой соломинки (0,3 г против 0,1 г, соответственно), а плотность ее материала превышает плотность жидкого азота (охлажденная затычка погружается на дно емкости с жидким азотом). Вследствие этого затычка, располагаясь на верху, препятствует всплыванию всего устройства в жидком азоте при его размещении на хранение в гоблете. Сочетание разных цветов затычки и гоблета может выполнять роль быстро различимых маркеров.
Сквозные отверстия, сделанные в стенках носителя под затычкой, позволяют жидкому азоту беспрепятственно заполнять весь объем полусоломинки на этапе витрификации при погружении носителя с эмбрионом вертикально в жидкий азот, что позволяет снизить ее плавучесть в жидком азоте. Эти же отверстия обеспечивают быстрое, спокойное (без турбулентности) и полное вытекание жидкого азота из просвета полусоломинки при ее извлечении ручкой-затычкой вверх вертикально из жидкого азота на этапе отогревания. Получить полное вытекание жидкого азота из полусоломинки на этом этапе очень важно, так как затем кончик носителя с эмбрионом должен быть моментально перемещен из под азота в чашку Петри с раствором для отогревания при 39°C.
На этапе витрификации носитель под жидким азотом мягко входит в соломинку на 0,5 мл до упора внешней широкой части затычки полусоломинки в края соломинки-чехла. При этом расплющенный участок носителя, упираясь изнутри в стенки соломинки-чехла большего диаметра, выполняет роль фиксатора и удерживает носитель в ее просвете. При использовании даже простейшего запаивателя легко подобрать режим, который обеспечивает однотипное расплющивание стенок носителя-полусоломинки, необходимое и достаточное для фиксации в соломинке-чехле.
Использование соломинки на 0,5 мл в качестве чехла позволяет надежно защитить носитель с верифицированным эмбрионом, размещенным на открытой поверхности, от возможных случайных механических воздействий.
Для хранения эмбрионов устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих размещается в сосудах с жидким азотом аналогично обычным соломинкам при криоконсервации биологического материала, занимая при этом минимальный объем.
Литература
Bavister B.D. A consistently successful procedure for in vitro fertilization of golden hamster eggs. Gamete Res. 1989; 23: 139-158.
Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extract and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster sperm in vitro. Biol. Reprod. 1977; 16: 228-237.
Elnahas K., Palapelas V., Diedrich K., Al-Hasani S. Vitrification of human oocytes and different development stages of embryos: An overview. Middle East Fertil. Soci. J. 2010; 15: 2-9.
Huang J., Chung J-T., Tan S.L., Chian R-C. High survival and hatching rates following vitrification of embryos at blastocyst stage: a bovine model study. Reprod. Biomed. Online. 2007; 14: 464-470.
Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. Online. 2005; 11: 300-308.
Liebermann J., Tucker M.J. Effect of carrier system on the yield of human oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after vitrification. Reproduction. 2002; 124: 483-489.
Liebermann J., Tucker M.J. Vitrifying and warming of human oocytes, embryos, and blastocysts. From: Methods in Molecular Biology, vol. 254: Germ Cell Protocols, Volume 2: Molecular Embryo Analysis, Live Imaging, Transgenesis, and Cloning. Edited by: H. Schatten © Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2004, pp.345-364.
Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L. et al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology. 1986; 25: 591-600.
Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 1988; 38: 1171-1180.
Rao B.S., Mahesh Y.U., Charan K.V., Suman K., Sekhar N., Shivaji S. Effect of vitrification on meiotic maturation and expression of genes in immature goat cumulus oocyte complexes. Cryobiology. 2012; 64: 176-184.
Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 2011; 141: 1-19.
Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fertil. 1972; 30: 493-497.
Vanderzwalmen P., Bertin G., Debauche C.H., Standaert V., Schoysman R. In vitro survival of metaphase II oocytes and blastocysts after vitrification in an Hemi Straw (HS) system. Fertil. Steril. 2000; 74 (Suppl.): 215-216.
Vanderzwalmen P., Bertin G., Debauche Ch., Standaert V., Bollen N., van Roosendaal E., Vandervorst M., Schoysman R., Zech N. Vitrification of human blastocysts with the Hemi-Straw carrier: application of assisted hatching after thawing. Hum. Reprod. 2003; 18: 1504-1511.
Whittingham D.G. Culture of mouse ova. J. Reprod. Fertil. 1971;. Suppl. 14:7-21.
Claims (1)
- Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих, состоящее из носителя открытого типа - полусоломинки, изготовленной путем отрезания косым срезом протяженностью около 1 см примерно половины соломинки для криоконсервации объемом 0,25 мл, стандартной затычки к ней (plug) и защитного чехла, изготовленного из соломинки для криоконсервации объемом 0,5 мл, отличающееся тем, что противоположный срезу открытый конец полусоломинки закрывают ее стандартной затычкой, непосредственно под которой в стенках полусоломинки прокалывают сквозное отверстие, а на расстоянии 1-2 см от затычки участок полусоломинки расплющивают в поперечном направлении.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013151446/10U RU141452U1 (ru) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013151446/10U RU141452U1 (ru) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU141452U1 true RU141452U1 (ru) | 2014-06-10 |
Family
ID=51218424
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013151446/10U RU141452U1 (ru) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU141452U1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2611166C2 (ru) * | 2015-07-28 | 2017-02-21 | Фирма ЦЕЛТРОНИКС | Автономное устройство для витрификации биологических объектов с использованием криогенного хладагента |
RU2668095C1 (ru) * | 2014-12-19 | 2018-09-26 | Биотек, Инк. | Устройство для криоконсервации в закрытой системе |
-
2013
- 2013-11-20 RU RU2013151446/10U patent/RU141452U1/ru active
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2668095C1 (ru) * | 2014-12-19 | 2018-09-26 | Биотек, Инк. | Устройство для криоконсервации в закрытой системе |
RU2611166C2 (ru) * | 2015-07-28 | 2017-02-21 | Фирма ЦЕЛТРОНИКС | Автономное устройство для витрификации биологических объектов с использованием криогенного хладагента |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4318861B2 (ja) | 生体試料のガラス化方法 | |
US20060046243A1 (en) | Method for vitrification of mammalian cells | |
AU2011291993B2 (en) | Method of liquid nitrogen surface vitrification | |
Orief et al. | Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? | |
US20140308655A1 (en) | Device for Manipulating Biological Materials in a Process of Cryopreservation and a Use of Such a Device | |
JP3588303B2 (ja) | 卵子または胚のガラス化用具及び方法 | |
JP3044323B1 (ja) | 細胞の凍結保存方法 | |
Santiago-Moreno et al. | Animal board invited review: Germplasm technologies for use with poultry | |
Strüssmann et al. | Cryopreservation of isolated fish blastomeres: effects of cell stage, cryoprotectant concentration, and cooling rate on postthawing survival | |
RU141452U1 (ru) | Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих | |
JP2007261973A (ja) | 胚のガラス化保存用具及びそれを用いた胚のガラス化保存方法 | |
Vajta et al. | Disadvantages and benefits of vitrification | |
Palasz et al. | Vitrification of bovine IVF blastocysts in an ethylene glycol/sucrose solution and heat-stable plant-extracted proteins | |
Luster | Cryopreservation of bovine and caprine oocytes by vitrification | |
RU2707252C1 (ru) | Способ заморозки ооцитов крупного рогатого скота | |
JPH02117601A (ja) | 豚の凍結受精卵及び凍結保存方法 | |
KR101934969B1 (ko) | 소 수정란의 저온 또는 실온 보존용 조성물 | |
Herrera-Hidalgo | Comparison of vitrification protocols in immature equine oocytes | |
JP3598368B2 (ja) | 胚のガラス化保存用液体組成物及びそれを用いた胚の超低温保存方法 | |
Choudhury et al. | Comparison between two cryo-devices for vitrification of immature oocytes of indigenous zebu cows in Bangladesh | |
JPH03232441A (ja) | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 | |
Patakiné Várkonyi et al. | Vitrification of early avian blastodermal cells with a new type of cryocontainer | |
Thorat | Assisted Reproductive Technologies (ARTs) in the Laboratory Mouse | |
Nedambale | Evaluation of cryopreservation methods for in vitro produced bovine embryos | |
Borini et al. | PreservAtion of HumAn oocytes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD1K | Correction of name of utility model owner | ||
RH9K | Utility model duplicate issue |
Effective date: 20180307 |