JP5093711B2 - Molecules that recognize AGE - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for readily preparing a mass of molecules binding with AGE (advanced glycation endproduct) in high specificity by recombining and expressing RAGE (AGE receptor) or a homologue thereof; and to provide a receptor chip for detecting the AGE for diagnosing diabetic vascular disorder, containing such the molecule, and a kit therefor. <P>SOLUTION: The biotinated RAGE prepared by recombination and expression by using a bacterial host cell and having a specific sequence and a homologue thereof are provided. The receptor chip is obtained by immobilizing the recombined and expressed biotinated RAGE and the homologue thereof on a solid phase. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&amp;INPIT

Description

本発明は、ＡＧＥを認識する分子、ならびに、そのような分子の製造方法、および、そのようなキットを含むＡＧＥ検出のためのキットに関する。   The present invention relates to molecules that recognize AGE, methods for producing such molecules, and kits for AGE detection that include such kits.

近年、糖尿病患者数は増加の一途を辿っている。それに伴い、糖尿病血管障害に罹患する患者人口も増加の一途を辿っいる。糖尿病患者の生活の質「QOL: Quality of Life」を損ねる元凶は血管合併症であり、全身の様々な組織傷害がそれによって起こるからである。これら全身での組織障害の中でも、眼、神経、および腎臓の障害は、それぞれ、糖尿病性網膜症、神経症、腎症（あわせて、三大合併症）とよばれ、特に、糖尿病において特徴的な疾患である。網膜症は、最終的には失明に至る疾患である。現在、後天性の失明原因の第１位が糖尿病によるものであり、日本においては年間約３０００人の糖尿病患者が失明している。腎症は最終的には腎不全に至り、透析療法が必要となる、透析導入原疾患の第１位であり、年間約１０００人が透析導入されている現状にある。現在では、このような合併症患者数が急激に増加し続けていることが、社会問題化しており、また、医学経済的にみても、これら合併症は、早期に解決すべき課題となっている。従って、これら合併症を早期に確実に検出する方法が求められている。   In recent years, the number of diabetic patients has been increasing. Along with this, the population of patients suffering from diabetic vascular disorders has been increasing. This is because vascular complications are the main cause of damaging the quality of life of diabetic patients, and various systemic injuries occur throughout the body. Among these systemic tissue disorders, eye, nerve, and kidney disorders are called diabetic retinopathy, neurosis, and nephropathy (a total of three major complications), respectively, and are particularly characteristic in diabetes Is a serious disease. Retinopathy is a disease that ultimately leads to blindness. Currently, diabetes is the number one cause of acquired blindness, and about 3,000 diabetic patients are blind each year in Japan. Nephropathy ultimately leads to renal failure and is the number one primary dialysis-induced disease that requires dialysis therapy. Currently, about 1,000 people are introduced into dialysis annually. At present, the rapid increase in the number of patients with such complications has become a social problem, and from a medical and economic viewpoint, these complications have become issues that need to be resolved early. Yes. Therefore, a method for reliably detecting these complications early is required.

糖尿病状態で加速的に生成が亢進する物質としては、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ： Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ）が公知である。従って、ＡＧＥを高感度で検出する方法／キットを提供することによって、糖尿病血管障害の早期診断が可能となる。ＡＧＥの特異的受容体としては、ＲＡＧＥ（Receptor for AGE）が公知であり、ＡＧＥ−ＲＡＧＥの、糖尿病血管障害の発生・進展における役割が注目され、多くの研究が行われてきている。（例えば、非特許文献１）
しかしながら、ＲＡＧＥを高発現する細胞は、後期の糖尿病患者の細胞でありそのため、天然の供給源は、限られている。ＡＧＥを検出する物質（センサー）としてＲＡＧＥを用いる場合には、ＲＡＧＥを組換え発現する必要がある。 As a substance whose production is accelerated in a diabetic state, a late glycation end product (AGE) is known. Therefore, by providing a method / kit for detecting AGE with high sensitivity, early diagnosis of diabetic vascular disorder becomes possible. As a specific receptor for AGE, RAGE (Receptor for AGE) is known, and the role of AGE-RAGE in the development and development of diabetic vascular disorders has attracted attention, and many studies have been conducted. (For example, Non-Patent Document 1)
However, cells that highly express RAGE are cells of late stage diabetic patients, and therefore natural sources are limited. When RAGE is used as a substance (sensor) for detecting AGE, it is necessary to recombinantly express RAGE.

ＲＡＧＥは糖鎖修飾された分子であり、ＡＧＥ以外に、アンフォテリンにも結合することが公知である。レセプター分子の糖鎖修飾によって、そのレセプター分子の表面の形状が変化することから、一般的に、天然の状態で糖鎖修飾されているレセプターとリガンドとの結合には、レセプターの糖鎖部分が重要であると考えられている。ＲＡＧＥとアンフォテリンとの結合の場合も、ＲＡＧＥのＮ−グリカンが結合に重要であることが報告されている（例えば、非特許文献２）。そのため、ＲＡＧＥの組換え発現には、真核生物宿主細胞を用いることが必須であると考えられていた。   RAGE is a sugar chain-modified molecule and is known to bind to amphoterin in addition to AGE. Since the shape of the surface of the receptor molecule changes due to the sugar chain modification of the receptor molecule, in general, the sugar chain part of the receptor is used for the binding between the receptor and the ligand that are sugar chain modified in the natural state. It is considered important. In the case of binding between RAGE and amphoterin, it has been reported that RAGE N-glycans are important for binding (for example, Non-Patent Document 2). For this reason, it has been considered essential to use eukaryotic host cells for recombinant expression of RAGE.

その一方で、真核生物細胞を宿主として用いた場合には、原核生物細胞と比較して、操作がより煩雑であり、また、細胞の増殖に多大な費用および時間が必要とされるという欠点もある。   On the other hand, when eukaryotic cells are used as a host, the operation is more complicated than prokaryotic cells, and the cost and time are required for cell proliferation. There is also.

この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
山本 靖彦、外４名、「ＡＧＥ−ＲＡＧＥ系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」、日薬理誌、日本薬理学会、２００３年、１２１、４９〜５６ GeethaSrikrishna、外６名、N-Glycans on the receptor for advanced glycation end productsinfluence amphoterin binding and neurite outgrowth、Journal of Neurochemistry、InternationalSociety for Neurochemistry、２００２、８０、９９８−１００８ Prior art document information relating to the invention of this application includes the following.
Yasuhiko Yamamoto, 4 others, “Possibility of inhibiting diabetic vascular disorder targeting AGE-RAGE system”, Japanese Pharmacological Journal, Japanese Pharmacological Society, 2003, 121, 49-56 GeethaSrikrishna, 6 others, N-Glycans on the receptor for advanced glycation end products influence amphoterin binding and neurite outgrowth, Journal of Neurochemistry, International Society for Neurochemistry, 2002, 80, 998-1008

ＲＡＧＥまたはそのホモログを組換え発現させて、ＡＧＥと高い特異性で結合する分子を、簡便かつ大量に提供すること、およびそのような分子の調製方法を提供すること、ならびに、そのような分子を含むＡＧＥ検出のための受容体チップおよびキットを提供することが、本願発明の課題である。   Recombinantly expressing RAGE or a homologue thereof to provide a simple and large amount of a molecule that binds with high specificity to AGE, and to provide a method for preparing such a molecule, and to provide such a molecule It is an object of the present invention to provide a receptor chip and kit for AGE detection.

従来からの予測に反して、大腸菌を宿主細胞として用いた場合に、高い特異性でＡＧＥに結合するＲＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子のフラグメントを組換え発現することができた。さらに、特定の配列を特異的にビオチン化する細菌細胞を宿主細胞として用い、ビオチン化される配列を含む組換えＲＡＧＥを発現することによって、ビオチン化組換えＲＡＧＥを産生し、アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相に組換えＲＡＧＥを固定化することによって、簡便に、高感度ＡＧＥ検出用チップを生成することができた。さらに、ジスルフィド還元系に変異を有する変異宿主細胞を用いること、および／または、宿主大腸菌を低温で培養することによって、組換え発現タンパク質による封入体の形成が抑制され、その結果、リフォールディングが不要な簡便な組換え高発現系を開発し、本発明を完成した。   Contrary to conventional predictions, when E. coli was used as a host cell, it was possible to recombinantly express RAGE molecules and fragments of RAGE molecules that bind to AGE with high specificity. Furthermore, a bacterial cell that specifically biotinylates a specific sequence is used as a host cell, and by expressing recombinant RAGE containing the biotinylated sequence, biotinylated recombinant RAGE is produced, and avidin or streptavidin is added. By immobilizing recombinant RAGE on the immobilized solid phase, a highly sensitive AGE detection chip could be easily generated. Furthermore, by using mutant host cells with mutations in the disulfide reduction system and / or culturing host E. coli at low temperatures, inclusion body formation by recombinantly expressed proteins is suppressed, and as a result no refolding is required A simple recombinant high expression system was developed to complete the present invention.

したがって、本発明は、以下を提供する。   Accordingly, the present invention provides the following.

（項目１） 糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
ここで、ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列によってビオチン化され、以下：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、アミノ酸配列ＫＩＧ、アミノ酸配列ＫＩ、アミノ酸配列ＫＩＡ、アミノ酸配列ＫＩＥ、アミノ酸配列ＫＬＧ、または、アミノ酸配列ＫＶＧ
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または、配列番号６に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される、ポリペプチド。 (Item 1) A polypeptide comprising a receptor-derived sequence and a biotinylated sequence that is not glycosylated, wherein the polypeptide binds to AGE, wherein the receptor-derived sequence is:
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) the sequence of a fragment of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) When a Blast analysis using the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as a reference sequence, using BLOSUM-62 as a matrix and using only Low-complexity as a filter, an E value of 1e-20 or less The amino acid sequence of a polypeptide that is
(D) the amino acid sequence of a polypeptide having at least one conservative substitution to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(E) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having one or several substitutions, additions and deletions relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(F) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having at least one conservative substitution and one or several substitutions, additions, deletions to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and
(G) the amino acid sequence of a polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions;
Selected from the group consisting of
Here, the biotinylated sequence is biotinylated with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the following:
(I) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence KIG, the amino acid sequence KI , Amino acid sequence KIA, amino acid sequence KIE, amino acid sequence KLG, or amino acid sequence KVG
(J) An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or a fragment of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Sequence;
(K) A matrix using the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 as a reference sequence Amino acid sequence of a polypeptide having an E value of 1e-20 or less when Blast analysis using BLOSUM-62 as a filter and using only Low-complexity as a filter;
(L) At least 1 with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. The amino acid sequence of a polypeptide having two conservative substitutions;
(M) 1 or 2 with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 The amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence with several substitutions, additions and deletions;
(N) at least 1 with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 The amino acid sequence of a polypeptide having one amino acid sequence with one conservative substitution and one or several substitutions, additions, deletions;
A polypeptide selected from the group consisting of:

（項目２） 細菌宿主細胞によって組換え発現されたポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。   (Item 2) The polypeptide according to claim 1, which is a polypeptide recombinantly expressed by a bacterial host cell.

（項目３） 前記細菌宿主細胞が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する、請求項２に記載のポリペプチド。   (Item 3) The polypeptide according to claim 2, wherein the bacterial host cell expresses a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

（項目４） 前記レセプター由来の配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列であり、前記ビオチン化配列が配列番号４に記載されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。   (Item 4) The polypeptide according to claim 1, wherein the receptor-derived sequence is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and the biotinylated sequence is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.

（項目５） 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞である、請求項２に記載のポリペプチド。   (Item 5) The polypeptide according to claim 2, wherein the bacterial host cell is a cell having a mutation in a disulfide reduction system.

（項目６） 前記ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が：
（ｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；
（ｉｉ）グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；ならびに
（ｉｉｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するＥ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、請求項５に記載のポリペプチド。 (Item 6) A cell having a mutation in the disulfide reduction system:
(I) E. deficient in thioredoxin reductase gene coli;
(Ii) E. deficient in the glutathione reductase gene. E. coli; and (iii) E. coli lacking both the thioredoxin reductase gene and the glutathione reductase gene. coli,
6. The polypeptide of claim 5, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of:

（項目７） 請求項１に記載のポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
（１）請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程；および
（２）該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。 (Item 7) A method for producing the polypeptide of claim 1, wherein the method comprises:
(1) providing a bacterial host cell comprising a gene encoding the polypeptide of claim 1; and (2) using a medium containing biotin under conditions where the polypeptide is expressed, Culturing,
Including the method.

（項目８） 前記細菌宿主細胞が、配列番号７に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する、請求項７に記載の方法。   (Item 8) The method according to claim 7, wherein the bacterial host cell contains a gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 7.

（項目９） 前記請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子がＴ７プロモーターと作動可能に連結している、請求項７に記載の方法。   (Item 9) The method according to claim 7, wherein the gene encoding the polypeptide of claim 1 is operably linked to a T7 promoter.

（項目１０） 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞である、請求項７に記載の方法。   (Item 10) The method according to claim 7, wherein the bacterial host cell is a cell having a mutation in a disulfide reduction system.

（項目１１） 前記ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が：
（ｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；
（ｉｉ）グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；ならびに
（ｉｉｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するＥ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。 (Item 11) A cell having a mutation in the disulfide reduction system is:
(I) E. deficient in thioredoxin reductase gene coli;
(Ii) E. deficient in the glutathione reductase gene. E. coli; and (iii) E. coli lacking both the thioredoxin reductase gene and the glutathione reductase gene. coli,
The method of claim 7, wherein the method is selected from the group consisting of:

（項目１２） 前記細胞培養工程が１５℃〜３７℃で行われる、請求項７に記載の方法。   (Item 12) The method according to claim 7, wherein the cell culture step is performed at 15 ° C to 37 ° C.

（項目１３） 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドが、ビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。   (Item 13) A receptor chip, wherein the polypeptide according to any one of claims 1 to 6 is immobilized on a solid phase via a factor capable of specifically binding to biotin.

（項目１４） 表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドがビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。   (Item 14) A factor capable of specifically binding biotin to the polypeptide according to any one of claims 1 to 6, which is suitable for detection by surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, or mass spectrometer. Receptor chip immobilized on a solid phase.

（項目１５） 以下の工程を包含する、受容体チップの作製方法：
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程；
（２）該ポリペプチドが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程；
（３）該培養した細胞から、該ポリペプチドを単離する工程、および
（４）該単離したポリペプチドを、固相に固定化する工程
を包含する、方法。 (Item 15) A method for producing a receptor chip including the following steps:
(1) providing a bacterial host cell comprising a gene encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 6;
(2) culturing the cell using a medium containing biotin under conditions where the polypeptide is expressed;
(3) a method comprising isolating the polypeptide from the cultured cells, and (4) immobilizing the isolated polypeptide on a solid phase.

さらに本発明は、ＲＡＧＥ由来のポリペプチド、またはＲＡＧＥ由来のポリペプチドが固相に固定された受容体チップを用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるＡＧＥの検出方法を提供する。   Furthermore, the present invention provides a method for detecting AGE by an intermolecular interaction analysis method, comprising using a RAGE-derived polypeptide or a receptor chip having a RAGE-derived polypeptide immobilized on a solid phase.

また本発明は、ＲＡＧＥのリガンド認識に関係する領域をビオチン化タンパク質として細胞もしくは試験管内で発現させた後、発現させたビオチン化タンパク質をアビジンまたはストレプトアビジンを介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるＡＧＥの検出方法を提供する。   In the present invention, a region related to RAGE ligand recognition is expressed as a biotinylated protein in a cell or in a test tube, and the expressed biotinylated protein is maintained on a solid phase while maintaining its orientation via avidin or streptavidin. And a method for detecting AGE by an intermolecular interaction analysis method, characterized by using the immobilized protein.

本発明に従って、ＲＡＧＥ由来ポリペプチドを組換え発現させて、糖鎖修飾がされていないにも関わらず、ＡＧＥと高い特異性で結合するポリペプチドを、簡便かつ大量に提供することが可能となった。また、本発明に従って、ＲＡＧＥ由来ポリペプチドを用いるＡＧＥ検出のための受容体チップを提供することが可能となった。さらに、本発明に従って、これらポリペプチドおよび受容体チップを製造する簡便な方法を提供することが可能になった。   According to the present invention, a RAGE-derived polypeptide can be recombinantly expressed to easily and in large quantities provide a polypeptide that binds to AGE with high specificity even though it is not modified with a sugar chain. It was. In addition, according to the present invention, it has become possible to provide a receptor chip for AGE detection using a RAGE-derived polypeptide. Furthermore, according to the present invention, it has become possible to provide a simple method for producing these polypeptides and receptor chips.

さらに、本発明に従って、糖尿病血管障害の診断方法、および、診断するための受容体チップを簡便かつ安価に提供することが可能となった。   Furthermore, according to the present invention, it has become possible to provide a method for diagnosing diabetic vascular disorder and a receptor chip for diagnosis in a simple and inexpensive manner.

さらに、ＲＡＧＥは、糖尿病血管障害以外の疾患において特異的に発現するタンパク質、例えば、アルツハイマー症などと関連のあるβアミロイド、ならびに種々の疾患（例えば、神経疾患、癌、および炎症）に関連したマーカーを認識し得るため、神経性疾患、癌、炎症など多くの病態の検出および早期診断に利用可能である。従って、本発明のタンパク質、受容体チップ、およびキットは、糖尿病血管障害のみならず、神経性疾患、癌、炎症など多くの病態の検出および早期診断に利用可能である。   In addition, RAGE is a protein that is specifically expressed in diseases other than diabetic vascular disorders, such as β-amyloid associated with Alzheimer's disease and the like, and markers associated with various diseases (eg, neurological diseases, cancer, and inflammation) Therefore, it can be used for detection and early diagnosis of many pathological conditions such as neurological diseases, cancer and inflammation. Therefore, the protein, receptor chip and kit of the present invention can be used not only for diabetic vascular disorders but also for detection and early diagnosis of many pathological conditions such as neurological diseases, cancer and inflammation.

（発明の実施の形態）
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。 (Embodiment of the Invention)
The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。   Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.

本明細書において使用される用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。   The term “receptor” as used herein is a biological structure comprising one or more binding domains that reversibly and specifically complex with one or more ligands, wherein Thus, this complexation has a biological structure. Receptors can be completely outside the cell (extracellular receptors), inside the cell membrane (but directing the receptor portion to the extracellular environment and cytosol), or completely inside the cell (intracellular Of the receptor). They can also function independently of cells. Receptors in the cell membrane allow cells to communicate (eg, signal transduction) with space outside their boundaries and to function in the transport of molecules and ions to the inside and outside of the cell. As used herein, a receptor may be a full length receptor or a fragment of a receptor.

受容体フラグメントを用いる場合には、受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位を用いる。受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位は、以下のように同定することができる。ホモロジーやドメイン検索により相同性や機能上の類似点の高いタンパク質の構造からリガンド認識領域を推定することができる。例えば、同一のリガンドに特異的に結合する、異なる受容体分子のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて算出した場合、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上の相同性を示す領域が、リガンド認識領域として推定される。好ましくは、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用する。   When a receptor fragment is used, a site related to ligand recognition of the receptor protein is used. The site related to ligand recognition of the receptor protein can be identified as follows. Ligand recognition regions can be estimated from protein structures with high homology and functional similarity by homology and domain search. For example, when the amino acid sequences of different receptor molecules that specifically bind to the same ligand are calculated using the BLAST default parameters, 50% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% or more, even more preferably A region showing 65% or more homology is estimated as a ligand recognition region. Preferably, BLOSUM-62 is used as the matrix and only Low-complexity is used as the filter.

例えば、配列番号２のフラグメントのアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸配列に１つの保存的置換を有するアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸配列に１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列；ならびに、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもまた、本発明のＲＡＧＥ由来ポリペプチドとして利用可能である。   For example, the amino acid sequence of the fragment of SEQ ID NO: 2; the amino acid sequence having one conservative substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; the amino acid sequence having one or several substitutions, additions, deletions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 And a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences having at least one conservative substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and one or several substitutions, additions, deletions; It can be used as the RAGE-derived polypeptide of the present invention.

さらに欠損変異やアミノ酸置換などを導入した変異受容体をコードする遺伝子を動物細胞などに一過性発現させ、その機能に必須の領域を決定することも、当業者は容易になし得る。   Further, those skilled in the art can easily determine a region essential for the function by transiently expressing a gene encoding a mutant receptor into which a deletion mutation or amino acid substitution has been introduced in an animal cell or the like.

好ましくは、上記条件でＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号２に記載されるアミノ酸を参照配列とした場合、Ｅ値が、１ｅ−２０以下、１ｅ−２５以下、１ｅ−３０以下、１ｅ−３５以下、１ｅ−４０以下、１ｅ−４５以下、１ｅ−５０以下または１ｅ−５５以下であり、かつ、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４５０アミノ酸残基を有するポリペプチドも、本明細書のＲＡＧＥ由来ポリペプチドに包含される。   Preferably, when a BLAST search is performed under the above conditions and the amino acid described in SEQ ID NO: 2 is used as a reference sequence, the E value is 1e-20 or less, 1e-25 or less, 1e-30 or less, 1e-35 or less, 1e-40 or less, 1e-45 or less, 1e-50 or less, or 1e-55 or less, and at least 200 amino acid residues, at least 250 amino acid residues, at least 300 amino acid residues, at least 350 amino acid residues, at least 400 Polypeptides having amino acid residues, at least 450 amino acid residues, are also encompassed by the RAGE-derived polypeptides herein.

本明細書において使用される用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。本発明において代表的なリガンドは、ＡＧＥである。   The term “ligand” as used herein is a binding partner for a specific receptor or family of receptors. The ligand can be an endogenous ligand for the receptor, or alternatively, a synthetic ligand for the receptor, such as a drug, drug candidate, or pharmacological means. A typical ligand in the present invention is AGE.

本明細書において使用する場合、「ＡＧＥ」とは、後期糖化反応生成物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の略称であり、非酵素的に糖化を受けたタンパク質、脂質などの総称である。グルコースなどの還元糖は、タンパク質やアミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応し（可逆的な反応であり前期反応と呼ばれる）、糖化産物を形成する（シッフ塩基やアマドリ転移化合物）。さらに縮合、開裂、架橋形成などの不可逆的な反応を経てＡＧＥを形成する。ＡＧＥは上述の過程を経て生成された構造物の総称であり、生体に存在するＡＧＥ構造としてはカルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどがが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。   As used herein, “AGE” is an abbreviation for advanced glycation end products and is a generic term for non-enzymatically glycated proteins, lipids, and the like. Reducing sugars such as glucose react non-enzymatically with amino groups of proteins and amino acids (reversible reaction, called pre-reaction) to form saccharification products (Schiff base and Amadori transfer compound). Furthermore, AGE is formed through irreversible reactions such as condensation, cleavage, and cross-linking. AGE is a general term for structures generated through the above-described processes. Examples of AGE structures existing in living bodies include carboxymethyllysine (CML), carboxyethyllysine (CEL), pentosidine, pyralin, imidazoline, methylglyoxal, and crosslin. However, it is not limited to this. A product obtained by glycation of albumin, immunoglobulin, ovalbumin or the like present in plasma is also AGE, and is widely used in experimental systems as AGE. Hemoglobin A1c used as an index for blood glucose control is an Amadori transfer compound, but is included in AGE. Arbitrary proteins can also be converted to AGE. For example, CML albumin and CEL albumin included in AGE are both AGEs in which albumin is glycated.

本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。   As used herein, the terms “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also be assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is included.

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。   As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide”. A “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide that includes a derivative of a nucleotide or that has an unusual linkage between nucleotides and is used interchangeably. Specific examples of such an oligonucleotide include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond derivative oligonucleotide, a ribose and phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a peptide nucleic acid bond, uracil in the oligonucleotide is C− A derivative oligonucleotide substituted with 5-propynyluracil, a derivative oligonucleotide where uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, and cytosine in the oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligonucleotides in which the ribose in the DNA is replaced with 2'-O-propylribose Examples thereof include derivative oligonucleotides in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-). 98 (1994)). The term “nucleic acid” is also used herein interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide. Particular nucleic acid sequences also include “splice variants”. Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid implicitly encompasses any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid. As the name suggests, a “splice variant” is the product of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (another) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The production mechanism of splice variants varies, but includes exon alternative splicing. Other polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also encompassed by this definition. Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of splice products) is included in this definition.

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。   As used herein, “gene” refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. A gene that defines the primary structure of a protein is called a structural gene, and a regulatory gene that affects its expression. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”. As used herein, “homology” of genes refers to the degree of identity of two or more gene sequences with respect to each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.

本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明の配列番号１に記載の核酸配列を有する核酸をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのような核酸を得ることができる。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。   As used herein, “stringent conditions” refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a nucleic acid can be obtained by using a nucleic acid having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. . Specifically, for example, hybridization is performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized, and then 0.1 to 2 times. Polynucleotides that can be identified by washing the filter at 65 ° C. using a SSC (saline-sodium citrate) solution at a concentration (composition of a 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) Means. Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford Universe.

本明細書中では、「レセプター由来の配列」とは、レセプターポリペプチドのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびにレセプターポリペプチドのアミノ酸配列／核酸配列を改変することによって得られる配列であって、レセプター自体のリガンド結合能を保持する配列をいう。レセプター由来の配列としては、例えば、ＲＡＧＥ由来の核酸配列／アミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。本明細書において、ＲＡＧＥ配列を改変することによって得られるポリペプチドであって、リガンドであるＡＧＥに対する結合能を保持するポリペプチドを、ＲＡＧＥの「ホモログ」という。ＲＡＧＥ由来の配列としては、代表的には、ＡＧＥに対する結合する能力を有するポリペプチドの発現に使用可能な配列であり、かつ：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。。 In the present specification, “receptor-derived sequence” means an amino acid sequence of a receptor polypeptide and a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence, and a sequence obtained by modifying the amino acid sequence / nucleic acid sequence of the receptor polypeptide. A sequence that retains the ligand-binding ability of the receptor itself. Examples of the receptor-derived sequence include, but are not limited to, a RAGE-derived nucleic acid sequence / amino acid sequence. In the present specification, a polypeptide obtained by modifying the RAGE sequence and retaining the binding ability to the ligand AGE is referred to as a “homolog” of RAGE. RAGE-derived sequences are typically sequences that can be used to express polypeptides that have the ability to bind to AGE, and:
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) the sequence of a fragment of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) When a Blast analysis using the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as a reference sequence, using BLOSUM-62 as a matrix and using only Low-complexity as a filter, an E value of 1e-20 or less The amino acid sequence of a polypeptide that is
(D) the amino acid sequence of a polypeptide having at least one conservative substitution to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(E) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having one or several substitutions, additions and deletions relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(F) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having at least one conservative substitution and one or several substitutions, additions, deletions to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and
(G) the amino acid sequence of a polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions;
Examples include, but are not limited to, a sequence selected from the group consisting of: or a nucleic acid sequence encoding these amino acid sequences. .

本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。   In this specification, comparison of base sequence identity and calculation of homology are calculated using BLAST, which is a sequence analysis tool, using default parameters.

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。   In the present specification, “expression” of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form. Preferably, a gene, polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form. However, transcription and production of mRNA can also be an aspect of expression.

本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。   In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural. “Derivative amino acid” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such derivative amino acids and amino acid analogs are well known in the art. The term “natural amino acid” refers to the L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, γ-carboxyglutamic acid, arginine, ornithine , And lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to in this specification are in L form. The term “unnatural amino acid” refers to an amino acid that is not normally found in proteins in nature. Examples of non-natural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homo-arginine D-form or L-form and D-phenylalanine. “Amino acid analog” refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and / or function of an amino acid. Examples of amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like. Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。   Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by the generally accepted single letter code.

本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。   In the present specification, a “corresponding” amino acid has or is predicted to have the same action as a predetermined amino acid in a protein or polypeptide as a reference for comparison in a protein molecule or polypeptide molecule. In particular, in the case of an enzyme molecule, it means an amino acid that is present at the same position in the active site and contributes similarly to the catalytic activity.

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。   In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural. “Derivative nucleotide” or “nucleotide analog” refers to a nucleotide that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same function as the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chiral methylphosphonate, 2-O-methylribonucleotide, peptide-nucleic acid (PNA). .

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において使用する場合、好ましくは、受容体「フラグメント」は、全長受容体が特異的に結合し得るリガンドに特異的に結合する。ＲＡＧＥ由来ポリペプチドの好ましいフラグメントは、ＡＧＥに対する結合能を有するポリペプチドフラグメントである。   In the present specification, the “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. As used herein, preferably a receptor “fragment” specifically binds a ligand to which a full-length receptor can specifically bind. A preferred fragment of a RAGE-derived polypeptide is a polypeptide fragment capable of binding to AGE.

本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する原核生物である細菌を培養し、細菌中に組換え受容体タンパク質を封入体として蓄積させ、その宿主細菌を破壊することによって、そのポリペプチドを得る方法を用いてもよい。   Examples of the method for producing the polypeptide of the present invention include culturing a bacterium that is a prokaryote that produces the polypeptide, accumulating the recombinant receptor protein as inclusion bodies in the bacterium, and destroying the host bacterium. In some cases, a method for obtaining the polypeptide may be used.

本発明において使用するビオチン化配列としては、例えば、「ＭＫＬＫＶＴＶＮＧＴＡＹＤＶＤＶＤＶＤＫＳＨＥＮＰＭＧＴＩＬＦＧＧＧＴＧＧＡＰＡＰＡＡＧＧＡＧＡＧＫＡＧＥＧＥＩＰＡＰＬＡＧＴＶＳＫＩＬＶＫＥＧＤＴＶＫＡＧＱＴＶＬＶＬＥＡＭＫＭＥＴＥＩＮＡＰＴＤＧＫＶＥＫＶＬＶＫＥＲＤＡＶＱＧＧＱＧＬＩＫＩＧＤＬＥＬ」（配列番号３）が挙げられる。アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号４）もまたビオチン化モチーフとして利用可能である。これら配列において、実際にビオチン化を受けるＫ（リジン）残基以外に変異を導入しても、ビオチン化活性に大きな影響はないので、リジン残基以外を置換した配列もまた、ビオチン化モチーフとして使用することができる。また、実際にビオチン化を受けるＫを含んだ「ＫＩＧ，ＫＩ，ＫＩＡ，ＫＩＥ，ＫＩＧＤＰ（配列番号５），ＫＬＷＳＩ（配列番号６），ＫＬＧ，ＫＶＧ」などをＣ末側に付加することによるビオチン化も可能である。さらに、これら配列のフラグメントのアミノ酸配列；これら配列に１つの保存的置換を有するアミノ酸配列；これら配列に１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列；ならびに、これら配列に少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもまた、本発明のビオチン化配列として利用可能である。   As a biotinylation sequence used in the present invention, for example, “MKLKVTVNGTAYDVDVDVDKSHENSPMGTILFGGGGTGAGAPAPAAGGAGAKGAGEGEIPAPLAGTVSKILVKEGDTVKAGQTVLVLEAMKMEITENAPTDGKVEKVLVQELDAVGQKQLGDAVGQ The amino acid sequence “GLNDIFEAQKIEWHE” (SEQ ID NO: 4) can also be used as a biotinylation motif. In these sequences, introducing a mutation other than the K (lysine) residue that actually undergoes biotinylation does not have a significant effect on the biotinylation activity. Can be used. In addition, biotin by adding “KIG, KI, KIA, KIE, KIGDP (SEQ ID NO: 5), KLWSI (SEQ ID NO: 6), KLG, KVG” and the like containing K that actually undergoes biotinylation to the C-terminal side. It is also possible. In addition, amino acid sequences of fragments of these sequences; amino acid sequences having one conservative substitution in these sequences; amino acid sequences having one or several substitutions, additions, deletions in these sequences; and at least one in these sequences Polypeptides having an amino acid sequence selected from the group consisting of conservative substitutions and amino acid sequences having one or several substitutions, additions, deletions can also be used as the biotinylated sequences of the present invention.

デフォルトパラメーターを用い、これらの配列を参照配列として用いて、Ｅ値が、１ｅ−２０以下、１ｅ−２５以下、１ｅ−３０以下、１ｅ−３５以下、１ｅ−４０以下、１ｅ−４５以下、１ｅ−５０以下または１ｅ−５５以下であり、かつ、少なくとも２００アミノ酸残基、少なくとも２５０アミノ酸残基、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも３５０アミノ酸残基、少なくとも４００アミノ酸残基、少なくとも４５０アミノ酸残基を有するポリペプチドも、本明細書のビオチン化配列に包含される。本発明のビオチン化配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドによってビオチン化される。   Using default parameters and using these sequences as reference sequences, E values are 1e-20 or less, 1e-25 or less, 1e-30 or less, 1e-35 or less, 1e-40 or less, 1e-45 or less, 1e-45 or less, 1e -50 or less or 1e-55 or less and having at least 200 amino acid residues, at least 250 amino acid residues, at least 300 amino acid residues, at least 350 amino acid residues, at least 400 amino acid residues, at least 450 amino acid residues Polypeptides are also encompassed by the biotinylated sequences herein. The biotinylated sequence of the present invention is biotinylated with a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

なお、エンドプロテイナーゼであるＦａｃｔｏｒＸａの認識配列「ＩＥＧＲ」（配列番号８）、エンテロキナーゼの認識配列「ＤＤＤＤＫ」（配列番号９）、またはトロンビンの認識配列「ＬＶＰＲＧＳ」（配列番号１０）などをこれらビオチン化モチーフと発現されるＲＡＧＥ配列／ＲＡＧＥ由来配列との間に挿入し、ＦａｃｔｏｒＸａまたはエンテロキナーゼによる切断によりＲＡＧＥ由来配列を精製することも可能である。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する場合、これらビオチン化モチーフと配列番号２のアミノ酸配列との間にアミノ酸配列「ＩＥＧＲ」を挿入し、ＲＡＧＥ由来ポリペプチドのみの精製をすることも可能である。   In addition, the recognition sequence “IEGR” (SEQ ID NO: 8) of Factor Xa, which is an endoproteinase, the recognition sequence “DDDDDK” (SEQ ID NO: 9) of enterokinase, the recognition sequence “LVPRGS” (SEQ ID NO: 10) of thrombin, etc. It is also possible to purify the RAGE-derived sequence by cleavage between Factor Xa or enterokinase after insertion between the activating motif and the expressed RAGE sequence / RAGE-derived sequence. For example, when a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is expressed, the amino acid sequence “IEGR” is inserted between these biotinylated motifs and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to purify only the RAGE-derived polypeptide. It is also possible to do.

「形質転換体」とは、宿主細胞を形質転換することによって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。   “Transformant” refers to all or part of an organism such as a cell produced by transforming a host cell. A prokaryotic cell is illustrated as a transformant. A transformant is also referred to as a transformed cell, transformed tissue, transformed host, etc., depending on the subject, and encompasses all of these forms herein, but may refer to a particular form in a particular context. .

形質転換体を得るための宿主細菌細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細菌細胞を用いることができる。原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。 The host bacterial cell for obtaining the transformant is not particularly limited as long as it expresses a polypeptide having physiological activity, and various host bacterial cells conventionally used in genetic manipulation can be used. . Examples of prokaryotic cells include prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue. , Escherichia
E. coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli
HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, Escherichia coli HMS174 (DE3), Escherichia coli HMS174 (DE3) pLysS, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammuniagenes, Brevibacterium immarioph lum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticumATCC14066, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium
glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium amphiphilum ATCC 15354, Pseudomonas sp. Examples thereof include D-0110.

ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合は、好ましくは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが宿主細胞ゲノム中に組み込まれたλＤＥ３溶原菌を用いる。λＤＥ３溶原菌としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｂ８３４（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳが挙げられるが、これに限定されない。（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）
ＲＡＧＥ遺伝子の発現にＴ７プロモーターを用いる場合、Ｔ７ ＲＮＡの天然のインヒビターであるＴ７ リゾチウムを欠損する宿主細胞株を用いることが、好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌａｃＩ、ＢＬ２１ ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、およびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられるが、これに限定されない。 When the T7 promoter is used for expression of the RAGE gene, λDE3 lysogens in which T7 RNA polymerase is integrated into the host cell genome are preferably used. Examples of the λDE3 lysogen include AD494 (DE3), AD494 (DE3) pLysS, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, BL21 (DE3) plac, BL21 trxB (DE3), BL21 trxB (DE3) pLysS, BLR (DE3), BLR (DE3) pLysS, B834 (DE3), B834 (DE3) pLysS, HMS174 (DE3), HMS174 (DE3) pLysS, HMS174 (DE3) pLysE, OrigigE, OrigigE Origami (DE3) pLysS, Origami B (DE3), Origmi B (DE3) pLysS, Rosetta (DE3), Rosetta (DE3) pLysS, Rosetta-gami DE3), Rosetta-gami (DE3) pLysS, RosettaBlue (DE3), RosettaBlue (DE3) pLysS, Tuner (DE3), and Tuner (DE3) but pLysS include, but are not limited thereto. ( Novagen, Madison, WI, USA )
When the T7 promoter is used for expression of the RAGE gene, it is preferable to use a host cell line that lacks T7 lysozyme, which is a natural inhibitor of T7 RNA. Examples of such host cells include AD494 (DE3), BL21 (DE3), BL21 (DE3) plac, BL21 trxB (DE3), BLR (DE3), B834 (DE3), HMS174 (DE3), Origami (DE3). ), Origami B (DE3), Rosetta (DE3), Rosetta-gami (DE3), RosettaBlue (DE3), and Tuner (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA).

上記を考慮すると、本発明において使用するのに好ましい宿主細菌細胞は、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）である。 In view of the above, a preferred host bacterial cell for use in the present invention is, for example, Origami (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA ) .

本発明において得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよい。   As long as the polypeptide derived from the cell obtained in the present invention has substantially the same action as the naturally occurring polypeptide, one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, added and / or deleted. Also good.

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。   Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure, such as, for example, the binding site of a ligand molecule, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in proteins that still retain their original properties after substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or in the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。   In designing such modifications, the hydrophobicity index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ. Mol. Biol. 157 ( 1): 105-132, 1982). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 .8); Glycine (−0.4); Threonine (−0.7); Serine (−0.8); Tryptophan (−0.9); Tyrosine (−1.3); Proline (−1.6) ); Histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) And arginine (-4.5)).

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。   It is known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in ligand binding capacity). It is well known. In such amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline ( Alanine (−0.5); histidine (−0.5); cysteine (−1.0); methionine (−1.3); valine (−1.5); leucine (−0.5 ± 1); -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。   In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid is similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and isoleucine; However, it is not limited to these.

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。   In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene. “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. “Ortholog” is also called an orthologous gene, which is a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, the human and mouse alpha hemoglobin genes are orthologs, but the human alpha and beta hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, orthologs may also be useful in the present invention.

「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。   “Conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. An array. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent modifications (mutations)” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the art, each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan), produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of the polypeptide.

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。   As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain. Deletion of amino acids means deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。   Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥとの結合能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。   As used herein, “substitution, addition or deletion” of a polypeptide or polynucleotide is a substitution of an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, with respect to the original polypeptide or polynucleotide. , Adding or removing. Such substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such number is a function (for example, ability to bind to AGE) in a variant having the substitution, addition or deletion. Etc.) as long as it is retained. For example, such a number can be one or several, and preferably can be within 20%, within 10%, or less than 100, less than 50, less than 25, etc. of the total length.

高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ
Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。 Macromolecular structures (eg, polypeptide structures) can be described in terms of various levels of configuration. For a general discussion of this configuration see, for example, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd Edition, 1994), and Canter and Schimmel, Biophysical Chemistry Part.
I: See The Information of Biological Macromolecules (1980). “Primary structure” refers to the amino acid sequence of a particular peptide. “Secondary structure” refers to locally arranged three-dimensional structures within a polypeptide. These structures are generally known as domains. A domain is a portion of a polypeptide that forms a compact unit of the polypeptide and is typically 50-350 amino acids long. Exemplary domains are made from parts such as β-sheets (such as β-strands) and α-helix stretches. “Tertiary structure” refers to the complete three-dimensional structure of a polypeptide monomer. “Quaternary structure” refers to a three-dimensional structure formed by non-covalent association of independent tertiary units. Terms relating to anisotropy are used in the same way as terms known in the energy field.

本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。 General molecular biology techniques that can be utilized in the present invention include Ausubel F. et al. A. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook
J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, etc. can be easily implemented by those skilled in the art.

本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、細菌宿主細胞において自律複製が可能である、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。   In the present specification, when referring to a gene, a “vector” refers to one that can transfer a target polynucleotide sequence into a target cell. Examples of such vectors include those containing a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention, which is capable of autonomous replication in a bacterial host cell.

「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーターおよび、選択マーカーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細菌細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。   “Expression vector” refers to a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. The regulatory element can preferably include a terminator and a selectable marker. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector and the type of regulatory elements used can vary depending on the host bacterial cell.

「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核宿主細胞において自立複製が可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。   “Recombinant vector” refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell. Examples of such vectors include those that are capable of autonomous replication in prokaryotic host cells and that contain a promoter at a position suitable for transcription of the polynucleotide of the present invention.

原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰＡＮ，ＰＡＣ（ａｖｉｄｉｔｙ社製）などが例示される。   “Recombinant vectors” for prokaryotic cells include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all available from Roche Molecular Biochemicals), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), QE PKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), pLSA1 (Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)), pGEL1 (Proc.). Natl.Acad.Sci.USA, 82, 4306 (1985)), pBluescript II SK + (Stratagene), pBluescript. II SK (-) (Stratagene), pTrs30 (FERM BP-5407), pTrs32 (FERM BP-5408), pGHA2 (FERM BP-400), pGKA2 (FERM B-6798), pTerm2 (US Pat. No. 3,219,796) , US4939094, US5160735), pEG400 [J. Bacteriol. , 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pTrxFus (Invitrogen), pMAL-c2 (New England Biolabs), pUC19 (GeUC19, pUC33) 1985)], pSTV28 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pPA1 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-233798), Pinpoint Xa (Promega), PAN, PAC (Avidity) and the like.

本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。代表的なプロモーターとしては、Ｔ７プロモーターが挙げられるがこれに限定されない。   As used herein, the term “promoter” refers to a region on DNA that determines the transcription start site of a gene and directly regulates its frequency, and is a base sequence that initiates transcription when RNA polymerase binds. is there. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene. A typical promoter includes, but is not limited to, the T7 promoter.

本明細書において使用される「固相」とは、抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。   As used herein, “solid phase” refers to a planar support on which molecules such as antibodies can be immobilized. In the present invention, when detecting using the principle of surface plasmon resonance, the solid phase is preferably a glass substrate base material having a metal thin film containing gold, silver or aluminum on one side. In the present invention, when detecting using the principle of the crystal oscillator microbalance, a frequency conversion element (for example, a crystal oscillator or a surface acoustic wave element) is used as a solid phase, and the receptor is directly coupled. One side of the quartz plate is coated with silicone, and the other side is provided with a gold electrode as a solid phase.

本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板は固相の概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。   As used herein, “substrate” refers to the material (preferably solid) on which the chips or arrays of the invention are constructed. Therefore, the substrate is included in the concept of solid phase. The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials.

固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。   As such a material for use as a solid phase and a substrate, any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicone, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (also alloys) Included), natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon), including but not limited to: The substrate may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin Organic materials such as polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. In the present invention, a membrane used for blotting such as a nylon membrane, a nitrocellulose membrane, and a PVDF membrane can also be used. When analyzing a high-density material, it is preferable to use a material having hardness such as glass. A preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above.

本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。   In this specification, “chip” or “microchip” is used interchangeably and refers to a micro integrated circuit that has various functions and is a part of a system. In the present specification, a solid phase on which a biotinylated receptor is immobilized is referred to as a receptor chip and / or a receptor microchip.

本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の受容体が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の受容体のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる受容体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの受容体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される受容体は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の受容体が固定され得る。 As used herein, “array” refers to a substrate (eg, a chip) having a pattern or a pattern in which one or more (eg, 1000 or more) receptors are arranged and arranged. Among the arrays, those patterned on a small substrate (eg, 10 × 10 mm) are referred to as microarrays. In this specification, microarrays and arrays are used interchangeably. Accordingly, even a pattern that is larger than the above-described substrate may be called a microarray. For example, an array is composed of a set of desired receptors that are themselves immobilized to a solid surface or membrane. Array preferably comprises at least 10 two identical or different receptors, at least 10 3 and more preferably, and more preferably at least 10 4, even more preferably at least 10 5 a. These receptors are preferably arranged on a surface of 125 × 80 mm, more preferably 10 × 10 mm. As the format, a microtiter plate of a size such as a 96-well microtiter plate or a 384-well microtiter plate or a size of a slide glass is contemplated. The receptor to be immobilized may be one type or a plurality of types. The number of such types can be any number from 1 to the number of spots. For example, about 10 types, about 100 types, about 500 types, and about 1000 types of receptors can be immobilized.

基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の生体分子（例えば、受容体）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える生体分子が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子である受容体のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞と特異的に結合する因子は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。 Any number of biomolecules (eg, receptors) can be disposed on a solid surface or membrane, such as a substrate, as described above, but typically up to 10 8 biomolecules per substrate, others In embodiments, up to 10 7 biomolecules, up to 10 6 biomolecules, up to 10 5 biomolecules, up to 10 4 biomolecules, up to 10 3 biomolecules, or 10 2 biomolecules. Up to 10 biomolecules may be arranged, but up to 10 8 biomolecules may be arranged. In these cases, the size of the substrate is preferably smaller. In particular, the size of a receptor spot that is a biomolecule can be as small as the size of a single biomolecule (which can be on the order of 1-2 nm). The minimum substrate area is determined in some cases by the number of biomolecules on the substrate. In the present invention, the factor that specifically binds to a cell is usually arrayed and fixed in a spot shape of 0.01 mm to 10 mm by covalent bond or physical interaction.

アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある基板または固相に作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。本明細書において、生体分子は、受容体、受容体のフラグメント、または受容体の改変体である。   A “spot” of biomolecules can be placed on the array. As used herein, “spot” refers to a certain set of biomolecules. In this specification, “spotting” refers to producing a spot of a certain biomolecule on a certain substrate or solid phase. Spotting can be done by any method, for example, it can be accomplished by pipetting or the like, or it can be done by automated equipment, such methods are well known in the art. As used herein, a biomolecule is a receptor, a fragment of a receptor, or a variant of a receptor.

本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。   As used herein, the term “address” refers to a unique location on a substrate and may be distinguishable from other unique locations. The address is suitable for associating with a spot with that address, and can take any shape, with entities at all each address being distinguishable from entities at other addresses (eg, optical). The shape defining the address can be, for example, a circle, an ellipse, a square, a rectangle, or an irregular shape. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” can be used to indicate a specific concept, but in the present specification, if it is not necessary to distinguish between the two, “Spot” may be used interchangeably.

各々のアドレスを定める大きさは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子の大きさおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。   The size defining each address is, among other things, the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of analyte and / or available reagents, the size of the microparticles and the array in which the array is used Depends on the degree of resolution required for the method. The size can range, for example, from 1-2 nm to several centimeters, but can be any size consistent with the application of the array.

アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。   The spatial arrangement and shape defining the address is designed to suit the particular application in which the microarray is used. The addresses can be densely distributed, widely distributed, or subgrouped into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.

マイクロアレイについては、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、Ｍ．Ｆ．Ｔｅｍｐｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、７（１５）、８１５−８２２（２００２）に広く概説されている。   For details on microarrays, see Shujunsha, Cell Engineering separate volume "DNA microarrays and the latest PCR method" F. Templin, et al. , Protein microarray technology, Drug Discovery Today, 7 (15), 815-822 (2002).

マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。   Since the data obtained from the microarray is enormous, data analysis software for managing the correspondence between clones and spots, data analysis, etc. is important. As such software, software attached to various detection systems can be used (Ermolaeva O et al. (1998) Nat. Genet. 20: 19-23). The database format includes, for example, a format called GATC (Genetic Analysis Technology Consortium) proposed by Affymetrix.

微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。   For microfabrication, see, for example, Campbell, S .; A. (1996). The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Press; V. (1996). Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services; Madou, M .; J. et al. (1997). Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press; Rai-Chudhury, P .; (1997). Handbook of Microlithography, Micromachining, & Microfabrication: Microlithography, etc., which are incorporated by reference in the relevant portions herein.

マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。この場合、まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、メチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。この単分子膜に、直径数μｍから１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射する。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。スポット内に導入された反応性官能基を使ってストレプトアビジン、アビジンなどのビオチンと特異的に結合するタンパク質を固定化する。最後に受容体タンパク質のビオチン化部位を介して受容体タンパク質を固定化することにより、化学的処理を経ずに穏やかな条件下で方向性を保った状態での、受容体タンパク質の固定化が完了する。例えば、カルボキシル基含有スポットの場合には、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換し、アビジンやストレプトアビジンなどを固定化させた後、微量の生体分子含有溶液を各スポットに滴下することで、固定化を行うことができる。スポット周囲に形成させた疎水性の単分子膜は、溶液の拡散を抑えるために有効である。スポット周囲のバックグラウンド領域と分析物との非特異的な相互作用を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質、ポリエチレングリコールのような親水性高分子でブロッキングを行う。   Various methods such as a microcontact printing method and an optical lithography method can be used for the production of the microarray, and a method using a micropatterned surface of an alkanethiol monomolecular film is preferable. In this case, first, an alkanethiol monomolecular film having a hydrophobic functional group such as a methyl group or a fluoromethyl group is formed on a glass substrate having a gold thin film deposited on one side. This monomolecular film is overlaid with a photomask in which a large number of light-transmitting spots having a diameter of several μm to 1 mm are arranged and irradiated with ultraviolet rays. As a result, the alkanethiol in the irradiated part can be decomposed and removed in the form of spots. Proteins that specifically bind to biotin such as streptavidin and avidin are immobilized using reactive functional groups introduced into the spot. Finally, by immobilizing the receptor protein through the biotinylation site of the receptor protein, it is possible to immobilize the receptor protein in a state where the orientation is maintained under mild conditions without chemical treatment. Complete. For example, in the case of a carboxyl group-containing spot, the carboxyl group is converted to an active ester using N-hydroxysuccinimide, avidin, streptavidin, etc. are immobilized, and then a small amount of a biomolecule-containing solution is dropped into each spot. By doing so, immobilization can be performed. The hydrophobic monomolecular film formed around the spot is effective for suppressing the diffusion of the solution. In order to suppress non-specific interaction between the background region around the spot and the analyte, blocking is performed with an inert protein such as bovine serum albumin or a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol.

ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインチップなどを使った分析技術の進歩を見ても明らかなように、マイクロアレイは、一枚の基板上で多数の検体に対してハイスループット分析が可能であるため、きわめて有効な分析手段である。本発明は、このようなマイクロアレイの考え方を、多種類の生体分子−細胞間相互作用を迅速に計測するために応用する。この場合、きわめて多くの検体を同時に分析したり、分析に必要な生体分子および細胞の量をできる限り少なくするためには、マイクロアレイの集積化が重要である。しかし一方で、マイクロアレイ上の細胞に関する情報を取得する場合、ある程度以上の細胞数からなる集団を対象とした測定を行わない限り、誤差の大きいデータしか得ることができない。このような観点から、マイクロアレイを構成する各スポットの大きさは、少なくとも数十〜数千個程度の細胞が相互作用することのできる大きさであることが望ましく、例えば、円形のスポットの場合、その直径はおおよそ数μｍから１ｍｍ程度である。   As can be seen from the advances in analysis technology using DNA microarrays, protein chips, etc., microarrays are capable of high-throughput analysis of a large number of specimens on a single substrate, making them extremely effective analyses. Means. The present invention applies such a microarray concept in order to rapidly measure many kinds of biomolecule-cell interactions. In this case, integration of microarrays is important in order to analyze an extremely large number of samples at the same time and to reduce the amount of biomolecules and cells required for analysis as much as possible. On the other hand, when acquiring information about cells on the microarray, only data with a large error can be obtained unless measurement is performed on a population consisting of a certain number of cells. From this point of view, it is desirable that the size of each spot constituting the microarray is such a size that at least several tens to several thousand cells can interact. For example, in the case of a circular spot, Its diameter is approximately several μm to 1 mm.

マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。   Various methods such as a microcontact printing method and an optical lithography method can be used for the production of the microarray, and a method using a micropatterned surface of an alkanethiol monomolecular film is preferable.

本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルライブラリ化合物など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書において好ましい生体分子は、受容体および受容体フラグメント、ならびにそれらのリガンドである。   As used herein, the term “biomolecule” refers to a molecule related to a living body. In this specification, “living body” refers to a biological organism, and includes, but is not limited to, animals, plants, fungi, viruses and the like. A biomolecule includes a molecule extracted from a living body, but is not limited thereto, and any molecule that can affect a living body falls within the definition of a biomolecule. Such biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA, genomic DNA, RNA such as mRNA), polysaccharides. , Oligosaccharides, lipids, small molecules (for example, hormones, ligands, signal transmitters, organic small molecules, combinatorial library compounds, etc.), complex molecules thereof, and the like. Preferred biomolecules herein are receptors and receptor fragments and their ligands.

本明細書において使用される場合、「ビオチンと特異的に結合する因子」とは、ビオチンと特異的に結合し得る任意の因子をいう。ビオチンと特異的に結合する因子とビオチンとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。ビオチンと特異的に結合する因子としては、アビジン、およびストレプトアビジン、ならびにこれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。   As used herein, “an agent that specifically binds to biotin” refers to any agent that can specifically bind to biotin. The binding between biotin and a factor that specifically binds to biotin may be reversible or irreversible. Factors that specifically bind to biotin include, but are not limited to, avidin, streptavidin, and variants thereof.

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属表面に生じた表面プラズモン（弾性波）と、全反射した電磁波によって発生するエバネッセント波（光波）との間で起こる相互作用である。プラズモン波とエバネッセント波の波数と波動ベクトルが近似的に一致する条件を与える光の入射角θにおいて共鳴が起こり、エバネッセント波が表面プラズモンの励起に使われるため反射光強度が低下する。表面プラズモン共鳴を得るためには、高屈折率媒体からなるプリズムを配置し（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）、レーザー光およびＬＥＤ光を入射する方法がとられる。ここで、プリズムとは反対側の金属表面に接触する媒体の誘電率の変化によって、プラズモン波の波数が変化する。すなわち、金属表面上に物質が接近することによって、表面プラズモン共鳴を与える光の入射角がシフトする。このことを利用して、金属表面の物質による被覆をセンシングすることが可能となる。この測定法は、表面鉛直方向の分解能に優れており（０．１ｎｍのオーダー）、表面に存在する物質量をｎｇ〜ｐｇ／ｃｍ２のオーダーでリアルタイムに観測することが可能である。また、水媒体中で測定できることもタンパク質のような生体分子の挙動を調べる上で大きな利点である。これを利用した測定装置が生体分子間相互作用測定装置として開発され、タンパク質およびＤＮＡなどの相互作用の分析に応用されている。 Surface plasmon resonance (SPR) is an interaction that occurs between surface plasmons (elastic waves) generated on a metal surface and evanescent waves (light waves) generated by totally reflected electromagnetic waves. Resonance occurs at the incident angle θ of the light that gives the condition that the wave numbers and wave vectors of the plasmon wave and evanescent wave approximately match, and the reflected light intensity decreases because the evanescent wave is used for excitation of the surface plasmon. In order to obtain surface plasmon resonance, a method is adopted in which a prism made of a high refractive index medium is arranged (Kretschmann arrangement) and laser light and LED light are incident. Here, the wave number of the plasmon wave changes due to the change in the dielectric constant of the medium contacting the metal surface opposite to the prism. That is, the incident angle of light that gives surface plasmon resonance shifts as a substance approaches the metal surface. By utilizing this fact, it becomes possible to sense the coating of the metal surface with the substance. This measurement method is excellent in resolution in the vertical direction of the surface (on the order of 0.1 nm), and the amount of the substance existing on the surface can be observed in real time on the order of ng to pg / cm 2 . In addition, the ability to measure in an aqueous medium is a great advantage in examining the behavior of biomolecules such as proteins. A measuring device utilizing this has been developed as a biomolecule interaction measuring device and applied to the analysis of protein and DNA interactions.

水晶発振子マイクロバランスは、周波数変換素子の電極上に化学的に結合対の一方を結合・固定化し、その周波数変換素子を水中に浸漬し、その結合対と対応する結合対との特異的に結合により生じる質量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定して、結合の有無を検出するものである（例えば、特開平６−９４５９１）。この周波数変換素子としては、例えば水晶発振子、表面弾性波素子（ＳＡＷ）などが挙げられる。   Quartz crystal microbalance is a method in which one of the bond pairs is chemically bonded and fixed on the electrodes of the frequency conversion element, the frequency conversion element is immersed in water, and the bond pair and the corresponding bond pair are specifically identified. The frequency change of the frequency conversion element accompanying the mass change caused by the coupling is measured to detect the presence or absence of the coupling (for example, JP-A-6-94591). Examples of the frequency conversion element include a crystal oscillator and a surface acoustic wave element (SAW).

本発明の受容体チップはまた、質量分析計のための質量分析チップとしても使用され得る。一般的に、質量分光測定による分析は、レーザービームを含む、レーザーなどの高エネルギー源を用いた少量のサンプルの気化およびイオン化を伴っている。物質はレーザービームによって、質量分析チップ先端の表面からガスあるいは気相に気化され、このプロセス中に、個々の分子の一部は陽子を取り込んで、イオン化される。これら正の電荷にイオン化された分子は、次に、短い高圧電界で加速され、高真空度チェンバーに導かれ（ドリフト）、その先で、感度の高い検出装置の表面に衝突する。飛行時間はイオン化された分子の質量の関数であるから、イオン化と衝突との間に経過する時間は、その分子の質量の判定に用いることができ、その分子質量は、次に特定の質量の既知の分子が存在しているかどうかの判定に用いることができる（飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ））。また、イオン化されたサンプルに含まれる特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）のイオンだけが安定な振動状態になることを利用して、直流成分と高周波の交流成分の電圧を加えることにより、特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を有するイオンのみを通過させる質量フィルターを用いて（必要であれば、フラグメントイオンを生成させて）、サンプル（またはサンプルのフラグメントイオン）の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を検出することもできる（タンデム質量分析法）。   The receptor chip of the present invention can also be used as a mass spectrometry chip for a mass spectrometer. In general, analysis by mass spectrometry involves vaporization and ionization of a small amount of sample using a high energy source such as a laser, including a laser beam. The material is vaporized from the surface of the tip of the mass spectrometry chip into a gas or gas phase by a laser beam, and during this process, some of the individual molecules take in protons and are ionized. These molecules ionized to a positive charge are then accelerated by a short high-voltage electric field, led to a high vacuum chamber (drift), and then impinge on the surface of a sensitive detector. Since time of flight is a function of the mass of an ionized molecule, the time that elapses between ionization and collision can be used to determine the mass of that molecule, which in turn can It can be used to determine whether a known molecule is present (Time of Flight Mass Spectrometry (TOF)). In addition, by applying only a specific mass / charge number (m / Z) ion contained in the ionized sample to a stable vibration state, by applying a voltage of a direct current component and a high frequency alternating current component, The mass / charge number of the sample (or sample fragment ions) using a mass filter that passes only ions with a specific mass / charge number (m / Z) (if necessary, generating fragment ions) (M / Z) can also be detected (tandem mass spectrometry).

気相イオンの生成方法としては、粒子のサンプルへの衝撃から得られる脱着／イオン化法などがある。この方法には、高速原子衝撃法（ＦＡＢ−揮発性マトリクスに懸濁したサンプルに中性粒子（neutral）を衝撃する）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ−ｋｅＶ
一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する）、液体ＳＩＭＳ（ＬＳＩＭＳ−一次種がイオンであることを除いてＦＡＢと同様）、プラズマ脱着質量分析法（ＭｅＶ一次イオンを用いることを除いてＳＩＭＳと同様）、大量クラスタ衝撃法（ＭＣＩ−大きいクラスタの一次イオンを用いてＳＩＭＳと同様）、レーザ脱着／イオン化法（ＬＤＩ−レーザ光を用いて、表面から種を脱着／イオン化する）、マトリクス補助型レーザ脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着／イオン化することを除いてＬＤＩと同様）などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ）を用いる方法が挙げられる。 As a method for generating gas phase ions, there is a desorption / ionization method obtained from impact of particles on a sample. This method includes a fast atom bombardment method (in which a sample suspended in a FAB-volatile matrix is bombarded with neutral particles), secondary ion mass spectrometry (SIMS-keV).
Primary ions bombard the surface to generate secondary ions), liquid SIMS (LSIMS—similar to FAB except primary species are ions), plasma desorption mass spectrometry (except using MeV primary ions) Same as SIMS), mass cluster bombardment (similar to SIMS using MCI-primary ions of large clusters), laser desorption / ionization (desorption / ionization of species from the surface using LDI-laser light), Matrix assisted laser desorption / ionization methods (MALDI—similar to LDI except that the species is desorbed / ionized from the matrix that can assist in desorption and ionization events). Representative mass spectrometry methods include laser desorption / ionization, time-of-flight mass spectrometry (TOF).

質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を結合した質量分析チップを用いる測定方法は、例えば以下のように、特表平９−５０１４８９に開示される：
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子（例えば、リガンドを含む混合物）の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと；前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと；前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと；前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと；このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子（例えば、受容体に特異的に結合するリガンド）のイオンの質量を検出することができる。 In a mass spectrometer, a measurement method using a mass spectrometry chip to which a molecule that performs affinity binding such as a receptor is bound is disclosed in, for example, JP-T-9-501589 as follows:
Exposing a receptor-immobilized mass spectrometry chip surface to a source of the analyte molecules (eg, a mixture comprising a ligand) to allow the analyte molecules to bind; Placing a bonded mass spectrometry tip on one end of a time-of-flight mass spectrometer and applying a vacuum and an electric field to create an accelerating potential in the spectrometer; Striking at least a portion of the analyte in the spectroscopic instrument bound to the induced tip of the mass spectrometry chip using one or more laser pulses to desorb ions; Detecting the mass of ions by time of flight within the mass spectrometer; and displaying the mass thus detected. In this method, the ion mass of a molecule (for example, a ligand that specifically binds to a receptor) bound to the mass spectrometry chip can be detected.

上記の方法において、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定法により、分析対象物分子の質量を測定することが可能であり、この方法においては、分析対象物の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物と一緒にエネルギー吸収物質（例えば、シナピン酸、シンナムアミド、シンナミル臭化物、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いることができる。   In the above method, the mass of the analyte molecule can be measured by laser desorption / ionization, time-of-flight mass spectrometry, and in this method, in order to facilitate the desorption and ionization of the analyte. In addition, an energy absorbing substance (for example, sinapinic acid, cinnamamide, cinnamyl bromide, 2,5-dihydroxybenzoic acid, and α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) can be used together with the analyte.

質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を固定化した質量分析チップを用いるさらなる測定方法は、特表平１１−５１２５１８に開示される。この開示される方法においては、一般にヒドロゲル、およびさらに詳細には、カルボキシメチル化デキストランなどの多糖のヒドロゲルを有する支持体表面に受容体のような親和性結合分子をチップに固定化し、その分析物（例えば、リガンド）をその支持体と接触させた後、親和性結合分子に結合した分析物の有無およびその質量等について解析する。   A further measurement method using a mass spectrometry chip on which a molecule that performs affinity binding such as a receptor is immobilized in a mass spectrometer is disclosed in JP-T-11-512518. In this disclosed method, an affinity binding molecule, such as a receptor, is immobilized on a chip, generally on a support having a hydrogel, and more particularly a polysaccharide hydrogel such as carboxymethylated dextran, and the analyte. After contacting (for example, a ligand) with the support, the presence or absence of the analyte bound to the affinity binding molecule and the mass thereof are analyzed.

本明細書において使用するＡＧＥの受容体としては、ＲＡＧＥおよびその改変体であＲＡＧＥ由来の配列が挙げられるが、これに限定されない。ＲＡＧＥ由来の配列とは、ＲＡＧＥ自体の核酸／アミ酸配列のみならず、ＲＡＧＥ自体の核酸／アミノ酸配列を改変した配列をも包含する。ＲＡＧＥ由来の配列としては、代表的には、ＡＧＥに結合する能力を有するポリペプチドの発現に使用可能な配列であり、かつ：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントの配列；
（ｃ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ−６２を使用し、フィルターとしてＬｏｗ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙのみを使用するＢｌａｓｔ解析を行った場合に、Ｅ値が１ｅ−２０以下であるポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つの保存的置換、および、１または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに、
（ｇ）配列番号１に記載される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される配列、あるいは、これらアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。 As used herein, AGE receptors include, but are not limited to, RAGE and variants thereof derived from RAGE. The sequence derived from RAGE includes not only the nucleic acid / amino acid sequence of RAGE itself but also a sequence obtained by modifying the nucleic acid / amino acid sequence of RAGE itself. RAGE-derived sequences are typically sequences that can be used to express a polypeptide having the ability to bind to AGE, and:
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) the sequence of a fragment of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) When a Blast analysis using the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as a reference sequence, using BLOSUM-62 as a matrix and using only Low-complexity as a filter, an E value of 1e-20 or less The amino acid sequence of a polypeptide that is
(D) the amino acid sequence of a polypeptide having at least one conservative substitution to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(E) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having one or several substitutions, additions and deletions relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(F) an amino acid sequence of a polypeptide having an amino acid sequence having at least one conservative substitution and one or several substitutions, additions, deletions to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and
(G) the amino acid sequence of a polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions;
Examples include, but are not limited to, a sequence selected from the group consisting of: or a nucleic acid sequence encoding these amino acid sequences.

（ＡＧＥ結合能を有するポリペプチドの発現）
大腸菌などの細菌宿主細胞を用いて、外来タンパク質を多量に発現すると、封入体を形成する場合が多い。封入体は、ポリペプチドの折り畳みが異常であり、そのため、ポリペプチドが本来有する機能を失っている場合が多い。そこで、（１）封入体を形成しない（または少量のみの封入体を形成する）宿主細菌細胞の使用、（２）封入体を形成しない条件での宿主細菌細胞の培養、（３）形成された封入体のリフォールディング、または、（４）これら（１）〜（３）の組合せを用いる必要がある。これら各々について、限定されることはないが、例えば、以下のように実施することが可能である。 (Expression of polypeptide having AGE binding ability)
When a large amount of foreign protein is expressed using bacterial host cells such as E. coli, inclusion bodies are often formed. Inclusion bodies have abnormal polypeptide folding, and therefore often lose the functions inherent to the polypeptide. Therefore, (1) use of host bacterial cells that do not form inclusion bodies (or form only a small amount of inclusion bodies), (2) culture of host bacterial cells under conditions that do not form inclusion bodies, (3) formed It is necessary to use refolding of inclusion bodies or (4) a combination of these (1) to (3). Although not limited to each of these, for example, it can be implemented as follows.

（１．封入体形成を抑制する宿主細菌細胞の使用）
一般的に、封入体は、組換えポリペプチド内での適切なジスルフィド結合が形成されずに、ポリペプチドの可溶性が低下することによって形成される場合が多い。そこで、細菌宿主細胞においてジスルフィド結合の形成を促進し、可溶性タンパク質としての発現の可能性を高める変異株を宿主として使用することによって、封入体の形成が抑制される。ジスルフィド結合の形成を促進する変異株としては、チオレドキシンリダクターゼ遺伝子、および／またはグルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損する細菌が挙げられるが、これに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉのチオレドキシンリダクターゼ遺伝子としては、ｔｒｘＢが公知であり、グルタチオンリダクターゼ遺伝子としてはｇｏｒが公知である。従って、ジスルフィド還元系に変異を有するＥ．ｃｏｌｉとしては、（ｉ）ｔｒｘＢ変異株、（２）ｇｏｒ変異株、および（３）ｔｒｘＢ ｇｏｒ変異株が挙げられるが、これに限定されない。ｔｒｘＢ変異を有するが、ｇｏｒ変異を有さないＥ．ｃｏｌｉ株としては、例えば、ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）株が挙げられるが、これに限定されない。ｔｒｘＢ変異およびｇｏｒ変異の両方を有するＥ．ｃｏｌｉ株としては、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、Ｒｏｓｅｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）株が挙げられるが、これに限定されない。 (1. Use of host bacterial cells that suppress inclusion body formation)
In general, inclusion bodies are often formed by a decrease in polypeptide solubility without the proper formation of disulfide bonds within the recombinant polypeptide. Thus, inclusion body formation is suppressed by using as a host a mutant that promotes the formation of disulfide bonds in bacterial host cells and increases the potential for expression as a soluble protein. Mutants that promote disulfide bond formation include, but are not limited to, bacteria that lack the thioredoxin reductase gene and / or the glutathione reductase gene. E. trxB is known as a thioredoxin reductase gene of E. coli, and gor is known as a glutathione reductase gene. Therefore, E. coli having mutations in the disulfide reduction system. Examples of E. coli include, but are not limited to, (i) trxB mutant, (2) gor mutant, and (3) trxB gor mutant. E. has a trxB mutation but no gor mutation. Examples of the E. coli strain include, but are not limited to, the AD494 (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA) strain. E. coli with both trxB and gor mutations. Examples of E. coli strains include, for example, Origami (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA), Origami B (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA), Rosetta-gami (DE3) (Novagen, I, Madison, Madison, I). , USA) strains, but is not limited thereto.

（２．低温での組換え細菌の培養）
一般的に、細菌を低温で培養することによって、封入体の形成を抑制することが可能である。宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉの場合、Ｅ．ｃｏｌｉの最適培養温度が通常３７℃であるのに対して、封入体形成を抑制するのに十分低い培養温度は、約１５〜３０℃、好ましくは約２０〜２５℃、より好ましくは約２５℃である。従って、このような低温で宿主細菌細胞を培養することによって、封入体形成を抑制することが可能である。 (2. Culture of recombinant bacteria at low temperature)
In general, it is possible to suppress the formation of inclusion bodies by culturing bacteria at a low temperature. The host cell is E. coli. In the case of E. coli, E. coli. While the optimal culture temperature of E. coli is usually 37 ° C, a culture temperature low enough to suppress inclusion body formation is about 15-30 ° C, preferably about 20-25 ° C, more preferably about 25 ° C. It is. Therefore, it is possible to suppress inclusion body formation by culturing host bacterial cells at such a low temperature.

（３．受容体チップの調製）
上記のように封入体形成を抑制する条件下で生成したＲＡＧＥは、正しい高次構造にフォールディングし、リガンド認識能を有しているので、そのまま、アビジンもしくはストレプトアビジン等を介して方向性を保った状態でチップ、キュベット等の固相上に固定し、これをセンサー（すなわち、受容体チップ）として使用することが可能である。 (3. Preparation of receptor chip)
As described above, RAGE produced under conditions that suppress inclusion body formation folds into the correct higher-order structure and has ligand recognition ability, so that it retains its directivity via avidin or streptavidin as it is. It is possible to fix it on a solid phase such as a chip or cuvette and use it as a sensor (that is, a receptor chip).

（実施例１：組換え宿主細胞の培養）
宿主細菌細胞としてＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）を用いた。図１に記載のように、目的ＲＡＧＥ遺伝子クローニングサイトとして、５’側はＮｄｅＩ，３’側にはＸｈｏＩ（ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩもまた使用可能）を使用する。その結果、目的タンパク質のＣ末側にビオチンリガーゼによって認識されるビオチン化アミノ酸配列が付加される。ＲＡＧＥの場合、Ｎ末側が細胞外領域でありＡＧＥの認識に必須な領域であるため、チップ化などに際してＣ末側で固定化が可能なように、Ｃ末側にビオチン化アミノ酸配列を付加した。この手順を用いて、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端側にビオチン化アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号４）をコードする核酸配列を連結し、Ｔ７プロモーターの制御下に配置したプラスミドを作製した。用いたプラスミドのクローニング部位を図１に示す。図１中、「ＦＸａ」は第Ｘａ因子の切断部位を示し、「ｒｂｓ」はリボゾーム結合部位を示す。このプラスミドと、ビオチンリガーゼ遺伝子を発現するプラスミド（ＣｏｌＥ１系であるｐＥＴベクターと不和合性グループが異なるため同一細胞内で安定に共存しうるｐ１５Ａ系プラスミドであるｐＡＣベクターにビオチンリガーゼ遺伝子を挿入したプラスミド）の両方を用いて宿主細菌細胞を形質転換した。この形質転換した宿主細胞の培養に使用した培地は、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加した、改変ＬＢ培地（０．５％ ＮａＣｌ、０．５％酵母エキス、１％トリプトン）である。 (Example 1: Culture of recombinant host cells)
Origami (DE3) was used as a host bacterial cell. As shown in FIG. 1, as the target RAGE gene cloning site, NdeI is used on the 5 ′ side, and XhoI (BamHI, SmaI, HindIII can also be used) on the 3 ′ side. As a result, a biotinylated amino acid sequence recognized by biotin ligase is added to the C-terminal side of the target protein. In the case of RAGE, since the N-terminal side is an extracellular region and an essential region for AGE recognition, a biotinylated amino acid sequence was added to the C-terminal side so that it can be immobilized on the C-terminal side when chipping or the like . Using this procedure, a nucleic acid sequence encoding the biotinylated amino acid sequence “GLNDIFEAQKIEWHE” (SEQ ID NO: 4) was linked to the C-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to prepare a plasmid placed under the control of the T7 promoter. . The cloning site of the plasmid used is shown in FIG. In FIG. 1, “FXa” indicates the cleavage site of factor Xa, and “rbs” indicates the ribosome binding site. This plasmid and a plasmid that expresses the biotin ligase gene (a plasmid in which the biotin ligase gene is inserted into the pAC vector, which is a p15A-based plasmid that can stably coexist in the same cell because the incompatibility group differs from the ColE1-based pET vector) ) Were used to transform host bacterial cells. The medium used for culturing the transformed host cells was a modified LB medium (0.5%) supplemented with 50 μg / ml ampicillin, 34 μg / ml chloramphenicol, 15 μg / ml kanamycin, 12.5 μg / ml tetracycline. NaCl, 0.5% yeast extract, 1% tryptone).

２５℃で一晩培養した前培養液を、５％の最終濃度になるように培地に添加し、２５℃で攪拌培養した。なお、本培養への添加量を５％以上にして、誘導開始までの培養時間を短縮することも可能である。また、前培養を３７℃で行なった場合、添加量が５％を越えると可溶性として得られる割合が減少した。   A pre-culture solution cultured overnight at 25 ° C. was added to the medium to a final concentration of 5%, and the mixture was stirred and cultured at 25 ° C. It should be noted that the amount of addition to the main culture can be made 5% or more to shorten the culture time until the start of induction. In addition, when the preculture was performed at 37 ° C., the proportion obtained as soluble decreased when the addition amount exceeded 5%.

培養後に、Ａ６００での吸光度が０．５〜０．７に達した段階で、１ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μＭ ｄ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｄ型［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸）］（いずれも最終濃度）を添加し、目的タンパク質の誘導とビオチン化を開始し、さらに１８時間攪拌培養をすることにより、目的とするタンパク質を可溶性ビオチン化タンパク質として発現させることができた。 After the culture, when the absorbance at A 600 reached 0.5 to 0.7, 1 mM IPTG, 50 μM d-biotin (D type [(+)-cis-hexahydro-2-oxo-1H-thieno- ( 3,4) -imidazole-4-valeric acid)] (both at final concentrations), induction of the target protein and biotinylation are started, and the target protein is soluble by stirring for 18 hours. It could be expressed as a biotinylated protein.

なお、培養温度３７℃では、目的タンパク質は、１００％近く不溶性となるが、培養温度を２５℃に下げることにより、発現した目的タンパク質の内、８０％程度を可溶性タンパク質として発現させることが可能であった。全細胞抽出物と各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２Ａに示す。図２中、「−」は誘導前の全細胞抽出物、「＋」は誘導後の全細胞抽出物、「Ｓ」誘導後の全細胞抽出物中の可溶性画分、「Ｐ」誘導後の全細胞抽出物中の不溶性画分、「Ｎｉ」可溶性画分のＮｉアガロースカラム溶出画分、「Ｍｕ」ストレプトアビジンムテインマトリックスカラム（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，ＳＷＩＴＺＥＲＬＡＮＤ）からの溶出画分を示す。一方、培養温度を３０℃に下げた場合は、封入体形成の抑制の程度は、少なかった（図２Ｂ）。   At the culture temperature of 37 ° C., the target protein becomes almost insoluble at 100%, but by reducing the culture temperature to 25 ° C., about 80% of the expressed target protein can be expressed as a soluble protein. there were. The results of SDS-PAGE of the whole cell extract and each fraction are shown in FIG. 2A. In FIG. 2, “−” indicates whole cell extract before induction, “+” indicates whole cell extract after induction, soluble fraction in whole cell extract after “S” induction, and “P” after induction. The insoluble fraction in the whole cell extract, the Ni agarose column elution fraction of the “Ni” soluble fraction, and the elution fraction from the “Mu” streptavidin mutein matrix column (Roche, Basel, SWITZERLAND) are shown. On the other hand, when the culture temperature was lowered to 30 ° C., the degree of suppression of inclusion body formation was small (FIG. 2B).

（実施例２：培養液よりのＲＡＧＥの調製）
菌体を収菌後、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８．０）に懸濁し、超音波破砕した後、遠心した上清を租溶解液（可溶性画分）とした。Ｎ末端に存在するＨｉｓタグを利用しＮｉアガロースカラムに結合させ、ＦＰＬＣシステムによるイミダゾール濃度勾配により溶出を行なった。可溶性ビオチン化ＲＡＧＥを含む画分を回収し溶解緩衝液にて透析後、ＡｖｉＴａｇ（Ｃ末）（「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号４））を利用しストレプトアビジン ムテイン マトリックス（Ｒｏｃｈｅ社製）カラムに結合させた。１０ｍＭ ｄ−ｂｉｏｔｉｎにて溶出することにより精製可溶性ビオチン化ＲＡＧＥを得た。１Ｌ当りの培養から、最終的に数ｍｇの精製可溶性ビオチン化ＲＡＧＥを得ることが可能であった。 (Example 2: Preparation of RAGE from culture solution)
After collecting the cells, the cells are suspended in a lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0), sonicated, and the centrifuged supernatant is dissolved in a soluble solution (soluble fraction). ). The His tag present at the N-terminus was used to bind to a Ni agarose column, and elution was performed with an imidazole concentration gradient by the FPLC system. A fraction containing soluble biotinylated RAGE is collected, dialyzed with a lysis buffer, and bound to a streptavidin mutein matrix (Roche) column using AviTag (C powder) (“GLNDIFEAQKIEWHE” (SEQ ID NO: 4)). It was. Purified soluble biotinylated RAGE was obtained by elution with 10 mM d-biotin. From cultures per liter it was finally possible to obtain several mg of purified soluble biotinylated RAGE.

（実施例３：組換えＲＡＧＥのＡＧＥ結合能）
実施例２に従って調製した組換えＲＡＧＥのＡＧＥ結合能を確認した。 (Example 3: AGE binding ability of recombinant RAGE)
The AGE binding ability of the recombinant RAGE prepared according to Example 2 was confirmed.

（１：ＡＧＥの調製）
ＡＧＥとしては、糖化ＢＳＡを用いた。糖化ＢＳＡは、以下の手順によって調製した。 (1: Preparation of AGE)
As AGE, glycated BSA was used. Glycated BSA was prepared by the following procedure.

糖化ＢＳＡとしては、実施例中ではフルクトースにより糖化したＢＳＡを使用（グルコース、リボースなどによる糖化処理をした糖化ＢＳＡも類似の手法で準備）した。   As the saccharified BSA, BSA saccharified with fructose was used in the examples (glycated BSA subjected to saccharification treatment with glucose, ribose, etc. was also prepared in a similar manner).

エタノール殺菌した薬匙を使用し、ガンマー線滅菌済みの５０ｍｌ コニカルチューブ中へ４．５１ｇのフルクトース（Ｓｉｇｍａ社製， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を計量した。２０ ｍｌの滅菌１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を加え、キャップをした後、ボルテックスによりフルクトースを完全に溶解させた。次に８．３ｍｌの３０％ＢＳＡ溶液（ＢＳＡはＳｉｇｍａ社製， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を添加し、転倒混和により穏やかに溶液を混合した。最後に２１ｍｌの滅菌蒸留水を添加し、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ， ５００ｍＭ フルクトース ／ ４００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液とした。この溶液（Ｆｒｕｃ ５００ ＢＳＡ）を０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、遮光条件下において３７℃で６もしくは１２週間反応させた（実験に使用したのは１２週間反応させたもの）。毎週、少量の反応液を無菌的に採取し、ｐＨを確認した。ｐＨに変化が認められる場合は、滅菌水で調製した１０Ｎ ＮａＯＨを添加し、ｐＨを常に７．４に保つようにした。糖化反応の進行の検証と糖化ＢＳＡの特性解析用の試料として１週間目、６週間目に５ｍｌの反応産物を無菌的に採取し、−８０℃にて凍結保存した。１２週目に糖化反応を終了させるために、未反応のフルクトースを透析により除去した。透析は、オートクレーブ滅菌したＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， １０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， １３７ ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣＬ， ｐＨ ７．４）に対して４℃で行なった。透析後の試料は可能な限り無菌的に扱い、０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、冷蔵保存した。１週目、６週目の糖化ＢＳＡも溶解後同様の透析処理により未反応のフルクトースを除去し、０．２２μｍのフィルターにより無菌ろ過した後、冷蔵保存し、１，６，１２週目の各試料に関して、糖化反応の進行とＡＧＥとしての特性を評価し、１２週目のものを糖化ＢＳＡ（ＡＧＥ−ＢＳＡ）として使用した。   Using ethanol-sterilized shells, 4.51 g of fructose (Sigma, St. Louis, MO, USA) was weighed into a 50 ml conical tube sterilized with gamma rays. After adding 20 ml of sterile 1M phosphate buffer (pH 7.4) and capping, the fructose was completely dissolved by vortexing. Next, 8.3 ml of 30% BSA solution (BSA is made by Sigma, St. Louis, MO, USA) was added, and the solution was gently mixed by inversion mixing. Finally, 21 ml of sterilized distilled water was added to prepare a solution having a final concentration of 50 mg / ml BSA, 500 mM fructose / 400 mM phosphate buffer (pH 7.4). This solution (Fruc 500 BSA) was aseptically filtered through a 0.22 μm filter and then allowed to react at 37 ° C. for 6 or 12 weeks under light-shielding conditions. A small amount of reaction solution was aseptically collected every week to check the pH. If there was a change in pH, 10N NaOH prepared with sterile water was added to keep the pH always at 7.4. As a sample for verifying the progress of the saccharification reaction and analyzing the characteristics of saccharified BSA, 5 ml of the reaction product was aseptically collected at 1 week and 6 weeks and stored frozen at -80 ° C. In order to terminate the saccharification reaction at 12 weeks, unreacted fructose was removed by dialysis. Dialysis was performed at 4 ° C. against autoclaved PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, pH 7.4). The sample after dialysis was handled as aseptically as possible, filtered aseptically through a 0.22 μm filter, and stored refrigerated. After dissolution of glycated BSA at 1st week and 6th week, unreacted fructose was removed by the same dialysis treatment, and after aseptic filtration with a 0.22 μm filter, each sample was stored at refrigeration. Regarding the samples, the progress of the saccharification reaction and the characteristics as AGE were evaluated, and those at 12 weeks were used as glycated BSA (AGE-BSA).

コントロール用の糖化処理を受けていないＢＳＡとして、フルクトースを添加しない条件下で全く同様の処理をしたＢＳＡを使用した。   As a BSA that had not been subjected to a saccharification treatment for control, BSA that had been treated in exactly the same manner under the condition where fructose was not added was used.

糖化ＢＳＡは、励起波長が３３５ｎｍであり、放出波長が４２０ｎｍである蛍光特性を有する。   Glycated BSA has a fluorescent property with an excitation wavelength of 335 nm and an emission wavelength of 420 nm.

（２：ＡＧＥ結合能の測定）
１．５ｍｌの遠心用チューブに粗精製ｓＲＡＧＥ溶液（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ イミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ；タンパク濃度は、２．５〜５ｍｇ／ｍｌ）３００μｌを分注した。次に２０μｌのストレプトアビジン−ムテインマトリックス５０％スラリーを添加し、室温で回転混和により１０分間反応させた。スイングローターにより５００ｇ×５ 分間の遠心処理を行い、上清を除去し、ｓＲＡＧＥが固定化されたストレプトアビジン−ムテインマトリックス（ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ）を沈澱画分として回収した。３００μｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、転倒混和、遠心処理によるｓＲＡＧＥ固定化ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎの回収を２回繰り返すことにより、非特異的にＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎに吸着しているタンパク質などを除去した。続いて、３００μｌのＡＧＥ−ＢＳＡ（１２週間糖化処理を行なったＡＧＥ−ＢＳＡ、４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で回転混和により１時間反応させた。上述の遠心処理によりＡＧＥ−ＢＳＡ−ｓＲＡＧＥ−ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ複合体が回収された。この複合体を０．０５％ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， １０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， １３７ ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣＬ， ｐＨ ７．４）を３００μｌ添加し、転倒混和、遠心処理を２回繰り返す洗浄の作業を行ない、非特異的に吸着していた分子を除去した。最終的に回収されたＡＧＥ−ＢＡＳ−ｓＲＡＧＥ− ＳＡ−Ｍｕｔｅｉｎ複合体を２００μｌのＰＢＳに懸濁した後、９６ウェルの無蛍光のマイクロタイタープレートに添加し、３３５ｎｍで励起し、４２０ｎｍの吸収波長で蛍光強度を測定した。コントロールとしてＦｒｕｃ−５００−ＢＳＡの代わりにフルクトース非存在下で糖化処理区と同条件で３７℃に放置したＢＳＡを使用した。独立した3回の測定を行なった結果を以下の表に記す。 (2: Measurement of AGE binding ability)
A crude purified sRAGE solution (Lysis buffer: 10 mM imidazole, 100 mM NaH 2 PO 4 , 150 mM NaCl; protein concentration is 2.5 to 5 mg / ml) was dispensed into a 1.5 ml centrifuge tube. Next, 20 μl of a streptavidin-mutein 50% slurry was added and allowed to react at room temperature by rotary mixing for 10 minutes. Centrifugation was performed at 500 g × 5 minutes with a swing rotor, the supernatant was removed, and streptavidin-mutein matrix (SA-Mutein) on which sRAGE was immobilized was recovered as a precipitated fraction. 300 μl of Lysis buffer was added, and by collecting the sRAGE-immobilized SA-Mutein by inverting and centrifuging twice, proteins and the like adsorbed non-specifically to SA-Mutein were removed. Subsequently, 300 μl of AGE-BSA (AGE-BSA which had been subjected to saccharification treatment for 12 weeks, 4 mg / ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature by rotary mixing for 1 hour. The AGE-BSA-sRAGE-SA-Mutein complex was recovered by the above centrifugation. To this complex was added 300 μl of PBS containing 0.05% tween 20 (1 mM KH 2 PO 4 , 10 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, pH 7.4), mixed by inversion, and centrifuged. The washing operation was repeated twice to remove the non-specifically adsorbed molecules. The finally recovered AGE-BAS-sRAGE-SA-Mutein complex was suspended in 200 μl of PBS, then added to a 96-well non-fluorescent microtiter plate, excited at 335 nm, and with an absorption wavelength of 420 nm. The fluorescence intensity was measured. As a control, BSA which was allowed to stand at 37 ° C. under the same conditions as in the saccharification treatment group in the absence of fructose was used instead of Fruc-500-BSA. The following table shows the results of three independent measurements.

上記の結果から、組換え発現したＲＡＧＥは、糖化ＢＳＡに対する特異的認識能を有していることが明らかとなった。また、従来ＲＡＧＥのＮグルカンを除去した場合に、リガンドに対する特異的結合能が顕著に減少したことを考慮すると、糖鎖修飾されていない細菌細胞宿主を用いて発現した上記ＲＡＧＥの特異的認識能は、予想外に高いものであると評価できる
（実施例４：ドットブロット分析）
（実験条件）０．２２μｍのポアサイズのニトロセルロース膜上に１μｌのリガンド溶液（２０ｎｇ〜８μｇの濃度勾配）を直接スポットすることにより吸着させた。リガンド溶液としては１２週間反応のＡＧＥ−ＢＳＡ、フルクトース非存在下で調製したＢＳＡ（コントロール）を用いた。スポットを完全に乾燥させた後、タンパク質の結合していない部分をブロックするため、ブロッキング緩衝液：５％ スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０， ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ８．０）中で、室温で１時間反応させた。続いて１０μｇ／ｍｌもしくは１μｇ／ｍｌの濃度のｈｓＲＡＧＥ、コントロールとして１０μｇ／ｍｌ（いずれも最終濃度）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ中で室温にて１時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔ中にて１５分間振とうする洗浄の過程、さらに同様の洗浄を１．５分で３回繰り返し、非特異的な結合を除去した。続いて室温にて１時間、一次抗体との反応を行なった。抗体は、抗ＲＡＧＥ抗体ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ， ＵＳＡ ）をＴＢＳ−Ｔにて１：１０００に希釈して使用した。反応後の膜をＴＢＳ−Ｔにて上記同様に洗浄した。次に二次抗体との反応を行なった。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）をＴＢＳ−Ｔにて１：１０００に希釈して使用した。室温で１時間振とう反応させた後、上述の洗浄の過程を経て、最後の検出の段階に進んだ。検出はＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ ）キットにより、Ｘ線フィルムへの露光により、各ドットに由来する発光を可視化した。 From the above results, it was revealed that the recombinantly expressed RAGE has a specific recognition ability for glycated BSA. Moreover, when the N-glucan of RAGE is removed, the specific recognition ability of the RAGE expressed using a bacterial cell host not modified with a sugar chain is considered considering that the specific binding ability to the ligand is significantly reduced. Can be evaluated to be unexpectedly high (Example 4: dot blot analysis)
(Experimental conditions) 1 μl of a ligand solution (concentration gradient of 20 ng to 8 μg) was directly spotted on a nitrocellulose membrane having a pore size of 0.22 μm for adsorption. As the ligand solution, AGE-BSA reacted for 12 weeks and BSA (control) prepared in the absence of fructose were used. After completely drying the spot, blocking buffer: TBS-T containing 5% skim milk (0.1% Tween 20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8) to block unbound protein. 0) at room temperature for 1 hour. Subsequently, the reaction was performed at room temperature for 1 hour in TBS-T containing 10 μg / ml or 1 μg / ml of hsRAGE and 10 μg / ml (both final concentrations) BSA as a control. After the reaction, the washing process of shaking the nitrocellulose membrane in TBS-T for 15 minutes and the same washing were repeated three times in 1.5 minutes to remove non-specific binding. Subsequently, the reaction with the primary antibody was performed at room temperature for 1 hour. The antibody used was an anti-RAGE antibody rabbit IgG (Santa Crua Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) diluted 1: 1000 with TBS-T. The membrane after the reaction was washed with TBS-T in the same manner as described above. Next, reaction with a secondary antibody was performed. The antibody used was an anti-rabbit IgG antibody (BioRad, Hercules, CA, USA) labeled with horseradish peroxidase diluted 1: 1000 with TBS-T. After a reaction of shaking for 1 hour at room temperature, the process proceeds to the final detection stage through the above washing process. Detection was performed using an ECL (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) kit, and the luminescence derived from each dot was visualized by exposure to an X-ray film.

結果を図３に示す。コントロールは、ｓＲＡＧＥを添加しなかった対照実験である。図３のブロッティングの結果で確認できる黒い点が、ｓＲＡＧＥが膜上のリガンドを認識し、結合したことを意味する。リガンドの濃度が同一の場合、ドットの濃さと反応の強さは比例関係にある。また、ｓＲＡＧＥは、アンフォテリン（ＲＳＤ、ＭＮ、ＵＳＡ）にも結合することが確認された。   The results are shown in FIG. The control is a control experiment in which no sRAGE was added. The black dots that can be confirmed in the blotting results in FIG. 3 mean that sRAGE recognized and bound the ligand on the membrane. When the ligand concentration is the same, the dot density is proportional to the reaction intensity. Moreover, it was confirmed that sRAGE also binds to amphoterin (RSD, MN, USA).

ｓＲＡＧＥがＡＧＥ−ＢＳＡのみと反応し、コントロールのＢＳＡとは反応していないことから、大腸菌を宿主として調製したｓＲＡＧＥが、天然型ＲＡＧＥ同様の特異的なＡＧＥ認識能を有していることが分る。   Since sRAGE reacts only with AGE-BSA and not with control BSA, sRAGE prepared using Escherichia coli as a host has a specific AGE recognition ability similar to that of natural RAGE. The

またその結合能であるが、ＡＧＥ−ＢＳＡの濃度勾配から１０μｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥ溶液を使用した場合、０．０２μｇ／ドットで十分検出可能、０．００４μｇ／ドットが検出限界に近いと推定される。１ドットが１μｌであることから、検出限界は４μｇ／ｍｌ（約６００ｎＭ）と計算される。細胞上に発現している糖鎖付加のなされた天然型ＲＡＧＥによるＡＧＥの認識によって引き起こされる細胞の種々の機能変化を引き起こすＡＧＥの濃度として、５０μｇ／ｍｌが使用されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７４， ３１７４０−３１７４９， １９９９）。実験系と評価基準の違いから厳密な比較とはいえないが、大腸菌で発現させたｓＲＡＧＥが予想に反して、天然型ＲＡＧＥに匹敵するＡＧＥ認識能を有していることを示唆している。   In addition, the binding ability is estimated to be sufficiently detectable at 0.02 μg / dot when a 10 μg / ml sRAGE solution is used from the concentration gradient of AGE-BSA, and 0.004 μg / dot is estimated to be close to the detection limit. . Since one dot is 1 μl, the detection limit is calculated to be 4 μg / ml (about 600 nM). 50 μg / ml is used as a concentration of AGE that causes various functional changes in cells caused by recognition of AGE by glycosylated natural RAGE expressed on cells (J. Biol. Chem). , 274, 31740-31749, 1999). Although it cannot be said that it is a strict comparison due to the difference between the experimental system and the evaluation criteria, it is suggested that sRAGE expressed in E. coli has AGE recognition ability comparable to that of natural RAGE, contrary to expectations.

（実施例５：受容体チップの作製）
ＡＧＥなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へビオチン化ＲＡＧＥを固定化し、実際のリガンドの結合を検討する。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡＣＯＲＥ杜製のＢＩＡＣＯＲＥ、並びに株式会社日立ハイテクノロジーズ製のＩＡｓｙｓを使用する。 (Example 5: Production of receptor chip)
For the purpose of use as a sensor for detecting AGE or the like, biotinylated RAGE is immobilized on a sensor site of a device that can be detected by surface plasmon resonance, and the binding of an actual ligand is examined. As the surface plasmon resonance apparatus, BIACORE manufactured by BIACORE 杜 and IAsys manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation are used.

（１）再構成ビオチン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのストレプトアビジンセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これをＢＩＡＣＯＲＥ本体に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。表面プラズモン共鳴の原理を利用した機器の場合、リガンドの結合をレゾナンスユニット：ＲＵの増加として検出することになる。   (1) The reconstituted biotinylated extracellular region is immobilized on a BIACORE streptavidin sensor chip so that the part involved in ligand recognition faces outward. After this is inserted into the BIACORE main body, the binding with AGE (for example, glycated BSA) is measured. In the case of an instrument using the principle of surface plasmon resonance, binding of a ligand is detected as an increase in resonance unit: RU.

（２）再構成ビオチン化受容体をＩＡｓｙｓのビオチンキュベット上に、ストレプトアビジンを介してリガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これをＩＡｓｙｓ本体に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。   (2) The reconstituted biotinylated receptor is immobilized on a biotin cuvette of IAsys so that the part involved in ligand recognition is directed outward via streptavidin. After this is inserted into the IAsys body, the binding to AGE (for example, glycated BSA) is measured.

（実施例６：ＢＩＡＣＯＲＥを用いた受容体チップの性能評価）
リフォールディングにより得られたｓＲＡＧＥをＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップＳＡ上に固定化した。実施例３に従って調製された、異なった濃度のフルクトースにより糖化処理を行なったＡＧＥ−ＢＳＡをインジェクションした。その結合と解離を測定したセンサーグラムを図４に示す。０秒でＡＧＥ−ＢＳＡを添加し、１８０秒後に緩衝液による洗浄を開始した。流速を２０μｌ／分とした。ｓＲＡＧＥを固定化していないフローセルをリファレンスセルとし、リファレンスセルの値との差を応答（ＲＵ）として示した。図４中、応答（ＲＵ）値の大きい順に、１２８μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌの糖化処理ＡＧＥ−ＢＳＡを用いたセンサーグラムの結果が示されている。 (Example 6: Performance evaluation of receptor chip using BIACORE)
The sRAGE obtained by refolding was immobilized on the sensor chip SA of BIACORE. AGE-BSA prepared according to Example 3 and subjected to saccharification treatment with different concentrations of fructose was injected. A sensorgram for measuring the binding and dissociation is shown in FIG. AGE-BSA was added at 0 seconds, and buffer washing was started after 180 seconds. The flow rate was 20 μl / min. A flow cell in which sRAGE is not fixed is used as a reference cell, and a difference from the value of the reference cell is shown as a response (RU). In FIG. 4, the results of sensorgrams using glycated AGE-BSA of 128 μg / ml, 64 μg / ml, 32 μg / ml, 16 μg / ml, 8 μg / ml, 4 μg / ml in descending order of response (RU) values. It is shown.

精製したｓＲＡＧＥをＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップＳＡ上に固定化し、。実施例３に従って調製された、異なった濃度のフルクトースにより糖化処理を行なったＡＧＥ−ＢＳＡをインジェクションし、その結合と解離を測定したセンサーグラム。０秒でＡＧＥ−ＢＳＡを添加し、１８０秒後に緩衝液による洗浄を開始した。流速は、２０μｌ／分とした。ｓＲＡＧＥを固定化していないフローセルをリファレンスセルとし、リファレンスセルの値との差を応答（ＲＵ）として示した。図５中、応答（ＲＵ）値の大きい順に、１２８μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌの糖化処理ＡＧＥ−ＢＳＡを用いたセンサーグラムの結果が示されている
反応速度論的解析は、ＢＩＡＣＯＲＥの解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０によった。解析は、センサーグラムを非線形最小二乗法により直接ｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ させ解析する非線形解析（Ｎｏｎ ｌｉｎｅａｒ ｆｉｔｔｉｎｇ）によった。さらに非線形解析の内、結合相と解離相のグラフに対して同時にカーブフィッティングする同時解析（Ｓｉｍｕｌｔｅｎｅｏｕｓ ｆｉｔｔｉｎｇ）により、結合速度定数と解離速度定数を算出した。さらに、フィッティングに際して、ＲＡＧＥとＡＧＥ−ＢＳＡの結合反応様式のモデルとして、１対１の反応を前提とした １：１ラングミュア結合（ｌａｎｇｕｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ）を採用した。 Immobilize the purified sRAGE on the BIACORE sensor chip SA. FIG. 3 is a sensorgram in which AGE-BSA prepared according to Example 3 and subjected to saccharification with different concentrations of fructose was injected and its binding and dissociation were measured. AGE-BSA was added at 0 seconds, and buffer washing was started after 180 seconds. The flow rate was 20 μl / min. A flow cell in which sRAGE is not fixed is used as a reference cell, and a difference from the value of the reference cell is shown as a response (RU). In FIG. 5, the results of sensorgrams using glycated AGE-BSA of 128 μg / ml, 64 μg / ml, 32 μg / ml, 16 μg / ml, 8 μg / ml, 4 μg / ml in descending order of response (RU) values. The reaction kinetic analysis shown was by BIACORE's analysis software BIAevaluation 3.0. The analysis was based on non-linear fitting in which the sensorgram was directly subjected to curve fitting by a non-linear least square method. Further, among the nonlinear analysis, the binding rate constant and the dissociation rate constant were calculated by simultaneous analysis (simultaneous fitting) in which the curve of the bonded phase and the dissociated phase was simultaneously fitted. Furthermore, at the time of fitting, as a model of the binding reaction mode between RAGE and AGE-BSA, 1: 1 Langmuir binding based on a one-to-one reaction was adopted.

その結果得られた、結合定数ＫＤ（Ｍ）＝ｅ-７〜ｅ−８であり、細胞上に発現している天然ＲＡＧＥのＫＤ（Ｍ）＝ｅ−７（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１４９８７−１４９９７，１４９９８−１５００４，１９９２）と同等以上の結合能を有することが示された。また、細胞アッセイにより算出した天然ＲＡＧＥの１２５Ｉ標識ＡＧＥに対するＫｄは、１００ｎＭ以上と報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１４９８７−１４９９７，１４９９８−１５００４，１９９２）。この報告と比較しても大腸菌を宿主として調製された本発明のｓＲＡＧＥは、天然のＲＡＧＥと同程度の十分な結合能を有していることが示されている。 The resulting binding constant K D (M) = e −7 to e −8 , and K D (M) = e −7 of natural RAGE expressed on cells (J. Biol. Chem. , 267, 14987-14997, 14998-15004, 1992). Moreover, Kd with respect to 125 I labeling AGE of natural RAGE computed by the cell assay is reported to be 100 nM or more (J. Biol. Chem., 267, 14987-14997, 14998-15004, 1992). Compared with this report, it has been shown that the sRAGE of the present invention prepared using Escherichia coli as a host has sufficient binding ability comparable to that of natural RAGE.

使用したモデルの正しさやＦｉｔｔｉｎｇの良好さの指標となり得るＣｈｉ２は、２以下であり、２０以下で良好とされることから、Ｆｉｔｉｎｇは良好であると判断された。 Chi 2 , which can be an index of the correctness of the model used and the goodness of fitting, is 2 or less and is good at 20 or less, so fitting was judged to be good.

（実施例７：水晶発振子マイクロバランスへの応用）
ＲＡＧＥポリペプチドまたはそのホモログを、ＡＧＥなどを検出するセンサーとして使用する目的で、水晶発振子マイクロバランスにより検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチン化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を測定する。装置としては、Ｉｎｔｉｕｍ社製のＡｆｆｉｎｉｘＱを使用する。 (Example 7: Application to crystal oscillator microbalance)
For the purpose of using RAGE polypeptide or its homolog as a sensor for detecting AGE, etc., each biotinylated protein is immobilized on the sensor site of a device that can be detected by quartz crystal microbalance, and the actual ligand binding is measured. To do. As the apparatus, AffinixQ manufactured by Intium is used.

再構成ビオチン化受容体を水晶発振子上に、ストレプトアビジンを介してリガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化する。これを装置に挿入後、ＡＧＥ（例えば、糖化ＢＳＡ）との結合を測定する。水晶発振の原理を利用した機器の場合、リガンドが結合すると、重量負荷が増加するため、振動数（Ｈｚ）の減少として検出される。   The reconstituted biotinylated receptor is immobilized on a crystal oscillator through streptavidin so that the part involved in ligand recognition faces outward. After this is inserted into the apparatus, binding to AGE (eg, glycated BSA) is measured. In the case of a device using the principle of crystal oscillation, when a ligand is bound, the weight load increases, and therefore it is detected as a decrease in the frequency (Hz).

本発明のポリペプチド、ポリペプチドを含むチップを用いることによって、糖尿病血管障害についての高感度な診断方法、および、予防効果評価手法が提供される。   By using the polypeptide of the present invention and a chip containing the polypeptide, a highly sensitive diagnostic method and preventive effect evaluation method for diabetic vascular disorders are provided.

図１は、ビオチン化ＲＡＧＥの発現に使用したベクター（ｐＥＴ１６−ａｖｉＴａｇ）のクローニング部位を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a cloning site of a vector (pET16-aviTag) used for expression of biotinylated RAGE. 図２Ａおよび２Ｂは、ＲＡＧＥポリペプチドを、それぞれ、２５℃および３０℃で発現した結果である。Figures 2A and 2B are the results of expressing RAGE polypeptides at 25 ° C and 30 ° C, respectively. 図３は、ｓＲＡＧＥを用いたドットブロットの結果である。FIG. 3 shows the result of dot blot using sRAGE. 図４は、ｓＲＡＧＥをセンサーチップに固定化して製造した受容体チップを用いた結合実験の結果である。応答（ＲＵ）値の大きい順に、１２８μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌの糖化処理ＡＧＥ−ＢＳＡを用いたセンサーグラムの結果が示されている。FIG. 4 shows the results of a binding experiment using a receptor chip manufactured by immobilizing sRAGE on a sensor chip. Sensorgram results using 128 μg / ml, 64 μg / ml, 32 μg / ml, 16 μg / ml, 8 μg / ml, 4 μg / ml of glycated AGE-BSA are shown in descending order of response (RU) value. .

配列番号１ ＲＡＧＥタンパク質の細胞外領域の核酸配列
配列番号２ ＲＡＧＥタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号３ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号４ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号５ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号６ ビオチン化モチーフのアミノ酸配列
配列番号７ ビオチンリガーゼのアミノ酸配列
配列番号８ ＦａｃｔｏｒＸａの認識配列
配列番号９ エンテロキナーゼの認識配列
配列番号１０ トロンビンの認識配列
配列番号１１ ｐＥＴ１６−ａｖｉＴａｇのクローニング部位 SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence of extracellular region of RAGE protein SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of extracellular region of RAGE protein SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of biotinylated motif SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of biotinylated motif SEQ ID NO: 5 Amino acids of biotinylated motif SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of biotinylated motif SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of biotin ligase SEQ ID NO: 8 Recognition sequence of FactorXa SEQ ID NO: 9 Recognition sequence of enterokinase SEQ ID NO: 10 Recognition sequence of thrombin SEQ ID NO: 11 Cloning site of pET16-aviTag

Claims (10)

糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；および、
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
ここで、該ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼによってビオチン化される、配列番号４に記載されるアミノ酸配列であり、
ここで、該ビオチン化配列は、該レセプター由来の配列のＣ末端側に連結され、
ここで、該ポリペプチドは、以下の工程：
（１’）該ポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含有する細菌宿主細胞を提供する工程；ならびに
（２’）該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細菌宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法によって製造される、ポリペプチド。 A polypeptide comprising a receptor-derived sequence and a biotinylated sequence that is not glycosylated, wherein the polypeptide binds to AGE, wherein the receptor-derived sequence is:
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and
(B) the amino acid sequence of a polypeptide having one conservative substitution relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
Selected from the group consisting of
Here, the biotinylated sequence is an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 that is biotinylated by a biotin ligase consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7.
Here, the biotinylation sequence is linked to the C-terminal side of the receptor-derived sequence,
Here, the polypeptide comprises the following steps:
(1 ′) providing a bacterial host cell containing a gene encoding the polypeptide and a gene encoding a biotin ligase consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and (2 ′) the polypeptide and Culturing the bacterial host cell using a medium containing biotin under conditions where the biotin ligase is expressed;
A polypeptide produced by a method comprising: 前記レセプター由来の配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。 The polypeptide of claim 1, wherein the receptor-derived sequence is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞であって、ここで、該ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が：
（ｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；
（ｉｉ）グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；ならびに
（ｉｉｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するＥ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。 The bacterial host cell is a cell having a mutation in the disulfide reduction system, wherein the cell having a mutation in the disulfide reduction system is:
(I) E. deficient in thioredoxin reductase gene coli;
(Ii) E. deficient in the glutathione reductase gene. E. coli; and (iii) E. coli lacking both the thioredoxin reductase gene and the glutathione reductase gene. coli,
2. The polypeptide of claim 1 selected from the group consisting of: 糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、
該ポリペプチドは、ＡＧＥと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下：
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；および、
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に対して、１つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択され、
ここで、該ビオチン化配列は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼによってビオチン化される、配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなり、
ここで、該ビオチン化配列は、該レセプター由来の配列のＣ末端側に連結され、
ここで、該方法は、以下：
（１）該ポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程；ならびに
（２）該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。 A method of producing a polypeptide comprising a receptor-derived sequence and a biotinylated sequence that is not glycosylated, comprising:
The polypeptide binds to AGE, where the sequence from the receptor is:
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and
(B) the amino acid sequence of a polypeptide having one conservative substitution relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
Selected from the group consisting of
Here, the biotinylated sequence consists of an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 that is biotinylated by a biotin ligase consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7.
Here, the biotinylation sequence is linked to the C-terminal side of the receptor-derived sequence,
Here, the method is as follows:
(1) providing a bacterial host cell comprising a gene encoding the polypeptide and a gene encoding a biotin ligase consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and (2) the polypeptide and the biotin ligase Culturing the cells using a medium containing biotin under conditions where
Including the method. 前記ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ７プロモーターと作動可能に連結している、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the gene encoding the polypeptide is operably linked to a T7 promoter. 前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞であって、ここで、該ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が：
（ｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；
（ｉｉ）グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するＥ．ｃｏｌｉ；ならびに
（ｉｉｉ）チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するＥ．ｃｏｌｉ、
からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。 The bacterial host cell is a cell having a mutation in the disulfide reduction system, wherein the cell having a mutation in the disulfide reduction system is:
(I) E. deficient in thioredoxin reductase gene coli;
(Ii) E. deficient in the glutathione reductase gene. E. coli; and (iii) E. coli lacking both the thioredoxin reductase gene and the glutathione reductase gene. coli,
The method of claim 4, wherein the method is selected from the group consisting of: 前記細胞培養工程が１５℃〜３７℃で行われる、請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein the cell culture step is performed at 15 ° C. to 37 ° C. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドが、ビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。 A receptor chip, wherein the polypeptide according to any one of claims 1 to 3 is immobilized on a solid phase via a factor capable of specifically binding to biotin. 表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドがビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。 A solid phase via a factor capable of specifically binding biotin to the polypeptide according to any one of claims 1 to 3, which is suitable for detection by surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, or mass spectrometer. Receptor chip immobilized on. 以下の工程を包含する、受容体チップの作製方法：
（１）請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程；
（２）該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程；
（３）該培養した細胞から、該ポリペプチドを単離する工程、ならびに
（４）該単離したポリペプチドを、固相に固定化する工程
を包含する、方法。 A method for producing a receptor chip comprising the following steps:
(1) A step of providing a bacterial host cell comprising a gene encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 2 and a gene encoding a biotin ligase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. ;
(2) culturing the cells using a medium containing biotin under conditions where the polypeptide and the biotin ligase are expressed;
(3) A method comprising isolating the polypeptide from the cultured cells, and (4) immobilizing the isolated polypeptide on a solid phase.
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