KR101247610B1 - 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 구조의 나노입자 이합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 표면에 올리고뉴클레오티드로 결합된 금 또는 은 코어(core) 및 상기 코어를 둘러싼 금 또는 은 쉘(shell)로 이루어진 코어-쉘 나노 입자로 이루어진 나노입자 이합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 코어-쉘 나노입자 이합체와 이의 제조방법, 및 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 라만 활성분자가 나노 입자로 구성된 이합체의 접합부에 위치하도록 제조된 나노입자 이합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 코어의 표면에 올리고뉴클레오티드로 결합되어 있으며, 상기 코어를 둘러싼 금 또는 은 쉘(shell)로 이루어진 코어-쉘 나노 입자 이합체에 관한 것이다. 코어를 형성하는 나노입자는 금 또는 은 나노입자이다. 또한, 본 발명은 상기 코어-쉘 나노입자 이합체, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
생물학적 샘플 및 기타 샘플로부터의 단일 분자에 대한 고감도의 정확한 검출은 의학 진단학, 병리학, 독물학, 환경 샘플링, 화학적 분석 및 기타 많은 분야에서 널리 사용될 수 있으며, 이를 위하여 지난 수년간 생물-화학 분야에서는 소량의 합성물질 및 생체 분자의 대사, 분포 및 결합 등을 연구하는데 특정 물질로 표지된 나노 입자 및 화학물질을 널리 사용해 왔다. 대표적으로는 방사성 동위원소를 이용한 방법, 유기 형광물질을 이용한 방법, 무기 물질인 양자점(Quantum dots)을 이용한 방법이 있다.
방사성 동위원소를 이용한 방법에서 방사성 표지물질(Radioactive isotope)로는 생체 내에서 널리 발견되는 1H, 12C, 31P, 32S, 127I 등의 방사성동위체인 3H, 14C, 32P, 35S, 125I 등이 널리 사용된다. 방사성 동위원소들은 비 방사성의 동위체와 화학적 성질이 거의 비슷하여 임의로 치환이 가능하고, 방출 에너지가 비교적 커서 소량의 검출도 가능하다는 장점이 있기 때문에 오랫동안 사용되어 왔다. 그러나, 인체에 해로운 방사선 때문에 다루기가 용이하지 않고, 일부 동위원소의 방사성은 방출에너지가 큰 대신 반감기가 짧아서 장시간의 보관이나 실험에 불편한 단점도 있다.
방사성 동위원소에 대한 대안으로 널리 사용되는 것은 유기 형광물질(Organic fluorescent dyes)이다. 형광물질들은 특정 파장에 의해서 활성이 되면 고유의 파장을 갖는 빛을 발광하게 된다. 특히, 검색법이 소형화됨에 따라, 방사성 물질 역시 검출 한계를 나타내어 검색에 오랜 시간이 요구된다. 이에 비해 형광물질의 경우 적절한 조건에서 분자당 수천 개의 광자를 방출할 수 있어 단일분자 수준의 검출까지도 이론적으로 가능하다. 그러나, 방사성 동위원소처럼 활성 리간드의 원소를 직접 치환할 수는 없고, 구조 활성관계를 통해 비교적 활성에 영향을 주지 않는 부분을 변형하여 형광물질을 연결해야 하는 제한점이 있다. 또한, 이러한 형광 표지물질들은 시간이 지나면서 형광 세기가 약해지며(photobleaching), 활성을 시키는 빛의 파장이 매우 좁고 발광되는 빛의 파장이 매우 넓어 서로 다른 형광물질 간에 간섭이 있는 단점을 가지고 있다. 또한, 사용할 수 있는 형광물질의 수가 극히 제한되어 있다.
또한, 반도체 나노 물질인 양자점은 CdSe, CdS, ZnS, ZnSe 등으로 구성되어 있으며 크기 및 종류에 따라서 각각 다른 색의 빛을 발광한다. 유기 형광물질에 비하여 넓은 활성 파장을 가지고 있으며 좁은 발광 파장을 나타내기 때문에 다른 색을 발광하는 가짓수가 유기 형광물질보다 많다. 따라서, 최근 들어 유기 형광물질의 단점들을 극복하기 위한 방법으로 양자점이 많이 사용되고 있다. 그러나, 독성이 강하고, 대량 생산이 힘들다는 단점이 있다. 또한, 이론적으로 그 가지 수는 다양하나 실제적으로 사용되고 있는 수는 극히 제한되어 있다.
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로, 최근에는 라만 분광학 및/또는 표면 플라스몬 공명을 이용한 표지물질을 이용하고 있다.
그 중에서도, 표면 증강 라만 산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)은 금, 은 등의 금속 나노구조의 거친(roughened) 표면에 분자가 흡착될 때 라만 산란의 세기가 106 ~ 108 배 이상 급격히 증가되는 현상을 이용한 분광법이다. 빛을 유형 매질에 통과시키는 경우 어느 정도의 양은 고유 방향에서 벗어나는데, 이러한 현상은 라만 산란으로 알려져 있다. 산란된 광 중 일부가 광의 흡수 및 전자의 높은 에너지 준위로 여기함에 따라 고유의 자극된 광과 진동수가 상이하며, 라만 방출 스펙트럼의 파장은 샘플 내의 광 흡수 분자의 화학 조성 및 구조 특성을 나타내므로, 라만 분광법은 현재 아주 빠른 속도로 발전하고 있는 나노 기술과 결합하여 단 하나의 분자를 직접 측정할 수 있는 고감도의 기술로 발전가능하며, 특히 메디컬 센서로서 긴요하게 쓰일 수 있을 것으로 많은 기대를 받고 있다. 이 표면 증강 라만 분광법(SERS) 효과는 플라스몬 공명의 현상과 관련되며, 여기서 금속 나노입자는 금속 내 전도 전자의 집단 커플링으로 인해 입사 전자기 방사선에 응답하여 뚜렷한 광학적 공명을 나타내므로, 본질적으로 금, 은, 구리 및 다른 특정 금속의 나노입자들은 전자기 방사선의 집중화 효과를 향상시키는 소형 안테나로서 작용할 수 있다. 이러한 입자 부근에 위치한 분자는 라만 분광법 분석에 대해 훨씬 큰 감도를 나타낸다.
따라서, 고감도 DNA 분석과 더불어 SERS 센서를 이용하여 다양한 질병과 관련된 유전자, 단백질(바이오 마커)의 조기 진단을 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 라만 분광법은 다른 분석법(적외선 분광법) 방법과는 달리 여러 가지 장점을 가지고 있다. 적외선 분광법은 분자의 쌍극자 모멘트의 변화가 있는 분자의 경우 강한 신호를 얻을 수 있는 반면, 라만 분광법은 분자의 유도 편극률 변화가 있는 비극성 분자의 경우에도 강한 신호를 얻을 수 있으므로, 거의 모든 유기 분자들이 고유의 라만 시프트(Raman Shift, cm-1)을 가지고 있다. 또한 물 분자에 의한 간섭의 영향을 받지 않으므로, 단백질, 유전자 등의 생체분자(biomolecules)의 검출에 더욱 적합하다. 하지만 낮은 신호 세기로 인하여 오랜 연구 기간에도 불구하고 실용화되는 수준에 이르지는 못하였다. 상기 표면 증강 라만 산란법의 발견 이후 꾸준한 연구를 거듭해 오다, 형광분자가 흡착된 나노입자의 무질서한 응집체에서 단일 분자 수준의 신호 검출이 가능한 표면증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS)이 보고된 이후로(science 1997, 275(5303), 1102; Phys rev lett 1997, 78(9), 1667), 다양한 나노 구조(나노입자, 나노 껍질, 나노선)들을 이용한 SERS 증강 현상에 대한 연구들이 보고되었다. 이러한 고감도의 SERS 현상을 바이오 센서 개발에 이용하기 위하여 Mirkin 연구팀은 최근 DNA와 결합된 금 나노입자를 이용한 고감도 DNA 분석에 성공하였으며, 이러한 포맷의 검출 한계는 20 fM 이었다(2002, science, 297, 1536). 그러나, 라만 활성 분자(예컨대, Rhodamine 6G)를 가진 은(Ag) 나노입자의 염 유도 응집(salt induced aggregation)에 기초한 단일 분자 SERS 활성 기질을 제조하는 방법은 최초 연구 이후로 거의 진척된 바가 없다. 불균일하게(heterogeneous) 응집된 콜로이드는 단지 이의 분획(1% 미만)만이 단일 분자 SERS 활성을 갖는다고 보고되었다(J Phys Chem B 2002, 106(2), 311). 이와 같이 랜덤하게 불균일해진(거칠해진) 표면은 SERS 와 관련된 많은 양의 흥미롭고 필수적인 데이터를 제공하나, 표면 형태학상의 작은 변화에 의해서도 증강(enhancement)의 변화가 상당히 변화하기 때문에 이러한 전략은 본질적으로 재현이 불가능하다. 최근에는, Fang 등이 SERS 에서의 증강 부위의 분포의 정량적인 측정에 관하여 보고하였다. 가장 밀집된 부위(EF>109)는 총 1,000,000 부위 중 64 부위였으나 이들은 전체 SERS 강도에 24%를 기여하는 것으로 보고되었다(Science, 2008, 321, 388). 이러한 SERS 신호가 극대화 될 수 있는 구조체를 재현성 있게 확보 할 수 있다면, 매우 신뢰도 높은 유용한 초고감도 생체 분자 분석법이 될 수 있으며, 체외 진단법 외에도 생체 내 이미징 기술로도 매우 유용할 것으로 판단된다.
그러나, 이전의 다양한 분석물의 SERS 검출에 관한 방법에서는 전형적으로 기판 및/또는 지지체 상으로 코팅되는 콜로이드 금속 입자, 예컨대 응집된 은 나노입자를 사용하였으며, 이러한 배열은 때로 106 내지 108 만큼 증가된 감도로 SERS 검출을 가능하게 하는 반면, 뉴클레오티드 등의 작은 분석물의 단일 분자 검출이 가능하지 않았다. 또한, SERS의 장점에도 불구하고 SERS 현상은 메커니즘이 완벽하게 이해되지 않았을 뿐 아니라, 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노 물질 합성 및 제어의 어려움과, 스펙트럼을 측정할 때 사용되는 빛의 파장, 편광 방향에 따른 증강효율의 변화 등으로 인해 재현성 및 신뢰성 측면에서 해결해야할 문제가 많으며, 이는 나노-바이오센서의 개발 및 상용화를 비롯한 SERS 현상의 응용에 커다란 숙제로 남겨져 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 구조적으로 정확하게 정의되어 있는 나노 물질(well-defined nanostructure)의 광학적 성질에 대한 이해와 이를 이용하여 SERS 현상을 정확하게 제어하기 위한 연구의 필요성이 몹시 커지고 있는 상황이다.
이에, Jeong, Proke, Schneider, Lee는 금속 입자 이합체(dimer)의 경우 두 개 이상의 나노 입자 사이에 매우 강한 전자기장인 핫 스팟(hot spot 또는 interstitial field)이 형성되어 SERS 신호가 증강된다고 보고하였으며, 전자기적인 이론계산에 따르면 상기 핫 스팟(hot spot)에 의해 1012 정도의 SERS 증강이 예측된다. 이와 같이 라만 검출의 증강된 감도는 콜로이드 입자 응집체 내부에서 명백히 균일하지 않지만, 핫 스팟의 존재 여부에 따라 달라진다. 그러나 이러한 핫 스팟의 물리적 구조, 증강된 감도가 이루어지는 나노입자들로부터의 거리 범위, 및 감도를 증강시키는 분석물과 응집체 나노입자 간의 공간적 관계성은 그 특성이 제시된 바 없다. 또한, 응집된 나노입자는 용액 중에서 본질적으로 불안정하여, 단일 입자 분석물 검출의 재현성에 역효과를 준다.
또한, 금 또는 은 이합체 구조에 대한 이론적인 시뮬레이션 및 proof-of-concept(개념증명) 시도가 존재한다고 하더라도, 나노입자 사이의 접합부(junction)에 실제로 단일 분자를 위치시켜 제조한 예는 없었다. 금 또는 은 나노 입자를 SERS 의 잘 정의된 재현 가능한 구조를 갖도록 합성하는 것은 여전히 도전할만한 과제로 남아있다.
이에 본 발명자들은, 단일 DNA 검출에 고도의 민감도와 재현성을 가지는 나노 입자 구조물을 개발하고자 노력한 결과, 코어-쉘 구조의 이합체 나노입자의 접합부(junction)에 단일 라만 활성 분자를 위치시키고, 쉘의 두께를 조절하여 상기 이합체 나노 입자 간의 간격 거리를 특정 범위로 조절함으로써 라만 활성분자가 두 나노입자의 접합부에 위치한 코어-쉘 구조의 이합체 나노입자를 개발하였고, 상기 이합체 나노입자가 매우 강화된 표면증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 신호를 나타내며 고도로 재현 가능한 핫 스팟 나노입자임을 입증하였으며, 상기 나노 입자의 라만 산란 증강은 SERS 증강 인자(EEM)가 ~2.7×1012까지 나타남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 코어-쉘 구조의 나노입자 이합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 나노입자 이합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 나노입자 이합체를 이용하여 분석물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 나노입자 이합체를 포함하는 분석물 검출용 키트를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 표면에 올리고뉴클레오티드가 결합된 금 또는 은 코어(core) 및 상기 코어를 둘러싼 금 또는 은 쉘(shell)로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개의 접합부에 라만 활성분자가 위치하며, 상기 두 개의 나노입자가 올리고뉴클레오티드를 통해 연결된 구조를 가지는 나노입자 이합체에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명의 나노입자 이합체는, 두 개의 나노입자로 구성되어 있고, 각각의 나노입자는 코어(금 또는 은) 및 코어를 둘러싼 쉘(금 또는 은)로 구성되어 있고, 각각의 나노입자의 코어 표면에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 쉘 외부로 노출되어 있으며, 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드 간의 혼성결합을 통하여 연결되어 있는 구조를 가지고 있다. 또한, 상기 혼성결합이 이루어지는 부분인 접합부에는 라만활성분자가 위치할 수 있다. 특히, 상기 각각의 나노입자는 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 코어의 표면에 결합되고, 상기 올리고뉴클레오티드의 일부는 쉘의 외부로 노출되어 있으며, 노출된 부분의 서열을 통하여 이합체를 형성할 수 있다. 이 때, 각각 노출된 두 개의 올리고뉴클레오티드가 서로 혼성 결합을 하거나, 또는 각각 노출된 두 개의 올리고뉴클레오티드와 모두 혼성 결합을 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 통하여 혼성 결합 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "코어"란 그 표면에 올리고뉴레오티드가 직접 결합되어 있는 금속 입자를 의미하며, 바람직하게는 금 또는 은이다. 또한, 본 발명에서 용어 "쉘"이란 상기 코어를 둘러싸고 있는 금속 코팅층으로서, 코어 표면에 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드의 일부가 쉘의 내부에 위치하게 된다. 본 발명에서 쉘로서 금 또는 은을 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 바람직한 양태로서 본 발명은 i) 금 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체, ii) 은 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체, iii) 금 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체, iv) 은 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체, 및 v) 금 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자와 은 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자가 연결된 나노입자 이합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 나노입자 이합체에 관한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 나노입자 이합체는 금 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체이다.
상기와 같은 본 발명의 코어-쉘 구조의 나노입자 이합체는 호모이합체(homodimer) 또는 헤테로이합체(heterodimer) 로 존재할 수 있다. 호모이합체는 크기와 구조가 동일한 나노입자 두 개가 연결되어 이합체를 형성한 것이고, 헤테로이합체는 크기 또는 구조가 서로 다른 나노입자 두 개가 연결되어 이합체를 형성한 것이다.
본 발명에 따른 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 중심을 형성하고 있는 코어 입자는 직경이 5 nm 내지 300 nm 인 것이 바람직한데, 이는 코어의 직경이 5 nm 미만이면 라만 표면증강 효과가 떨어지는 문제점이 있고, 300 nm를 초과하면 생물학적 응용시 많은 제약을 받는 문제점이 있기 때문이다. 보다 바람직하게는, 코어의 직경은 10 nm 내지 40 nm가 바람직하다. 나노입자는 형상면에서 대략 구형일 수 있으나, 임의의 형상 또는 불규칙 형상의 나노입자들이 사용될 수 있다.
상기 코어 입자 표면에는 나노 쉘이 도입되어 있는데, 나노 쉘은 코어 입자의 표면에 증강된 라만 산란(Raman scattering) 효과를 부여하여 라만 분광법에 의한 분석을 보다 용이하게 한다. 즉, 나노 쉘이 도입된 코어 입자는 표면증강 산란 효과(surface enhanced Raman scattering)가 매우 크기 때문에 어떠한 화학물질의 시그널도 얻을 수 있다는 이점이 있다. 바람직하게 본 발명의 쉘 두께는 1 nm 내지 300 nm이고, 보다 바람직하게는 1 내지 20 nm이다. 또한, 쉘의 두께는 코어의 크기와 사용된 DNA의 길이가 증가함에 따라 비례적으로 증가할 수 있다.
본 발명의 코어 입자 표면에는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 기능화되어 있음을 특징으로 한다. 우선, 코어 A에는 3' 말단이 티올로 개질되어 있는 하나 이상의 보호 올리고뉴클레오티드 및 역시 3' 말단이 티올로 개질되어 있는 하나의 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 결합될 수 있다. 한편, 코어 B에는 5' 말단이 티올로 개질되어 있는 하나 이상의 보호 올리고뉴클레오티드 및 역시 5' 말단이 티올로 개질되어 있는 하나의 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 결합될 수 있다. 또한, 상기 코어 A의 표면에 개질된 타겟포착 올리고뉴클레오티드 및 코어 B의 표면에 개질된 타겟포착 올리고뉴클레오티드 중 어느 한 쪽에는 라만활성분자가 개질되어 있음을 특징으로 한다. 또한 코어 A에 5' 말단을 이용한 결합, 코어 B에 3' 말단을 이용한 결합으로도 본 발명을 완성할 수도 있다.
본 발명에서 용어 "보호 올리고뉴클레오티드"란 코어 입자의 표면에 결합되어 있으며 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 코어 표면에 잘 결합될 수 있도록 코어 입자를 안정화하는 한편, 표면을 보호하는 기능을 하는 올리고뉴클레오티드를 말한다.
본 발명에서 용어 "타겟포착 올리고뉴클레오티드"란 타겟 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로서, 코어 A의 타겟포착 올리고뉴클레오티드와 코어 B의 타겟포착 올리고뉴클레오티드는 모두 하나의 공통 타겟 올리고뉴클레오티드와 혼성화(hybridization)되어 나노입자 이합체 구조를 형성하게 한다.
본 발명에서 용어 "타겟 올리고뉴클레오티드"란 코어 A의 타겟포착 올리고뉴클레오티드와 코어 B의 타겟포착 올리고뉴클레오티드에 모두 상보적인 서열을 포함하고 있어서, 각각의 타겟포착 올리고뉴클레오티드와 혼성화를 이룸으로써, 두 타겟포착 올리고뉴클레오티드를 연결하여 나노입자 이합체 구조를 형성하게 하는 가교 역할 올리고뉴클레오티드를 말하며, 본 이합체 구조를 이용한 최종 목표 분석물을 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 보호 올리고뉴클레오티드 및 타겟포착 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단이 표면 결합 기능기를 가지는 화합물로 개질되어 되어 표면 결합 기능기를 통해 코어 입자 표면에 부착되어 있다.
본 발명에서 용어 "표면 결합 기능기를 가지는 화합물"은 올리고뉴클레오티드를 코어 입자 표면에 부착시키기 위해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 연결시킨 화합물을 말한다. 이러한 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 유형은 용액에 침전하지 않을 작은 응집체의 나노입자를 생성하는 한 제한되지 않는다. 표면 결합 기능기를 통하여 나노 입자를 가교-결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25 참조). 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 한 말단은 코어 입자 표면에 부착되는 표면 결합 기능기를 보유하는데, 바람직하게 황-함유기, 예컨대 티올기 또는 술프히드릴기(sulfhydryl, HS)이다. 상기 반응기는 알코올 및 페놀의 유도체로서 산소 자리에 황이 포함된 RSH 의 식을 가지는 화합물일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 각각 RSSR' 또는 RSR'의 식을 가지는 티올 에스테르(thiol ester) 또는 다이티올 에스테르(dithiol ester)일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 아미노기(-NH2)일 수 있다. 추가적으로, 상기 표면 결합 기능기를 가지는 화합물은 DNA 프로브, 항체, 올리고뉴클레오시드 및 아미노산 등과 같은 생체분자에 대한 반응 그룹(reactive group)으로서, 예컨대 -NH2, -COOH, -CHO, -NCO, 및 엑폭사이드기와 같은 다양한 반응기와 연결될 수 있다. 이러한 많은 반응성 기는 당분야에 공지되어 있고 본 방법 및 장치에 사용될 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드에서 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 반대 말단은 스페이서 서열을 포함할 수 있으며 스페이서 서열은 코어 표면에 도입되는 쉘이 타겟포착 올리고뉴클레오티드의 타겟인식 서열을 커버하지(covering) 않으면서 적절한 쉘 두께를 유지할 수 있는 공간을 제공한다. 본 발명에서는 스페이서 서열의 하나의 예로서, A10-PEG를 사용하였다.
본 발명에서 용어, "라만 활성분자"란, 본 발명의 나노입자 이합체가 하나 이상의 분석물에 부착하였을 때 라만 검출 장치에 의한 분석물의 검출 및 측정을 용이하게 하는 물질을 말한다. 본 발명에서는 코어 A의 표면에 개질된 타겟포착 올리고뉴클레오티드 및 코어 B의 표면에 개질된 타겟포착 올리고뉴클레오티드 중 어느 한 쪽에는 라만활성분자가 개질되어 있음을 특징으로 한다. 라만 활성분자는 특정 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 이후 생체분자를 보다 효과적으로 분석할 수 있게 하는 이점이 있다.
라만 분광법에 사용될 수 있는 라만 활성분자는 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만 활성분자의 예로서, FAM, Dabcyl, TRITC(테트라메틸 로다민-5-아이소티오시아네이트), MGITC(말라키트 그린 아이소티오시아네이트), XRITC(X-로다민-5-아이소티오시아네이트), DTDC(3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오다이드), TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 프탈산, 테레프 탈산, 아이소프탈산, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인 또는 황 등이 있으나 이에 제한되지 않rh, 사용된 라만 활성분자가 뚜렷한 라만 스펙트럼을 나타내어야 하고 서로 다른 유형의 분석물과 특히 결합하거나 연관될 수 있어야 한다. 바람직하게는 시아닌 계열 형광 유지분자인 Cy3, Cy3.5, Cy5 또는 FAM, Dabcyl, Rhodamine 계열의 형광분자를 포함하는 유기 형광분자들 이다. 유기 형광분자는 라만 분석 시 사용하는 여기 레이저 파장과 공명하여 더욱 높은 라만 신호의 검출이 가능한 장점이 있다. 라만 활성분자는 분석물에 직접 부착될 수 있거나 다양한 링커 화합물을 통해 부착될 수 있다.
본 발명자들은 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부(junction)에 위치하는 경우에만 SERS 신호의 검출이 가능하다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 코어-쉘 모노머 구조에서는 핫 스팟이 없고 또한 단 하나의 라만 활성분자가 존재하므로 SERS 신호가 검출되지 않았다(도 3A-1,2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 라만 활성분자로 라벨링된 코어-쉘 구조의 나노입자 이합체의 제조방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 1) 표면이 보호 올리고뉴클레오티드 및 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합된 코어 A, 및 표면이 보호 올리고뉴클레오티드 및 라만활성분자가 말단에 결합된 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합된 코어 B 를 각각 제조하는 단계, 2) 상기에서 제조된 코어 A 및 코어 B 에 타겟 올리고뉴클레오티드를 처리하여 혼성화시킴으로써 이합체를 형성하는 단계, 3) 상기의 코어 A 및 코어 B 의 표면에 각각 쉘을 도입하는 단계를 포함하는, 나노입자 이합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
첫 번째 단계는 각각 표면이 보호 올리고뉴클레오티드와 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합되어 있는 코어 A 및 코어 B를 제조하는 단계이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 하나의 타겟포착 올리고뉴클레오티드 서열이 코어입자 표면에 결합되도록 조절하기 위하여 금 코어입자 A를 3' 말단이 티올로 개질된 두 종류의 올레고뉴클레오티드 서열인, 하나 이상의 보호 올리고뉴클레오티드 및 하나의 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합하였다. 금 코어입자 B 역시 5' 말단이 티올로 개질된 두 종류의 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 결합하였다. 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드 서열의 몰비는, 금 코어입자 표면의 올리고뉴클레오티드의 나노입자-크기 의존적 로딩(loading) 능력에 기초하여, 코어 A에 대하여는 99:1, 코어 B 에 대하여 199:1이 되도록 조절하였다(도 1A). 중요하게, 코어 B에 결합된 타겟 포착 올리고뉴클레오티드 서열의 말단에 라만 신호 기능을 하는 Cy3, FAM,또는 Dabcyl 를 결합시켰다.
또한, 타겟포착 올리고뉴클레오티드 서열(target capturing sequence)이 결합되지 않은 모노머 입자를 제거하여 올리고뉴클레오티드 개질된 코어 A 및 B를 정제하기 위하여 자기(magnetic) 분리 기술을 이용할 수 있다. 토실(tosyl) 그룹 마그네틱 비드(직경 1㎛, 인비트로젠)는 아민-개질된 올리고뉴클레오티드 상보적 서열에 의하여 각각 코어 A 또는 B 의 타겟포착 서열로 치환결합 할 수 있다. 오직 타겟포착 서열로 결합된 코어입자만이 마그네틱 비드에 상보적인 혼성 결합을 하므로, 반응 후 용액중에서 외부 자장을 가하여, 자성 나노입자를 분리한 다음, 이중 나선 DNA 염기서열의 용융점(Tm) 이상으로 승온하여 자성 나노 입자에 결합된 코어입자를 분리할 수 있다.
추가적으로, 상기 단계 1에서 코어 A와 코어 B를 각각 제조한 후, 코어 A와 코어 B의 타겟포착 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 가진 자성 마이크로 입자와 혼성화 반응을 진행하여, 코어 A와 코어 B에서 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노 입자만를 분리하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.
두 번째 단계는 상기에서 제조된 코어 A 및 코어 B에 타겟 올리고뉴클레오티드를 가하여 혼성화시킴으로써 이합체를 형성하는 단계이다. 첫 번째 단계에서 마그네틱 비드에 의하여 분리 및 정제된 코어입자 A 및 B의 용액은, 예컨대 0.3M PBS 내의 충분한 양의 타겟 올리고뉴클레오티드 서열과 혼성결합을 통해 목적하는 이합체 나노입자를 합성할수 있다. 따라서 본 발명에 따른 이합체 합성법은 매우 높은 수율(70-80%)로 이합체를 합성할 수 있다.
세 번째 단계로서 코어 입자 표면으로의 나노 쉘 입자의 도입은, 예컨대 금 코어 입자와 은 나노 입자의 전구체를 용매 존재 하에 10~100℃에서 반응시키는 것에 의해 도입되는 것이 바람직하다. 상기에서 은 나노 입자의 전구체는 AgNO3, 또는 AgClO4를 선택하는 것이 바람직하며, 금 나노입자의 전구체는 HAuCl4 등의 Au 이온이 포함된 어떠한 화합물도 전구체로 사용가능하다. 또한 은 이온이나 금 이온을 금 또는 은 나노입자로 전환하는데 필요한 환원제는 하이드로퀴논(hydroquinone), 소듐보로하이드라이드(NaBH4), 아스코르브산 소디움(Sodium Ascorbate) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나노 쉘 형성 반응의 용매는 수용액(정제수 또는 인산 버퍼 등이 존재해도 무방)이 바람직하다. 나노쉘의 정밀한 두께 조절을 위하여 추가로 안정화제(stabilizer)를 추가할 수 있다. 상기에서 반응온도가 10℃ 미만이면 은 나노 입자를 형성시키는데 너무 많은 시간이 소요되는 문제점이 있고, 100℃를 초과하면 은 나노 입자가 불균일하게 형성되는 문제점이 있기 때문에 상기 범위의 온도에서 반응시키는 것이 바람직하다. 상기에서 반응시간은 반응온도에 따라 10~24시간 동안으로 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 라만 활성분자가 두 나노입자의 접합부에 위치한 코어-쉘 구조의 나노입자 이합체는, 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자가 기능화되어, 각종 생체분자들을 검출하는데 응용될 수 있다.
예컨대, 검출하고자 하는 분석물은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물일 수 있다. 또한, 분석물이 핵산일 경우 상기 핵산은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 및 합성 핵산을 포함한다.
또한, 상기 분석물을 인식할 수 있는, 나노입자 이합체 등의 표면에 결합될 수 있는 바이오 분자의 비제한적인 예는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 압타머를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 나노입자 이합체는, 나노입자 이합체의 전체가 무기물로 코팅될 수 있다. 무기물로 나노입자 이합체 전체가 코팅되면 구조가 변형될 가능성이 적어지므로 나노입자 이합체의 구조를 안정하게 유지할 수 있어 보관 및 사용에 보다 바람직하다. 상기 무기물은 나노입자 이합체의 구조를 유지하고, 라만 신호에 영향을 주지 않는 물질이면 제한되지 않으며, 일례로 실리카를 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 나노입자 이합체를 이용한 분석물의 검출 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 1) 본 발명의 나노입자 이합체를 제조하는 단계; 2) 상기 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자를 기능화하는 단계; 3) 상기 나노입자 이합체를 하나 이상의 분석물을 포함하는 샘플에 노출시키는 단계; 및 4) 레이저 여기(excitation) 및 라만 분광법을 이용하여 하나 이상의 분석물을 검출 및 확인하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 분석물은 임의의 공지된 라만 분광법에 의해 검출 또는 확인될 수 있으며, 바람직하게는 표면 증강 라만 분광법(SERS, Surface Enhanced Raman Scattering), 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS, Surface enhanced resonance Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 및/또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS, coherent anti-Stokes Raman spectroscopy)을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "표면 증강 라만 산란법(SERS)"이란 거칠게 처리된 특정 금속 표면에 흡착되어 있거나 수백 나노미터 이내의 거리에 위치해 있을 때 발생되는 라만 산란의 일종으로 이때 라만 산란의 세기는 일반 라만의 세기와 비교하여 106 ~ 108 배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법을 말한다. 용어 "표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS)"이란 SERS 활성 표면에서의 흡착물에 대한 레이저 여기 파장의 공명 현상을 이용한 분광법을 말한다. 용어 "비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)"이란 라만 활성 매질에 고정가변의 두 레이저 광을 입사시키고, 이들의 결합에 의해 얻어지는 반(反) 스토크스 방사의 스펙트럼을 측정하는 분광법을 말한다.
보다 구체적인 양태로서, 본 발명의 상기 분석물 검출 방법은, 1) 본 발명의 나노입자 이합체를 제조하는 단계; 2) 상기 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 바이오분자를 기능화하는 단계; 3) 시료에서 핵산을 추출, 정제, 및 증폭시키는 단계; 4) 상기 증폭된 핵산의 특정서열에 코어-쉘 나노입자 이합체를 반응시켜 혼성화를 수행하는 단계; 및 5) 상기 나노입자 이합체가 결합된 핵산에 라만분광을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 검출방법일 수 있다. 또한, 이와 동일한 유형의 방법을 이용하여 핵산에 대한 기타 정보, 예컨대, 샘플에 존재하는 1종 이상의 단일 염기 다형성(SNP) 또는 다른 유전적 변이의 형태를 검출할 수 있으며, 나아가 DNA 시퀀싱에도 응용이 가능하다.
이러한 실시양태에서, 라만 활성 기판은 하나 이상의 라만 검출 단위장치와 작동가능하게 결합될 수 있다. 라만 분광법에 의한 분석물의 검출을 위한 여러 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, 미국특허 제6,002,471호, 제6,040,191호, 제6,149,868호, 제6,174,677호, 제6,313,914호). SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 거친 금속 표면, 예컨대 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면 상에 흡수된 분자에 대해 106 이상으로 증강된다.
라만 검출 장치의 비제한적인 예는 미국특허 제6,002,471호에 개시되어 있다. 여기 빔은 532 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔이 사용될 수 있다. 여기 빔은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 하나 이상의 분석물을 함유하는 라만 활성 기판 상으로 초점이 모아진다. 분석물로부터의 라만 방출 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광장치와 결합된다. 공초점 광학기로는 배경 신호를 감소시키기 위한 다이크로익 필터(dichroic filter), 차단 필터, 공초점 핀홀, 대물렌즈 및 거울의 조합을 포함한다. 공초점 광학기 뿐만 아니라 표준 풀 필드(full field) 광학기도 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 사태형 광다이오드를 포함하는 라만 검출기)에 의해 검출된다.
검출 장치의 또 다른 예는 미국특허 제5,306,403호에 개시되어 있으며, 이로는 단광자 카운팅 방식으로 작동하는 갈륨-비소 광전자증배관(RCA Model C31034 또는 Burle Industries Model C3103402)이 구비된 스펙스 모델(Spex Model) 1403 이중 격자 분광계를 들 수 있다. 여기화 공급원은 스펙트라피직스(SpectraPhysics), 모델 166으로부터의 514.5nm 선 아르곤-이온 레이저, 및 크립턴(krypton)-이온 레이저(Innova 70, 비간섭성)의 647.1nm 선을 포함한다.
다른 여기화 공급원으로는 337nm에서의 질소 레이저(레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.) 및 325nm에서의 헬륨-카드뮴 레이저(라이코녹스(Liconox)(미국특허 제6,174,677호), 발광 다이오드, Nd:YLF 레이저, 및/또는 다양한 이온 레이저 및/또는 염료 레이저를 포함한다. 여기 빔은 밴드패스 필터(Corion)에 의해 스펙트럼으로 정제되어 6X 대물 렌즈(Newport, Model L6X)를 이용하는 라만 활성 기판 상에 초점화될 수 있다. 대물 렌즈는 홀로그래피 빔 스플리터(Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18)를 이용하여 분석물을 여기시키고 라만 신호를 수집하여 여기 빔 및 방출된 라만 신호에 대한 직각 형태를 만드는데 모두 사용될 수 있다. 홀로그래피 노치 필터(Kaiser Optical Systems, Inc.)는 레이라이(Rayleigh) 산란 방사선을 감소시키는데 사용될 수 있다. 다른 라만 검출기로는 적색 증강된 고감도 전하 결합 소자(RE-ICCD) 검출 시스템(Princeton Instruments)이 장착된 ISA HR-320 분광기를 포함한다. 푸리에 변환 분광기(마이컬슨 간섭계에 기초함), 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, InCaAs 검출기, 전자증배 CCD, 고감도 CCD 및/또는 광트랜지스터 어레이 등 다른 유형의 검출기가 사용될 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 적절한 형태 또는 구성의 라만 분광법 또는 관련 기법이 분석물 검출에 사용될 수 있으며, 이로는 노말 라만 스캐터링, 공명 라만 스캐터링, 표면 증강 라만 스캐터링, 표면 증강 공명 라만 스캐터링, 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS), 자극 라만 스캐터링, 역 라만 분광법, 자극 게인 라만 분광법, 하이퍼-라만 스캐터링, 분자 광학 레이저 시험기(molecular optical laser examiner, MOLE) 또는 라만 마이크로탐침 또는 라만 현미경법 또는 공초점 라만 마이크로분광기, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 분해 공명 라만, 라만 해리 분광법 또는 UV-라만 현미경법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 실시양태는 사용되는 컴퓨터 유형에 대해 제한을 두지 않는다. 예시적 컴퓨터는 정보를 상호교환하는 버스 및 정보 처리를 위한 프로세서를 포함할 수 있다. 컴퓨터는 램(RAM) 또는 다른 동적 저장 장치, 롬(ROM) 또는 다른 정적 저장 장치 및 데이터 저장 장치, 예컨대 마그네틱 디스크 또는 광학 디스크 및 이와 상응하는 드라이브를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 컴퓨터는 당해 분야에 공지된 주변 장치, 예컨대 표시 장치(예컨대, 음극 선관 또는 액정 표시), 알파벳 입력 장치(예컨대, 키보드), 커서 조절 장치(예컨대, 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향키) 및 커뮤니케이션 장치(예컨대, 모뎀, 네트워크 인터페이스 카드 또는 에더넷, 토큰 링 또는 기타 유형의 네트워크와 결합하는데 사용된 인터페이스 장치)를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터와 작동가능하게 결합될 수 있다. 검출 장치로부터의 데이터는 프로세서에 의해 처리되고 데이터는 주기억장치에 저장될 수 있다. 표준 분석물에 대한 방출 프로파일 상의 데이터는 또한 주기억 장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 라만 활성 기판에서의 분석물로부터의 방출 스펙트럼을 비교하여 샘플의 분석물 유형을 확인할 수 있다. 프로세서는 검출 장치로부터의 데이터를 분석하여 여러 분석물의 정체 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 서로 다르게 구비된 컴퓨터는 특정 이행에 사용될 수 있다. 따라서, 시스템의 구조는 본 발명의 상이한 실시양태에서 다를 수 있다. 데이터 수집 작업 이후, 전형적으로 데이터는 데이터 분석 작업으로 보내질 것이다. 분석 작업을 용이하게 하기 위해, 검출 장치에 의해 수득된 데이터는 상기한 바와 같이 디지털 컴퓨터를 사용하여 전형적으로 분석할 것이다. 전형적으로, 컴퓨터는 검출 장치로부터의 데이터 수용 및 저장 뿐만 아니라 수집된 데이터의 분석 및 보고를 위해 적절히 프로그래밍될 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 나노입자 이합체를 포함하는 분석물 검출용 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 검출하고자 하는 분석물이 핵산일 경우에는 시료에 포함된 핵산을 증폭하기 위하여 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 검출 대상 핵산에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 더욱 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 더욱 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 검출 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 검출하고자 하는 분석물이 단백질일 경우에는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 본 발명의 나노입자 이합체로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 더욱 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로쉘룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있다.
이러한 검출 키트에는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 의한 라만 활성분자가 두 나노입자의 접합부에 위치한 코어-쉘 나노입자 이합체는 라만 활성 분자가 정확하게 두 나노입자의 접합부에 위치해 있으며, 라만 활성 분자와 나노 입자 표면 사이의 거리는 은 또는 금 나노입자로 정확하게 두께가 조절되어 있으므로, 매우 강화된 표면증강 라만 산란(SERS) 신호를 얻을 수 있다. 더구나 오로지 하나의 라만 활성 분자가 위치해 있음에도 불구하고, 강한 라만 신호를 얻을 수 있다. 또한 상기 코어쉘 나노입자 이합체를 합성한 방법 등은 매우 높은 순도로 이합체를 합성할 수 있는 유용한 방법이며, 특히 코어 A, B의 합성시의 올리고뉴클레오티드의 당량적 조절, 자성 나노입자를 이용한 코어 A, B의 정제 등을 통해 높은 순도로 목적 나노 구조체를 합성할 수 있었다. 또한 두 나노입자 사이의 갭은 나노 수준으로 조절 가능한 방법으로 갭 간의 거리를 조절할 수 있다. 따라서, 이 코어쉘 나노구조는 매우 높은 정도로 신호가 증폭된 나노 구조체이므로, 이를 이용한 DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 단백질(바이오마커) 등 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능하며, 대규모 게놈 서열 분석, 단일 염기 다형성(SNP)의 검출, 서열 비교, 유전자형별 분석, 질병 상관 및 약제 개발 등에 사용할 수 있다.
도 1(A) 및 (B)는 마그네틱 정제, DNA 하이브리드화, 및 은-쉘 형성 과정에 의한 금 나노입자 이합체의 합성 과정을 나타낸 개략도이다. 프로브 A 보호 서열은 3'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -AAACTCTTTGCGCAC-5', 프로브 A 타겟 결합 서열은 3'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -CTCCCTAATAACAAT-5', MMP-A 의 변형된 서열은 3'-NH2-(CH2)3-A10-PEG18-ATTGTTATTAGGGAG-5'(Tm=38℃)이다. 프로브 B 보호서열은 5'-HS-(CH2)6-A 10 -PEG 18 -AAACTCTTTGCGCAC-3', 프로브 B 타겟 결합 서열은 5'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3' MMP-B의 변형된 서열은 5'-NH2-(CH2)3-A10-PEG18-TTTAATATTGATAAGGAT-3'(Tm=40℃)이다. 밑줄 친 서열은 은-쉘 형성을 촉진하기 위하여 디자인된 스페이서 서열이다. 타겟 DNA 서열은 5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3'(탄저균 서열)이다. 도 1(C)는 각 이합체 나노입자로부터 SERS 핫 스팟 구조를 알아보기 위한 교정된 AFM, 공초점 라만 분광기(레이저 초점 지름 250nm)를 이용한 실험 장치를 나타낸 것이다.
도 2(A)는 금 나노입자 이합체를 형성하기 전과 후의 자외선-가시광선 스펙트라 및 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이다. (B)는 금 나노입자 이합체에 은-쉘을 도입하기 전과 후의 자외선-가시광선 스펙트라 및 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이다. (C)는 은-쉘 두께에 따라 ~400nm 의 은 나노 파티클의 플라즈몬 공명을 나타낸 것이다. 금-은 코어-쉘 이합체 구조의 HR-TEM 이미지에 대응한다. 도면에 나타난 코어-쉘 나노입자의 HR-TEM 이미지인 C.1a, C.1b 는 각각 은 쉘 두께가 5nm, 10nm 인 금-은 코어-쉘 모노머를 나타낸다. C.2, C.3, C.4 는 은 쉘 두께가 각각 ~3nm, ~5nm, ~10nm 인 금-은 코어-쉘 헤테로이합체 입자를 나타낸다.
도 3(A)는 금-은 코어-쉘 모노머 및 헤테로이합체 나노입자의 AFM(atomic force micrograph, 1㎛ × 1㎛)을 나타낸다. (B)는 금-은 코어-쉘 나노 입자의 모노머 또는 이합체로부터 얻은 교정된 SERS 스펙트라를 나타낸 것이다. (C)는 514.5nm 여기 레이저, 1s 축적(1s accumulation), 샘플 100μW, 레이저 초점 지름 250nm 에서 얻은 모든 스펙트라를 나타낸 것이다. 라만 스펙트라(붉은 선)는 NaCl 용액에 의한 응집된 은 콜로이드에서 Cy3-개질된 올리고뉴클레오티드로부터 얻은 것이고, 라만 스펙트라(검은 선)는 같은 조건에서 Cy3-자유 올리고뉴클레오티드에서 얻은 것이다.
도 4는 각 분석된 금-은 코어-쉘 이합체 나노입자가 단일 분자 활성을 가지는 Cy3 에 상응하는 SERS 신호를 나타낸다는 것을 보여주는 그림이다. (A)는 금-은 코어-쉘 이합체의 탭핑-모드 AFM 이미지(5㎛ × 5㎛) 를 나타낸다(도 2(B)-2 의 은-쉘 두께 ~5nm, 간격거리 1nm 이하 에 대응함). (B)는 각 이합체 구조에서 얻은 Cy3 의 표면 증강 라만 스펙트라를 나타낸 것으로, 레이저 파장 514.5nm, 레이저 전력 ~80μW, 레이저 초점 지름 ~250nm, 노광시간(integration time) 1초에서 측정한 것이다.
도 5(A) 및 (B)는 축적 시간 1초에서 동일한 입자에서 얻은 블링킹 SERS 스펙트라를 나타낸 것이고, (C)는 다른 입사 레이저 편광에서의 금-은 코어-쉘 헤테로이합체에서 얻은 SERS 스펙트라를 나타낸 것이며, (D)는 θ에 관한 1470 및 1580cm-1 라만 밴드의 통합 SERS 강도의 polar spot 를 나타낸다. 레이저 파장 514.5nm, 레이저 전력 ~40μW, 레이저 초점 직경 ~250nm, 노광시간(integration time) 20초에서 측정한 것이다.
도 6은 FAM 과 Dabcyl 로 라벨링된 올리고뉴클레오티드로 개질된 나노입자 이합체로부터 얻은 SERS 스펙트라를 나타낸 것이다. (a)는 용액 내 FAM 라벨링된 올리고뉴클레오티드(1 nM) 및 Dabcyl 라벨링된 올리고뉴클레오티드(1 nM)의 라만 스펙트라를 나타낸다. (b)는 FAM 라벨링된 금-은 코어-쉘 나노입자 이합체(은 쉘, 5 nm), Dabcyl 라벨링된 금-은 코어-쉘 나노입자 이합체(은 쉘, 5 nm)의 라만 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 2(A)는 금 나노입자 이합체를 형성하기 전과 후의 자외선-가시광선 스펙트라 및 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이다. (B)는 금 나노입자 이합체에 은-쉘을 도입하기 전과 후의 자외선-가시광선 스펙트라 및 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이다. (C)는 은-쉘 두께에 따라 ~400nm 의 은 나노 파티클의 플라즈몬 공명을 나타낸 것이다. 금-은 코어-쉘 이합체 구조의 HR-TEM 이미지에 대응한다. 도면에 나타난 코어-쉘 나노입자의 HR-TEM 이미지인 C.1a, C.1b 는 각각 은 쉘 두께가 5nm, 10nm 인 금-은 코어-쉘 모노머를 나타낸다. C.2, C.3, C.4 는 은 쉘 두께가 각각 ~3nm, ~5nm, ~10nm 인 금-은 코어-쉘 헤테로이합체 입자를 나타낸다.
도 3(A)는 금-은 코어-쉘 모노머 및 헤테로이합체 나노입자의 AFM(atomic force micrograph, 1㎛ × 1㎛)을 나타낸다. (B)는 금-은 코어-쉘 나노 입자의 모노머 또는 이합체로부터 얻은 교정된 SERS 스펙트라를 나타낸 것이다. (C)는 514.5nm 여기 레이저, 1s 축적(1s accumulation), 샘플 100μW, 레이저 초점 지름 250nm 에서 얻은 모든 스펙트라를 나타낸 것이다. 라만 스펙트라(붉은 선)는 NaCl 용액에 의한 응집된 은 콜로이드에서 Cy3-개질된 올리고뉴클레오티드로부터 얻은 것이고, 라만 스펙트라(검은 선)는 같은 조건에서 Cy3-자유 올리고뉴클레오티드에서 얻은 것이다.
도 4는 각 분석된 금-은 코어-쉘 이합체 나노입자가 단일 분자 활성을 가지는 Cy3 에 상응하는 SERS 신호를 나타낸다는 것을 보여주는 그림이다. (A)는 금-은 코어-쉘 이합체의 탭핑-모드 AFM 이미지(5㎛ × 5㎛) 를 나타낸다(도 2(B)-2 의 은-쉘 두께 ~5nm, 간격거리 1nm 이하 에 대응함). (B)는 각 이합체 구조에서 얻은 Cy3 의 표면 증강 라만 스펙트라를 나타낸 것으로, 레이저 파장 514.5nm, 레이저 전력 ~80μW, 레이저 초점 지름 ~250nm, 노광시간(integration time) 1초에서 측정한 것이다.
도 5(A) 및 (B)는 축적 시간 1초에서 동일한 입자에서 얻은 블링킹 SERS 스펙트라를 나타낸 것이고, (C)는 다른 입사 레이저 편광에서의 금-은 코어-쉘 헤테로이합체에서 얻은 SERS 스펙트라를 나타낸 것이며, (D)는 θ에 관한 1470 및 1580cm-1 라만 밴드의 통합 SERS 강도의 polar spot 를 나타낸다. 레이저 파장 514.5nm, 레이저 전력 ~40μW, 레이저 초점 직경 ~250nm, 노광시간(integration time) 20초에서 측정한 것이다.
도 6은 FAM 과 Dabcyl 로 라벨링된 올리고뉴클레오티드로 개질된 나노입자 이합체로부터 얻은 SERS 스펙트라를 나타낸 것이다. (a)는 용액 내 FAM 라벨링된 올리고뉴클레오티드(1 nM) 및 Dabcyl 라벨링된 올리고뉴클레오티드(1 nM)의 라만 스펙트라를 나타낸다. (b)는 FAM 라벨링된 금-은 코어-쉘 나노입자 이합체(은 쉘, 5 nm), Dabcyl 라벨링된 금-은 코어-쉘 나노입자 이합체(은 쉘, 5 nm)의 라만 스펙트라를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 라만 활성 분자(Cy3)가 두 나노입자 접합부에 위치한 금-은 코어-쉘 나노입자의 제조
라만 활성 금-은 코어-쉘 이합체의 합성은 타겟 올리고뉴클레오티드가 결합 금 나노입자 및 이에 추가적으로 은 전구체의 양에 의해 조절되는 은-쉘 형성의 DNA-directed bridging method 에 기초하여 합성하였다(도 1).
우선, 보호(protecting) 및 타겟포착 올리고뉴클레오티드 서열의 몰비의 정확한 조절 및 효과적인 정제 단계에 의하여, 타겟 올리고뉴클레오티드를 가진 고도로 정제된 금 나노입자 이합체 구조를 얻었다. 여전히 금 나노입자(AuNP) 표면 및 Cy3 분자 간의 최대 간격 거리(d; gap distance)가 7.5 nm 이므로, 증폭된 전자기적 증대를 얻기 위해 간격을 줄일 필요가 있었다. SERS 검출에서 은이 금에 비하여 수 배 더 향상된 효과가 있기 때문에 은 나노 쉘을 도입하기로 하였다.
구체적으로, 증폭된 SERS 신호를 만들기 위해 나노입자 간 간격 거리를 줄이기 위해서, 은 나노 쉘을 기존에 알려진 개질 방법(Chem. Comm. 2008, J. Phys. Chem. B 2004, 108, 5882-5888)에 의하여 나노미터 수준으로 조절하며, 금 나노입자 이합체 표면을 코팅하였다. 상온에서 3시간 동안, 0.3M PBS 용액 내에서 안정화제로서 100μL 의 폴리(비닐)피롤리돈 및 환원제로서 50μL 의 L-소듐 아스코르브산[10-1M] 의 존재 하에, 금 나노입자 이합체 용액 250μM 을 다양한 양의 AgNO3[10-3 M] 와 반응시켰다. ~3nm, ~5nm, ~10nm 의 은-쉘 두께를 가지는 금-은 코어-쉘 헤테로이합체 나노입자는 각각 30μL, 40μL, 70μL 의 AgNO3[10-3 M] 용액을 사용하여 합성하였다. 이러한 방법으로, 은 쉘 두께를 ~3nm, ~5nm, ~10nm 등 나노 단위로 성공적으로 조절하여, 타겟 올리고뉴클레오티드와 결합된 금-은 코어-쉘 헤테로이합체 구조를 얻을 수 있었다.
전형적인 합성 방법에 의하여, 하나의 타겟포착 올리고뉴클레오티드 서열이 금 나노입자 표면에 개질되도록 조절하기 위하여 프로브 A 에 대한 금 나노입자(15nm) 를 두 종류의 3' 말단 티올-개질된 올리고뉴클레오티드 서열로 기능화(functionalize) 하였다. 프로브 B 에 대한 금 나노입자(30nm) 역시 두 종류의 5' 말단-티올-개질된 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 기능화하였다. 두 종류의 서열의 몰비는, 금 나노입자 표면의 올리고뉴클레오티드의 나노입자-크기 의존적 로딩(loading) 능력에 기초하여, 프로브 A에 대하여 99:1 프로브 B 에 대하여 199:1 이 되도록 조절하였다(도 1). 중요하게, 프로브 B 에 대하여 타겟포착 올리고뉴클레오티드 서열은 라만 태그로서 기능하는 Cy3 를 말단에 결합하였다. 올리고뉴클레오티드 개질된 프로브 A 및 B 는 또한, 타겟 포착분자 서열(target capturing sequence)이 결합되지 않은 모노머 입자를 제거하기 위하여 자기(magnetic) 분리 기술에 의해 정제한다. 마그네틱 비드(직경 1㎛, 인비트로젠) 의 토실(tosyl) 그룹은 아민-개질된 올리고뉴클레오티드 상보적 서열에 의하여 각각 프로브 A 또는 B 의 타겟 포착 서열로 치환 결합되었다. 오직 타겟 포착 서열로 결합되어 있는 금 나노입자만이 마그네틱 비드에 의하여 분리될 수 있다. 다음으로, 정제된 프로브 A 및 B 용액은 0.3M PBS 내의 충분한 양의 타겟 올리고뉴클레오티드 서열로 혼성 반응하였다.
또한, 상기와 유사한 방법으로, 라만 활성분자로서 FAM과 Dabcyl로 각각 라벨링된 올리고뉴클레오티드로 개질된 금-은 코어-쉘 나노입자 이합체를 제조하였다.
실시예 2. 자외선-가시광선분광법(UV-visible spectroscopy) 및 HR-TEM 이미지 분석
금 나노입자 이합체의 형성(라만활성분자로서 Cy3 사용)은 자외선-가시광선분광법(UV-visible spectroscopy) 및 HR-TEM 이미지로 확인하였다(도 2). 자외선-가시광선 스팩트럼은 이합체 형성 후에 약간의 적색-변환된 스펙트럼을 나타내며, 이는 Oaul Alivisatos 등(Angew chem. 1999.38(12), 1808) 이 보고한 이전의 결과와 일치한다. 도 2A 는 금 나노입자 이합체의 전형적인 HR-TEM 을 나타낸다. 최소 200 개를 분석한 결과, 25%의 입자가 모노머로 존재하고, 65%가 이합체로 존재했으며, 10% 이하가 트라이머 또는 테트라머 또는 그 이상의 응집체로 존재하였다. 금 입자 간의 입자 간 거리는 HR-TEM 분석에 의할때 ca. 2~3 nm 였다. 실제로, 용액 상태(0.3 PBS) 에서의 나노입자 간의 간격 거리는 건조 상태보다 훨씬 긴 ~15nm 일 것이라고 예상된다. 또한, 증폭된 SERS 신호를 만들기 위해 나노입자 간 간격 거리를 줄이기 위해서, 은 나노입자가 기존에 알려진 개질 방법(Chem. Comm. 2008, J. Phys. Chem. B 2004, 108, 5882-5888)에 의하여 나노미터로 조절하면서 금 나노입자 이합체 표면에 도입하였다(실시예 1 참조). ~3nm ~10nm 의 은-쉘 두께를 가지는 금-은 코어-쉘 모노머(도 2C의 1a, 1b) 역시 유사한 조건에서 정제된 프로브 B 용액(30nm AuNP) 로부터 합성하였다. 각 용액의 자외선-가시광선 스펙트럼(도 2B)은 은 쉘 두께에 따라 ~400nm 의 플라즈몬 공명 피크에서 구별되었다. 도 2C 는 개별 금-은 코어-쉘 헤테로이합체의 HR-TEM 이미지를 나타내며, 직경 26nm-36nm(도 2C-2), 30nm-40nm(도 2C-3), 40nm-50nm(도 2C-3) 의 두 개의 코어-쉘 나노입자 구형 및 은 쉘 두께를 나타낸다. 두 나노입자 간에는 1nm 이하의 좁은 틈이 있다. 도 2C-1a, 1b 는 또한 개별 금-은 코어-쉘 모노머의 HR-TEM 이미지를 나타내며, 직경 40nm(쉘 두께=5nm, 도 2C-1a), 50nm(쉘 두께=10nm, 도 2C-1b)의 각 나노입자의 구형 및 은 쉘 두께를 나타낸다.
다음으로, 코어-쉘 나노입자의 모노머 또는 헤테로이합체(라만활성분자로서 Cy3 사용)의 SERS/AFM를 측정하였다. 전형적인 방법에서, 반복된 원심분리(8000rpm, 20분, 3회)에 의해 세척된 금-은 코어-쉘 헤테로이합체 용액의 aliquot(20μL)은 폴리-L-라이신 코팅된 글라스 표면에 스핀 코팅(spin coated) 하였고, 초순수 워터(nanopure water)로 여러번 세척한 후, 공기중에서 건조하였다. 샘플 제조 후, 즉시 AFM 및 SERS 측정에 사용하였다. SERS 스펙트럼은 inverted 광학현미경(inverted optical microscope)(Axovert 200, Zeiss)이 장착된 AFM-연관된 NanoRaman 현미경에 의해 기록하였으며 이와 별개의 홈메이드 스캐닝 콘트롤러에 의해 압전(piezoelectric) x-y 샘플 스캐너(Physik Instrument)를 조정하였다. 아르곤 이온 레이저(Melles Griot, USA)의 514.5 nm 선이 단일-모드 광학 섬유와 커플링된 여기 소스(excitation source) 로서 사용되었다. 컬러 필터(dichroic mirror)(520DCLP, Chroma Technology Corp.)는 50nW 내지 1mW에서 여기(excitation) 레이저 빔이 글라스 커버 슬립 상층 표면 위의 회절-한계 스팟(250nm)에 빔의 초첨을 둔 유침 대물렌즈 현미경(oil immersion microscope objective 현미경)(100×, 1.6 N.A., Zeiss)을 향하도록 하였다. Nanoscope IV 컨트롤러를 사용하여, AFM(Bioscope, Digital Instruments Inc., Veeco Metrology Group)을 micro mechanical 스테이지로 두었다. 광한 현미경 스테이지 상단의 tapping mode AFM 모듈은 100nm 의 오버랩 precision 의 AFM 지형 이미지(topographical image)의 로만 신호와 관련되어 있다. 레이저 초점 스팟은 AFM 팁 중심에 맞추어져 있어서 AFM 팁 말단에 대해 대칭적으로 산란한다. 라만 신호의 백그라운드는 LN2 냉각된(-125℃) 전하-결합 장치에서 모아진다. 산란된 스펙트럼은 하나의 acquision, 1초간 추적(accumulation), 400μW, 500-2000cm-1의 범위에서 기록하였다. 모든 데이터는 Si 로부터 백그라운드 신호를 빼줌으로서 수정된 baseline 이다.
실시예 3. 금-은 코어-쉘 나노 입자의 AFM(atomic force micrograph) 분석
도 3A는 대표적인 코어-쉘 모노머 및 헤테로이합체 나노구조(라만활성분자로서 Cy3 사용)의 확대된 AMF(atomic force micrograph) 이미지(1㎛ × 1㎛)를 나타낸다. 모양 및 직경은 HR-TEM 분석 결과와 일치하였다. 도 3B는 SERS 스펙트럼은 도 3A에서 지시된 단일 입자에 대한 AFM 이미지에 의해 교정한 것을 나타낸다. 코어-쉘 모노머 구조에는 핫 스팟이 없고 또한 단 하나의 Cy3 분자만 존재하므로, 은 쉘 두께가 5nm(도 3A-1) 또는 10nm(도 3A-2) 인 금-은 코어-쉘 모노머는 SERS 신호가 검출되지 않았다. 은 쉘이 없는 금 이합체 또는 1nm 이하의 간격 거리를 가진 금 이합체 역시 SERS 신호가 검출되지 않았다. 이는 514.5nm 레이저 여기 조건 하의 전자기적 증대가 부족하기 때문이다. 쉘 두께가 얇은(3nm 미만) 도 3A-4 의 경우, 역시 입사 레이저 파워(~200μM)를 높인 경우에도 신호가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 매우 얇은 은 레이어(layer) 는 충분한 전자기적 증대를 생산할 수 없음을 나타낸다. 반면, 쉘 두께가 ~5nm 인 도 3A-5 의 경우에는 하나의 Cy3이 나노입자 사이의 접합부(junction) 에 위치한 단일 금-은 코어-쉘 이합체로부터 검출한 상대적으로 높은 SERS 신호가 나타났다. 낮은 강도(intensity)에도 불구하고, 514.5nm 의 레이저 여기(excitation)에서의 지문 스펙트라(fingerprint spectra)인 1470 및 1580cm-1에서 Cy3의 특징적인 피크가 나타났다. 낮은 강도(intensity)는 단일 분자 SERS 연구(science 1997. 275(5203), 1102, Phys rev lett 1997, 78(9), 1667, Nano lett 2006, 6(1) 2173, Nano lett DOI: 10.1021/ni803621x)에서 사용한 파워 강도(intensity) 와 비교했을 때 비교적 낮은 레이저 파워(100μW) 및 핫 스팟 부위 내에서 단지 하나의 분자에 영향을 준다. 또한 금 나노입자 상에서 개질된 올리고뉴클레오티드와 같은 다른 종으로부터의 시그널을 측정하였다. 도 3C는 응집된 은 콜로이드에서, Cy3 개질된 올리고뉴클레오티드(5-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3', 1nM, 붉은 선)의 SERS 스펙트라를 Cy3-free 올리고뉴클레오티드(5-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-3', 1nM, 검은 선)의 SERS 스펙트라와 비교한 결과를 나타낸다. 도 3C(검은 선)의 SERS 스펙트라는 아데닌 염기(A10이 스페이서 서열로 사용되었다)가 풍부함으로 인하여 아데닌 모드(734cm-1, 1320cm-1)가 우세하다는 것과 다른 염기보다 더 증대되어 있다는 것을 나타낸다(JACS 2008, 130(16), 5523). 또한, 다른 DNA 염기에 대하여 지금까지 보고된 가장 낮은 검출 한계가 마이크로몰이하(sub-micromolar) 범위라는 것도 중요하다(JACS, 2006, 128, 15580). 그러나 도 3C의 SERS 스펙트라(붉은선)는 Cy3 분자에서 발생한 신호인 1470cm-1, 1580cm-1에서의 상대적으로 높은 신호를 나타낸다(Ananl chem. 2004, 76, 412-417). 그러나, 라만 강도 및 시간에 따른 스펙트라 위치 변동(spectral positions fluctuate with time), 및 스펙트라가 각 이합체마다 다르게 관찰된다(J. Phys. Chem. B 2002, 106, 8096). 따라서, 스펙트라 패턴은 기존에 보고된 것과 완전히 부합하지는 않는다. 은 쉘 두께에 관계없이, 실험 조건 하에서 금-은 코어-쉘 모노머에서의 검출가능한 SERS 신호의 부재는, 이합체 구조의 접합부에 위치한 Cy 구조만이 1470 및 1580cm-1에서 SERS 피크를 유도한다는 것을 확인시켜 준다. 쉘 두께가 ~10nm에서의 코어-쉘 이합체의 라만 스펙트라는(도 3A-6) 1480cm-1에서의 다른 Cy-3 관련 피크와 함께 734cm-1 , 1320cm-1에서의 아데닌 모드가 우세하다는 것을 나타낸다. 다른 나노입자에 대한 라만 산란 강도는 실험마다 일정한 형식(form)을 유지하지는 않는다. 두꺼운 은 쉘은 적절하지 않은 전자기적 증강을 야기하는 Cy3 분자를 커버할 수 있다.
실시예 4. 금-은 코어-쉘 이합체 나노입자의 입사 레이저의 편광에 따른 SERS 스펙트라 분석
쉘 두께가 ~5nm 인 대부분의 코어-쉘 이합체 나노입자(라만활성분자로서 Cy3 사용)는, 도 4A, B 에 나타난 것과 같이, 단일 입자로부터 검출가능한 SERS 를 나타내었다. 입사 레이저 광(incident laser light)이 이합체의 입자간 축에 정확히 편광되지는 않는다는 것을 고려하면(도 4A 1, 2, 3, 4, 5), 수직적으로 편광화된 각 이합체 나노 입자들은 검출가능한 SERS 신호를 나타낸다. 그러나, 도 5C는 1470cm-1에서 작은 피크만을 보여주는데, 이는 이합체 발생(orientation)이 입사관에 거의 수직이기 때문이다. 따라서, 쉘 두께가 최적화된 이들 코어-쉘 이합체 나노구조가 단일 DNA 검출에 고도로 적용가능한 핫 스팟 구조일 수 있다는 것을 발견하였다.
단일 분자 검출에서 온-오프 블링킹(blinking)이 발견된다는 것은 실험적으로 잘 알려져 있다(도 5A)(J. Phys. Chem. B2002, 106, 8096). 라만 강도가 없을 때 10초의 시간이 생기고 이어서 라만 강도가 돌아오면 주기적인 on" 시간이 생긴다. 이 온-오프 사이클링 현상은 신호가 존재하는 초강력장(intense field)으로부터 종국적으로 영원히 사라질 때까지 수 분간 계속될 수 있다. 또한, 핫 스판 안팎에서 분자의 운동으로 인한 초 단위의 SERS 강도 변화(fluctuation)을 관찰할 수 있다. 이들 블링킹 및 변동(blinking and fluctuation) 현상은 이전 문헌과 잘 합치한다.
도 5C 및 도 5D는 금-은 코어-쉘 이합체에 대한 SERS 신호의 입사 레이저 편광화된 의존을 보여준다. 모든 스펙트라는 514.5nm 여기 레이저(excitation laser), 20s 축적(accumulation), 샘플 40μW에서 검출된다. 입사된 레이저 광이 이합체의 세로축(longitudinal axis)에 평행하게 편광화되었을 때 Cy3 피크가 최대화되었다. 레이저가 세로축으로부터 20 및 40도 회전했을 때, Cy3 신호는 점차 감소하였다. 마지막으로, 광이 세로축에 수직으로 편광하였을때 Cy3 피크는 사라졌다(예컨대, 90 및 270도). 1580cm-1에서 다음 공식을 통해 이합체 구조에서 핫 스팟의 증강 인자(enhancement factor : EF)를 측정하였다.
EF=(I sers × N bulk )/(I bulk × N molecule )
I ser s와 I bulk 는 SERS 및 bulk 스펙트라에 대한 동일한 밴드의 강도를 나타내고, N bulk 는 bulk 샘플에 대한 bulk 분자 표지의 수를 나타내고, N molecule 은 SERS 스펙트럼에서 Cy3 분자 표지의 수를 나타낸다(N molecule =1). 1580cm-1 밴드 영역에서 가장 강한 스펙트라 밴드가 나타났으므로, 이 밴드를 I sers 와 I bulk 강도로 사용하였다. 이러한 접근에 따라, 핫 스팟의 EF는 2.7×1012로 계산되었다.
한편, FAM 과 Dabcyl 로 라벨링된 올리고뉴클레오티드로 개질된 나노입자 이합체로부터 SERS 스펙트라를 측정한 경우에도 Cy3 의 경우와 마찬가지로 고감도의 라만 스펙트라를 얻을 수 있어, 본 발명에 따른 나노입자 이합체의 구조 및 제조방법은 일반적인 라만 활성분자에 대해 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (28)
- 표면에 올리고뉴클레오티드가 결합된 금 또는 은 코어(core) 및 상기 코어를 둘러싼 금 또는 은 쉘(shell)로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개의 접합부에 라만 활성분자가 위치하며, 상기 두 개의 나노입자가 올리고뉴클레오티드를 통해 연결된 구조를 가지며, 상기 라만활성분자는 상기 올리고뉴클레오티드에 개질된 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 각각의 나노입자는 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 코어의 표면에 결합되고, 상기 올리고뉴클레오티드의 일부는 쉘의 외부로 노출된 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제2항에 있어서, 상기 각각의 나노입자 표면에 결합된 올리고뉴클레오티드는 보호 올리고뉴클레오티드 및 타겟포착 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제3항에 있어서, 상기 두 개의 나노입자 표면에 결합된 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 타겟 올리고뉴클레오티드와 혼성화를 이루고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 티올기, 아민기 및 알콜기로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표면 결합 기능기로 금 나노입자, 은 나노입자 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 표면 결합 기능기와 올리고뉴클레오티드 사이에 스페이서 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노입자 이합체는
i) 금 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체,
ii) 은 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체,
iii) 금 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체,
iv) 은 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자 두 개가 연결된 나노입자 이합체, 및
v) 금 코어 및 은 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자와, 은 코어 및 금 쉘로 이루어진 코어-쉘 나노입자가 연결된 나노입자 이합체
로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 코어의 직경은 5~300nm 임을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제8항에 있어서, 상기 코어의 직경은 10~40nm 임을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 쉘의 두께는 1~300nm 임을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제10항에 있어서, 상기 쉘의 두께는 1~20nm 임을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 라만 활성분자는 FAM, Dabcyl, TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올릿, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황 및 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5), 로다민(Rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 라만 활성분자는 유기 형광 분자인 나노입자 이합체.
- 제1항의 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자가 기능화되어 있는 나노입자 이합체.
- 제14항에 있어서, 상기 검출하고자 하는 분석물은 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물인 나노입자 이합체.
- 제14항에 있어서, 상기 바이오분자는 항체, 항체 단편, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 압타머인인 나노입자 이합체.
- 제1항에 있어서, 상기 나노입자 이합체가 무기물로 전체가 코팅된 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 제17항에 있어서, 상기 무기물은 실리카인 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
- 1) 표면이 보호 올리고뉴클레오티드 및 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합된 코어 A, 및 표면이 보호 올리고뉴클레오티드 및 라만활성분자가 말단에 결합된 타겟포착 올리고뉴클레오티드로 결합된 코어 B 를 각각 제조하는 단계,
2) 상기에서 제조된 코어 A 및 코어 B 에 타겟 올리고뉴클레오티드를 처리하여 혼성화시킴으로써 이합체를 형성하는 단계, 및
3) 상기의 코어 A 및 코어 B 의 표면에 각각 쉘을 도입하는 단계를 포함하는, 제1항의 나노입자 이합체의 제조 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 단계 1에서 코어 A와 코어 B를 각각 제조한 후, 코어 A와 코어 B의 타겟포착 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 가진 자성 마이크로 입자와 혼성화 반응을 진행하여, 코어 A와 코어 B에서 타겟포착 올리고뉴클레오티드가 결합된 나노 입자만를 분리하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 이합체의 제조 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 쉘의 도입은 코어로 이루어진 이합체와 쉘 전구체를 환원제 및 안정화제의 존재 하에서 반응시키는 것에 의해 이루어지는 방법.
- 1) 제1항 내지 18항 중 어느 한 항의 나노입자 이합체를 제조하는 단계, 2) 상기 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자를 기능화하는 단계, 3) 상기 나노입자 이합체를 하나 이상의 분석물을 포함하는 샘플에 노출시키는 단계, 및 4) 레이저 여기여기(excitation) 및 라만 분광법을 이용하여 하나 이상의 분석물을 검출 및 확인하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법.
- 1) 제1항 내지 18항 중 어느 한 항의 나노입자 이합체를 제조하는 단계; 2) 상기 나노입자 이합체의 표면 또는 코어의 표면에 검출하고자 하는 핵산에 상보적인 바이오분자를 기능화하는 단계; 3) 시료에서 핵산을 추출, 정제, 및 증폭시키는 단계; 4) 상기 증폭된 핵산의 특정서열에 코어-쉘 나노입자 이합체를 반응시켜 혼성화를 수행하는 단계; 및 5) 상기 나노입자 이합체가 결합된 핵산에 라만분광을 수행하는 단계를 포함하는, 핵산의 검출방법.
- 제23항에 있어서, 상기 핵산의 검출방법은 질병의 진단을 위한 핵산의 검출방법인 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
- 제23항에 있어서, 상기 핵산의 검출방법은 단일 염기 다형성(SNP)의 검출방법인 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
- 제22항에 있어서, 상기 라만 분광법이 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS) 하이퍼-라만 및/또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)인 것을 특징으로 하는 분석물을 검출하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 핵산은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 및 합성 핵산인 것을 특징으로 하는 분석물을 검출하는 방법.
- 제1항 내지 18항 중 어느 한 항의 나노입자 이합체를 포함하는, 분석물 검출용 키트.
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