CN102556959B - 一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法 - Google Patents
一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明阐述了一种可用来高产率制备高纯度且间距可调金属纳米颗粒二聚体的方法，利用两个末端分别修饰双巯基分子的长度可调的双链DNA作为连接部件，通过巯基和金纳米颗粒表面形成化学键将颗粒组装成离散二聚体，并且经过一步法电泳分离得到高纯度的目标产物。本发明的方法可同时制备高纯度尺寸和组成对称以及非对称的金纳米颗粒二聚体，涉及步骤少、操作简单、条件易控、重复性好，消除了利用DNA单修饰的金纳米颗粒组装纯度不高、步骤繁琐的问题。本发明可为等离激元共振光子学的基础研究提供坚实的平台，可用于表面增强拉曼散射和金属增强荧光等分子光谱研究，并可作为基于等离激元共振的超高灵敏度传感器。
Description
技术领域
本发明涉及利用生物大分子DNA可编程地组装离散金属纳米颗粒等离激元共振二聚体的方法，属于纳米材料制备领域。
背景技术
当特定波长入射光与金属纳米颗粒表面的自由电子相互作用时，可激发自由电子的集体震荡，把光限制在金属纳米颗粒表面的纳米尺度内，即产生局域表面等离子体共振。贵金属纳米颗粒由于局域表面等离子体共振效应导致其具有独特的光电性质，如在颗粒表面近场区域产生显著的电磁场增强现象，这使得该处的分子拉曼散射信号增强几个至十几个数量级，从而实现单分子的拉曼光谱检测，这种电磁场增强效应也可提高分子的荧光产生信号、原子的高次谐波产生效率等。由于金属纳米颗粒表面等离子体共振效应受到越来越广泛的关注，大量新颖的金属纳米结构也不断涌现，这催生了一门新兴交叉学科——等离激元光子学的诞生，越来越多物理、化学、生物、材料领域的研究人员投入到这一新兴学科的研究中。随着相关研究的不断深入和拓展，等离激元纳米结构在化学生物传感器、近场成像技术、负折射材料、光通信纳米波导等众多领域显示出巨大的潜在应用价值。
在金属纳米结构的研究中，金属纳米颗粒二聚体由于其结构简单、易建模等特点而被广泛研究，包括理论计算及单颗粒的光学性质观测等陆续见诸报端。然而对金属纳米颗粒的等离激元共振耦合作用的研究依然停留在固定间距的纳米颗粒之间，在这些研究中纳米颗粒的间距难以调控。对可控金属纳米结构的高产率制备是影响后续深入研究及应用的关键环节，目前也是一项极具挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的是提出一种高纯度金属纳米颗粒二聚体的制备方法，以克服现有方案的组装产率不高，纯化步骤繁琐等不足。
本发明的上述目的，可以通过以下技术方案来实现：一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，所述方法制备所得为尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体，其特征在于包括步骤。
S1：对单链寡核苷酸ssDNA末端修饰硫辛酸，其中单链寡核苷酸的长度与金属纳米颗粒二聚体的间距可调控性匹配；S2：将两条经末端修饰且具有互补序列的单链寡核苷酸ssDNA杂交配对成dsDNA；S3：通过修饰硫辛酸所具有的巯基与金属纳米颗粒的结合作用组装成离散型的二聚体，并用过量硫辛酸对金属纳米颗粒表面进行封闭处理；S4：采用电泳法将尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体分离。
进一步地，步骤S1中，在含有70%乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA-NHS及末端经氨基修饰的ssDNA，并加入作为少量缚酸剂的三乙胺，反应12小时，并利用真空蒸发设备将经过硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA浓缩，蒸发去除其中的乙腈成分；
步骤S2中，将两条经末端修饰且具有互补序列的单链寡核苷酸ssDNA在等摩尔的条件下，在1×PBS缓冲液中从95℃缓慢降至室温进行配对杂交成dsDNA；
步骤S3中，向含有50mM的NaCl的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒等摩尔的dsDNA，反应6小时，随后加入过量的NaCl使金属纳米颗粒团聚沉降，加速金属纳米颗粒偶联成二聚体，将沉降物经离心后重悬在50mM的NaCl溶液中，加入过量硫辛酸对金属纳米颗粒表面的其余部位进行封闭处理；
步骤S4中，在3%的琼脂糖中电泳分离出尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体。
更进一步地，所述金属纳米颗粒至少为金、银、铂、钯四种金属之一的纳米颗粒或纳米壳，或为半导体量子点。
更进一步地，在步骤S1之前，对单链寡核苷酸ssDNA还可以特定修饰荧光染料或可特异性结合目标的检测物。
本发明的上述目的，还可以通过以下技术方案来实现：一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，所述方法制备所得为尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体，其特征在于包括步骤。
S1’：预备序列互补配对的单链寡核苷酸ssDNA1和单链寡核苷酸ssDNA2，并分别末端修饰硫辛酸，其中单链寡核苷酸的长度与金属纳米颗粒二聚体的间距可调控性匹配；S2’：将硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA1与尺寸相对较大的金属纳米颗粒在摩尔比为1的条件下混合、修饰；S3’：将硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA2与尺寸相对较小的金属纳米颗粒在摩尔比大于1的条件下混合、修饰；S4’：将两组金属纳米颗粒混合组装，并使尺寸相对较小的金属纳米颗粒和尺寸相对较大的金属纳米颗粒之间摩尔比大于1；S5’：采用电泳法将尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体分离。
进一步地，步骤S1’中，预备序列互补配对的单链寡核苷酸ssDNA1和单链寡核苷酸ssDNA2，在含有70%乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA-NHS及末端经氨基修饰的ssDNA1，并加入作为少量缚酸剂的三乙胺，反应12小时，并利用真空蒸发设备将经过硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA1浓缩，蒸发去除其中的乙腈成分，以相同的方法分次同步或异步修饰单链寡核苷酸ssDNA2。
步骤S2’和S3’中，在含有50mM的NaCl的尺寸相对较大的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒等摩尔的ssDNA1，同时在含有50mM的NaCl的尺寸相对较小的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒摩尔比大于1的ssDNA2，反应12小时。
步骤S5’中，在3%的琼脂糖中电泳分离出尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体。
更进一步地，所述金属纳米颗粒至少为金、银、铂、钯四种金属之一的纳米颗粒或纳米壳，或为半导体量子点。
更进一步地，在步骤S1’之前，对单链寡核苷酸ssDNA1和/或单链寡核苷酸ssDNA2同时或择一特定修饰荧光染料或可特异性结合目标的检测物。
本发明的技术方案较之于现有技术，其显著优点体现在：该制备方法可制备高纯度的尺寸和组成对称及非对称的金纳米颗粒二聚体，所涉及的步骤少、操作简单、条件易控、重复性好。此外，本发明的方法还可用来方便、高产率的制备金纳米颗粒和银纳米颗粒、半导体量子点、金纳米壳四者之间任选两者作为构筑激元的尺寸和组成对称及非对称二聚体结构，并且纳米颗粒之间的距离可通过改变双链DNA的长度进行调控。
附图说明
图1是通过本发明制得的13nm金颗粒构成的对称二聚体透射电子显微镜照片；
图2是通过本发明制得的13nm金颗粒构成的对称二聚体低温电镜照片；
图3是通过本发明制得的13nm和5nm金颗粒构成的非对称二聚体透射电子显微镜照片；
图4是通过本发明制得的13nm金颗粒构成的对称二聚体琼脂糖电泳照片。
具体实施方式
近年来，利用生物大分子DNA作为构筑基元引导金属纳米颗粒可控组装是等离激元纳米结构研究中的前沿和热点研究内容。DNA具有高度特异识别能力，遵循简单的A-T、C-G碱基配对规则，因此具有高度的可设计性；DNA双螺旋具有结构刚性，并且刚性长度可达到50nm，目前对DNA的功能修饰技术也在不断进步和完善，这些优势使得DNA可用来修饰并引导金属纳米颗粒进行复杂、可控的组装，构筑丰富多样的金属纳米结构，包括金纳米颗粒二聚体、三聚体、金纳米颗粒纳米线等。
为了***深入地研究金属纳米颗粒的局域表面等离激元共振耦合作用，以及基于表面等离激元共振效应的增强分子光谱、荧光能量转移、生物传感等纳米光子学的基础及应用问题，本发明针对现有常见的金属纳米颗粒结构组装制备过程繁琐、产率及纯度低的缺陷，提出新的制备金纳米颗粒纳米结构尤其是金纳米颗粒二聚体纳米结构的高纯度简便制备方法。设计总的来看：利用两个末端分别修饰双巯基分子的不同长度双链DNA作为连接部件，通过巯基和金纳米颗粒表面形成化学键将颗粒组装成离散二聚体，并且经过一步法电泳分离得到高纯度的目标产物，包括对称和非对称的金纳米颗粒二聚体。
分步骤概括来看：制备尺寸对称金纳米颗粒二聚体的具体方法为：对单链寡核苷酸ssDNA末端修饰硫辛酸（简称DHLA），将经过末端修饰的具有互补序列的ssDNA杂交配对形成dsDNA，随后通过控制dsDNA和金纳米颗粒的摩尔比，利用巯基和金纳米颗粒的结合作用将金纳米颗粒组装成离散二聚体，并且用过量DHLA对金纳米颗粒表面进行封闭处理，最后利用电泳手段一步分离出高纯度的对称产物。
再者，制备尺寸非对称的金纳米颗粒二聚体的具体方法为：先在DHLA修饰的ssDNA1和金纳米颗粒摩尔比为1的条件下对大尺寸金纳米颗粒进行修饰；同时在DHLA修饰的ssDNA2（ssDNA2和ssDNA1互补配对）和金纳米颗粒摩尔比>1的条件下，对小尺寸金纳米颗粒进行修饰，随后将以上两组颗粒混合组装，并使小尺寸颗粒和大尺寸颗粒的摩尔比>1，最后通过电泳一步分离得到高纯度的非对称产物。
上述制备方法中，单链寡核苷酸的长度与金属纳米颗粒二聚体的间距可调控性匹配。金属纳米颗粒至少为金、银、铂、钯四种金属之一的纳米颗粒或纳米壳，或为半导体量子点。对单链寡核苷酸ssDNA1和/或单链寡核苷酸ssDNA2还可以同时或择一地特定修饰荧光染料或可特异性结合目标的检测物。
下面便结合图1至图4对本发明技术方案的两个实施例作进一步的详细说明，但以下关于实施例的描述及说明对本发明保护范围不构成任何限制。
实施例1：在含有70%乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA-NHS及末端经氨基修饰的单链引物P30和P30C（P30和P30C为含有30个碱基的寡核苷酸，且序列互补），并加入少量三乙胺作缚酸剂，反应12小时。利用真空蒸发设备将经过DHLA修饰的引物P30及P30C浓缩，并蒸发掉其中的乙腈成分。
制备由30bp dsDNA连接的13nm对称金纳米颗粒二聚体，将DHLA-P30和DHLA-P30C在等摩尔的条件下，在1×PBS缓冲液中从95℃缓慢降至室温进行配对杂交成双链dsP30，向含有50mM的NaCl的13nm金纳米颗粒水溶液中加入等摩尔的dsP30。反应6小时。随后加入过量的NaCl使金纳米颗粒团聚沉降，进一步促进金纳米颗粒偶联成二聚体，将沉降物经离心后重悬在50 mM的NaCl溶液中，加入过量DHLA对13nm金纳米颗粒表面其余部位进行封闭。最后在3%的琼脂糖中电泳分离出目标产物。
制备由20nm和13nm金纳米颗粒组成非对称二聚体结构，在含有50mM的NaCl的20nm金纳米颗粒水溶液中加入等摩尔的DHLA-P30，同时在含有50mM的NaCl的13nm金纳米颗粒水溶液中加入P30C，并使P30C和13nm金纳米颗粒的摩尔比为5，反应12小时。将以上两组经过修饰的金纳米颗粒混合组装，13nm金纳米颗粒和20nm金纳米颗粒摩尔比为3，反应12小时，最后在3%的琼脂糖中电泳分离出目标产物。
实施例2：在含有70%乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA-NHS及末端经氨基修饰的单链引物P15和P15C（P15和P15C为含有15个碱基的寡核苷酸，且序列互补），并加入少量三乙胺作缚酸剂，反应12小时。利用真空蒸发设备将经过DHLA修饰的引物P15及P15C浓缩，并蒸发掉其中的乙腈成分。
制备由15bp dsDNA连接的13nm对称金纳米颗粒二聚体，将DHLA-P15和DHLA-P15C在等摩尔的条件下，在1×PBS缓冲液中从95℃缓慢降至室温进行配对杂交成双链dsP15，向含有50mM的NaCl的13nm金纳米颗粒水溶液中加入等摩尔的dsP15。反应6小时。随后加入过量的NaCl使金纳米颗粒团聚沉降，进一步促进金纳米颗粒偶联成二聚体，将沉降物经离心后重悬在50mM的NaCl溶液中，加入过量DHLA对13nm金纳米颗粒表面其余部位进行封闭。最后在3%的琼脂糖中电泳分离出目标产物。
制备由13nm和5nm金纳米颗粒组成非对称二聚体结构，在含有50 mM NaCl的13nm金纳米颗粒水溶液中加入等摩尔的DHLA-P15，同时在含有50 mM的NaCl的5nm金纳米颗粒水溶液中加入P15C，并使P15C和5nm金纳米颗粒的摩尔比为5，反应12小时。将以上两组经过修饰的金纳米颗粒混合组装，5nm金纳米颗粒和13nm金纳米颗粒摩尔比为3，反应12小时，最后在3%的琼脂糖中电泳分离出目标产物。
通过本发明方法制得的不同间距的金纳米颗粒二聚体的动态光散射平均粒径统计（单位nm）如下表所示。
。
上述这些制得的纳米颗粒二聚体可作为纳米光子学研究的基础结构和平台，用来研究表面等离激元共振效应增强分子光谱、荧光能量转移以及基于等离激元共振效应的高灵敏度传感器。
以上通过具体实施范例的描述，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明专利申请权利保护范围之内。
Claims (8)
1.一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，所述方法制备所得为尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体，其特征在于包括步骤：
S1：对单链寡核苷酸ssDNA末端修饰硫辛酸，其中单链寡核苷酸的长度与金属纳米颗粒二聚体的间距可调控性匹配；
S2：将两条经末端修饰且具有互补序列的单链寡核苷酸ssDNA杂交配对成dsDNA；
S3：控制dsDNA与金属纳米颗粒的摩尔比为1，并通过修饰硫辛酸所具有的巯基与金属纳米颗粒的结合作用组装成离散型的二聚体，并用过量硫辛酸对金属纳米颗粒表面进行封闭处理；
S4：采用电泳法将尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体分离。
2.根据权利要求1所述的一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，在含有70％乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA—NHS及末端经氨基修饰的ssDNA，并加入作为少量缚酸剂的三乙胺，反应12小时，并利用真空蒸发设备将经过硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA浓缩，蒸发去除其中的乙腈成分；
步骤S2中，将两条经末端修饰且具有互补序列的单链寡核苷酸ssDNA在等摩尔的条件下，在1XPBS缓冲液中从95℃缓慢降至室温进行配对杂交成dsDNA；
步骤S3中，向含有50mM的NaCl的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒等摩尔的dsDNA，反应6小时，随后加入过量的NaCl使金属纳米颗粒团聚沉降，加速金属纳米颗粒偶联成二聚体，将沉降物经离心后重悬在50mM的NaCl溶液中，加入过量硫辛酸对金属纳米颗粒表面的其余部位进行封闭处理；
步骤S4中，在3％的琼脂糖中电泳分离出尺寸对称的金属纳米颗粒二聚体。
3.根据权利要求1或2所述的一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：所述金属纳米颗粒至少为金、银、铂、钯四种金属之一的纳米颗粒或纳米壳，或为半导体量子点。
4.根据权利要求1或2所述的一种高纯度金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1之前，对单链寡核苷酸ssDNA特定修饰荧光染料或可特异性结合目标的检测物。
5.一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，所述方法制备所得为尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体，其特征在于包括步骤：
S1’：预备序列互补配对的单链寡核苷酸ssDNAl和单链寡核苷酸ssDNA2，并分别末端修饰硫辛酸，其中单链寡核苷酸的长度与金属纳米颗粒二聚体的间距可调控性匹配；
S2’：将硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNAl与尺寸相对较大的金属纳米颗粒在摩尔比为1的条件下混合、修饰；
S3’：将硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNA2与尺寸相对较小的金属纳米颗粒在摩尔比大于1的条件下混合、修饰；
S4’：将两组金属纳米颗粒混合组装，并使尺寸相对较小的金属纳米颗粒和尺寸相对较大的金属纳米颗粒之间摩尔比大于1；
S5’：采用电泳法将尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体分离。
6.根据权利要求5所述的一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：
步骤S1’中，预备序列互补配对的单链寡核苷酸ssDNAl和单链寡核苷酸ssDNA2，在含有70％乙腈的水溶液中加入活性中间体DHLA-NHS及末端经氨基修饰的ssDNAl，并加入作为少量缚酸剂的三乙胺，反应12小时，并利用真空蒸发设备将经过硫辛酸修饰的单链寡核苷酸ssDNAl浓缩，蒸发去除其中的乙腈成分，以相同的方法分次同步或异步修饰单链寡核苷酸ssDNA2；
步骤S2’和S3’中，在含有50mM的NaCl的尺寸相对较大的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒等摩尔的ssDNAl，同时在含有50mM的NaCl的尺寸相对较小的金属纳米颗粒水溶液中加入相对颗粒摩尔比大于1的ssDNA2，反应12小时；
步骤S5’中，在3％的琼脂糖中电泳分离出尺寸非对称的金属纳米颗粒二聚体。
7.根据权利要求5或6所述的一种金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：所述金属纳米颗粒至少为金、银、铂、钯四种金属之一的纳米颗粒或纳米壳，或为半导体量子点。
8.根据权利要求5或6所述的一种高纯度金属纳米颗粒二聚体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1’之前，对单链寡核苷酸ssDNAl和/或单链寡核苷酸ssDNA2同时或择一特定修饰荧光染料或可特异性结合目标的检测物。
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