KR101245004B1 - 주혈흡충증 진단에 유용한 합성 주혈흡충 특이항원 및 이를 포함하는 주혈흡충증의 검출을 위한 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주혈흡충증 진단에 유용한 합성 일본 주혈흡충 특이항원 및 이를 포함하는 주혈흡충 검출을 위한 진단 키트에 관한 것으로, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 본 발명의 인체에 기생하는 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체는 기존의 진단키트보다 높은 특이도와 민감도를 제공하여 일본주혈흡충증을 포함하여 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증 등 사람에 기생하는 주혈흡충증의 진단에 보다 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

주혈흡충증 진단에 유용한 합성 주혈흡충 특이항원 및 이를 포함하는 주혈흡충증의 검출을 위한 진단 키트 {A synthetic antigen against Schistosoma japonicum useful in diagnosing Schistosoma and the diagnostic kit for detecting Schistosoma comprising the same}

본 발명은 주혈흡충증 진단에 유용한 합성 주혈흡충 특이항원 및 이를 포함하는 주혈흡충 검출을 위한 진단 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 주혈흡충증 진단이 가능하며, 기존의 제품에 비해 높은 특이성과 민감도를 제공하는 합성 주혈흡충 특이항원 및 이를 포함하는 일본 주혈흡충증, 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증과 같은 주혈흡충증의 진단에 유용한 진단키트에 관한 것이다.

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주혈흡충 (schostosomes)은 사람에 감염되는 흡충류 중 가장 중요한 것으로 세계보건기구 (WHO) 에서는 1억 8,000~2억 명 가량이 주혈흡충증에 감염된 것으로 추정하고 있으며, 매년 약 20만 명이 사망하고 있어 말라리아 다음으로 중요시하는 열대병이다. 주혈흡충증은 수인성 질환이며, 유미유충이 물속에서 사람의 피부를 뚫고 침입하여 인체감염을 일으킨다. 사람의 주 감염경로는 주로 물속에서 일을 하거나 물놀이를 할 때 피부를 통하여 감염된다. 즉, 벼농사를 짓는 농부, 물속에서 수영을 할 때, 낚시질, 빨래 등이 감염되는 기회가 된다. 또한 유미유충을 포함하는 음료수를 통한 감염도 일어난다. 일본주혈흡충의 보유숙주는 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 물소, 사슴, 쥐 등이 보유숙주로 작용한다. 이 주혈흡충은 사람의 정맥혈관 내에 기생하는 흡충으로서 사람의 문맥 (portal vein), 간내 문맥순환 (portal circulation), 장간막 정맥 (mesentery vein) 혹은 골반 및 방광 정맥총 (bladder plexus venosus) 등에 기생하면서 이질성 (dysentery) 증상 혹은 혈뇨 (hematuria)를 동반하는 만성 질환을 일으킨다. 사람에 기생하는 주혈흡충에는 일본주혈흡충 (Schistosoma japonicum), 만손주혈흡충 (Schistosoma mansoni), 방광주혈흡충 (Schistosoma haematobium), 장간막주혈흡충 (Schistosoma intercalatum), 메콩주혈흡충 (Schistosoma mekongi) 5종류가 알려져 있다. 이 중에서 일본주혈흡충, 만손주혈흡충, 방광주혈흡충이 가장 중요한 종류로 세계적으로 널리 분포한다. 장간막주혈흡충과 메콩주혈흡충은 일부 지역에 국한되어 있고, 메콩주혈흡충은 최근에 신종으로 명명되었다 (Savioli et al., 1997).

주혈흡충은 다른 흡충류와 달리 자웅이체로서 암컷과 수컷이 다른 개체로 구분되나 성충은 암수가 쌍을 이루어 기생한다. 수컷은 원통형의 짧은 앞부분과 비교적 폭이 넓은 뒷부분으로 나누어져 있다. 이 뒷부분의 복측에 깊은 홈이 있어 암컷을 안고 있기에 편한 포자관 (gynecophoral canal)을 형성한다. 구흡반 (oral sucker)과 복흡반 (ventral sucker)은 암컷보다 수컷에서 잘 발달되어 있다. 충란도 다른 흡충류와 달리 난개 (operculum)가 없고, 충란의 말단 혹은 측방에 극 (spine) 혹은 극상돌출 (knob)이 나와 있으며 난각 속에는 섬모에 덮혀 있는 미라시디움 (miracidium) 유충이 들어있다 (Valli et al., 1999).

대변 혹은 소변을 통하여 밖으로 나온 충란은 물속에서 부화되어 그 속에 있던 미라시디움 (miracidium)이 탈출한다. 미라시디움은 중간숙주인 우렁이 (snail)에 침입하면 스포로시스트 (sporocyst)가 된다. 그 속에서 인체감염형인 유미유충 (cercaria)이 발육한다. 성숙한 유미유충은 꼬리의 끝이 둘로 갈라져 있는 특이한 형태를 나타내며 (furcocercous cercaria), 우렁이 체내에서 빠져나와 물속으로 유출하고 물속에서 24-48시간 동안 자유로이 유영하다가 종속주인 사람의 피부에 닿으면 이를 뚫고 인체 내에 침입한다. 만일, 물속에 있는 유미유충이 음료수를 통해 들어오게 되면 구강이나 식도 등의 점막을 관통한 후 체내로 침입한다.

인체 내에 침입한 유충은 문맥 (portal vein), 장간막 정맥 (mesentery vein)이나 골반부 정맥총 (pelvic plexus venosus) 등 기생부위에 도달하여 성충으로 발육한다. 피하조직으로 들어온 유충은 소정맥 (venule) 또는 림프관 (lymph duct)을 통하여 침입부위로부터 우심 (right heart)으로 운반되고, 우심에서 폐 (lung)까지 이동한 후 폐모세혈관 (pulmonary capillary)을 지나 폐정맥 (pulmonary vein)을 거쳐 대순환계통 (systemic circulation)으로 나와 장간막 동맥 (mesentery artery) 또는 문맥 (portal vein)에 이르러 성충으로 발육한다. 주혈흡충은 감염 후 30-40일이면 성충으로 되고, 대변 혹은 소변으로 충란을 배출한다.

주혈흡충증의 지리적인 분포는 세계적으로 매우 광범위하게 분포되어 있는 특성을 보이며 그 종류에 따라 분포양상이 또한 다르다. 일본주혈흡충은 일본, 중국의 중남부지역, 필리핀, 타이, 인도네시아 등지에서 널리 분포하고 있다. 특히 중국의 양자강 유역에 농후한 유행지가 있다. 약 1억에 가까운 감염자가 있을 것으로 추산한다. 만손주혈흡충은 아프리카 나일 삼각주 (nile delta) 지역에 농후한 유행지를 형성하고 있고, 아프리카 전역에서 발견되며 방광주혈흡충과 혼합 분포하는 곳이 많다. 예멘, 사우디아라비아 등의 중동과 남미의 브라질, 수리남, 베네수엘라, 푸에르토리코, 도미니카공화국에도 유행지가 있다. 현재 적어도 6,000 만명이 감염되어 있을 것으로 추산하고 있다. 방광주혈흡충은 과거에는 나일강 하류 지역에 유행지가 있었으나 현재는 전 아프리카에 퍼져 있으며, 중동의 이스라엘, 예멘, 사우디아라비아, 레바논, 시리아, 터키, 이라크, 이란 등과 인도에까지 분포되어 있다. 최근 아프리카에서 수력발전을 위한 댐공사나 농업용 관개공사 등으로 분포지역도 넓어지고, 감염자 수도 과거보다 크게 증가하고 있다 (Savioli et al., 2002).

주혈흡충증은 그 병변과 임상증상에 있어서 종류에 따라 약간 다르나 대체적으로 다음 세 시기로 나눌 수 있다. 잠복기는 유충이 사람의 피부를 침입하여 성충이 될 때까지의 시기이다. 이때 처음 나타나는 증상은 유충이 침입한 피부에 가려움증을 동반한 피부염이 생긴다. 유충이 간이나 다른 기관에 침입하면 점상출혈과 호산구 등 다핵백혈구의 침윤이 있다. 또한, 감염된 후 수일 동안 독성 혹은 알러지성 발진이 있을 수 있다. 이 시기에 혈액상으로 높은 호산구 증가증이 나타난다. 급성기는 충체가 산란을 시작하는 시기이며 성충은 문맥, 간내 문맥순환, 장간막 정맥, 골반부 정맥총 또는 방광 정맥총 등에 살면서 장벽이나 방광의 소정맥지에서 산란한다. 주혈흡충의 종류마다 산란량과 산란 부위가 달라 병변과 증상이 다르게 나타난다 (Neves et al., 1973).

일본주혈흡충은 한 마리당 매일 배란 수가 3,500개로 가장 많이 산란한다. 산란된 충란은 점막하 조직 또는 점막을 통하여 삼출된 혈액과 같이 장관에 배출된다. 때로는 충란이 쉽사리 혈류를 통하여 간, 비장 혹은 폐로 운반된다. 이때 나타나는 임상증상은 발열, 메스꺼움, 두드러기, 호산구 증가, 복부 불쾌감, 설사, 체중감소, 기침, 간비대, 비종대 등이 나타난다. 이와 같은 시기가 중감염일 때는 1년 반, 경감염일 때는 4-5년 경과된 다음 만성기에 들어간다 (Ross et al., 2000).

만손주혈흡충은 암컷 한 마리가 하루 300개의 충란을 낳아 비교적 산란량이 적다. 따라서, 장벽에 삼출되는 충란의 수와 장과 간 내 혈관 주위조직에 침착되는 충란수도 적어서 일본주혈흡충증의 경우보다 병변이 훨씬 적고, 가벼운 증상을 보인다.

방광주혈흡충의 병변은 일본주혈흡충과 비슷하지만 이 충은 골반 정맥총이나 방광 정맥총 내에 기생하며 한 마리가 1일에 1,500개의 충란을 산란한다. 따라서 이 곳에서 산란된 충란은 방광 점막을 파괴하고 혈액과 더불어 방광 내로 탈출하고 소변으로 배출된다. 그러므로 병변은 주로 비뇨생식기계 특히 방광벽에 나타난다. 증상으로 가장 중요한 것은 혈뇨 (hematuria) 이다.

만성기의 일본주혈흡충증과 만손주혈흡충증에 있어서는 간종대 (hepatomegaly) 및 비종대 (splenomegaly)가 점차 심해진다. 간은 시일이 경과하면서 경변증으로 진행한다. 장간막과 대망 (omentum)이 점차 두꺼워지고, 결장과 유착하고 복부팽만이 현저해진다. 그리고 장점막의 위축으로 심한 소화장애를 일으킨다. 복수 및 부종이 나타나며 간경변 및 문맥 전색 (portal embolism)의 정도에 따라 복수가 더욱 진전하게 된다. 만일, 충란이 대순환계를 통하여 뇌에 이르면 잭손씨 간질 (Jacksonian epilepsy)의 증후도 나타난다. 방광주혈흡충증에서는 충란이 방광점막에 손상을 주어 방광점막의 비후 증식이 오고, 방광 내에 유두종양 증식 (papillomatous growth)을 볼 수 있으며, 결국에는 방광암까지 발전된다. 또한 충란이 석회화하면 이를 핵으로 하여 방광에 결석이 생길 수도 있다 (Ross et al., 2000).

주혈흡충증의 진단은 잠복기에는 실제 진단이 불가능하나 급성기에는 혈점액성 대변 내에서 충란을 검출하거나 혈뇨 중에서 충란을 검출할 수 있다. 특히 만손주혈흡충증일 때는 산란되는 충란의 수가 적어 많은 양의 대변을 가지고 집란법, 특히 AMS III법을 사용하여 검사하는 것이 좋다. 만성기에는 충란의 발견이 곤란하며 일본주혈흡충증이나 만손주혈흡충증에서는 직장경으로 직장점막을 생검하여 충란을 발견한다. 만일, 대변이나 직장점막 생검에서 충란이 발견되지 않는 경우 간생검을 하여 충란이 발견되는 수가 있다. 그러나, 방광주혈흡충에서는 충란이 방광에서 소변을 통하여 배출되므로 소변에서 본충의 특이한 충란을 발견하여야 한다. 만일 소변에서 충란이 발견되지 않으면 방광경이나 방광점막 생검을 실시하여 충란을 발견, 진단 할 수 있다.

지금까지 알려진 치료제로는 프라지콴텔(praziquantel)이 가장 특효약으로 알려졌다. 프라지콴텔 60 mg/kg의 용량을 1일 2회 혹은 3회로 나누어 복용하되 1일 혹은 2일간 투여하면 완전 치료가 가능하다. 부작용으로 가벼운 두통과 복부 불쾌감 및 현기증 등이 있을 수 있다.

현재까지 전 세계적인 주혈흡충 퇴치사업 (national schistosomiasis control program)에서 표준법으로 사용하고 있는 주혈흡충의 진단은 대변검사 (stool examination)나 소변검사 (urine filtration) 이다. 최근에는 여러 가지 혈청학적 검사, 즉, 보체결합반응, 충란주위침강반응, 한천이중확산법, 간접혈구응집반응, 간접형광항체법, 면역전기영동법, 효소항체법 (ELISA) 등이 유용하나 이들의 진단법은 아직까지 민감도와 특이도가 낮아 보조적인 검사법으로 사용된다. 현재까지 가장 확실한 진단은 대변이나 소변에서 충란을 발견하는 것이다.

대변 충란 검사법은 대변에서 주혈흡충의 알을 찾아내는 것이다. 이 검사는 가장 정확하게 감염여부를 판단할 수 있을 뿐 아니라, 대변 내 충란수를 측정하여 얼마나 심하게 감염되었는지 즉 감염 정도를 추정할 수 있는 장점이 있어 가장 일반화 된 방법이다. 그러나 충란 검출율이 10-30%에 불과하고, 또한 노동집약적이며 시간이 많이 소모되며 검체를 채취하거나 검사 방법이 불편하다.

혈청학적 방법은 충체가 어려서 아직 충란을 산란하지 않거나, 충체가 노쇠하여 충란을 생성하지 않을 경우 혈청에서 항체를 검출하여 주혈흡충 감염을 잠정 진단할 수 있다. 기생충 특이 항체를 혈청학적으로 검사하는 방법에는 보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법 등이 있다 (Zhu 2002).

상기에 기술한 바와 같이 다양한 진단 방법이 있으나, 주혈흡충의 감염에 있어서 중요한 문제점 중 하나는 검사실적으로 민감도와 특이도가 둘 다 높은 진단법이 정립되어 있지 않다는 점이다. 충란을 인체 가검물 또는 조직에서 직접 검출하는 것이 가장 확실한 방법이지만, 민감도가 낮고, 때로는 너무 침습적인 방법을 사용해야만 하는 것이 문제가 된다. 또한 임상증상과 방사선학적 검사가 진단에 도움이 되지만 다른 질병과 확실하게 감별하거나 원인 기생충을 확진할 수 있는 방법은 되지 못한다. 선별검사로 흔히 사용되고 있는 피내반응 검사는 민감도는 높지만, 특이도가 낮다고 알려져 있고, 현증과 과거 감염을 구분하지 못하며 충체 전체를 갈아서 만드는 조항원을 사용하는 데서 기인한 교차반응이 심해서 진단검사로는 부적절하다. 이를 보충하기 위해 1950년대 이후 기생충 특이 항체를 혈청학적으로 검사하는 보체 결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법 등이 개발되었지만, 민감도와 특이도면에서나 편리성 면에서 ELISA 방법이 우수하기 때문에 임상검사실에서 현증 감염의 진단 및 혈청학적 역학조사, 치료효과의 모니터링 및 치유판정에 유용하게 사용되고 있다.

만손주혈흡충과 방광주혈흡충의 진단방법은 효과적인 방법들이 보고되었다. 만손주혈흡충의 CAA(circulating anodic antigen)과 CCA(circulating cathodic antigen)을 진단하는 방법이 개발되었다. CCA에 대한 단클론항체를 이용한 진단용 스트립이 상용화 되었다 (van Dam et al., 1996; van Dem et al., 2002). 또한 만손주혈흡충의 SEA(soluble egg antigen)을 이용한 니트로셀룰로오스-돗(Nitrocellulose dot)-ELISA 방법은 만손주혈흡충에 대해서는 100% (38/38), 방광주혈흡충에 대해서는 93.6% (44/47)의 우수한 진단율을 보였으며, 특이도는 100% 이었다. 그리고 만손주혈흡충의 DNA를 증폭하는 PCR 진단방법은 민감도 92.9-95.3%, 특이도는 100% 이었다 (Gomes et al., 2009).

항-충란 항원(Anti-egg antigen) IgG 항체(antibody)를 진단하는 상품화된 ELISA 진단키트 (IgG-ELISA)는 민감도 (sensitivity)가 79.3-87.4% 이었으며 특이도 (specificity)는 38.9-53.5%로 매우 낮았다. 양성 진단율 (positive predictive value)은 20.8-24.6%로 매우 낮았다 (Lin et al., 2008). 일본주혈흡충 SEA (soluble egg antigen)을 항원으로 사용하여 IHA (indirect hemagglutination assay)와 ELISA를 수행한 결과, IHA는 민감도 83.7-92.3%, 특이도 55.8-67.3%를 보였으며, ELISA는 민감도 88.4-96.2%, 특이도는 38.4%를 보였다 (Zhou et al., 2007). 현재까지 연구된 일본 주혈흡충을 진단하기 위한 ELISA 방법은 민감도와 특이도를 올리는 문제에 있어서 한계가 있다. 또한 고가의 장비와 전문가를 반드시 필요로 하기 때문에 실제 주혈흡충증 환자가 자주 발생하는 농어촌 지역이나 섬 지역에서는 검사가 거의 불가능한 상태이다.

현재 혈청학적 진단방법은 일본 주혈흡충을 진단하는 가장 일반적인 방법이다. 일반적인 혈청학적 진단방법은 조항원이나 정제된 항원을 사용하여 항체 또는 항원을 진단하는 방법이다. 합성된 펩타이드를 사용하는 방법은 순수한 항원결정기 (epitope)를 제공하므로 이를 사용하여 항체나 순환 항원(circulating antigen)을 진단하는 방법은 기생충 감염진단 분야에 밝은 전망을 제시한다 (Noya et al., 2003).

이에 본 발명자들은 일본 주혈흡충증에 대해 보다 정확하고 특이적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 주혈흡충에 대한 3개의 특이항원을 합성하였으며, ELISA 시험을 통해 이러한 3개의 주혈흡충 특이항원이 일본주혈흡충증을 포함하여 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증 등 사람에 기생하는 주혈흡충증의 진단을 가능하게 할 뿐만 아니라 특히 기존의 제품에 비해 높은 특이성과 민감도를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인체에 기생하는 주혈흡충의 진단에 유용한 신규한 주혈흡충 특이항원을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 주혈흡충 특이항원을 포함하는 진단키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 주혈흡충 특이항원을 이용하여 주혈흡충증을 진단하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 인체에 기생하는 주혈흡충의 특이항원 23K Glutathione S-transferase(23K GST), 23K Glutathione S-transferase M1(23K GST M1), 23K Triosephosphate Isomerase(23K TPI) 또는 이의 서열 상동체를 제공한다.

상기한 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기한 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체를 포함하는 것을 특징으로 하는 주혈흡충증 진단 키트를 제공한다.

상기한 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기한 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체를 이용하는 것을 특징으로 하는 주혈흡충증 진단방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 인체에 기생하는 주혈흡충의 특이항원은 23K GST, 23K GST M1 및 23K TPI로서 명명하였으며, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 주혈흡충 특이항원은 또한 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1 및 23K TPI의 서열 상동체를 포함한다.

명명	아미노산 서열
23K GST (38 aa)	VAAGVEFED PGGRLPIVKITD QVEDVESEYH EKISKEI(서열번호 1)
23K GST M1 (45 aa)	GLVQPTRLL LEYLEEK CVSRIA YSKDFETLKVDFL DAFPKLVCFK (서열번호 2)
23K TPI (26 aa)	QSLAKEI TLSER SPGQAQEVHN FLRK (서열번호 3)

본원에서 정의되는 “주혈흡충 특이항원의 상동체”는 23K GST, 23K GST M1 또는 23K TPI의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상 상동성을 갖는 유사체를 포함한다.

본 발명에 따른 주혈흡충 특이항원은 주혈흡충증 진단이 가능하며 기존의 진단키트에 비해 높은 특이성 및 민감도를 제공한다.

본원에서 정의되는 “인체에 기생하는 주혈흡충”은 일본주혈흡충 (Schistosoma japonicum), 만손주혈흡충 (Schistosoma mansoni), 방광주혈흡충 (Schistosoma haematobium), 장간막주혈흡충 (Schistosoma intercalatum), 메콩주혈흡충 (Schistosoma mekongi), 바람직하게는, 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증 또는 일본주혈흡충증을 포함하며, 보다 바람직하게는 일본주혈흡충증을 포함한다.

본 발명은 상기 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체를 포함하는 주혈흡충증 진단키트를 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체를 이용하는 것을 특징으로 하는 주혈흡충증 진단방법을 제공한다.

본원에서 사용한 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 주혈흡충의 발병여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단 키트를 이용한 주혈흡충증 진단의 민감도 및 특이도는 시판되고 있는 진단 키트와 비교한 결과 보다 높은 민감도 및 특이도가 있었으며, 종래 진단 키트에 비하여 신속하고 간편하게 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 진단키트는 주혈흡충증의 진단에 용이하게 이용할 수 있을 것이다.

또한 본 발명에서는 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 또는 이의 서열 상동체를 이용하는 것을 특징으로 하는 주혈흡충증의 진단방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 진단 키트에 생물학적 시료를 상기의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하여 흡수되도록 하여 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선의 유무에 따라 주혈흡충증의 양성 여부를 판단하는 방법이다.

본원에서 사용한 용어, “생물학적 시료”는 주혈흡충증이 의심되거나 검사하려는 인간을 포함한 포유동물의 혈청, 혈장 등을 말하며, 본 발명에서는 편의상 “검체” 또는 “샘플”이라고 지칭하기도 한다. 상기 생물학적 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다.

생물학적 시료에 주혈흡충 항체가 있는 경우에는 본 발명의 상기 진단 키트 내 주혈흡충 특이항원이 항체와 결합하고 이들이 검사선을 통과함에 따라 상기 주혈흡충 특이항원과 생물학적 시료 내의 항체가 결합된 복합체가 검사선의 포획체와 결합하면서 육안으로 식별할 수 있도록 막 위의 검사선에서 색 변화가 일어난다. 그러나 생물학적 시료에 주혈흡충항체가 없는 경우에는 본 발명의 주혈흡충 항원과 결합하지 않아 막 위의 검사선에서 아무런 변화가 일어나지 않는다.

본 발명에서, 이 방식으로 측정된 주혈흡충 특이 항원의 수준은 주혈흡충증의 진단을 위해 지표로 이용될 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 예를 들면, 주혈흡충증의 소견 전 진단(조기 진단), 주혈흡충증의 발병의 확정 진단(definitive diagnosis), 그 중증도의 평가(scoring), 그의 경과의 모니터링, 치료 효능과 예후의 평가를 위해 유용하다.

본 발명의 주혈흡충 특이항원은 기존의 진단키트보다 높은 특이도와 민감도를 제공하여 일본주혈흡충증을 포함하여 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증 등 사람에 기생하는 주혈흡충증의 진단에 보다 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 일본주혈흡충 항체에 대해 특이적으로 반응하는 일본주혈흡충의 특이항원 합성의 제작방법을 도시한 흐름도를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 일본주혈흡충의 조항원과 일본주혈흡충증 환자의 혈청내의 일본주혈흡충증 항체와의 반응성을 보여 주는 면역블롯 (immunoblot) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 일본주혈흡충 특이항원을 2-D 전기영동을 이용하여 분리 정제를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 합성된 3종류의 일본주혈흡충 특이항원의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 합성된 3종류의 일본주혈흡충 특이항원과 일본주혈흡충증 환자의 혈청과의 반응성을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 일본주혈흡충증 특이 항체와 반응성이 있는 일본주혈흡충 항원 정제

1-1. 일본주혈흡충증 특이 항체와 반응성이 있는 일본주혈흡충 항원의 확인

필리핀 열대의학연구소 (Research Institute for Tropical Medicine, Philippines, Manila)에서 제공된 일본주혈흡충 항체 양성 혈청을 이용하여 본 시험을 수행하였다. 본 시험에 이용된 혈액들은 충란 검사를 통해서 일본주혈흡충증 환자로 확인된 혈액들이다. 이들 혈액들을 면역블롯 (immunoblot)에 이용하였다.

일본주혈흡충은 필리핀 열대의학연구소 (Research Institute for Tropical Medicine, Philippines, Manila)에서 제공된 것을 사용하였다. 일본주혈흡충을 생리식염수를 이용하여 3회 세척한 다음, 충체 10 mg당 5 ml의 생리식염수를 가하여 조직분쇄기 (tissue grinder; PolyTron, Kinematica AG 사, 스위스)를 이용하여 5분간 분쇄하고, 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 10% 아크릴아미드 겔 (acrylamide gel)에 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동된 겔내에 있는 단백질 항원들을 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮긴 후, 일본주혈흡충증 환자들의 혈액과 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이것을 0.1% Tween 20이 포함된 생리식염수로 씻은 다음, 항 인간 면역글로블린-HRP 축합체 (anti-human IgG-HRP conjugate; Sigma, St. Louis, Mo. USA)와 반응시켰다. 그 후, 멤브레인용 티엠비 (Membrane 1 component TMB, BioFX, USA)를 이용하여 발색시켰다(도 2 참조).

1-2. 일본주혈흡충 특이 항원의 정제

전기영동을 통하여 분리된 일본주혈흡충 항원의 정제는 전기용출 (electro-elution)을 이용하였다. 도 2에서와 같이 SDS-PAGE를 수행한 다음, 일본주혈흡충증 항체와 강하게 반응하는 부분인 분자량 20 kDa과 23 kDa 부위의 항원들을 확인하였다. 이 후, 많은 양의 간흡충 항원들을 동일한 조건에서 전기영동을 하여 분자량 20 kDa과 23 kDa 부위의 겔 (gel)을 잘라서 모은 다음, 전기용출기 (ElectroEluter Model 422; Bio-Rad 사, 미국)를 이용하여 전기 용출 (electro-elution)하였다. 추출된 일본주혈흡충 항원 용액을 0.1% 에스디에스 (SDS)와 0.1% 트원 20(Tween 20)이 포함된 생리식염수로 투석 (dialysis)하였다.

실시예 2: 일본주혈흡충 특이항원의 염기서열 분석 및 합성

2-1. 2D-전기영동

고정화 pH 구배(immoblized pH gradients, IPG; Amersham Bioscience, USA)를 사용하였다. 정제된 일본주혈흡충 특이항원을 투석용 재수화(rehydration) 용액 (8 M urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris, pH 6.8)에 1시간씩 2번 투석시켰다. 준비된 시료 60 ㎕를 2DE 재수화(rehydration) 용액 (8 M urea, 0.5% CHAPS, 0.2% DTT, 0.5% IPG 완충액, 0.002% bromophenol blue) 65 ㎕와 혼합하여 IPG strip (pH 3-10, 길이 7 cm)을 실온에서 밤새 재수화(rehydration)시켰다. Ettan IPGphor Isoelectic Focusing System(Amersham Bioscience, USA)을 사용하여 1단계에서 500 V로 30분, 2단계 1,000 V로 30분, 3단계 5,000 V로 1시간 40분 focusing시켜서 총 8,000 kVh 전압을 가했다.

등전기 초점화(Isoelectrofocusing, IEF)시킨 IPG 스트립(strip)을 1% DTT가 포함된 평형화완충액 (2% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M 우레아, 30% 글리세롤, 0.002% bromophenol blue)에 15분 동안 1차 평형화시키고, 2.5% 요오드아세트아미드(iodoacetamide)가 포함된 평형화완충액에 15분 동안 2차 평형화시켰다. 평형화시킨 스트립을 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하고 은 염색법(Silver staining Kit, BIo-Rad, USA)으로 염색하였다(도3a 및 도3b 참조).

2-2. 일본주혈흡충 특이항원의 염기서열 분석

2-D 전기영동(electrophoresis)을 통하여 분석된 3개의 20 kDa 단백질 spot과 6개의 23 kDa 단백질 spot을 폴리아크릴아마이드 겔에서 잘라냈다 (도 3a ; 도 3b 참조). 각 spot을 일본 오카야마대학 (Research Institute for Infectious Disease, Okayama University, Japan)에 보내 단백질 서열을 분석하였다. 분석 결과 20 kDa 단백질은 SJCHGC01885 단백질, 23 kDa 단백질은 글루타치온 S-전이효소(Glutathione S-transferase) M1 (23K GST M1), 글루타치온 S-전이효소 (23K GST), 트리오세포스페이트 아이소머라제(Triosephosphate isomerase) 1a (23K TPI)로 분석되었다.

2-3. 일본주혈흡충 특이항원 합성

분석된 3종류의 일본 주혈흡충 특이항원 (23K GST M1, 23K GST, 23K TPI)은 (주)펩트론(대전, 한국; www.peptron.co.kr)에서 합성하였다. 합성된 3종류의 일본주혈흡충 특이항원의 단백질 서열은 서열번호 1, 2 및 3에 나타내었다(도 4 참조).

실시예 3: 합성된 3종류의 일본주혈흡충 특이항원의 면역분석 (ELISA)를 이용한 일본주혈흡충증 환자 혈청과의 반응성 확인

3-1. ELISA 시험

합성된 일본주혈흡충 특이항원 단백질 100 ng을 200 ㎕의 카보네이트 코팅 완충액(carbonate coating buffer)에 희석하여 ELISA 플레이트에 넣어 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 이후 혼합액을 제거하고 0.1% Tween 20이 포함된 생리식염수 (PBST)로 5회 수세하였다. 1차 항체는 일본주혈흡충 환자 혈청을 1/100으로 희석하여 사용하였고, 대조군으로 정상 혈청을 사용하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 혈청 혼합액을 제거하고 PBST로 5회 수세한 후 항 인간 면역글로블린-HRP 축합체 (anti-human IgG-HRP conjugate)와 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, TMB (Tetramethylbenzidine solution, BioFX, USA)를 이용하여 발색을 시킨 후 흡광계(spetrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 정상 혈청의 흡광도의 평균을 계산하여 양성 판정의 기준으로 사용하였다 (도 5 참조).

본 발명의 일본주혈흡충 특이항원은 기존의 진단키트보다 높은 특이도와 민감도를 제공하여 일본주혈흡충증을 포함하여 만손주혈흡충증, 방광주혈흡충증 등 사람에 기생하는 주혈흡충증의 진단에 보다 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> A synthetic antigen against Schistosoma japonicum useful in diagnosing Schistosoma and the diagnostic kit for detecting Schistosoma comprising the same <130> DIF/2010-08-0006/HY <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> 23K GST <400> 1 Val Ala Ala Gly Val Glu Phe Glu Asp Pro Gly Gly Arg Leu Pro Ile 1 5 10 15 Val Lys Ile Thr Asp Gln Val Glu Asp Val Glu Ser Glu Tyr His Glu 20 25 30 Lys Ile Ser Lys Glu Ile 35 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> 23K GST M1 <400> 2 Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys 1 5 10 15 Cys Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 20 25 30 Asp Phe Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 35 40 45 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> 23K TPI <400> 3 Gln Ser Leu Ala Lys Glu Ile Thr Leu Ser Glu Arg Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Gln Glu Val His Asn Phe Leu Arg Lys 20 25

Claims (6)

1. 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 인체에 기생하는 주혈흡충의 특이항원 23K Glutathione S-transferase(23K GST), 23K Glutathione S-transferase M1(23K GST M1), 23K Triosephosphate Isomerase(23K TPI).
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 인체에 기생하는 주혈흡충이 일본주혈흡충 (Schistosoma japonicum), 만손주혈흡충 (Schistosoma mansoni), 방광주혈흡충 (Schistosoma haematobium), 장간막주혈흡충 (Schistosoma intercalatum) 또는 메콩주혈흡충 (Schistosoma mekongi)인 것을 특징으로 하는 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI.
4. 제 1 항에 따른 주혈흡충의 특이항원 23K GST, 23K GST M1, 23K TPI 를 포함하는 것을 특징으로 하는 주혈흡충증 진단 키트.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 주혈흡충증이 일본주혈흡충, 만손주혈흡충, 방광주혈흡충, 장간막주혈흡충 또는 메콩주혈흡충인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
6. 삭제

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