KR101257134B1 - 재조합 단백질의 만노스 함량을 조절하는 방법 - Google Patents

재조합 단백질의 만노스 함량을 조절하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 당단백질의 만노스 함량, 특히, 만노스 고함량을 조절(예, 감소시키는)하는 방법에 관한 것이다.
만노스, 재조합 당단백질, IL-15, 모노클로날 항체

Description

재조합 단백질의 만노스 함량을 조절하는 방법{Methods for modulating mannose content of recombinant proteins}
고등 진핵생물은 다양한 해독후 변형, 예컨대 메틸화, 황화, 인산화, 지질 첨가 및 글리코실화 등을 수행한다. 이러한 변형은 단백질의 기능에 매우 중요한 것일 수 있다. 분비 단백질, 막 단백질 및 소포 또는 특정 세포내 소기관에 표적화되는 단백질은 글리코실화될 가능성이 있다.
N-결합(N-linked) 글리코실화는 단백질 중의 인식 서열(예, Asn-X-Ser/Thr)에서 발견되는 아스파라긴 잔기에 올리고사카라이드의 첨가를 수반하는 글리코실화의 한 형태이다. N-결합 당단백질은 표준 분지 구조, 즉 만노스(Man), 갈락토스, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 뉴라믹산으로 구성되는 구조를 포함한다. 단백질 N-글리코실화는 돌리콜(지질 운반 중간체) 상에 회합된 N-결합 올리고사카라이드(예, Glc3 Man9 GlcNAc2)가 초기 단백질의 적당한 아스파라긴(Asn)으로 이동하는 소포체(ER) 내에서 일반적으로 시작된다. 이는 모든 진핵생물의 N-결합 당단백질에 일반적인 사건이다. N-결합 사카라이드에는 2가지 주요 형태가 있다: 만노스 고함량(high-mannose) 올리고사카라이드 및 복합(complex) 올리고사카라이드.
만노스 고함량 올리고사카라이드는 일반적으로 많은 만노스 잔기(예컨대, 4개 이상)를 보유하는 2종의 N-아세틸글루코사민을 포함한다. 복합 올리고사카라이드는 본래 2종보다 많은 N-아세틸글루코사민을 비롯하여, 거의 임의의 수의 다른 종류의 사카라이드를 포함할 수 있기 때문에 붙여진 이름이다. 이러한 두 종류의 올리고사카라이드는 단백질의 여러 부위에서 단백질을 글리코실화할 수 있다. 올리고사카라이드가 만노스 고함량형인지 또는 복합형인지는, 골지체에 존재하는 사카라이드 변형 단백질에 대한 접근용이성에 좌우되는 것으로 생각된다. 사카라이드가 비교적 접근이 용이하지 않다면, 대부분 본래 만노스 고함량 형태로 남아있을 것이다. 접근이 용이하다면, 많은 만노스 잔기가 절단되고 전술한 다른 종류의 기가 첨가되어 사카라이드가 추가 변형될 것이다.
올리고사카라이드 쇄는 단백질에 첨가된 후, 3개의 글루코스와 1개의 만노스 잔기가 3가지 다른 효소에 의해 일정한 순서대로 제거된다. 이 사건은 ER에서 일어나고, 단백질이 추가 프로세싱되기 위해 골지로 수송될 수 있다는 시그널이다. ER에서 프로세싱된 후에는 만노스 고함량형 올리고사카라이드가 형성된다. 3개의 글루코스 잔기와 1개의 특정 알파-1,2 결합된 만노스 잔기는 ER에서 특정 글루코시다제와 알파-1,2-만노시다제에 의해 제거되어, 코어 올리고사카라이드 구조인 Man8GlcNAc2를 형성한다. 이러한 코어 당 구조를 보유하는 단백질은 골지체로 수송되고, 여기서 당 잔기는 다양한 변형을 일으킨다.
포유동물 세포에서 당 쇄의 변형은 당이 첨가되는 단백질 잔기에 따라서 3가 지 다른 경로를 통해 진행되게 된다. 3가지 다른 경로는 다음과 같다: (1) 코어 당 쇄가 변화되지 않는 경로; (2) 코어 당 쇄에 존재하는 만노스의 6번 위치에 UDP-N-아세틸 글루코사민(UDP-GlcNAc) 중의 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 잔기(GlcNAc-1-P)가 첨가되어 코어 당 쇄가 변화되는 경로; 또는 (3) 코어 당 쇄가 먼저 만노시다제 I에 의해 3개의 만노스 잔기가 제거되어 Man5GlcNAc2로 변환된 다음, GlcNAc가 첨가되고 2개의 만노스 잔기가 추가로 제거되어 Man5GlcNAc2가 추가 변형된 다음, 연속하여 GlcNAc, 갈락토스(Gal) 및 N-아세틸뉴라민산(시알산(NeuNAc)라고도 불림)가 첨가되어 다양한 하이브리드 또는 복합 당 쇄가 형성되는 경로(R.Kornfeld and S. Kornfeld, Ann.Rev.Biovhem. 54: 631-664(1985); Chiba et al., J.Biol.Chem. 273: 26298-26304(1998)).
재조합 단백질의 올리고사카라이드 함량은 치료용 당단백질의 안전성과 효능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이러한 당단백질의 올리고사카라이드 함량, 특히 만노스 함량을 제어하는 방법은 유익할 것이다.
당단백질 조성물, 특히 치료용 항체의 높은 만노스 함량은 치료용으로 사용 중에 그 단백질의 안전성과 효능에 유의적인 영향을 미칠 수 있다. 만노스 고함량 당단백질은 대식세포 및 수지상 세포 상의 만노스 수용체 등으로 인해, 만노스 저함량 대응물보다 더 빠르게 혈행으로부터 제거된다는 증거가 있지만, 이러한 이론에만 한정되는 것은 아니다. 또한, 만노스 고함량 당단백질은 면역원성이 더 큰 것으로 생각되고 있다. 따라서, 만노스 함량이 낮은 치료용 당단백질, 예컨대 치료용 항체를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명은 당업계의 이와 같은 요구를, 재조합 생산된 단백질 및 펩타이드의 만노스 함량을 조절(예, 제어 또는 감소)하는 방법을 제공하여 해결하고자 한다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로, 재조합 발현된 당단백질의 만노스 함량, 특히 만노스 고함량에 영향을 미치는 인자의 발견을 기초로 한다.
따라서, 일 관점으로서, 본 발명은 세포가 생산하는 당단백질이 저함량의 만노스를 보유하도록 세포배양 조건을 조정하여, 포유동물 숙주 세포에서 생산된 재조합 당단백질의 만노스 함량(즉, 올리고사카라이드 측쇄 상의 만노스 함량)을 조절하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된, "만노스 저함량"이란 용어는 조성물에 존재하는 당단백질의 약 10% 미만, 또는 약 8% 미만, 또는 약 5% 미만(예, 약 4% 이하)이 4개보다 많은 만노스 잔기를 보유하는(즉, M5 이상인 종) 당단백질 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된, "만노스 저함량"이란 용어는 또한 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만 또는 이러한 임의의 범위 사이의 임의의 값, 또는 심지어 0%인 당단백질 조성물을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 만노스 저함량은 세포 배양 환경을 낮은 삼투질농도(예컨대, 약 600mOsm/Kg 미만, 또는 약 500mOsm/Kg 미만, 또는 약 400mOsm/Kg 미만, 예컨대 약 380 내지 250mOsm/Kg 사이)로 유지시킴으로써 달성된다. 이는 당단백질의 올리고사카라이드 측쇄 상에 존재하는 만노스 함량이 낮은, 즉 만노스 잔기 가 4개 이하인 당단백질을 세포 배양물에 농축시킨다. 따라서, 특정 양태에 따르면, 본 발명은 삼투질농도가 약 600mOsm/Kg 이하(예컨대, 약 200 내지 600mOsm/Kg 범위 사이, 예컨대 약 250 내지 550mOsm/Kg, 약 250 내지 500mOsm/Kg, 약 250 내지 450mOsm/Kg, 약 250 내지 400mOsm/Kg, 약 250 내지 380mOsm/Kg, 또는 약 250 내지 350mOsm/Kg)인 배지에서 당단백질을 발현하는 포유동물 숙주 세포(예, 배양물 확장 또는 생산기의 숙주 세포)를 배양하는 것을 포함하여, 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 삼투질농도 범위는 다양한 세포 배양 매개변수, 예컨대 세포 배양 배지 중의 염, 비타민, 당, 펩톤 및 아미노산 중 하나 이상의 농도를 비롯하여, 이에 국한되지 않는 매개변수를 조정하여 달성할 수 있다. 따라서, 특정 양태에 따르면, 본 발명은 칼륨 농도 약 70mM 이하(예컨대, 약 10mM 내지 약 50mM) 및/또는 나트륨 농도 약 200mM 이하(예컨대, 약 50mM 내지 약 100mM)인 배지에서 당단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하고, 이 세포 배양물의 삼투질농도를 약 600mOsm/Kg 이하로 유지시켜, 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1 이상의 아미노산이 실질적으로 없는 배지에서 당단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하고, 이 세포 배양물의 삼투질농도를 약 600mOsm/Kg 이하로 유지시켜, 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 또 다른 양태에 따르면, 배지는 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, I-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살 HCl, 피리독신 HCl, 리보플라빈, 타민 HCl 및 시아노코발라민으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 비타민을 약 0.00005g/L 내지 약 0.9g/L의 농도로 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 배지는 글루코스를 약 1mM 내지 약 90mM의 농도로 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 배지는 효모 추출물, 효모 가수분해물, 대두 펩톤, 대두 가수분해물, 밀 펩톤 및 밀 가수분해물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 펩톤을 약 0.5g/L 내지 약 60g/L의 농도로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 삼투질농도를 바람직한 수준, 예컨대 약 600mOsm/Kg 이하로 유지시키는데 필요한 양으로 1종 이상의 삼투보호제(osmoprotectant)를 포함할 수 있다. 적당한 삼투보호제는 당업계에 공지되어 있고, 그 예로는 베타인, 글리신, L-트레오닌 및 L-프롤린, 이의 유도체, 예컨대 글리신 베타인 및 베타인 알데하이드 등이 있다. 특정 양태에서, 삼투보호제(예, 베타인)는 세포 배양 배지에 약 20mM 이상의 농도로 존재한다. 특정 양태에서, 삼투보호제(예, 베타인)는 약 1mM 내지 약 100mM 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 농도로 존재한다.
단독으로 제어되거나 또는 본 명세서에 기술된 1 이상의 매개변수들과 함께 제어될 수 있는 추가 세포 배양 매개변수에는, 예컨대 세포가 배양되는 온도 및 시간의 기간이 있다. 특정 양태에서, 재조합 당단백질을 발현하는 숙주 세포는 약 31℃ 내지 약 38℃의 온도에서 배양한다. 다른 특정 양태에서, 재조합 당단백질을 발현하는 숙주 세포는 약 5일 내지 약 14일의 기간 동안 배양한다.
본 발명에 따라 재조합 당단백질을 발현하기에 적당한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있고, 그 예로는 CHO 세포, 림프구 세포(예, NSO 세포) 및 다양한 다른 포유동물 세포와 같은 본 명세서에 기술된 임의의 세포가 있다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 만노스 저함량의 다양한 당단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 만노스 함량이 낮은 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는데 사용된다. 적당한 항체는 예컨대 쥐 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체 및 완전 사람 항체뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 항체 형태를 포함할 수 있다. 다른 특정 양태에서, 항체는 IL-15에 결합하며, 그 예로는 전문이 본 발명에 참고인용되는 미국 공개번호 2003-0138421에 개시된 항체가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 특정 양태에 따르면, 항체는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 뿐만 아니라 IL-15에 결합하는 상동성 서열(예컨대, 서열번호 4 또는 서열번호 2와 동일성이 각각 약 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상인 아미노산 서열을 보유하는 서열)을 보유하는, IL-15에 결합하는 완전 사람 모노클로날 항체이다. 또 다른 특정 양태에서, 항체는 서열번호 8 내지 10에 제시된 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 뿐만 아니라 IL-15에 결합하는 상동성 서열(예컨대, 서열번호 8 내지 10 중에 임의의 서열과 동일성이 각각 약 80, 85, 90, 95% 이상인 아미노산 서열을 보유하는 서열)을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 5 내지 7에 제시된 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 뿐만 아니라 IL-15에 결합하는 상동성 서열(예컨대, 서열번호 5 내지 7 중에 임의의 서열과 동일성이 각각 약 80, 85, 90, 95% 또는 그 이상인 아미노산 서열을 보유하는 서열)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 보유하고, IL-15에 결합하는 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 양태에서, IL-15에 결합하는 사람 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8 내지 10에 제시된 3개의 CDR을 모두 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 5 내지 7에 제시된 3개의 CDR을 모두 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존적 아미노산 치환체를 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생산된 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 제공한다. 따라서, 이러한 당단백질은 전술한 치료용 당단백질 중 임의의 당단백질, 예컨대 항체, 호르몬, 효소, 펩타이드 및 다른 당단백질을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 만노스 저함량의 전술한 당단백질 중 임의의 당단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 양태에서, 이 조성물은 만노스 저함량의 분리된 당단백질(예컨대, IL-15에 결합하는 분리된 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
따라서, 또 다른 관점에서, 본 발명은 사람 IL-15의 과발현과 관련이 있고(있거나) 사람 IL-15 유도 효과의 하향조절 또는 억제가 유익한 장애를, 만노스 저함량의 분리된 IL-15 항체를 피험체에게 투여함으로써 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이런 장애의 예에는 혈관염, 건선, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환(예, 크론 병 또는 셀리악병(celiac)), 동종이식거부반응, 이식편대숙주 질환, T-세포 림프종 및 T-세포 백혈병 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아 니다.
따라서, 또 다른 관점에서 본 발명은 사람 IL-15의 과발현과 관련이 있고(있거나) 사람 IL-15 유도 효과의 하향조절 또는 억제가 유익한 장애를, 만노스 저함량의 분리된 IL-15 항체를 피험체에게 투여함으로써 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이런 장애의 예에는 관절염, 연결조직 장애, 안과 장애, 신경 장애, 위장 및 간장 장애, 알레르기 장애, 혈액 장애, 피부 장애, 폐 장애, 악성종양, 이식 유래 장애, 내분비계 장애, 혈관 장애, 부인과 장애 및 감염 질환 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
도 1은 교반기 대조군(50ml) 및 생물반응기(150L 및 500L)에서 항체를 발현하는 세포를 배양하여 생산한, IL-15에 결합하는 완전 사람 모노클로날 항체의 만노스 고함량과 삼투질농도 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 2는 IL-15에 결합하는 완전 사람 모노클로날 항체의 만노스 고함량과 삼투보호제인 베타인의 첨가 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 3은 배양 배지의 K+ 농도와 삼투질농도 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 4는 15mM 또는 45mM KCl을 함유하는 배지에서 세포를 배양하여, IL-15에 결합하는 완전 사람 모노클로날 항체의 만노스 고함량과 삼투질농도 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 5는 만노스 고함량을 10% 이하로 유지시키기 위한 K+의 최적 농도가 약 0 내지 약 70mM 사이임을 보여주는, K+ 농도와 만노스 고함량 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 6은 만노스 고함량을 10% 이하로 유지시키기 위한 Na+의 최적 농도가 약 0mM 내지 약 200mM 사이임을 보여주는, Na+ 농도와 만노스 고함량 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 7은 아미노산 농도와 만노스 고함량 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
도 8은 사용된 공급 배지의 종류와 만노스 고함량 사이의 상관성을 도시한 그래프이다.
따라서, 본 발명은 만노스 저함량의 치료용 당단백질, 예컨대 치료용 항체를 제조하는데 바람직하다.
본 명세서의 더욱 용이한 이해를 위해 먼저 특정 용어들을 정의한다. 다른 정의들도 상세한 설명을 통해 제시된다.
I. 정의
탄수화물 잔기에 대한 본 명세서에서의 설명은 올리고사카라이드에 일반적으로 사용되는 명명법을 참고로 한다. 본 명명법을 사용하는 탄수화물 화학의 논의는 예를 들어 문헌[Hubbard and Ivatt, Ann.Rev.Biochem. 50: 555-583(1981)]에서 찾아볼 수 있다. 이 명명법에는 예컨대 만노스를 나타내는 Man; 2-N-아세틸글루코사민을 나타내는 GlcNAc; 갈락토스를 나타내는 Gal; 및 글루코스를 나타내는 Glc가 있다. 시알산은 속기 기호인 NeuNac로 표시되는 5-N-아세틸뉴라민산 및 NeuNGc로 표시되는 5-글리콜릴뉴라민산을 참고로 하여 기술한다.
본 명세서에 사용된 "삼투질농도"란 용어는 수용액에 용해된 용질 입자의 삼투압의 측정단위를 의미한다. 용질 입자에는 이온 및 이온화되지 않은 분자를 모두 포함한다. 삼투질농도는 용액 1kg에 용해된 삼투적 활성 입자의 농도(즉, 오스몰)로서 표현된다(38℃에서 1mOsm/kg H2O는 19mmHg의 삼투압에 해당한다). 본 명세서에 사용된, "mOsm"은 "밀리오스몰/kg 용액"을 의미한다. 예시적 양태에서, 세포 배양 배지의 삼투질농도는 약 600mOsm/Kg 이하, 또는 약 550mOsm/Kg 이하, 또는 약 500mOsm/Kg 이하, 또는 약 450mOsm/Kg 이하, 또는 약 400mOsm/Kg 이하, 또는 약 380mOsm/Kg 이하, 또는 약 200mOsm/Kg 내지 약 600mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 550mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 500mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 450mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 400mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 380mOsm/Kg 사이, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 350mOsm/Kg 사이로 유지된다.
본 명세서에 사용된, "당단백질"이란 용어는 만노스 잔기를 포함하는 올리고사카라이드 측쇄가 하나 이상인, 펩타이드 및 단백질, 예컨대 항체를 의미한다. 당단백질은 숙주 세포와 동종성이거나 또는 사용된 숙주 세포와 이종성, 즉 외인성, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포에 의해 생산된 사람 당단백질일 수 있다. 이러한 당단백질은 일반적으로 "재조합 당단백질"이라 불린다. 특정 양태에서, 숙주 세포에 의해 발현된 당단백질은 배지로 직접 분비된다. 포유동물 당단백질의 예에는 다음과 같은 분자 및 이에 대한 항체, 사이토카인, 예컨대 IL-1 내지 IL-15, 및 이들의 수용체; 케토카인, 예컨대 TNF, TECK 및 이들의 수용체, 예컨대 TNFR, CCR9; 성장 호르몬, 예컨대 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 분비 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A 쇄; 인슐린 B 쇄; 프로인슐린; 난포자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성호르몬; 글루카곤; 응혈인자; 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자, 조직인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항응혈인자, 예컨대 프로테인 C; 심방성 나트륨이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스노겐 활성인자, 예컨대 유로키나제 또는 사람 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈성 성장인자; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 사람 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민; 뮬러관 억제 물질; 릴랙신 A 쇄; 릴랙신 B 쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선자극 호르몬 관련 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 악티빈; 혈관내피세포 성장인자(VEGF); 호르몬 또는 성장인자의 수용체; 인테그린; 프로테인 A 또는 D; 류마티스성 인자; 향신경성 인자, 예컨대 골 유래 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판 유래 성장인자(PDGF); 섬유아세포 성장인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장인자(EGF); 형질전환 성장인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, 또는 TGF-베타5; 인슐린 유사 성장인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골형성 유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1 내지 IL-15; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴촉진인자; 바이러스 항원, 예컨대 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 및 조절 단백질이 있다.
본 명세서에 사용된, "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"란 용어는 일반적으로 다음과 같은 카테고리 중 하나 이상의 카테고리에 속하는 1 이상을 성분을 제공하는, 포유동물 세포의 성장에 사용되는 영양소 용액을 의미한다: 1) 에너지원, 보통 글루코스와 같은 탄수화물 형태; 2) 1 이상의 모든 필수 아미노산, 보통 기본 20개 아미노산 세트와 시스테인; 3) 비타민 및/또는 기타 저농도로 필요로 되는 유기 화합물; 4) 유리 지방산; 및 5) 미량원소, 여기서 미량원소는 일반적으로 극히 저 농도, 보통 마이크로몰 범위의 농도로 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생의 원소로서 정의된다. 영양소 용액은 세포 성장의 최적화를 위해 선택적으로 추가 성분이 보충되기도 한다.
본 발명의 포유동물 세포 배양물은 배양되는 특정 세포에 적당한 배지에서 제조된다. 특정 세포 종류의 배양에 사용될 수 있는 적당한 세포 배양 배지는 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 시판되는 배지의 예에는 햄스(Ham's) F10(SIGMA), 최소필수배지(MEM, SIGMA), RPMI-1640(SIGMA) 및 둘베코변형이글 배지(DMEM, SIGMA)가 있다. 이러한 배지 또는 여타 적당한 임의의 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장인자(예컨대, 인슐린, 트란스페린 또는 표피성장인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액(예컨대, HEPES), 뉴클레오사이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예, Gentamycin™), 미량원소(보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 지질(예컨대, 리놀레산 또는 다른 지방산) 및 이들의 적당한 담체, 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있고(있거나), 본 명세서에 기술된 바와 같이 만노스 저함량의 재조합 당단백질의 생산을 촉진하도록 변형될 수 있다. 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지는 이 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 발현된 재조합 당단백질의 만노스 고함량을 조절(예컨대, 감소)하도록 최적화된다. 특정 양태에서, 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이고, 적당한 배지는 이러한 배지에서 배양된 CHO 세포에 의해 발현되는 재조합 당단백질의 만노스 고함량이 조절(예컨대, 감소)되도록, DMEM/HAM F-12계 배합물과 같은 기본 배지 성분에 아미노산, 염, 당, 펩톤 및 비타민 등의 1 이상의 성분의 농도가 변형된 것이다.
세포 배양물의 "성장기"란 용어는 세포가 일반적으로 빠르게 분열하는, 지수적 세포 성장 기간(즉, 대수기)을 의미한다. 세포는 이러한 성장기에서 약 1일 동안, 약 2일 동안, 약 3일 동안, 약 4일 동안, 또는 4일 이상의 기간 동안 유지된다. 세포가 성장기에서 유지되는 시간의 기간은 예컨대 세포 종류 및 세포 성장 속도와 배양 조건에 따라 달라질 것이다.
"전이기"란 용어는 성장기와 생산기 사이의 시간 기간을 의미한다. 일반적으로, 전이기는 배양 조건을 조절하여 성장기에서 생산기로의 이동을 지원할 수 있는 기간 동안의 시간이다. 조절될 수 있는 다양한 세포 배양 매개변수에는 온도, 삼투질농도, 비타민, 아미노산, 당, 펩톤, 암모늄 및 염 중 하나 이상이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
세포 배양물의 "생산기"란 용어는 세포 성장이 정점에 이른 시간 기간을 의미한다. 대수기적 세포 성장은 일반적으로 이 생산기 전이나 생산기 중에 끝나고, 단백질 생산이 우세해진다. 이 단계에서 원하는 단백질을 생산하기 위해서는 세포 배양 배지를 보충하는 것이 바람직하다.
"포유동물 숙주 세포", "숙주 세포" 및 "포유동물 세포"란 용어는 적당한 영양소와 성장 인자를 함유하는 배지에서 단층 배양되거나 현탁 배양된 상태일 때 성장 및 생존을 할 수 있는 포유동물 유래의 세포주를 의미한다. 일반적으로, 이러한 세포는 당해의 특정 당단백질을 발현하여 배양 배지로 다량 분비할 수 있다. 적당한 포유동물 숙주 세포의 예에는 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77; 4216(1980)); dp12CHO 세포(EP 307247); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양 성장용으로 서브클로닝된 293 세포)(Craham et al., J.Gen Virol., 36: 59(1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(ATCC CCL10); 마우스 세르톨리 세포(TM4)(Mather, Bibl. Reprod., 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76)(ATCC CRL-1587); 사람 경부암 세포(HeLa)(ATCC CCL2); 개 신장 세포(MDCK)(ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A)(ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138)(ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2 HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad.Sci., 383: 44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주(Hep G2)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 나타내는 것이다. 이러한 용어들은 특정 피험체 세포뿐만 아니라 이 세포의 후손도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 후속 세대에서는 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 후손은 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함되는 것이다.
"발현", "발현한다"란 용어는 일반적으로 숙주 세포 내에서 일어나는 전사 및 해독을 의미한다. 숙주 세포에 존재하는 유전자 산물의 발현 수준은 세포에 존재하는 대응 mRNA의 양 또는 이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 양 중 어느 하나를 기초로 하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 산물 유전자로부터 전사된 mRNA는 노던 하이브리드화에 의해 정량될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). 유전자에 의해 암호화된 단백질은 단백질의 생물학적 활성을 분석하거나, 이러한 활성과는 무관한 분석법, 예컨대 단백질과 반응할 수 있는 항체를 이용하는 방사능면역분석법 또는 웨스턴 블롯팅 분석 등으로 정량할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). 일부 양태에서, "발현" 및 "발현한다"란 용어는 본 발명의 방법에 의해 생산된 만노스 저함량의 재조합 단백질과 관련하여 사용된다.
본 명세서에 사용된 "저함량 만노스" 및 "만노스 저함량"이란 용어는 조성물의 약 10% 이하가 4개보다 많은 만노스 잔기를 보유하는 당단백질, 즉 M5 또는 그 이상의 종을 포함하는 당단백질 조성물을 의미한다. 이와 반대로, "만노스 고함량"이란 용어는 만노스 잔기가 4개보다 많은 당단백질이 조성물의 약 10%가 넘는 당단백질 조성물을 의미한다. 또한, "저함량 만노스" 및 "만노스 저함량"이란 용어는 조성물의 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과가 4개 이하의 만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 보유하는, 당단백질 조성물과 관련하여 사용되기도 한다.
"만노스 저함량의 당단백질"이란 용어는 숙주 세포를 배양하여 생산했을 때, 만노스 잔기가 4개보다 많은, 조성물의 당단백질(즉, M5 이상의 종)이 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 내지 약 5% 사이, 약 6% 이하, 약 5%와 6% 사이 이하, 약 7% 이하, 약 6%와 7% 사이 이하, 약 8% 이하, 약 7%와 8% 사이 이하, 약 9% 이하, 8%와 9% 사이 이하, 약 10% 이하, 또는 약 9%와 10% 사이 이하인 것을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 재조합 당단백질 조성물과 관련하여 사용된다. 따라서, "만노스 저함량의 당단백질"이란 용어는 숙주 세포를 배양하여 생산했을 때, 만노스 잔기가 4개 또는 그 이하(즉, 만노스 잔기 0 내지 4개)인 당단백질이 조성물에 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과인 것을 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 의미한다.
만노스 고함량은 당업계에 공지된 1 이상의 방법, 예컨대 Whuhrer et al.(Journal of Chromatography B vol. 825: 124-133, 2005) 및 Dell et al.(Science Vol. 291: 2351-2356)에 기술된 방법, 및 본 명세서에 기술된 방법, 예컨대 당단백질의 N-글리칸 맵핑 분석법 등으로 측정할 수 있다. 간략히 설명하면, 재조합 모노클로날 항체와 같은 재조합 당단백질로부터 N-글리칸을 효소적으로 제거하고 환원성 말단을 형광 태그(2-아미노벤즈아미드)로 표지한다. 형광성 N-글리칸은 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)로 분리하고 형광 검출법으로 검출한다. 중성 N-글리칸의 분리는 일반적으로 N-글리칸 구조의 증가된 복잡성을 기초로 한다. 하전성 N-글리칸의 분리는 하전의 수가 유래될 수 있는 시알산, 설페이트 및 여타 존재하는 변형의 수와 종류를 기초로 한다. 이러한 검사 샘플의 글리칸 프로필을 적당한 표준물과 시각적으로 비교한다.
또한, 만노스 고함량은 본 명세서에 바로 개시되는 방법, 즉 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab 단편, 진핵생물 숙주 세포에서 발현될 때의 펩티바디 및 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 비롯한, 이에 국한되지 않는 당단백질의 만노스 고함량을 검출 및/또는 정량하는 고처리량(high-throughput) 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 항체는 일반적으로 하나의 N-결합된 글리칸을 Fc 영역 위에 보유한다. 글리칸은 부분 매장된 구조로 인해, 종종 부분적으로만 가공되어, 지나치게 높은 만노스형 및 하이브리드형으로 생성된다. 클론 선택, 세포의 돌연변이 또는 다른 유전자 조작, 또는 세포 배양 조작은 세포가 생산하는 글리칸의 형태를 변경시킬 수 있다. 따라서, 다수의 조건/세포가 조사되어, 선별 중에 많은 글리칸 검사가 실시되어야만 한다. 통상적인 글리칸 맵핑은 느리고 노동 집약적인 방법으로서 수 일이 소요되는 방법이다. 본 발명의 고함량 만노스/하이드리드 글리칸 분석법은 훨씬 적은 조작자의 노력으로 훨씬 빠르게 글리칸 형태의 비를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 당단백질을 포함하는 조성물이나 샘플에서 당단백질의 만노스 고함량을 검출 및/또는 정량하는 방법으로서, 당단백질을 포함하는 샘플이나 조성물을 엔도글리코시다제 분해로 처리하는 단계, 및 분해된 당단백질을 환원제(필요한 경우)를 사용하여 환원시키는 단계, 및 분해된 당단백질을 변성 전기영동으로 분리하여, 고함량 만노스/하이브리드형 글리칸의 비를, 탈글리코실화된 중쇄의 분획(엔도글리코시다제 분해 후의 피크)으로부터 비글리코실화된 중쇄의 분획(엔도글리코시다제 처리 전의 피크 분획)을 공제하여 측정한다. 비글리코실화된 중쇄 분획 또는 엔도글리코시다제 처리 전의 피크 분획은 동일한 샘플이나 조성물을 엔도글리코시다제가 존재하지 않는 것을 제외하고는 동일한 분해 조건으로 처리하여 수득한다. 이 단계는 엔도글리코시다제 분해 단계와 동시에 또는 별도로 실시될 수 있다.
코어 글리칸에서 GlcNAc1과 GlcNAc2 사이의 하이브리드 및 고함량 만노스 글리칸은 선택적으로 절단하면서 복합 N-결합된 글리칸은 본래 상태로 방치하는 임의의 엔도글리코시다제를 본 발명에 사용할 수 있다. 적당한 정량을 위해, 엔도글리코시다제는 한정된 양이어서는 안 된다. 엔도글리코시다제 분해를 수행하기 위한 구체적인 조건, 예컨대 효소의 농도, 배양 온도 및 분해 시간 등은 사용된 엔도글리코시다제의 종류에 따라 달라진다. 본 발명에 관련된 엔도글리코시다제의 예에는 엔도글리코시다제 H 및 엔도글리코시다제 F1이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 양태에서, 당단백질을 함유하는 샘플은 엔도글리코시다제 H로 37℃에서 약 2시간 동안 처리하고, β-머캅토에탄올로 환원시킨 뒤, CE-SDS 분석으로 처리한다.
글리코실화된 당단백질, 예컨대 글리코실화된 항체로부터 탈글리코실화된 당단백질, 예컨대 탈글리코실화된 항체를 분리하는 방법의 예에는 다음과 같은 2가지 방법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다:
1) 환원 조건 하에서의 CE-SDS. 항체와 같은 글리코실화된 당단백질을 SDS 및 환원제로 변성시키고, 절단된 HC(탈글리코실화된 HC)와 글리칸을 보유하는 그 중쇄(HC)를 모세관 전기영동-SDS(CE-SDS)로 분리한다. 전기영동도는 UV 시그널로부터 생성된다. 피크 아래의 면적은 상대적 양에 비례한다. 따라서, 고함량 만노스/하이브리드 형의 양은 앞서 탈글리코실화된 HC 위치에서 용출된 분획으로부터 측정된다. GlcNAc-HC는 탈글리코실화된 HC와 함께 이동하기 때문에, 분해된 샘플의 프리피크(prepeak)에서 분해되지 않은 샘플의 탈글리코실화 HC %를 공제하면 고함량 만노스% 값이 수득된다. 분리에는 배열에 따라 15 내지 30분이 소요된다.
2) 미량유동학 기반의 CE-SDS. 당단백질은 1)에서와 같이 변성시키지만, 분리에는 "랩온어칩(lab on a chip)" 기구, 예컨대 캘리퍼 제품인 LC90 등을 이용한다. 분석에는 동일한 원리가 사용되고, 단백질의 검출에는 형광 염료를 통한 분리가 사용된다. 분리 시간은 1회 분석당 약 30초까지 감소되고 미량역가 평판으로부터 표본이 추출될 수 있다.
전술한 본 발명의 방법은 정제된 단백질은 물론 미정제 세포 배양 샘플에서도 수행될 수 있다. 재조합 항체인 경우에는, 정제가 필요하지 않을 정도로 시그널이 강하다.
특정 양태에서, 만노스 잔기가 4개보다 많은 당단백질에는 만노스 잔기 5 내지 9개를 보유하는 당단백질이 있다(즉, M5 내지 M9 종). 특정 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 당업자라면 숙주 세포에 의해 발현된 당단백질 조성물이 다양한 수의 만노스 잔기를 보유하는 당단백질을 포함한다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 만노스 저함량 당단백질은 만노스 잔기 4개 이하(예컨대 0 내지 4개의 만노스 잔기)를 보유하고, 만노스 고함량 당단백질은 4개가 넘는 만노스 잔기(예, M5 종 이상)를 보유한다.
본 발명의 특정 양태에서, 만노스 저함량의 당단백질은 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 만노스 저함량의 재조합 당단백질은 IL-15 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 사람 모노클로날 항체이다.
본 명세서에 사용된 "실질적으로 없는"이란 표현은 특정 성분이 없거나 함량이 감소된(즉, 변형되지 않은 배양 배지 대비) 세포 배양 배지 제조물을 의미한다. 예를 들어, 일 양태에서, 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 생산하는데 사용된 배양 배지는 특정 아미노산(예컨대, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산)이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 배양 배지는 변형되지 않은 배양 배지 대비, 상기 성분 중 하나 이상을 약 1% 미만, 또는 약 3% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 10% 미만으로 포함하도록 변형시킨 것이다.
본 명세서에서 호환 사용되고 있는 "IL-15", "IL-15 항원" 및 "인터루킨 15"는 세포에서 자연적으로 발현되는 임의의 변형체 또는 이소형(isoform)을 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 "항체"라는 용어는 완전 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원결합부") 또는 이의 단일쇄를 포함한다. "항체"는 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)가 이황화 결합에 의해 상호결합된 당단백질, 또는 이의 항원결합부를 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(약어, VH)과 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(약어, VL)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변영역으로 세분될 수 있고, 이 영역에는 더욱 보존적인, 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 영역이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되는데, 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 다음과 같은 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직이나 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포(예, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 보체(Clq) 등에 면역글로불린의 결합을 중재할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 항체의 "항원결합부" 및 "항원 결합 단편"(또는 간단히 "항체 일부")이란 용어는 항원(예, IL-15)에 선택적으로 결합하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 항체의 "항원결합부"란 용어에 속하는 항원 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 결합된 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward et al., Nature 341: 544-546(1989)); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 경우에 따라 결합될 수 있는 2 이상의 분리된 CDR의 결합물이 있다. 또한, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH가 다른 유전자에 의해 암호화될지라도, 두 도메인은 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 결합시킬 수 있고, 이로써 상기 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한다(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있는 것; 예컨대 Bird et al. Science 242: 423-426(1988); and Huston et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 5879-5883(1988)). 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원결합부" 및 "항원 결합 단편"이란 용어의 의미에 속하는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 항체 단편들은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 통해 수득될 수 있고, 단편은 본래 항체와 동일한 방식으로 용도에 따라 선별한다.
본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체를 의미한다. 따라서, "사람 모노클로날 항체"란 용어는 단일 결합 특이성을 나타내고 사람 배선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 의미한다. 일 양태에서, 사람 모노클로날 항체는 사람 중쇄 돌연변이유전자(transgene)와 경쇄 돌연변이유전자를 포함하는 게놈을 무한증식성 세포에 융합시킨, 사람을 제외한 돌연변이 동물, 예컨대 돌연변이 마우스에서 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 창조 또는 분리된 모든 사람 항체를 포함하며, 그 예로는 (a) 사람 면역글로불린 유전자에 대해 돌연변이성 또는 트랜스염색체성인 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마, (b) 상기 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합체의 조합성 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 사람 면역글로불린 유전자 서열의 접목을 수반하는 다른 임의의 방법에 의해 제조, 발현, 창조 또는 분리된 항체가 있다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 및 불변 영역을 보유한다. 하지만, 특정 양태에서 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발법(또는 사람 Ig 서열에 대해 돌연변이성인 동물이 사용될 때에는 생체내 체세포 돌연변이유발법)으로 처리될 수 있고, 이에 따라 이 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 배선 VH 및 VL 서열에서 유래되고 관련은 있지만, 생체내 사람 항체 배선 목록에 자연적으로 존재하는 것은 아닐 수 있다.
본 명세서에 사용된, "이종성 항체"는 이러한 항체를 생산하는, 사람을 제외한 돌연변이 유기체와 관련 있는 것으로 정의된다. 이 용어는 사람을 제외한 돌연변이 동물에 포함되지 않는 유기체에서 발견되는 것에 상응하고, 일반적으로 사람을 제외한 돌연변이 동물과 다른 종에서 유래되는 아미노산 서열 또는 암호화 핵산 서열을 보유하는 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는 다른 항원 특이성을 보유하는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다(예컨대, IL-15에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 IL-15 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 실질적으로 없다). 하지만, IL-15의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 다른 IL-15 단백질이나 다른 관련 사이토카인과 교차반응성이 있을 수 있다. 그러나, 항체는 항상 사람 IL-15에 결합하는 것이 바람직하다. 또한, 분리된 항체는 일반적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다. 특정 양태에서, 다른 IL-15 특이성이 있는 "분리된" 모노클로날 항체의 배합물은 잘 알고 있는 조성으로 혼합된 것이다.
본 명세서에 사용된, "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"란 용어는 소정 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 예를 들어, 일 양태에서, 항체는 분석물로서 재조합 사람 IL-15를 사용하고 리간드로서 상기 항체를 사용하여 BIACORE 3000 장치에서 표면플라스몬공명(SPR) 기술로 측정했을 때, 약 10-7M 미만, 예컨대 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 또는 심지어 그 이하인 친화성(KD)으로 결합하고, 근연성이 가까운 항원이나 소정의 항원 외에 다른 비특이적 항원(예, BSA, 카제인)에 대한 결합 친화성보다 적어도 2배 이상 큰 친화성으로 상기 소정의 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 표현은 "항원에 선택적으로 결합하는 항체"란 표현과 호환되어 사용된다.
본 명세서에 사용된 "KD"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리평형상수를 의미하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "이소타입(isotype)"이란 용어는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화된 항체 클래스(예, IgM 또는 IgG1)를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "이소타입 변환(switching)"이란 항체 클래스 또는 이소타입이 하나의 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스 중 하나로 변화하는 현상을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "미변환 이소타입(non-switched isotype)"은 어떠한 이소타입 변환도 일어나지 않았을 때 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 의미한다; 즉 미변환된 이소타입을 암호화하는 CH 유전자는 보통 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 하류에 바로 위치한 최초의 CH 유전자이다. 이소타입 변환은 전형적 또는 비전형적 이소타입 변환으로 분류되어 있다. 전형적 이소타입 변환은 돌연변이유전자에 있는 적어도 하나의 변환 서열 영역을 수반하는 재조합 사건에 의해 일어난다. 비전형적 이소타입 변환은, 예컨대 사람 σμ와 사람 Σμ(δ 관련 결실) 사이에 상동성 재조합 등에 의해 일어날 수 있다. 다른 비전형적 변환 기작으로서, 예컨대 특히 돌연변이유전자간 및/또는 염색체간 재조합 등이 일어날 수 있고, 이소타입 변환을 실현할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "변환 서열"이란 용어는 변환 재조합에 원인이 되는 DNA 서열을 의미한다. "변환 공여체" 서열, 일반적으로 μ변환 영역은 변환 재조합 동안 결실되는 작제물 영역의 5'(즉, 상류)일 것이다. "변환 수용체" 영역은 결실될 작제물 영역과 교체 불변 영역(예, γ, ε 등) 사이일 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위는 없기 때문에, 최종 유전자 서열은 일반적으로 작제물로부터 예측할 수 없을 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "글리코실화 패턴"은 단백질에 공유 부착되는, 더 구체적으로 면역글로불린 단백질에 공유 부착되는 탄수화물 단위의 패턴으로서 정의되어진다. 이종성 항체의 글리코실화 패턴은, 당업자 중 한사람이 이종성 항체의 글리코실화 패턴을 돌연변이유전자의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비사람의 돌연변이 동물 종에 존재하는 글리코실화 패턴과 더 유사한 것으로 생각한다면, 그 패턴은 비사람 돌연변이 동물의 종에 의해 생산되는 항체에서 자연적으로 발생하는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사한 것으로 특징지워질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "자연적으로 발생하는"이란 용어는 물체에 적용된 경우, 그 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연의 근원에서 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형된 적이 없는, 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연적으로 발생하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "재배열된"이란 용어는 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 각각 암호화하는 형태에서 D-J 또는 J 분절에 바로 인접하여 V 분절이 위치해 있는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 배열을 의미한다. 재배열된 면역글로불린 유전자의 유전자좌는 배선 DNA와 비교하여 확인할 수 있고; 재배열된 유전자좌는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/노나머 상동성 요소를 보유할 것이다.
V 분절과 관련하여 본 명세서에 사용된"재배열되지 않은" 또는 "배선 형태"란 용어는 V 분절이 D 또는 J 분절에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 형태를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "핵산 분자"란 용어는 DNA 및 RNA 분자를 의미한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있으나, 이본쇄 DNA인 것이 바람직하다.
IL-15에 선택적으로 결합하는 항체 또는 항체부(예, VH, VL, CDR3)를 암호화하는 핵산을 언급할때 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "분리된 핵산 분자"는 IL-15 외에 다른 항원에 결합하는 항체 또는 항체부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열이 없는 핵산 분자를 의미하며, 상기 다른 서열은 사람 게놈 DNA에서 본래 상기 핵산에 인접해 있는 서열일 수 있다. 서열번호 1 내지 4는 사람 항IL-15 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열에 해당한다. 특히, 서열번호 1 및 2는 당해 항체의 VH에 상응하고 서열번호 3 및 4는 당해 항체의 VL에 상응한다.
특정 양태에서, IL-15에 결합하는 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8 내지 10에 제시된 3개의 CDR 중 하나 이상, 바람직하게는 3개 모두를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 5 내지 7에 제시된 3개의 CDR 중 하나 이상, 바람직하게는 3개 모두를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 또한 서열번호 1 내지 10에 제시된 서열의 "보존적 서열 변형" 또는 "보존적 서열 치환"을 포함하는 것으로서, 즉 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 크게 영향을 미치거나 변경시키지 않는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 변형을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위 지향성 돌연변이유발 및 PCR 매개의 돌연변이유발 등에 의해 서열번호 1 내지 10 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전성 극성 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 보유한느 아미노산(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 있다. 따라서, 사람 항IL-15 항체에서 예상된 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환되어도 바람직하다.
대안적으로, 다른 양태에 따르면, 돌연변이는 포화돌연변이유발법 등에 의해 항IL-15 항체 암호 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 그 결과 수득되는 변형된 항IL-15 항체는 결합 활성에 대해 선별할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 뉴클레오타이드 서열(중쇄 및 경쇄 가변 영역) 및/또는 본 명세서에 개시된 아미노산 서열(중쇄 및 경쇄 가변 영역)에 의해 암호화된 항체는 보존적으로 변형된 유사 서열에 의해 암호화되거나, 유사 서열을 함유하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 이러한 실질적으로 유사한 항체가 본 명세서에서 서열번호 1 내지 4로서 개시된 부분(즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 서열을 기반으로 하여 산출될 수 있는 방법에 대한 논의는 이하에 제시된다.
핵산인 경우, "실질적인 상동성"이란 용어는 두 핵산 또는 이의 지정된 서열을 적당한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬시켜 비교했을 때, 이 뉴클레오타이드의 적어도 약 80%, 보통 적어도 약 90% 내지 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%가 동일하다는 것을 나타낸다. 또는, 실질적인 상동성은 선택적인 하이브리드화 조건 하에서 분절들이 가닥의 보체에 하이브리드화할 때에도 존재한다.
아미노산 서열인 경우, "상동성"이란 용어는 적당한 삽입 또는 결실로 두 아미노산 서열을 최적으로 정렬시켜 비교했을 때 두 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.
두 서열 사이의 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입시킬 필요가 있는 각 갭의 길이, 갭의 수를 고려하여, 그 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성% = 동일한 위치의 #/총 위치의 # x 100). 두 서열 사이에 동일성 백분율의 측정과 서열의 비교는 수학적 알고리듬을 사용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오타이드 서열 사이에 동일성 백분율은 NWSgapdna를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(에서 이용할 수 있음)으로 측정할 수 있다. 또한, 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 이.메이어스와 더블유.밀러(E.Meyers and W.Miller; CABIOS, 4: 11-17(1989))의 알고리듬을 통합시켜, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 니들만과 운쉬(Needleman and Wunsch; J.Mol.Biol. (48): 444-453(1970)) 알고리듬을 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(에서 이용할 수 있음)에 통합시켜, 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4와 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 관련 서열들의 동정 등을 위해, 공공 데이터베이스를 조사하기 위한 "조회(query) 서열"로서 사용할 수도 있다. 이러한 조사는 문헌[Altschul, et al., J.Mol.Biol. 215: 403-10(1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 조사는 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위하여 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12를 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 조사는 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 수행하여, 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 만들기 위해, Gapped BLAST를 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402(1997)]에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 프로그램 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 매개변수가 사용될 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태에 존재할 수 있다. 핵산은 세포의 다른 성분이나 다른 불순물, 예컨대 세포의 다른 핵산이나 단백질로부터 표준 기술, 예컨대 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 기타 당업계에 공지되는 기술로 정제되었을 때 "분리된" 또는 "실질적으로 순수한" 것이다[F.Ausubel., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)].
본 발명의 핵산 조성물은 종종 cDNA, 게놈 또는 이의 혼합물에서 유래되는 자연 서열(변형된 제한 부위 등은 제외)에서도 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 암호 서열에서 이러한 돌연변이는 바람직하다면 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 자연의 V, D, J, 불변 서열, 변환 서열 및 기타 본 명세서에 기술된 이러한 서열들에서 유래되거나 실질적으로 상동성인 DNA 서열이 예상된다(여기서, "유래되는"은 서열이 다른 서열과 동일하거나 변형되는 것을 시사한다).
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동적으로 결합된" 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인헨서가 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호 서열에 작동적으로 결합된 것이다. 전사 조절 서열과 관련된 경우, "작동적으로 결합된"은 결합된 DNA 서열이 인접한 것을 의미하고, 두 단백질 암호 영역을 결합시키는데 필수적인 경우라면 인접하고 리딩 프레임 내에 위치하는 것을 의미한다. 변환 서열에서, '작동적으로 결합된'은 서열들이 변환 재조합을 수행할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 여기에 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 생각되어야 한다. 벡터의 1가지 종류는 "플라스미드"로서, 이는 추가 DNA 분절이 결합될 수 있는 원형의 이본쇄 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈에 결합될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 기원을 보유하는 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로 인해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 여기에 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게 "발현 벡터")로 언급되어 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 호환되어 사용되기도 한다. 하지만, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 발현 벡터의 다른 형태, 예컨대 바이러스 벡터(예, 복제 결손성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스)를 포함하는 것으로 생각되어야 한다.
본 명세서에 사용된, "피험체"란 용어는 임의의 사람 또는 사람을 제외한 동물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 염증성 질환, 예컨대 류마티스성 관절염과 같은 관절염이 있는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. "사람을 제외한 동물"이란 용어는 모든 척추동물, 예컨대 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 사람을 제외한 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 발명의 다양한 관점은 이하 소부문에서 더 상세히 설명될 것이다.
II. 만노스 함량에 영향을 미치는 인자
(a) 삼투질농도
다양한 세포 배양 매개변수는 포유동물 세포 배양물에서 발현된 재조합 당단백질의 만노스 함량에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 세포 배양 배지의 삼투질농도가 높을수록 만노스 잔기가 4개보다 많은 당단백질(즉, M5 종 또는 그 이상)의 조성물내 백분율이 더 높아진다는 것이 본 발명을 통해 발견되었다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서 세포 배양 배지의 삼투질농도는 발현된 당단백질의 만노스 함량을 감소 또는 제어하기 위해 약 600mOsm/Kg 이하으로 유지한다(예컨대, 약 250mOsm/Kg 내지 약 600mOsm/Kg).
포유동물 세포 배양 시, 이 세포 배양 배지의 삼투질농도는 약 550mOsm/Kg 미만, 또는 약 500mOsm/Kg 미만, 또는 약 450mOsm/Kg 미만, 또는 약 400mOsm/Kg 미만, 또는 약 380mOsm/Kg 미만, 또는 약 200mOsm/Kg 내지 약 600mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 550mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 500mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 450mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 400mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 380mOsm/Kg, 또는 약 250mOsm/Kg 내지 약 350mOsm/Kg으로 유지시킨다.
삼투질농도를 바람직한 범위로 수득하기 위해, 배양 배지 중에 각종 구성 성분의 농도를 조정할 수 있다. 예를 들어, 삼투질농도를 증가시키기 위해 배양 배지에 첨가할 수 있는 용질에는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 가수분해된 동물 단백질, 예컨대 펩톤, 대사되지 않는 중합체, 비타민, 이온, 염, 당, 대사산물, 유기산, 지질 등이 있다. 그러나, 배양 배지 중의 다른 구성성분의 농도(들)의 변형을 통해 원하는 삼투질농도를 수득할 수도 있다는 것을 이해하고 있어야 한다.
다른 양태에서, 삼투질농도는 배양 배지에 1종 이상의 삼투보호제를 첨가하여 전술한 범위 내로 조정할 수 있다. 삼투보호제의 예는 당업계에 공지되어 있고, 그 예로는 베타인, 글리신, L-트레오닌 및 L-프롤린, 이의 유도체, 예컨대 글리신 베타인 및 베타인 알데하이드 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 베타인을 약 20mM 이상의 농도, 또는 약 1mM 내지 약 100mM의 농도, 더욱 바람직하게는 약 20mM 내지 약 30mM의 농도로 함유한다.
삼투질농도는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 본 명세서에 기술된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 삼투압계는 피셔 사이언티픽(미국 펜실베니아 피츠버그 소재)에서 상표명 OSMETTE로 시판되는 것 등이 있으며, 이것은 세포 배양 배지의 삼투질농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 또는, Osmette 모델 2007(Precision Systems, Inc., Natick, MA)도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 삼투질농도는 세포 배양 배지 중의 염, 당, 펩톤, 아미노산 및 암모늄 중 하나 이상의 농도를 변형시켜 조정할 수 있다.
또 다른 양태에서, 삼투질농도에 영향을 미치는 전술한 매개변수는 만노스 함량의 조절(예, 감소)을 위해 세포를 배양하는 온도와 시간 기간의 조작에 의해 조합될 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 다양한 세포 배양 매개변수는 단독으로 조정되거나 조합되어 조정되어 재조합 당단백질의 만노스 함량을 조절할 수 있다.
(i) 칼륨 및 나트륨 농도
본 발명으로 이어진 실험에서, 배양 배지에 칼륨(K+) 농도를 증가시키면 당단백질의 만노스 고함량이 수득되는 것으로 확인되었다. 따라서, 일 양태로서 본 발명은 K+ 농도가 약 70mM 이하(예컨대, 약 10mM 내지 약 50mM)인 세포 배양 배지를 이용한다.
전술한 바와 같이, 세포 배양 배지의 칼륨 농도는 단독으로 제어되거나, 또는 삼투질농도에 영향을 미치는 본 명세서에 기술된 다른 요인 중 하나 이상과 함께 제어될 수 있다. 특정 양태에서, 배양 배지는 추가로 약 200mM 이하(예컨대, 약 50mM 내지 약 100mM)의 나트륨 농도를 포함한다.
(ii) 아미노산
세포 배양 배지의 삼투질농도에 영향을 미치고(미치거나) 재조합 발현된 단백질의 만노스 고함량에 원인이 되는 것으로 발견된 다른 요인은 배지에 존재하는 아미노산의 농도와 종류이다. 예를 들어, 특정 양태에서, 배지에 총 20가지 아미노산의 농도를 배가시키면 만노스 함량이 증가한다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 감소된 아미노산 농도로 조정한다. 특정 배지에서, 아미노산 농도는 약 절반으로 감소된다.
다른 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1 이상의 아미노산이 실질적으로 없는 배지이다.
(iii) 당
세포 배양 배지의 삼투질농도에 영향을 주고/주거나 재조합적으로 발현된 단백질의 만노스 고함량에 기여하는 것을 밝혀진 기타 인자는 배지내 당의 농도 및 유형이다. 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 약 1mM 내지 약 90mM 농도의 글루코스를 포함한다.
(iv) 암모늄
세포 배양 배지의 삼투질농도에 영향을 미칠 수 있고(있거나) 재조합 발현된 단백질의 만노스 고함량에 원인이 되는 다른 요인은 약 30mM 이하(예, 약 0mM 내지 약 10mM)의 암모늄 농도이다. 일 양태에서, 암모늄 농도는 약 10mM 이하이다.
(v) 펩톤
세포 배양 배지의 삼투질농도에 영향을 미치고(미치거나) 재조합 발현된 단백질의 만노스 고함량에 원인이 되는 것으로 발견된 다른 요인은 배지에 사용된 펩톤의 농도 및 종류이다. 펩톤은 가수분해된 동물 단백질에서 생산된 배지 보충물이다. 펩톤의 근원은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 동물 부산물, 젤라틴 및 식물 재료 등이 있다. 펩톤의 예에는 약 0.5g/L 내지 약 60g/L의 농도의 효모 추출물, 효모 가수분해물, 대두 펩톤, 대두 가수분해물, 밀 펩톤 및 밀 가수분해물이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
(vi) 비타민
세포 배양 배지의 삼투질농도에 영향을 미치고(미치거나) 재조합 발현된 단백질의 만노스 고함량에 원인이 되는 것으로 발견된 다른 요인은 배지에 사용된 비타민의 농도와 종류이다. 특정 양태에서, 세포 배양 배지는 비오틴, D-칼슘, 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, I-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살 HCl, 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 시아노코발라민으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 비타인을 약 0.00005g/L 내지 약 0.9g/L의 농도로 포함한다.
(b) 온도
재조합 발현된 단백질의 만노스 고함량에 원인인 것으로 발견된 다른 요인은 세포 배양물이 유지되는 온도이다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 숙주 세포가 배양되는 온도는 재조합 발현된 당단백질의 만노스 함량을 조절(예, 감소)하기 위해 단독으로 조정하거나, 또는 이전 요인들(예, 세포 배양 시간 및 삼투질농도에 영향을 미치는 요인의 조정)과 함께 조정한다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 약 31℃, 또는 약 32℃, 또는 약 33℃, 또는 약 34℃, 또는 약 35℃, 또는 약 36℃, 또는 약 37℃, 또는 약 38℃에서 배양한다.
III. 세포 배양 절차
본 발명의 방법에 따르면, 숙주 세포는 만노스 저함량의 재조합 당단백질을 발현할 수 있게 하는 배지에서 배양된다. 적당한 세포 배양 절차와 조건은 당업계에 공지되어 있다. 숙주 세포(예, CHO 및 NSO 세포)는 매우 다양한 형식과 배양 용기에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 대량 또는 소량의 당단백질 생산용으로 설계된 형식으로 배양될 수 있다. 또한, 숙주 세포는 배양 플라스크 또는 접시의 바닥에 부착 배양되거나, 또는 교반 플라스크, 생물반응기 또는 회전 병 배양 중에 현탁물로 존재할 수 있다. 특정 양태에서, 재조합 당단백질을 상업적으로 적절한 양으로 생산하기 위해서는 숙주 세포를 생물반응기에서, 바람직하게는 용량이 약 2리터 이상, 또는 약 5리터 이상, 또는 약 10리터 이상, 또는 약 50리터 이상, 또는 약 100리터 이상, 또는 약 500리터 이상, 또는 약 1000리터 이상, 또는 약 1500리터 이상, 또는 약 2000리터 이상인 생물반응기에서 증식시킬 수 있다.
특정 양태에서, 숙주 세포는 액체 배지에서 배양(예, 유지 및/또는 증식)할 수 있고, 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양(예, 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 폭기 스피너 배양 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해 연속 또는 간헐적으로 배양되는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 진탕 플라스크에서 배양된다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 발효조(예, 발효 공정)에서 배양된다. 발효 공정은 회분식, 유가-회분식 및 연속식 발효 방법을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. "회분식 공정" 및 "회분식 발효"라는 용어는 배지, 영양소, 보충 첨가제 등의 조성이 발효 초기에 설정되어 발효 동안 변경되지 않는 폐쇄계를 의미한다: 하지만, 과도한 배지 산성화 및/또는 미생물 치사를 방지하기 위해 pH 및 산소 농도와 같은 요인을 제어하기 위한 시도는 수행될 수 있다. "유가-회분식 공정" 및 "유가-회분식" 발효란 용어는 1종 이상의 기질 또는 보충물이 첨가(예컨대, 증분만큼 첨가되거나 연속 첨가되고)되거나, 발효가 진행됨에 따라 세포 배양 조건이 변화하는 것을 제외하고는 회분식 발효를 의미한다. "연속 공정" 및 "연속 발효"란 용어는 일정한 발효 배지가 발효조에 연속적으로 첨가되고, 사용되거나 "조정된" 배지의 동량이 동시에 제거되어, 예컨대 원하는 산물(예, 재조합 당단백질)의 회수 등이 수행되는 시스템을 의미한다. 이와 같이 다양한 공정들이 개발되었고, 당업계에 공지되어 있다.
특정 양태에서, IL-15에 결합하는 재조합 사람 모노클로날 항체를 발현하는 숙주 세포는 회전 병, 2리터 스피너 플라스크 또는 다른 적당한 배양 시스템에서 증식된다.
IV. 당단백질의 회수
폴리펩타이드 생산 단계 후, 당해의 재조합 당단백질은 배양 배지로부터 당업계에 공지된 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 당해의 당단백질은 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수도 있지만, 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수하는 것이 바람직하다.
특정 양태에서, 배양 배지 또는 용해물은 원심분리하여 미립의 세포 파편을 제거한다. 그 다음, 불순물인 용해성 단백질과 폴리펩타이드를 적당한 정제 절차로 제거하여 당단백질을 정제한다. 정제 절차의 예에는 면역친화성 또는 이온교환 컬럼에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 크로마토그래피 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 설페이트 침전; Sephadex G-75 등을 이용한 겔 여과; 및 IgG와 같은 불순물을 제거하기 위한 프로테인 A 세파로스 컬럼 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 정제 동안에 단백분해성 분해를 억제하기 위해, 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)와 같은 프로테아제 억제제도 사용할 수 있다. 당업자라면, 당해 재조합 당단백질에 적합한 정제 방법은 재조합 세포 배양에서 발현 시, 당단백질의 특성에 변화를 감안하여 변형을 필요로 하기도 한다는 것을 잘 알고 있을 것이다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 발현된 재조합 당단백질은 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일반적으로, 항체는 맨처음 ELISA에 의해 특징을 규명한다. 예를 들어, 미량역가 평판을 정제된 항체, 예컨대 PBS 중의 IL-15로 코팅하고, 그 다음, 무관련 단백질, 예컨대 PBS에 희석된 소혈청알부민(BSA)으로 차단한다. 배양된 세포 유래의 추출물의 희석액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1 내지 2시간 동안 항온배양한다. 평판을 PBS/Tween 20으로 세척한 다음, 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소-항사람 IgG Fc 특이적 폴리클로날 시약과 37℃에서 1시간 동안 항온배양한다. 세척 후, 평판을 ABTS 기질로 발색시키고, OD 405에서 분석한다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 항체가 고유의 에피토프들에 결합하는지를 측정하기 위해, 각 항체는 시판되는 시약(Pierce, Rockford, IL)으로 비오틴화할 수 있다. 비오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 정제된 항체의 이소타입을 측정하기 위해, 이소타입 ELISA를 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 미량역가 평판의 웰은 항사람 Ig 10㎍/ml로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅할 수 있다. 5% BSA로 차단시킨 후, 평판을 10㎍/ml의 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 그 다음, 웰은 사람 IgG1 또는 다른 사람 이소타입 특이적인 접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 평판은 전술한 바와 같이 발색시키고 분석한다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산한 재조합 당단백질은 IL-15에 결합하는 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. IL-15를 발현하는 생세포에 IL-15 모노클로날 항체가 결합하는지를 검사하기 위해, 유동세포분석법(flow cytometry)을 사용할 수 있다. 간략히 설명하면, 막 결합된 IL-15를 발현하는 세포주 및/또는 사람 PBMC(표준 증식 조건 하에서 증식된 것)를 0.1% BSA와 0.01% NaN3을 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 4℃에서 1시간 동안 혼합시킨다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색 시와 동일한 조건 하에 플루오레세인 표지된 항사람 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단세포 상의 관문에 대해 광 스캐터 및 사이드 스캐터 성질을 이용하여 FACScan 기구로 분석할 수 있다. 형광 현미경을 이용한 대체 분석법은 유동세포분석법과 함께 또는 유동세포분석법 대신에 사용될 수 있다. 세포는 전술한 바와 같이 정확하게 염색하여 형광현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법은 각 세포를 가시화하지만, 항원의 밀도에 따라서 감도는 감소할 수 있다.
항IL-15 사람 IgG는 IL-15 항원과의 반응성이 웨스턴 블롯팅에 의해 추가 검사될 수 있다. 간단히 설명하면, IL-15를 발현하는 숙주 세포 유래의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 처리할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 전이시킨 다음, 20% 마우스 혈청으로 차단시키고, 검사될 모노클로날 항체로 탐침 처리했다. 사람 IgG 결합은 항사람 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하고 BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St.Louris, MO)로 발색시켜 검출할 수 있다.
V. 약제학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 만노스 저함량의 재조합 당단백질 1종 또는 배합물을 함유하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 만노스 저함량의 1종 이상의 치료 단백질, 예컨대 만노스 저함량인 치료 항체 또는 항원 결합 단편(예컨대, IL-15에 결합하는 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함한다. 다른 특정 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 만노스 저함량의 1종 이상의 재조합 당단백질을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 복합 요법으로, 즉 다른 제제와 함께 투여될 수도 있다. 예를 들어, 복합 요법은 본 발명의 조성물을 1종 이상의 추가 치료제, 예컨대 항염증제, DMARD(질병 변형 항류마티스 약물), 면역억제제, 화학요법 및 건선제와 함께 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 방사선요법과 함께 투여될 수 있다. 다른 항체, 예컨대 CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체와의 공동투여 역시 본 발명에 포함된다. 이와 같은 CD4 특이적 항체 또는 IL-2 특이적 항체와의 조합은 자가면역질환 및 이식거부를 치료하는데 특히 유용한 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용된, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예컨대, 주사 또는 주입에 의해)에 적합한 것이 바람직하다. 투여 경로에 따라, 재조합 당단백질, 예컨대 이중특이적 및 다중특이적인 항체 분자는 이 화합물을 실활시킬 수 있는 산 및 다른 자연 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 모화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 임의의 바람직하지 않은 독물 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다(예, Berge, S.M., et al., J.Pharm.Sci. 66:1-19(1977)). 이러한 염의 예에는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 있다. 산 부가 염에는 비독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등은 물론 비독성 유기산, 예컨대 지방족 모노카복시산 및 디카복시산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등에서 유래된 염이 있다. 염기 부가 염에는 알칼리성 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등은 물론, 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등에서 유래된 염이 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 활성 화합물은 이 화합물이 급속 방출되지 않게 하는 담체, 예컨대 임플란트, 경피성 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 조절 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생체분해성, 생체화합성 중합체가 사용될 수 있으며, 그 예로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등이 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있거나 특허되어 있다[예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 투여 경로로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서, 본 발명의 화합물은 실활을 방지하는 물질로 코팅되거나 그 물질과 함께 투여되어야 하는 경우가 있다. 예를 들어, 화합물은 적당한 담체, 예컨대 리포좀 또는 희석제 중에서 피험체에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제에는 식염수 및 수성 완충 용액이 있다. 리포좀은 통상의 리포좀뿐만 아니라 수중유중수(water-in-oil-in-water) CGF 에멀젼을 포함한다(Strejan et al., J.Neuroimmunol. 7:27(1984)).
약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질과 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비화합성이지 않은 한, 본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 것으로 생각되어야 한다. 보강용 활성 화합물도 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
치료용 조성물은 일반적으로 멸균성이고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액이나, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 약물 고농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로서 조제될 수 있다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성의 유지는 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키거나, 계면활성제를 사용하는 등의 방법으로 달성할 수 있다. 많은 경우에, 조성물은 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 염화나트륨 등의 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 주사성 조성물의 장기적 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴 등을 조성물에 첨가함으로써 수행될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을, 필요한 경우에 앞에 열거한 하나의 성분 또는 성분의 배합물과 함께 적당한 용매에 첨가한 뒤, 멸균 미세여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 앞에서 열거한 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 매개제에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 제조 시에, 바람직한 제조방법은 활성 성분과 미리 멸균 여과한 용액 유래의 임의의 다른 바람직한 성분의 분말을 생산하는 진공건조 및 냉동 건조(동결건조)이다.
투약 섭생은 최적의 원하는 반응(예, 치료적 반응)을 제공하도록 조정한다. 예를 들어, 단독 볼러스가 투여되기도 하고, 여러 분할 용량이 경시적으로 투여되기도 하며, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사람 항체는 피하 주사로서 매주 1회 또는 2회씩 투여되거나, 피하 주사로서 매달 1회 또는 2회씩 투여될 수 있다. 특히, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 조제되는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투약 단위 형태는 치료될 피험체의 단위 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것이며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 산출하도록 계산된 활성 화합물의 소정의 함량을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 고유의 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위한 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 한계에 의해 직접 좌우되고 지시된다.
약제학적으로 허용되는 항산화제의 예에는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 오일 용해성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파 토코페롤 등; (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 구연산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 있다.
치료용 조성물인 경우, 본 발명의 제형은 경구, 비측, 국소(예컨대, 협측 및 설하 투여용 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 제형을 포함한다. 이러한 제형은 단위 용량 형태로 제공되는 것이 편리하며, 의약 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 단일 투약 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 피험체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투약 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 산출하는 조성물의 함량일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 함량은 활성 성분 약 0.001% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 30%일 것이다.
질 투여에 적합한 본 발명의 제형으로는, 또한 당업계에 적당한 것으로 알려진 바와 같은 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 포옴 또는 스프레이 제형이 있다. 본 발명의 조성물을 국소 또는 경피 투여하기 위한 투약 형태에는 파우더, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제가 있다. 활성 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 완충액 또는 분사제와 멸균 조건 하에서 혼합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"이란 표현은 장 및 국소 투여외에 다른 투여 방식, 일반적으로 주사를 의미하며, 그 예로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막밑, 거미막밑, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있는 적당한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적당한 혼합물, 식물유, 예컨대 올리브유, 및 주사성 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트가 있다. 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제 사용에 의해 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 추가로 방부제, 흡습제, 유화제 및 분산제와 같은 보강제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 전술한 멸균 절차의 사용과 각종 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등의 등장제를 조성물에 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제 형태의 지속적인 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제의 첨가에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 화합물은 사람 및 동물에게 약제로서 투여될 때, 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성 성분을 예컨대 0.001% 내지 90%(더욱 바람직하게는, 0.005% 내지 70%, 예컨대 0.01 내지 30%)로 함유하는 약제학적 조성물로서 투여될 수도 있다.
적당한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은 선택된 투여 경로에 관계없이, 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 투약 형태로 조제된다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에게 독성이지 않고 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에서 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양이 수득되도록 변동될 수 있다. 선택된 투약 수준은 다양한 약동학적 요인, 예컨대 이용된 본 발명의 특정 조성물, 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 시간, 치료 기간, 이용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 종래 병력, 및 기타 의약 기술분야에 공지된 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 당해 기술분야의 숙련자인 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 쉽게 측정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 처음에는 약제학적 조성물에 이용된 본 발명의 화합물의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 양보다 낮은 수준으로 이용하기 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투약량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적당한 1일 용량은 치료 효과를 산출하는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 전술한 요인들에 따라 달라질 것이다. 투여는 목표 부위 가까이로 투여되는 것이 바람직한, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여인 것이 바람직하다. 바람직한 경우에, 치료 조성물의 효과적인 1일 용량은 하루 동안 적당한 간격으로 분리 투여되는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 준용량으로서, 선택적으로 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 단독으로 투여되는 것이 가능하기도 하지만, 약학적 제제(조성물)로서 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의약 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 5,399,163, 5,383,851, 5,321,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 공지된 임플란트 및 모듈의 예에는 약물을 조절된 속도로 분배하는, 이식가능한 미량주입 펌프를 개시하는 미국 특허 4,487,603; 약물을 피부를 통해 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 미국 특허 4,486,194; 약물을 정확한 주입 속도로 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 4,447,233; 지속적인 약물 전달을 위한, 변동성 유체 이식성 주입 장치를 개시하는 미국 특허 4,447,224; 멀티챔버 구획을 보유하는 삼투압성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 4,439,196; 및 삼투압성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 4,475,196이 있다. 이러한 이식체, 전달 시스템 및 모듈의 여타 다른 종류는 당업자에게 공지되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 치료적 당단백질은 생체내에 적당한 분포하도록 조제될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 많은 고친수성 화합물을 차단한다. 따라서, 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과하도록 하기 위해(필요한 경우), 예를 들어 리포좀으로 조제할 수 있다. 리포좀의 제조방법에 대해서는 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되어, 표적화된 약물 전달을 증가시키는 1 이상의 잔기를 포함할 수 있다(예컨대, V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol. 29: 685(1989)). 표적화 잔기의 예에는 다음과 같은 것이 있다:폴레이트 또는 비오틴(예컨대, 미국 특허 5,416,016(Low et al.)); 만노사이드(Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038(1988)); 항체(P.G.Bloeman et al. FEBS Lett. 357: 140(1995); M.Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180(1995)); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. Am.J.Physiol. 1233: 134(1995)), 이 중 여러 종은 본 발명의 제형 및 발명된 분자의 성분을 형성할 수 있다; p120(Schreier et al., J.Biol.Chem. 269: 9090(1994)); 또한, K.Keinanen; M.L.Laukkanen FEBS Lett. 346: 123(1994); J.J.Killion; I.J.Fidler Immunomethods 4:273(1994) 참조). 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀으로 조제되고, 더욱 바람직한 양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 양태에서, 리포좀의 치료 화합물은 종양 또는 감염의 근접 부위로 볼러스 주사에 의해 전달된다. 조성물은 주사능이 용이한 정도로 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존적이어야 한다.
다른 양태에서, 본 발명의 재조합 당단백질은 태반을 가로지르는 수송을 방지하거나 또는 감소되도록 조제될 수 있다. 이것은 항체의 PEG화 또는 F(ab)2' 단편의 사용과 같은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 문헌["Cunningham-Rundles C3 Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates." Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190; and to Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283]을 참고할 수 있다. 이것은 특히 당단백질이 재발성 자연 유산의 치료 또는 방지에 사용되는 항체일 때 적당하다.
류마티스성 관절염의 "치료적 유효량"은 바람직하게는 환자의 ACR20 예비 개선의 정의를 제공하는 것이며, 더욱 바람직하게는 ACR50 예비 개선의 정의, 더욱 더 바람직하게는 ACRD70 예비 개선의 정의를 제공하는 것이다.
ACR20 예비 개선의 정의는 압통관절수(TCJ) 및 종창관절수(SWJ)의 ≥20% 개선; 및 다음과 같은 5가지 평가 중 3가지에서의 ≥20% 개선으로서 정의된다: 환자 통증 평가(VAS), 환자의 총괄 평가(VAS), 의사의 총괄 평가(VAS), 환자의 자가평가 장애(HAQ), 급성기 작용물질(CRP 또는 ESR).
이와 같은 방식으로, ACR50 및 ACR70도 각각 ≥50% 및 ≥70%의 개선으로서 정의된다. 더 상세한 설명은 문헌[Felson et al. in American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis: Arthritis Rheumatism 38: 727-735(1995)]을 참고한다.
암을 억제하는 화합물의 능력은 사람 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 또는, 조성물의 이러한 성질은 화합물이 억제하는 능력, 예컨대 당업자에게 공지된 분석법에 의한 시험관내 억제를 조사하여 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 또는 피험체의 증후군을 경감시킬 수 있다. 당업자는 피험체의 크기, 피험체 증후군의 병도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인을 기초로 하여 상기 유효량을 측정할 수 있을 것이다.
또한, 건선을 치료하거나 예방하는 항체의 능력도 당업계에 공지된 방법에 따라 평가할 수 있다.
조성물은 멸균성이고 주사기에 의해 전달가능한 정도로 유체이어야 한다. 담체는, 물 외에도, 등장성 완충 식염수 용액, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적당한 혼합물일 수 있다. 적당한 유동성의 유지는 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키거나, 계면활성제를 사용하는 등의 방법으로 달성할 수 있다. 많은 경우에, 조성물은 당, 만니톨이나 소르비톨과 같은 폴리알콜 및 염화나트륨 등의 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 주사성 조성물의 장기적 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴 등을 조성물에 첨가함으로써 달성될 수 있다.
활성 화합물이 전술한 바와 같이 적당히 보호된다면, 화합물은 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 이하 실시예에서 설명될 것이며, 이 실시예는 추가 한정으로서 간주되어서는 안 된다. 본 명세서에 언급된 서열목록, 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허출원들의 내용은 본 발명에 참고인용된 것임이 분명하다.
이하에 논의된 모든 실시예에서, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역과 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 보유하는, IL-15에 결합하는 완전 사람 모노클로날 항체는 재조합 당단백질의 예로서 사용되었다(이하, 실시예에서 "전형적인 재조합 당단백질"이라고 명명된다). 하지만, 모든 재조합 당단백질의 만노스 함량이 본 명세서에서 논의된 바와 같이 조절될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
실시예 1: 삼투질농도는 재조합 당단백질의 만노스 함량에 영향을 미친다.
당단백질의 만노스 함량에 미치는 삼투질농도의 효과를 조사하기 위해, 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 함량은 진탕 플라스크 배양과 생물반응기 배양 중의 삼투질농도를 변화시켜 분석했다. 도 1에서 증명되듯이, 배지의 삼투질농도를 약 500mOsm/Kg에서 약 580mOsm/Kg으로 증가시키면, 만노스 고함량은 약 14%에서 약 24%로 증가했다.
다른 실험으로서, 삼투질농도와 만노스 고함량 사이의 관계에 대한 추가 증거를 마련하기 위해 삼투보호제인 베타인 20mM를 세포 배양물에 첨가했다. 다음 표는 이러한 실험의 결과를 정리한 것이다.
샘플 고함량 만노스%
36℃, 배양 배지 19
36℃, 배양 배지 + 베타인 14
37℃, 배양 배지 18
37℃, 배양 배지 + 베타인 13
만노스 고함량과 삼투질농도 사이의 상관성에 대한 또 다른 증거는 도 2에 도시했다. 세포 배양 배지에 약 20mM 베타인의 첨가는 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량을 급격히 감소시켰다. 예를 들어, 삼투질농도가 약 300mOsm/Kg일 때, 만노스 고함량은 베타인 약 0mM에서 약 9.5%인 것이 20mM 베타인의 첨가 시 약 4.5%로 감소했다(즉, 만노스 고함량 약 5% 감소). 이와 마찬가지로, 삼투질농도가 약 400mOsm/Kg일 때, 만노스 고함량은 약 0mM 베타인에서 약 16.5%인 것이 20mM 베타인 첨가 시 약 7.5%로 감소했다(즉, 만노스 고함량 약 9% 감소). 더욱이, 약 500mOsm/Kg의 삼투질농도에서, 만노스 고함량은 약 0mM베타인에서 약 25%인 것이 약 20mM 베타인 첨가 시 약 9.5%로 감소했다(즉, 만노스 고함량 약 15.5% 감소).
실시예 2: 배양물의 K+의 농도는 재조합 당단백질의 만노스 함량을 조절하기 위해 제어될 수 있다.
다른 실험으로서, 세포 배양 배지에 1종 이상의 염의 농도가 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 함량(예, 만노스 고함량)을 조절(예, 감소)하기 위해 제어되었다. 전형적인 실험에 따라, 세포 배양 배지에 K+의 농도를 제어했고, 만노스 함량, 구체적으로 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 당단백질을 발현하는 숙주 세포를 15mM 또는 45mM에서 배양하여 생산된 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량(즉, M5 종 이상)을 조사했다.
도 3과 4에서 확인되듯이, 삼투질농도가 증가함에 따라 만노스 고함량의 백분율도 약 3%에서 약 13%로 증가했다. 약 370mOsm/Kg 내지 약 500mOsm/Kg 사이의 삼투질농도는 만노스 고함량을 당단백질 조성물의 10%가 넘게 증가시켰다.
추가 실험으로서, 도 5에 제시된 것처럼, 세포 배양 배지에 K+ 농도의 최적 농도 범위는 재조합 당단백질의 만노스 고함량을 10% 이하의 백분율로 유지시키기 위해 약 0mM 내지 약 70mM이어야 하는 것으로 입증되었다.
실시예 3: 세포 배양 배지에 Na+의 농도는 재조합 당단백질의 만노스 함량을 조절하기 위해 제어될 수 있다.
또 다른 실험으로서, 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량을 조절(예컨대, 감소)하기 위해 Na+의 농도를 제어했다. 전형적인 실험에서, 세포 배양 배지에 Na+ 농도의 증가는 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량의 백분율을 증가시키는 것으로 확인되었다.
도 6은 만노스 고함량의 백분율을 10% 이하로 유지시키기 위한 Na+의 최적 농도 범위가 약 0mM 내지 약 200mM 사이라는 것을 입증한다.
실시예 4: 아미노산은 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 원인이다.
다른 실험으로서, 세포 배양 배지에 존재하는 아미노산이 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 미치는 효과를 조사했다. 도 7에서 확인되듯이, 공급 배지에 20가지 아미노산의 농도를 2배로 하면, 재조합 당단백질의 만노스 고함량의 백분율이 약 4%에서 약 10%로 증가했다. 이 실험은 아미노산이 농축된 배지가 이 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 발현된 만노스 고함량 당단백질의 함량을 증가시킨다는 것을 입증했다.
실시예 5: 공급 배지 조성물의 전체 조성은 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 원인일 수 있다.
이 실험에서는, 공급 배지의 여러 종류가 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 미치는 효과를 조사했다. 구체적으로, 변형되지 않은 배지와 비교하여, 아미노산 L-알라닌, L-아르기닌 HCl, L-아스파르트산 및 L-글루탐산이 실질적으로 없고, CaCl, MgCl, KCl 및 피루브산나트륨의 농도가 더 낮은 변형 공급 배지가 전형적인 재조합 당단백질의 만노스 고함량에 미치는 효과를 조사했다. 도 8에 예시되듯이, 변형 공급 배지 사용 시, 만노스 고함량은 약 4%이지만, 변형되지 않은 배지의 사용 시, 그 함량은 약 13%로 증가했다.
실시예 6: 만노스 고함량에 미치는 온도의 효과
만노스 고함량에 미치는 4가지 온도의 효과를 2개의 다른 공급 배지를 이용하여 조사했다. 다음 표 II의 데이터는 온도 증가가 만노스 고함량의 백분율을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
샘플명 36℃ 35℃ 34℃
농도(g/L) 고함량 만노스% 농도(g/L) 고함량 만노스% 농도(g/L) 고함량 만노스%
공급 배지 1 3.2 14 3.1 17 2.8 22
공급 배지 2 2.0 13 2.1 13 2.1 14
본 명세서는 여기에 인용된 참고문헌의 교시에 비추어서 가장 완전하게 이해된다. 본 명세서 중의 양태들은 본 발명에 속하는 양태들의 예로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 당업자라면, 이러한 다른 많은 양태들이 본 발명에 속하는 것이라는 것을 잘 알고 있을 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌과 특허문헌 및 수탁번호 또는 데이터베이스 참조번호로 명시된 서열들은 그 전체가 참고인용된 것이다. 참고인용된 자료가 본 발명과 모순되거나 일치하지 않는다면, 본 발명은 그러한 자료를 대신할 것이다. 본 명세서 중의 임의의 참고문헌의 인용은 그 참고문헌들이 본 발명의 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
본 명세서는 물론 청구의 범위에 사용된 성분의 양, 세포 배양, 처리 조건 등을 나타내는 모든 수치는 다른 언급이 없는 한, 모두 "약"이란 용어에 의해 수식되어 있는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 다른 반대 표시가 없는 한, 모든 수치의 매개변수는 근사치이며, 본 발명에서 수득하고자 하는 원하는 성질에 따라 매우 달라질 수 있다. 다른 표시가 없는 한, 일련의 요소 앞의 "적어도"란 용어는 일련의 모든 요소들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자라면, 겨우 통상적인 실험으로, 본 명세서에 기술된 본 발명의 구체적 양태들의 많은 등가물을 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구의 범위에 포함되는 것으로 생각되어야 한다.
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Claims (42)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. IL-15에 결합하고 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 재조합적으로 생성되는 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 숙주 세포를 삼투질농도가 250 내지 600mOsm/Kg인 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하며, 상기 배양 배지가 10 내지 70mM 농도의 칼륨, 50 내지 200mM 농도의 나트륨 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 염, 및 20mM 내지 30mM 농도의 베타인을 포함하는 것인,
    상기 재조합적으로 생성되는 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 N-결합 올리고사카라이드 당 5 내지 9개의 만노스 잔기를 갖는 당단백질을 감소시키는 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 배양 배지의 삼투질농도가 250 내지 500mOsm/Kg인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 배양 배지의 삼투질농도가 250 내지 380mOsm/kg인 방법.
  7. 삭제
  8. 제3항에 있어서, 배양 배지가
    (a) 10mM 내지 50mM 농도의 칼륨;
    (b) 50mM 내지 100mM 농도의 나트륨; 및
    (c) 상기 (a)와 (b)의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 염을 포함하는 방법.
  9. 제3항에 있어서, 배양 배지가 5% 미만의 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산 및 글루탐산을 함유하는 것인 방법.
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  17. 제3항에 있어서, 숙주 세포가 5 내지 14일 동안 배양되는 방법.
  18. 제3항에 있어서, 숙주 세포가 31℃ 내지 38℃의 온도에서 배양되는 방법.
  19. 제3항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
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