KR101241534B1 - 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

식물 중의 프로안토시아니딘류를 생체내의 장관을 통한 흡수가 용이한 정도로 저분자량화 한 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조 방법을 제공하고, 수득된 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 유효 성분으로 하는 활성 산소종의 생성 등이 원인이 되는 각종 생활습관병, 뇌질병의 치료 및 예방, 노화의 예방에 유용한 건강 식품 조성물 및 의약 조성물을 제공한다.

프로안토시아니딘류, 올리고머 조성물

Description

황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물 및 이의 제조 방법{Sulfur-containing proanthocyanidin oligomer composition and production method thereof}

본 발명은 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 및 이의 조성물, 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 식물중의 프로안토시아니딘류를 생체의 장관을 통하여 흡수가 용이한 정도로 저분자량화 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조 방법, 상기 방법으로 얻어지는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 유효 성분으로 하는, 활성 산소종의 생성 등이 원인이 되는 각종 생활습관병 또는 뇌질병의 치료 및 예방에 유용한 건강 식품 조성물 및 의약품 조성물을 제공한다.

식생활의 변화에 의한 지방 섭취의 과다, 환경의 변화, 오존층의 파괴에 의한 자외선에의 노출량 증가 및 환경 오염 물질의 증가 등에 의해 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 당뇨병 및 암 등의 소위 생활습관병이 증가하고, 더욱이 알레르기 및 치매 등의 뇌질환 환자도 계속 증가하고 있다. 고령화 사회의 진전과 함께 치매 및 알츠하이머 증후군 등의 환자의 증가가 위협적인데, 이들의 원인으로 생체내에서 생성되는 활성 산소종의 관여가 지적되고 있다(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10(2002), 2497-2509). 하지만, 활성 산소종의 완전한 생성을 억제하거나 제어하는 기술은 개발되지 않았기 때문에, 현재로서는 생활습관병 및 뇌질환 등에 유효하고 확실한 예방 및 치료 기술은 충분히 확립되어 있지 않은 실정이다.

식물에 존재하여 생리활성을 나타내는 천연 물질, 특히 폴리페놀류 화합물에 최근 관심이 집중되고 있다. 폴리페놀류는 일반적으로 차, 야채, 과실 또는 허브류 등에 함유되어 있고, 식품 또는 기호품으로서 오랜 기간 동안의 섭취 경험을 통해 알 수 있는 바와 같이 부작용이 없는 치료 및 예방제로서 기대될 수 있다.

폴리페놀 화합물은 식물의 2차 대사 산물로, 식물계에 보편적이고 다량으로 존재하고 다양한 생리 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 예전에는 약학 및 식물화학 등의 분야에서, 최근에는 건강식품 분야에서 주목을 받고 있다. 예컨대, 차의 폴리페놀, 특히 카테킨류는 항균, 항바이러스, 항돌연변이, 항산화, 혈압 상승 억제, 혈중 콜레스테롤 저하, 항충치, 항알레르기, 장내 플로라(flora) 개선 및 방취 등의 광범위한 생리 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

폴리페놀 중에서도 프로안토시아니딘류는 광범위한 식물에 함유되어 있는 폴리페놀이다. 프로안토시아니딘류가 상기와 같은 다양한 생리 활성을 나타내기 위 해서는 프로안토시아니딘 화합물이 장관을 통해 생체내로 흡수되는 것이 필요하다. 하지만, 프로안토시아니딘류의 분자량은 일반적으로 수천 내지 수만 정도이다. 이와 같은 분자 크기의 물질은 장관을 통해 흡수되는 것이 곤란하고, 섭취하더라도 생체에 흡수되지 않고 이용되지 않는 경우가 많다.

본 발명자들은 메밀 종자로부터 추출한 폴리페놀이 지방대사를 개선하고 뇌 기능을 개선하는 작용을 갖는 것을 발견하여 특허출원 하였지만(일본 특개평 제 10-218786호 공보), 이의 유효 성분이 프로안토시아니딘 폴리머이고 생체 흡수 측면에서 반드시 충분하다고 말할 수는 없었다.

발명의 개시

본 발명은 장관을 통해 생체에 흡수되기 어려운 프로안토시아니딘 화합물을 흡수되기 쉬운 형태로 변형시켜, 프로안토시아니딘 화합물이 나타내는 다양한 생리 활성 효과를 충분히 발휘시킴으로써 생체의 항산화 활성을 향상시키고, 활성 산소종이 원인이 되는 생활습관병 및 뇌질환의 치료 및 예방에 유용한 의약품 또는 건강 식품 등을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 그의 추출물을 SH 기 함유 화합물과 반응시켜 얻어지는 저분자의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머가 용이하게 장관을 통해 생체에 흡수되고, 경구 섭취에 의해 각종 생리 활성을 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 의약품 및 건강 식품 조성물로서 유용한 이하의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머, 이의 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

1. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 SH기 함유 화합물과 반응시킨 반응액을 농축 및 건조하여 얻어지는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 주요성분으로 함유하는 조성물.

2. 상기 1에 있어서, 상기 올리고머가 프로안토시아니딘의 2 내지 5량체인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

3. 상기 1에 있어서, 상기 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물이 과채류, 차류, 허브ㆍ스파이스류 및 목재ㆍ수피(樹皮)류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

4. 상기 1에 있어서, 상기 SH기 함유 화합물이 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH기 함유 펩티드 및 이들의 염류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 생활습관병의 치료 및/또는 예방용의 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

6. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 노화 예방용의 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

7. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 생활습관병의 개선 및/또는 예방용의 건강 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

8. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 노화 예방용의 건강 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.

9. 상기 1의 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 SH기 함유 화합물과 반응시켜 얻은 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 성분을 분획하여 얻어지는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머.

10. 상기 9에 있어서, 상기 올리고머가 프로안토시아니딘의 2 내지 5량체인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머.

11. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 SH기 함유 화합물과 산성 조건하에서 반응시키고, 반응액을 농축 및 건조하는 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물의 제조 방법.

12. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 SH기 함유 화합물과 산성 조건하에서 반응시키고, 반응액을 농축시키고, 분획처리하는 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조 방법.

13. 상기 11 또는 12에 있어서, 상기 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물이 과채류, 차류, 허브ㆍ스파이스류 및 목재ㆍ수피류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.

14. 상기 11 또는 12에 있어서, 상기 SH기 함유 화합물이 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH기 함유 펩티드 및 이들의 염류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.

15. 상기 11 또는 12에 있어서, 무기산, 유기산 또는 이들의 혼합물을 이용하여 산성 조건으로 하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

16. 상기 15에 있어서, 염산, 황산, 질산, 아세트산, 시트르산, 아스코르브산 및 말산(malic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

17. 하기 식 (4)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

(4)

18. 하기 식 (5)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

(5)

19. 하기 식 (6)으로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

(6)

20. 하기 식 (7)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

(7)

21. 하기 식 (8)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

(8)

발명의 상세한 설명

본 발명의 황함유 올리고머는 통상, 프로안토시아니딘의 2량체 내지 5량체 정도이고, 분자량은 통상 1500 이하이다.

프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물과 SH기 함유 화합물의 반응은 산성 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 산으로서는 염산, 황산 및 질산 등의 무기산류, 또는 아세트산, 시트르산, 아스코르브산 및 말산 등의 유기산류로부터 선택된 적당한 산이 0.1N~1.0N 정도, 바람직하게는 0.5N의 농도로 사용될 수 있다.

또한 본 명세서에 사용되는 프로안토시아니딘은 카테킨 중합체를 말하고, 구체적으로는 카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 갈로카테킨, 갈로카테킨 갈레이트 및 이들을 구성 단위로 하는 화합물을 포함한다.

프로안토시아니딘류를 함유하는 식물로는 감, 배, 포도, 딸기, 바나나, 아보카도(avocado), 마운틴 크랜베리(mountain cranberry), 연근 및 메밀 등의 과채류; 녹차, 홍차 및 우롱차 등의 일반적인 차류; 허브류, 스파이스류; 목재류, 소나무 수피 등의 광범위하고 다양한 식물이 포함된다. 상기 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 및 이의 추출물(착즙, 과즙 및 야채즙을 포함)이 적합하게 이용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 SH기 함유 화합물로서는 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH-함유 펩티트 또는 이들의 염 등을 들 수 있으나, 그 외에 황을 함유하는 양파 및 마늘 등의 천연물도 들 수 있다. 메르캅탄류도 사용 가능하지만, 본 발명의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머가 식품 또는 의약품 조성물에 사용되는 점을 고려하면, SH기 함유 화합물로서는 식품 또는 의약품에 사용이 허가된 물질이 바람직하다.

프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 그 추출물과 SH기 함유 화합물의 반응은 실온~80℃, 바람직하게는 40~60℃에서 수시간 내지 1주간, 바람직하게는 24~48시간 수행된다.

반응 용매로는 물, 메탄올 및 에탄올 등의 1종류 또는 2종류 이상의 혼합물이 사용될 수 있지만, 식품 또는 의약품 등의 용도를 고려한다면, 물 또는 에탄올이 바람직하다.

반응후는 잔사를 여과하고, 여과액을 농축한 후, 통상적인 방법에 의해 정제한다.

즉, 농축액의 정제는 추출 엑기스를 막처리(한외 여과 또는 역침투 등)하거나 흡착제로 처리하는 것에 의해 수행할 수 있다. 흡착제로서는 스티렌-디비닐벤젠계 흡착제, 메타크릴산 흡착제, 친수성 비닐폴리머, 변형 덱스트란 겔, 폴리아크릴아미드겔, 역상 실리카겔 또는 이온 교환 수지 등이 사용될 수 있다. 상기 흡착제를 사용하는 경우에는 여기에 흡착하는 분획(이하, '흡착 분획'이라 함)에는 SH기 함유 화합물로 반응하여 저분자량화한 폴리페놀 화합물(황함유 프로안토시아니 딘 올리고머)이 함유되어 있다. 상기 흡착 분획을 하이드로알콜, 알콜 또는 아세톤 등으로 용출시켜 각 분자량의 성분을 얻을 수 있다.

상기와 같은 과정을 수행하여 얻은 황함유 프로안토시아니딘 올리고머는 순상 HPLC 및 NMR 측정치로부터, 하기 일반식 (9)로 표시된 프로안토시아니딘의 2량체 내지 5량체인 것이 확인된다.

(9)

상기 식에서, n은 0 또는 1~3의 정수이고, R¹은 수소 원자 또는 하기 식

으로 표시되는 갈로일(galloyl)기를 나타내고, R² 및 R³는 각각 독립하여 수 소 원자 또는 수산기를 나타내고, R⁴는 시스테인, 시스틴, 글루타티온 또는 SH기 함유 펩티드 잔기를 나타낸다.

황함유 프로안토시아니딘 올리고머는 분자량 1500 이하의 저분자이기 때문에 장관을 통하여 생체에 용이하게 흡수되고, 후술하는 시험예에서 나타낸 바와 같이, 강한 DPPH 라디칼 소거 작용, SOD 유사 활성 증가 작용, P450 지질 과산화 억제 작용, FNT 산화 스트레스에 대한 보호 작용, β-아밀로이드에 유도된 산화적 세포사에 대한 신경 세포 보호 작용 및 스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병에 대한 예방 작용 등을 나타내고, 기타 폴리페놀 소재와 비교하여 높은 항산화능을 갖는다. 또 인간에 대한 항산화 지표의 모니터 시험에서 항산화 효과에 기초하여 판단된 데이터도 얻어진다.

따라서, 본 발명의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 유효 성분으로 하는 조성물은 생체의 과산화 지질 생성 억제 작용을 가질 뿐만 아니라, 활성 산소에 의해 발생하는 산화장애에 기인하는 질병에 효과를 갖기 때문에, 과산화 지질 또는 활성 산소 생성에 기인하는 각종 장기 장애 및 노화 방지 효과를 갖고, 그에 의해 각종 질병의 치료 및 방지에 유용하다. 또 뇌의 노화가 원인으로 추정되는 치매 등의 뇌기능 장애의 억제, 방지 및 치료에도 유효하다고 생각된다. 동시에 뇌기능의 개선에 의해, 학습 기능의 향상, 초조감의 감소, 불면증 해소 또는 안정 회복 등의 효과도 기대된다. 이 때문에, 본 발명의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 유효 성분으로 하는 조성물은 의약 조성물 및 건강 식품 조성물로서 이용하는 것이 가능하다.

본 발명의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 유효성분으로 하는 조성물은 독성은 전혀 나타내지 않으므로 충분히 안전하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구로 사용될 수 있지만, 경구적으로 사용되는 경우의 투여량은 연령, 체중, 증상, 목적으로 하는 치료 효과 및 투여 방법 등에 의해 상이하지만, 통상 성인 1인당 1회에 100 내지 2000mg의 범위이다. 본 발명 조성물을 경구 투여할 때에는 일반적으로 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 과립제 또는 시럽제 등으로, 비경구 투여할 때에는 주사제 또는 도포제로서 사용될 수 있다. 과립화, 정제화 또는 시럽제화할 때에는 필요에 따라 적당한 보조 물질(전분류, 덱스트린, 감미제류, 색소 또는 향료 등)을 사용하는 것도 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 의한 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물(분획 전의 분말: 물질 1) 및 이의 원료(포도씨 폴리페놀 추출물: 비교 물질 1)를 투여한 마우스의 혈청 중의 LPO 농도를 나타내는 그래프이고, (A)는 저용량 투여군, (B)는 고용량 투여군에 관한 결과를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 실시예 1에 의한 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성 물(물질 1) 및 이의 원료(비교 물질 1)를 투여한 마우스의 간장(A), 신장(B) 및 뇌(C) 중의 LPO 농도를 나타내는 그래프이다.

도 3A는 LPO 농도 초기치 정상자, 도 3B는 LPO 농도 초기치 이상자에 관하여, 각각 실시예 1의 본 발명 조성물(물질 1) 및 실시예 1의 원료(비교 물질 1)를 투여한 인간의 혈청 중의 LPO 농도를 나타낸다.

도 4A는 SOD 농도 초기치 정상자, 도 4B는 SOD 농도 초기치 이상자에 관하여, 각각 실시예 1의 본 발명 조성물(물질 1) 및 실시예 1의 원료(비교 물질 1)를 투여한 인간의 혈청 중의 SOD 활성 농도를 나타낸다.

도 5는 실시예 1에 있어서 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 β-아밀로이드에 의한 PC-12 세포사에 대한 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 6A 및 도 6B는 실시예 1에 있어서 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 β-아밀로이드에 의한 미토콘드리아 막전위의 저하에 대한 억제 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.

도 7A 및 도 7B는 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 β-아밀로이드에 의한 PC-12 세포내에의 활성 산소종 축적에 대한 감소 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.

도 8은 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 세포내 항산화 활성 효과를 나타내는 그래프이다.

도 9는 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 β-아밀로이드에 의한 세포막 과산화 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 공복시 혈당치의 저감 효과를 나타내는 그래프이다.

도 11은 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 뇨중 당 수치의 저감 효과를 나타내는 그래프이다.

도 12는 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 뇨중 단백질 수치의 저감 효과를 나타내는 그래프이다.

도 13은 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 혈중 PLO 수치의 저감 효과를 나타내는 그래프이다.

도 14는 본 발명 물질 1 및 비교 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 혈중 TEAC 수치(항산화능)의 상승 효과를 나타내는 그래프이다.

도 15는 본 발명 물질 1의 브롬산칼륨-유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 혈중 폴리페놀 농도의 상승 효과를 나타내는 그래프이다.

도 16은 본 발명 물질 1의 브롬산칼륨-유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 혈중 항산화능(TEAC)의 상승 효과를 나타내는 그래프이다.

도 17은 본 발명 물질 1의 브롬산칼륨-유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 혈중 과산화 지방 농도의 상승 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 18은 본 발명 물질 1의 브롬산칼륨-유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 혈중 요소질소 농도의 상승 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

도 19는 본 발명 물질 1의 브롬산칼륨-유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 혈중 크레아티닌 농도의 상승 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물의 실시예 및 시험예를 들어 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 범위내로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

포도씨 유래 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조

(1) 포도씨 폴리페놀의 추출

건조 포도씨 8kg을 80% 메탄올(30L)로 실온에서 3일간 추출하고, 잔사를 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 얻은 농축액을 하기조건에 의해 정제하였다.

[정제조건]

전량을 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조) 200 mmΦ×30cm(약 25L)에 충진하고, 100L의 물로 세정하였다. 메탄올 50L로 용출시킨 것을 감압농축하고, 동결건조하여 456g의 분말상 조성물을 회수하였다.

(2) 시스테인과의 저분자화 반응

상기(1)의 방법으로 얻은 포도씨 폴리페놀 400g, L-시스테인(와코순수화학공업(주) 제조) 400g, 아스코르브산(준세 화학(주) 제조) 4g, 시트르산(와코순수화학공업(주) 제조) 0.8kg 및 물 4L를 혼합하여, 40℃에서 48시간 반응시켰다. 그 후 반응액을 직경 200 mm, 높이 800 mm의 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조)을 담체로서 충진한 칼럼(용량 약 25L)에 충진하고, 100L의 물로 비흡착분획을 세정하였다. 이후, 40% 에탄올 50L로 용출한 분획을 회수하고, 감압농축하고, 동결건조하여, 물, 메탄올 및 에탄올에 쉽게 용해되는 적갈색 분말(수량 408g)을 얻었다. 이 분말을 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20; 파마시아(주) 제조)을 담체로서 충진한 칼럼(직경 50 mm, 높이 500 mm, 용적 약 1L)에 의해, 에탄올-물 혼합액으로 분획하고, 분획물의 올리고머 조성을 노나까 등(Nonaka et al.)의 방법(Chem. Pharm. Bull., 34(2), 633-642 (1986))에 의해 분석한 결과, 조성은 하기와 같았다.

시스테인 결합 에피카테킨 단량체 분획 19%

시스테인 결합 에피카테킨 2량체 분획 21%

시스테인 결합 에피카테킨 3량체 분획 11%

시스테인 결합 에피카테킨 4~6량체 분획 16%

(3) 시스테인 결합 에피카테킨 단량체

얻어진 시스테인 결합 에피카테킨 단량체 분획을 닌히드린-아세트산 시액의 분무 가열에 의해 적갈색을 띄는 스팟을 대상으로 세파덱스 LH-20 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피(물-메탄올-아세톤)에 의해 정제하여, 하기 (1)~(3)식으로 표시 되는 화합물(이하 '화합물 1~3'으로 약칭하는 경우가 있음)을 분리하였다.

(1)

(2)

(3)

식 (1)의 화합물(화합물 1)은 HR-FAB-MS(High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy: 고분해능 고속 원자 충돌법 질량 스펙트로스코피)의 측정으로 분자 이온 피크[M+H]⁺(m/z) 410.0925를 나타내고, 분자식 C₁₈H₂₀O₈NS에 상당하는 계산치 410.0910과 3.6ppm(10ppm 이내)의 오차로 일치했다. 따라서, 화합물 1은 분자식 C₁₈H₁₉O₈NS를 갖는 것으로 추정되고, 카테킨 또는 에피카테킨에 L-시스테인의 황 원자가 결합한 화학 구조로 생각된다. 또한, 화합물 1의 ¹H-NMR(수소핵자기공명 스펙트럼, 표 1 참조) 측정에 있어서, 카테킨 또는 에피카테킨에 공통하는 방향 환상의 5개의 프로톤 시그널 외에, 산소 원자 또는 황 원자를 기저부에 갖는 시그널군이 δ5.09(br.s), δ4.07(m) 및 δ3.86(d, J=2Hz)에 각각 프로톤 1개가 관찰되었다. 전자는 에피카테킨의 입체 배치를 갖는 것을 시사하고 있다. δ3.86(d, J=2Hz)의 프로톤 시그널은 4α 배치에 할당되고, 황 원자는 4β에 배치하는 티올리시스(thiolysis) 생성물의 시그널에 상당한다. 그 외, δ4.13(1H, dd, J=9,4Hz), δ2.95(1H, dd, J=15,9Hz) 및 δ3.43(1H, dd, J=15,4Hz)에 ABX형의 시그널군이 확인되고, 시스테인의 메틴기에 메틸렌기가 인접하는 부분 구조를 시사하고 있다. 상기 정보에 기초하여, 화합물 1의 화학 구조를 식 (1)로 표시되는 4β-(S-L-시스테이닐)-(-)-에피카테킨으로 추정하였다. 화합물 1의 ¹³C-NMR(탄소-13 핵자기 공명 스펙트럼, 표 2 참조)(DEPT법)에 있어서 확인된 각 탄소 급수를 포함하여 18개의 탄소 시그널도 이 구조를 지지하였다.

식 (2)의 화합물(화합물 2)의 ¹H-NMR(표 1 참조)에 있어서 산소 원자 또는 황 원자를 기저부에 갖는 시그널군이 δ4.86(1H, d, J=9,6Hz), δ4.22(1H, dd, J=9.6, 4.3Hz) 및 δ4.23(1H, d, J=4.3Hz)에 각각 프로톤 1개씩으로 확인되었다. 상기 δ4.86(1H, d, J=9,6Hz), δ4.22(1H, dd, J=9.6, 4.3Hz) 및 δ4.23(1H, d, J=4.3Hz)은 각각 카테킨의 2β, 3β 및 4α 배치에 할당되며, 황 원자가 4β에 배치하는 티올리시스(thiolysis) 생성물의 시그널에 상당한다. 따라서, 화합물 1과 화합물 2는 3 위치의 입체 배치만이 상이한 것으로 생각되고, 화합물 2의 화학 구조를 식 (2)로 표시되는 4β-(S-L-시스테이닐)-(+)-에피카테킨으로 추정하였다.

식 (3)의 화합물(화합물 3)은 HR-FAB-MS의 측정으로 분자 이온 피크[M+H]⁺(m/z) 426.0844를 나타내고, 화합물 1보다도 산소 원자가 1개 많은 분자식 C₁₈H₂₀O₉NS에 상당하는 계산치 426.0859와 3.5 ppm의 오차로 일치하였다. 또한, ¹H-NMR(표 1 참조)의 측정으로 방향 환 영역의 δ6.57(2H, s)에 2' 및 6' 위치의 수소가 등가 시그널로서 확인된 것 외에는 화합물 1과 대응 및 유사하였다. 표 2에 표시된 ¹³C-NMR의 시그널을 함께 고려하면, 화합물 3의 구조를 식 (3)으로 표시되는 4β-(S-L-시스테이닐)-(-)-에피갈로카테킨으로 추정하였다.

<표 1>

화합물 1, 2 및 3의 ¹H-NMR 시그널 할당(δ in ppm)

주) 화합물 1은 아세톤-d₆-D₂O, 화합물 2 및 3은 CD₃OD 중에서 각각 측정하였다.

<표 2>

화합물 1 및 3의 ¹³C-NMR 시그널 할당(δ in ppm)

주 1) 화합물 1은 아세톤-d₆-D₂O, 화합물 3은 CD₃OD 중에서 각각 측정하였다.

주 2) 오른쪽에 a), b)가 붙어 있는 칼럼 내 수치는 상호교환가능하다.

(4) 시스테인 결합 에피카테킨 2량체

시스테인 결합 에피카테킨 2량체 분획 분말을 동일한 방법으로 정제하여 하기 식 (4)로 표시되는 화합물(이하, 화합물 4로 약칭하는 경우가 있음)을 분리하였 다.

(4)

화합물 4는 FAB-MS의 측정에서 분자 이온 피크 [M+H]⁺(m/z) 698을 나타냈고, 화합물 1 보다 카테킨 유니트가 1개 많은 구조로 생각되었다. TLC 및 HPLC에 있어서 각각 단일 거동을 나타내었음에도 불구하고, 화합물 4의 ¹H-NMR은 넓은 시그널군에 날카로운 시그널이 혼재해 있는 스펙트럼을 나타내었다. 이 특징적인 ¹H-NMR 시그널 분포로부터 축합 결합 위치는 4→6 또는 4→8 중에서, 강한 회전 장해가 발생하는 후자라고 생각되었다. 4→8 결합에 직결하는 각 벤조피란 유래 시그널군은 광범위하게 변형되어 확인되었다. 즉, δ 4.22, δ 4.54 및 δ 4.96(각 1H, br. m, 각각 C-3, -4, -2)은 상단 유니트에, 보다 날카로운 δ 3.83, δ 3.90(각 1H, s, 각각 C-4', -3') 및 δ 5.20(1H, br. m, C-2')은 황 원자와 결합하여 있는 유니트(하단)에 각각 할당되었다. 분자 모형에 의한 고찰로부터도 하단 유니트는 상단에 비해 회전 장해를 회피하고 있음을 짐작할 수 있었다. δ 5.92의 방향 환 영역에는 C-6, -8, -6'에 할당된 프로톤 3개분의 시그널이 인벨롭(envelope)으로 확인되었다. δ 6.60으로부터 δ 7.09에 걸쳐 양 유니트 B환 상의 프로톤 군이 확인되고, 그 중 결합 정수 8.3Hz의 시그널인 더블렛(doublet) 시그널은 회전 장해를 회피하고 있는 하단 유니트의 5 위치에 할당된 것으로 생각되었다. 나머지 시그널 δ 2.95, δ 3.44(각 1H, br.m, cys-C-3) 및 δ 4.14(1H, dd, J=9,4Hz, cys-C-2)은 각각 시스테인 잔기 유래라고 추정되었다. 화합물 4의 ¹³C-NMR(표 3 참조)은 화합물 1에 상당하는 시그널군이 확인되고, 식 (4)에 표시된 화합물 4의 구조를 지지하고 있다. 따라서, 화합물 4의 구조를 4β-(S-L-시스테이닐)-(-)-에피카테킨-(4β→8)-(-)-에피카테킨으로 추정하였다.

<표 3>

화합물 4의 ¹³C-NMR 시그널 할당(δ in ppm)

주 1) 각 시료는 아세톤-d₆-D₂O 중에서 측정하였다.

주 2) 우측에 a), b) 및 c)가 붙어 있는 화학 쉬프트값은 각각 상호교환 가능하다.

(5) 시스테인 결합 에피카테킨 3량체

시스테인 결합 에피카테킨 단량체 분획 분말 을 동일한 방법으로 정제하여 하기 식 (5)로 표시되는 화합물(이하, '화합물 5'라고 약칭하는 경우가 있음)을 분리하였다.

(5)

화합물 5는 HR-ESI-MS의 측정에서 분자 이온 피크 [M-H]⁺(m/z) 984.1956을 나타냈고, 분자식 C₄₈H₄₂O₂₀NS에 상당하는 계산치 984.2011과 5.5 ppm의 오차로 일치하였다. 따라서, 화합물 5는 분자식 C₄₈H₄₃O₂₀NS을 갖는 것으로 추정되고, 카테킨 또는 에피카테킨으로 구성되는 3분자 축합체에 L-시스테인이 결합한 화학 구조라고 생각되었다. 또한, 화합물 5의 ¹H-NMR 시그널은 전체로서 광범위하고, 3 유니트는 모두 4→8 결합에 직쇄상으로 결합, L-시스테인이 하단 유니트에 결합해 있는 것이 시사되었다. 방향 환 상의 시그널로서 δ 5.98에 확인된 싱글렛(singlet)으로부터 A환-6-H, -8-H, A'환6-H, A"환-6-H로 할당되었다. 보다 저자장(低磁場)에 확인된 시그널군(δ 6.04, s; δ 6.91, 7.01, s; δ 7.11, s)은 높이비가 약 3:2:1:3이고, B환-, B'-환-, B"환 상의 2-H 유래 시그널에 할당되고, δ 6.91 및 δ 7.01(2:1)의 시그널은 중간에 위치하는 B'-2-H가 가장 회전 장해를 받고 있기 때문에 분열이 나타났다고 생각되었다. 상기 정보에 기초하여, 화합물 5의 평면 구조를 잠정적으로 식 (5)라고 추정하였다.

실시예 2

포도씨 유래 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조

실시예 1과 동일한 원료 및 조건으로 포도씨 폴리페놀을 추출하고, 실시예 1과 동일한 조건으로 정제하였다. 이 정제물을 이하의 조건으로 글루타티온과 반응시켜 저분자화하였다.

즉, 수득된 포도씨 폴리페놀 1.0g, 글루타티온(와코순수화학공업(주) 제조) 3.0g, 아스코르브산(준세 화학(주) 제조) 0.5g 및 1N 염산 50.0㎖을 혼합하고, 40℃에서 48시간 반응시켰다. 이 반응액을 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조), MCI겔 CHP-20(미쯔비시 화학(주) 제조) 및 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20; 파마시아(주) 제조) 등에 의해 정제하고, 감압농축하고, 동결건조하여 적갈색 분말을 수득하였다(수량 120 mg).

1) 글루타티온 결합 모노머

얻어진 적갈색 분말을 폴리스티렌겔, 세파덱스 LH-20 겔 및 ODS 계 실리카겔을 담체로 하고, 물 및 메탄올의 혼합액을 이동상으로 한 칼럼 크로마토그래피를 반복하고 정제하여 식 (6)으로 표시되는 화합물(화합물 6)을 얻었다.

(6)

화합물 6은 HR-ESI-MS(High Resolution Electro-Spray Ionization Mass Spectroscopy:고분해능 엘렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트로스코피)의 측정에서 분자 이온 피크 [M+H]⁺(m/z) 596.1550을 나타내었고, 분자식 C₂₅H₃₀O₁₂N₃S에 상당하는 계산치 596.1551과 0.17ppm의 오차로 일치하였다. 따라서, 화합물 6은 카테킨 또는 에피카테킨에 글루타티온의 L-시스테인 유래 황 원자가 결합한 화학 구조라고 생각되었다. 화합물 6의 ¹H-NMR에 있어서, 카테킨 또는 에피카테킨에 공통하는 방향 환상의 5개의 프로톤 시그널군(δ5.84, 5.96, 6.91(각 1H, 각각 8-, 6-, 2'-H); δ6.73-6.78(2H, m, 5'-, 6'-H)) 외에, 산소 원자 또는 황 원자를 기저부에 갖는 시그널군이 δ3.90, 3.91, 5.15(각 1H, 각각 3-, 4-, 5-H)로 확인되고, 화합물과 1과 동일하게 에피카테킨의 4 위치에 황 원자가 4β에 배치하는 구조라고 유추되었다. 그외, 시스테인 부분(δ3.63(1H, br.t, J=9,4Hz, cys-2-H), 3.72, 3.80(각 1H, d, J=17.6Hz, cys-3-H₂)), 글루탐산 부분(δ1.72(2H, m, glu-4-H₂), 1.78(2H, m, glu-3-H₂), 3.05(1H, br.d, J=5.4Hz, glu-2-H) 및 글리신 부분(δ3.20(2H, s, gly-2-H₂)에 상당하는 시그널군이 확인되었다. 이 구조는 화합물 6의 ¹³C-NMR(표 4 참조)의 측정에 있어서 25개의 탄소 시그널이 관측되는 것으로부터도 지지되었다.

따라서, 화합물 6의 구조를 글루타티온 분자의 시스테인 부분에 유래하는 황 원자가 에피카테킨의 4β에 결합한 식 (6)으로 표시되는 4β-(글루타티오닐)-(-)-에피카테킨으로 추정하였다.

<표 4>

화합물 6의 ¹³C-NMR 시그널 할당(δ in ppm)

주 1) 시료는 CD₃OD에 용해하여 측정하였다.

주 2) 우측에 *가 붙어 있는 화학 쉬프트값은 각각 상호교환 가능하다.

실시예 3

소나무 수피 유래 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조

(1) 소나무 수피 폴리페놀의 추출

분비나무(Abies sachalinensis) 수피 400g을 80% 메탄올 1.5L로 실온에서 3일간 추출하고, 잔사를 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 수득한 농축액을 하기 조건에 의해 정제하였다.

[정제조건]

농축액 전량을 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조) 50 mmΦ×30cm(약 600㎖)에 충진하고, 2500㎖의 물로 세정하였다. 그 후 메탄올 1200㎖로 용출하고, 용출물을 회수하여 감압농축하고, 동결건조하여 18.4g의 분말상 조성물을 회수하였다.

(2) 시스테인과의 저분자화 반응

상기(1)의 방법으로 얻은 소나무 수피 폴리페놀 1.0g, L-시스테인(와코순수화학공업(주) 제조) 1.7g, 아스코르브산(준세 화학(주) 제조) 0.25g 및 1N-염산 20.0㎖을 혼합하고, 40℃에서 48시간 반응시켰다. 그 후 반응액을 직경 25mm, 높이 150mm의 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조)을 담체로 충진한 칼럼(용적 약 100㎖)에 충진하고, 400㎖의 물로 비흡착분획을 세정하였다. 그 후, 메탄올 400㎖로 용출한 분획을 회수하고, 감압농축하고, 동결건조하여 적갈색 분말(수량 0.95g)을 수득하였다.

프로안토시아니딘은 시험관내(in vitro)에서는 강한 항산화 활성을 나타내지만, 경구적 섭취를 통한 생체내(in vivo)에서 충분한 효과를 발휘하지 않는다. 그 이유는 고분자의 프로안토시아니딘은 장관에서 흡수되기 어렵기 때문이라고 생각된다. 이에 대하여, 본 발명의 SH기 함유 물질에 의해 저분자화한 황함유 프로안토시아니딘 올리고머는 시험관내(in vitro)에서는 고분자의 프로안토시아니딘과 동일한 정도의 항산화 활성을 나타내고, 생체내(in vivo)에서도 고분자의 프로안토시아니딘 보다 우수한 항산화 활성을 나타낸다.

실시예 4

소귀나무(Myrica rubra) 유래 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조

(1) 소귀나무 폴리페놀의 추출

소귀나무 수피(양매피;bayberry) 400g을 80% 메탄올 1.5L로 실온에서 3일간 추출하고, 잔사를 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 농축액을 수득하고, 하기조건에서 정제하였다.

[정제조건]

농축액 전량을 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조) 50 mmΦ×30cm(약 600㎖)에 충진하고, 2500㎖의 물로 비흡착분획을 세정하였다. 그 후 메탄올 1200㎖로 용출하고, 용출물을 회수하여 감압농축하고, 동결건조하여 38.0g의 분말상 조성물을 회수하였다.

(2) 시스테인과의 저분자화 반응

상기 (1)의 방법으로 수득한 소귀나무 폴리페놀 1.0g, L-시스테인(와코순수화학공업(주) 제조) 1.7g, 아스코르브산(준세 화학(주) 제조) 0.25g 및 1N-염산 20.0㎖을 혼합하고, 40℃에서 48시간 반응시켰다. 그 후 반응액을 디아이온 HP-20(DIAION HP-20; 미쯔비시 화학(주) 제조) 25mmΦ×150mm(약 100㎖)에 충진하고, 400㎖의 물로 비흡착분획을 세정하였다. 그 후, 메탄올 400㎖로 용출하고, 용출물을 회수하여 감압농축하고, 동결건조하여 적갈색 분말 0.95g을 수득하였다.

(3) 양매피(bayberry bark) 폴리페놀과 L-시스테인의 결합체에 관하여

1) L-시스테인 결합 에피갈로카테킨 갈레이트 단량체(epigallocatechin gallate monomer)

상기 (2)에서 수득한 적갈색 분말을 폴리스티렌겔, 세파덱스 LH-20 겔 및 ODS 계 실리카겔을 담체로하고, 물, 메탄올 및 아세톤을 적정비로 혼합한 혼합액을 이동상으로 한 칼럼 크로마토그래피에 반복하여 정제하여, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 갈레이트, (4β→8)에피갈로카테킨 갈레이트, 상기 화합물3 및 이하의 식(7)과 (8)로 표시되는 화합물(화합물 7 및 화합물 8)을 분리하였다.

(7)

(8)

화합물 7은 ESI-MS 측정시 분자 이온 피크 [M-H]⁺(m/z) 575를 나타내었다. 또한, ¹H-NMR(표 5 참조) 측정 결과 화합물 1 및 화합물 3과 유사하였다. 그러나 약 1.3ppm 저자장 쉬프트된 3-βH(1H, 5.29, s), 방향족 영역의 A환 상에서 6, 8 위치, 6.68과 6.96에 각 프로톤 2개분의 날카로운 2세트의 날카로운 등가 단일선 시그날(1, 3, 4, 5 치환 벤젠상의 2와 6 위치의 수소 유래)이 관찰되었다. 이러한 시그날은 화합물 7이 에피갈로카테킨의 갈레이트인 것을 시사하는 것이다.

이러한 정보와 표 6에 표시된 ¹³C-NMR 시그날군의 할당을 함께 고려하여, 화 합물 7의 구조는 식(7)로 표시된 4β-(S-L-시스테이닐)-(-)-에피카테킨 갈레이트로 추정되었다.

2) L-시스테인 결합 에피갈로카테킨 갈레이트 2량체

화합물 8은 HR-ESI-MS 측정시 분자 이온 피크 [M-H]⁺(m/z)1032.1517을 나타내었고, 분자식 C₂₅H₃₀O₁₂N₃S에 상당하는 계산치 1032.1503과 1.4ppm의 오차로 일치하였다. 따라서, 화합물 7보다 에피카테킨 갈레이트 유니트가 1개 더 많은 구조로 생각되었다. 화합물 8의 ¹H-NMR은 화합물 4와 같은 넓은 시그날군에 날카로운 시그날이 혼재해 있는 스펙트럼을 나타내었고, 4→8축합형으로 여겨진다. ¹H 및 ¹³C-NMR의 시그날군은 화합물 4와 유사하게 할당되어 (각각 표 5 및 6), 화합물 8의 구조는 식(8)로 표시된 4β-(S-L-시스테이닐)-(-)-에피카테킨 갈레이트-(4β→8)-(-)-에피카테킨 갈레이트로 추정되었다.

<표 5>

화합물 7 및 8의 ¹H-NMR 시그날 할당(δ in ppm)

주)화합물 7은 25℃, 화합물 8은 40℃ 아세톤-d₆-D₂O 중에서 각각 측정하였다.

<표 6>

화합물 7 및 8의 ¹³C-NMR 시그날 할당(δ in ppm)

주 1) 화합물 1은 아세톤-d₆-D₂O, 화합물 3은 CD₃OD중에서 각각 측정하였다.

주 2) a) 및 b)가 우측에 있는 화학 쉬프트값은 각각 상호교환적이다.

시험예 1

DPPH 라디칼 소거작용

실시예 1의 분획전의 분말(물질 1), 물질 1을 분획하여 얻은 단량체 분획(물질 2), 물질 1을 분획하여 얻은 2량체 및 3량체분획(물질 3), 물질 1을 분획하여 얻은 4 ~ 6량체분획(물질 4), 실시예 1의 원료(포도씨 폴리페놀 추출물)(비교물질 1) 및 시판 카테킨(와코순수화학공업(주) 제조)(비교물질 2)에 대하여, 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH)라디칼 소거작용을 아래의 방법으로 측정하였다.

96웰-마이크로플레이트에 100㎕의 DPPH용액(60μM 에탄올 용액)을 넣고, 시험시료의 에탄올 용액 100㎕ 또는 대조군으로서의 에탄올 100 ㎕을 각각 가하고, 조용히 혼합하여 실온에서 30분간 방치하였다. 그 후 520 nm에서 흡광도를 측정하고, DPPH 라디칼 소거능을 하기 식에 의하여 산출하였다. 단계적으로 희석한 시험시료의 DPPH 라디칼 소거능과 농도로부터 50% 유효농도(EC₅₀)을 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = [(1-시험시료의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100

각 시료의 단계적인 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능으로부터 50% 유효농도(EC₅₀)를 산출하고 그 결과를 표 7에 나타내었다.

저농도에서는 물질 4가 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 다른 시료는 비슷한 활성을 나타내었다. 고농도에서는 각 시료는 높은 활성을 나타내었다.

<표 7>

DPPH 라디칼 소거에 있어서의 EC50(㎍/㎖)
물질 1	1.62
물질 2	2.78
물질 3	1.45
물질 4	0.77
비교물질 1	1.55
비교물질 2	1.71

시험예 2

활성산소소거효소(Superoxide dismutase; SOD)-유사 활성

시험예 1에서 사용된 것과 동일한 물질 1~4 및 비교물질 1~2에 대하여 혈중 SOD활성 측정키트(SOD 테스트 와코: 와코 순수화학공업(주) 제조)를 이용하여 SOD-유사 활성(SOD-like activity)을 측정하였다. 하기식에 의하여 SOD-유사 활성을 산출하고, 시험 시료의 농도와의 관계로부터 50% 유효농도(EC₅₀)을 산출하였다.

SOD-유사 활성(%) = [(1-시험시료의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100

각 시료의 단계적인 농도에서의 SOD-유사 활성으로부터 50% 유효농도(EC₅₀)를 산출하고 그 결과를 표 8에 나타내었다. 물질 2~4의 각 분획물은 비교물질 1~2에 비하여 높은 SOD-유사 활성을 나타내었다.

<표 8>

SOD-유사 활성에 있어서의 EC50(㎍/㎖)
물질 1	69.7
물질 2	84.8
물질 3	74.6
물질 4	75.5
비교물질 1	70.9
비교물질 2	62.0

시험예 3

아급성 FeNTA유도 다장기장애 모델에 대한 효과

생체에 투여하면 대량의 활성산소를 발생하여 다장기장애(multi organ failure)를 유발하는 생체내(in vivo) 산화 모델로 알려져 있는 FeNTA(질산 철(Fe(NO₃)₃)과 소듐 니트릴로트리아세테이트(NTA₃Na)의 혼합물)을 이용하여 시험하였다.

즉, 질산철 9수화물(관동화학(주) 제조) 240mg을 40㎖의 냉수에 용해한 것과, 소듐 니트릴로트리아세테이트(NTA₃Na) 수화물 390mg을 40㎖의 냉수에 용해한 것을 얼음 냉각하에서 혼합하고, 1N 염산으로 pH를 7.5로 조정하고, 총 부피를 100㎖ 로 맞추어 FeNTA 용액을 제조하였다. 제조 후 10분 이내에 Fe 기준으로 체중 킬로그람당 22.5mg의 FeNTA용액을 수컷 ddY계 마우스 7주령(평균 체중 30g)에 이틀에 한번씩 복강내 주사하였다. 물질 1 및 비교물질 1은 각각 체중 킬로그람당 25mg(저용량 투여군) 또는 50mg(고용량 투여군)을 매일 강제 경구투여하였다. 대조군으로서 수돗물을 투여하였다. 여기에서 FeNTA 용액을 투여하지 않은 것을 음성대조군으로 FeNTA 용액을 투여한 것을 양성대조군으로 하였다. 음료수 및 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 투여개시로부터 7, 14, 21, 28일째 되는 날 채혈하고, 혈청 중 과산화지질(LPO)농도를 측정하였다. 투여개시로부터 28일째 되는 날 해부하여, 간장, 신장 및 뇌를 적출하고, 각 장기의 세포파쇄액(homogenate)내 LPO 농도를 측정하였다.

[시험결과]

(1) 혈청내의 LPO 농도를 도 1(A) 및 도 1(B)에 도시하였다. 저용량 투여군에서는 물질 1의 21일째 혈청 LPO 농도가 비교물질 1 및 양성대조군에 대하여 유의적으로 저하하였다(도 1(A)). 고용량 투여군에서도 물질 1의 혈청 LPO 농도는 투여개시로부터 21일째 이후에 유의적으로 저하하였다(도 1(B)). 비교물질 1도 21일째에 낮은 수치를 나타내었지만, 본 발명의 물질쪽이 더 높은 효과를 나타내었다.

(2) 각 장기 중의 LPO 농도

간장, 신장 및 뇌내의 LPO농도를 도 2(A) ~ (C)에 나타내었다.

간장에서는 FeNTA의 투여에 의하여 LPO 농도가 유의적으로 상승되지 않았으며, 각 투여군에서도 변화가 관찰되지 않았다. 신장과 뇌에서는 FeNTA의 투여에 의하여 세포파쇄액 내의 LPO농도가 상승하였다. 물질 1 및 비교물질 1의 투여로 LPO 농도가 저하하였다. 신장, 뇌에서도, 물질 1 고용량 투여군에서 최저치를 나타내었다. 특히 뇌에서는 비교물질 1 투여군도 낮은 수치를 나타내었지만, 물질 1 고용량 투여군이 다른 군에 비하여 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다.

[결과의 요약]

FeNTA의 투여는 혈청내의 LPO농도를 상승시켰다. 물질 1은 비교물질 1에 비하여, 저용량으로 또한 단기간에 효과를 발휘하였다. 이는 물질 1이 저분자화에 의하여 경구 섭취될 때 장관으로부터 용이하게 흡수되고, 그로 인하여 저용량으로 또한 단기간에 효과를 발휘하게 되는 것으로 사료되었다. 특히, 물질 1은 신장 및 뇌에서 강력한 항산화활성을 나타냄을 명백하게 알게되었다.

시험예 4

인간에 대한 모니터 시험

[시험방법]

건강한 남녀 34명(평균 연령 41.2세, 남성 21명, 여성 13명)을 표 9에 표시된대로 2 그룹으로 분류하고, 물질 1 및 비교물질 1 각각을 500mg/일의 용량으로 28일간 투여하였다. 투여 개시전과 투여 28일후에 채혈하고 혈청내 LPO 농도, SOD-유사 활성을 측정하였다.

<표 9>

투여군	평균연령	남녀비	LPO 초기치ㆍ고	SOD초기치ㆍ저
물질 1	41.9세	남 10 여 7	7인	7인
비교물질 1	40.5세	남 11 여 6	11인	8인

[결과]

투여 전후 LPO 농도 및 SOD-유사 활성을 도 3 및 도 4에 도시하였다. 도 3(A)는 정상 초기치를 나타내는 사람에 관한 LPO 농도를 나타낸 것이고, 도 3(B)는 이상 초기치를 나타내는 사람의 LPO 농도를 나타낸 것이다. 도 4(A)는 정상 초기치를 나타내는 사람에 관한 SOD-유사 활성을 나타낸 것이고, 도 4(B)는 이상 초기치를 나타내는 사람의 SOD-유사 활성에 관한 결과를 나타낸 것이다.

비교 물질 1 및 물질 1을 28일간 투여한 결과 LPO 농도가 저하하였고, SOD-유사 활성은 상승하는 경향을 나타내었다. 이상 초기치를 나타내는 피검자 중에서 LPO 농도의 초기치가 비교적 높았던 사람(LPO 농도 8 이상) 및 SOD-유사 활성이 비교적 낮았던 사람(SOD-유사 활성이 12.0 이하)에 대해서 볼 때 물질 1을 투여한 군에서 통계적으로 유의하게 LPO 농도가 저하되었다(도 3(B)). 유사하게 SOD-유사 활성도 물질 1을 투여한 군에서 통계적으로 유의한 상승을 확인할 수 있었다(도 4(B)). 이로부터, 물질 1은 동량의 비교물질 1 보다 생체내 산화 상태의 개선에 더욱 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

시험예 5

β-아밀로이드 유도 산화적 세포사에 대한 신경세포 보호효과

신경재생 이상으로 유발되는 알츠하이머는 β-아밀로이드의 축적에 의한 노인반(senile plaque)을 형성하는 것을 특징으로 하고 있다. β-아밀로이드는 활성산소종을 생성하고, 신경세포에 대한 세포독성에 의한 알츠하이머의 발병과 진행에 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 신경세포독성 실험에 있어 광범위하게 사용되고 있는 PC-12세포에 대한 아폽토시스 유도(apotosis induction)에 의한 세포상해활성에 대하여 저분자화 폴리페놀(이하 GSM이라 약칭라는 경우가 있다)의 신경세포 보호효과를 조사하였다.

[실험방법]

PC-12세포는 10% 열불활성화 마혈청 및 5% 우태아혈청을 함유하는 DMEM 배지에 10 % 이산화탄소 분위기하에서 배양하였다. 4×10⁴ 세포/300㎕가 되도록 세포밀도를 조정하면서 24시간 예비배양한 후, 혈청을 함유하지 않은 N-2 배지 중에 GSM 또는 포도씨 폴리페놀(이하, GSP로 약칭하는 경우가 있다)을 1, 1.5, 5 또는 10 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 48웰 플레이트에서 배양하였다.

(1) 세포생존도 시험:

처리후 세포를 1 mg/㎖의 MTT용액으로 처리하고, 짙은 청색의 포르마잔(formazan) 산물을 완충액에 용해하여 540~595nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 무처리 대조군의 흡광도와의 비율(%)로 표시하였다.

[결과]

MTT 시험결과, GSM은 농도의존적으로 β-아밀로이드에 의한 PC-12세포사를 억제하는 것을 알 수 있었다. 그 효과는 특히 1 및 1.5 ㎍/㎖의 저농도 영역에서 GSP 보다 더 높았다(도 5).

(2) 미토콘드리아 막전위측정시험:

미토콘드리아 막전위의 측정을 위하여 지용성 양이온 탐침자인 TMRE를 사용하였다. GSM 또는 GSP 존재하 또는 비존재하에서 PC-12세포(1×10⁴ 세포/㎖)를 25μM의 β-아밀로이드로 처리한 후에, 인산완충생리식염수로 세정하고, 37℃에서 30분간 TMRE(150nM)로 처리하였다. 미토콘드리아 막전위에 의존적으로 미토콘드리아내에 축적된 TMRE를 여기파장 488nm, 방출파장 590nm에서 형광 검출하였다.

[결과]

미토콘드리아는 세포사의 징후에 선행하여 막의 완전성(integrity)에 변화를 가져온다. 그 변화는 미토콘드리아의 내막 및 외막 양방향에서 일어나는데, 최종적으로 시토크롬 C와 같은 가용성 막간 단백질을 방출하게 하는 막관통전위의 방전 또는 막투과성의 변화를 가져온다. PC-12 세포가 β-아밀로이드에 노출되면, 미토콘드리아 막관통전위가 급속하게 저하되어, 전위의존형 색소인 TMRE를 사용하는 적색의 형광으로 발현하게 된다(도 6(A)). β-아밀로이드에 의한 막관통전위의 저하는 GSM에 의한 전처리에 의하여 유의적으로 억제되었고, 그 효과는 GSP보다 더 높았다(도 6(A) 및 도 6(B)).

(3)세포내 활성산소종 축적의 측정

활성산소종의 세포내에서의 축적량을 관찰하기 위하여 형광 탐침자 DCF-DA(2',7'-디클로로디히드로플로레세인-디아세테이트; 2',7'-dichloro dihydro fluo resein-diacetate)를 사용하였다.

GSM 또는 GSP 존재하 또는 비존재하에서 PC-12세포(1×10⁶ 세포/3 ㎖)를 25μM의 β-아밀로이드처리한 후에, 크랩스-링거액으로 세정하고, 10μM의 DCF-DA를 가하였다. 37℃에서 15분간 배양한 후 아르곤 레이저를 장착한 공초점 레이저 현미경을 이용하여 여기파장 488nm, 방출파장 530nm에서 관찰하였다.

[결과]

β-아밀로이드에 의한 PC-12세포의 세포사에 있어서 산화 스트레스를 해명하기 위하여, 세포막을 투과할 수 있는 DCF-DA를 사용하여 세포내에서의 활성산소종의 축적을 측정하였다. 세포내에서 DCF-DA는 세포의 에스테라제 활성에 의하여 DCF로 가수분해되고 과산화물과 반응하여 형광물질을 생성한다. β-아밀로이드처리한 PC-12세포는 DCF색소에 의하여 염색되고 표시된다(도 7(A)). β-아밀로이드에 의한 세포내 활성산소종의 축적은 GSM에 의하여 감소되었고, 그 효과는 GSP보다 더 높았다(도 7(A) 및 도 7(B)).

(4) 세포내 글루타티온 농도:

세포내 글루타티온 농도는 시판되는 키트(BIOXYTECH GSH-400; OXIS Research사, 미국)를 사용하여 측정하였다.

GSM 또는 GSP 존재하 또는 비존재하에서 배양한 β-아밀로이드 처리한 PC-12세포를 회수하여 메타인산용액내에서 세포파쇄하고, 원심분리하여 상등액을 얻고, 이에 색소원염산용액(chromagen hydrochloric acid solution)을 가하였다. 교반 후 30% 수산화나트륨용액을 가하고 25℃에서 10분간 배양하였다. 그 후 원심분리하여 맑은 상등액을 얻고 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. BCA 단백질 측정 키트로 단백질 함량을 측정하고 단백질의 단위 중량당 글루타티온 농도를 무처리 대조군과 비교하였다.

[결과]

β-아밀로이드에 의한 PC-12세포의 세포사에는 산화 데미지가 관련되어 있다. β-아밀로이드를 처리한 세포에서는 세포내 글루타티온 농도가 저하한다. GSP 처리한 세포에서는 세포내 글루타티온 농도가 정상 수준까지 회복되지만, GSM의 경우에는 정상 수준 이상으로 세포내 글루타티온 농도가 나타났고, 세포내에서 높은 항산화 활성을 나타내었다(도 8).

(5) 과산화지질 농도:

과산화지질농도는 시판되는 키트(BIOXYTECH LPO-586; OXIS Research사, 미국)를 사용하여 측정하였다. GSM 또는 GSP 존재하 또는 비존재하에서 배양한 β-아밀로이드 처리한 PC-12세포를 회수하여 0.5 mM의 부틸화 히드록시톨루엔 함유 20 mM 트리스염산완충액 중에서 세포파쇄하고, 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액에 10.3 mM의 N-메틸-2-페닐인돌의 아세토니트릴 용액을 희석하고 혼합하였다. 37% 염산을 가하여 45℃에서 60분간 배양하였다. 냉각 후 원심분리하여 맑은 상등액을 얻고 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. BCA 단백질 측정 키트로 단백질 함류량을 측정하고 단백질의 단위 중량당 과산화지질 농도를 무처리 대조군과 비교하였다.

[결과]

β-아밀로이드 처리로 인한 세포막의 과산화는 과산화지질로부터 생성되는 말론디알데하이드(MDA)로 표시된다. GSM 또는 GSP의 전처리에 의하여 β-아밀로이드에 의한 지질 과산화가 억제되었고, 그 효과는 GSM에서 높았으며, 무처리 대조 수준 이하로 과산화지질을 억제하였다(도 9).

[결과의 요약]

GSM은 신경세포 모델세포주인 PC-12세포에 있어서, 신경세포내의 활성산소종의 축적을 감소시킴으로써, β-아밀로이드 독성에 의한 신경세포사를 억제하였다. 그 효과는 GSP보다 더 높았다. β-아밀로이드 독성에 의한 신경세포사는 세포에 대하여 산화 데미지가 관여하고 있는 바, GSM은 세포에 대한 산화 데미지를 억제하였으며 그 효과는 GSP보다 더 높았다.

GSM가 그 항산화작용으로 알츠하이머의 발병 및 진행에 깊이 관여하는 β-아밀로이드에 의한 신경세포사를 억제하는 것은 GSM로 알츠하이머의 발병 및 진행을 억제할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

시험예 6

스트렙토조토신(STZ; streptozotosin)유발 당뇨병에 대한 예방 효과

물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 예방 효과를 검토하기 위하여, STZ를 저용량 수회 투여(multiple low dose:MLD)하여 유발된 당뇨병 초기에 상당하는 상태 모델을 이용하여 물질 1의 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 예방 효과를 검토 하였다.

[방법]

Jla: ddy 마우스(수컷, 7주령)의 체중, 혈당치 및 혈중 LPO치를 측정하고, 각 군이 균등하게 되도록 이하와 같이 군을 나누었다.

(1) 음성대조군: STZ (-) (n = 5, 1 케이지)

(2) 양성대조군: STZ (+) (n = 15, 3 케이지)

(3) 물질 1 군: STZ (+) + 물질 1 (n = 10, 2 케이지)

(4) 비교물질 1 군: STZ (+) + 비교물질 1 (n = 10, 2 케이지)

20mg/kg 용량의 STZ를 4일간 연속하여 복강내 투여한 후(이를 2회 수행), 40mg/kg 용량의 STZ를 4일간 연속하여 복강내 투여하였다. 물질 1 또는 비교물질 1을 각 0.06%의 용량으로 분말 식이에 혼합하고 자유로이 섭취하게 하였다(하루 섭취된 사료량으로 볼 때, 물질 1 또는 비교물질 1의 1일 섭취량은 약 100 mg/kg이 되었다). 또한, 투여기간은 STZ 투여개시일의 5일 전부터 STZ 투여개시일이후 65일까지로 하였다.

투여기간 중 혈액 및 뇨를 채취하고, 혈당, 뇨당, 뇨단백질, 혈중요소질소(BUN) 및 혈중 LPO/TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)를 측정하였다. 그 측정 결과를 도 10 내지 도 14에 도시하였다.

[결과의 요약]

(1) 공복시 혈당치

당뇨병에서는 도 10에 표시된 바와 같이 공복시의 혈당치가 높다. STZ 투여후 35일, 49일 및 66일에 있어서, 양성 대조군은 음성대조군에 비교하여 유의적으로 혈당치가 높았고, 이로써 STZ를 저용량 수회 투여함으로써 경도 당뇨병 모델이 제조됨을 확인할 수 있었다. 물질 1군 및 비교물질 1군에 있어서 혈당치는 양성대조군에 비교하여 유의적으로 낮은 값을 나타내었고, 물질 1군이 비교물질 1군에 비하여 높은 혈당치 강하효과를 나타내었다.

(2) 뇨당치

당뇨병에서는 뇨중으로의 당 배설량이 증가한다. STZ 처리에 의하여 뇨중 당 배설량이 대폭 증가하였고, 이로써 마우스에서 당뇨병이 유발됨을 확인할 수 있었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 물질 1군 및 비교물질 1군에는 STZ에 의하여 증가한 뇨당치의 개선효과가 관찰되었고, 49일째에서는 양성대조군과의 사이에 각각 유의적인 차이가 확인되었다. 또한, 물질 1군이 비교물질 1군에 비하여 비교적 낮은 수치를 나타내었다.

(3) 뇨단백질치

당뇨병에서는 뇨중 단백질의 배설량이 증가한다. 도 12에 나타난 바와 같이, 물질 1 및 비교물질 1 은 STZ에 의하여 증가한 뇨중 단백질의 유출을 억제할 수 있었고, STZ 투여후 49일째에는 양 물질 모두 양성대조군과 비교시 유의적으로 단백질량이 저감하였다. 또한 물질 1이 비교물질 1에 비하여 본상태 모델의 초기 단계부터 효과를 나타내는 것이 예측되었다.

(4) 항산화지표

(4-1) 혈중 LPO치

도 13에 나타난 바와 같이, 물질 1군이 양성대조군 및 비교물질 1군에 비하여 낮은 수치를 보이는 경향을 확인하였다.

(4-2) 혈중 TEAC치

TEAC법은 화합물이 갖고 있는 항산화활성을 알파-토코페롤(α-tocopherol) 유도체인 트롤록스(Trolox)의 항산화능으로 환산하여 항산화강도를 상대평가하는 방법이다. 이 방법으로 얻은 값은 항산화지표로서 일반적으로 널리 사용되고 있다. 도 14에 나타난 바와 같이, 비교물질 1과 양성대조군은 49일째 및 66일째 모두 비슷한 혈중 항산화활성치를 나타내는 반면, 물질 1 투여군은 높은 값을 나타내었고, 가장 높은 항산화활성을 나타내었다.

[요약]

STZ 저용량 수회 투여 모델은 마우스에 경도 당뇨병을 유발할 수 있고, 고용량 일회 투여 모델과 비교시 혈당치에 있어 개체간의 차이도 적기 때문에, 당뇨병에 대한 예방 효과를 검토하기에 편리한 모델로 생각된다. 물질 1은 당뇨병 모델에 있어서, 병태 진행에 수반하는 혈당치나 뇨당치의 상승을 억제하여, 당뇨병 예방효과가 있음을 시사하였다.

STZ 유도 당뇨병은 췌장 β세포내에 특이적으로 발생된 라디칼로 인하여 β세포가 상해사됨으로써 유발된다. 물질 1 및 비교물질 1을 STZ 투여 5일전 부터 투여함으로써, 체내의 항산화 활성을 미리 높여 주어 STZ에 의한 β세포에 대한 상해를 경감시키는 것으로 사료되었다.

혈중 LPO 및 TEAC의 결과로부터 물질 1이 혈중의 항산화능을 유의적으로 상승시킴을 명백하게 알 수 있었다. 일산화질소나 활성산소 등의 라디칼이 인슐린 의존성 당뇨병에 있어 췌장 랑게르한스섬의 파괴에 관여한다는 것은 공지 사실이며, 유리 라디칼의 세포 상해를 억제함으로써 당뇨병을 경감할 수 있다는 것이 인간에 대한 시험으로 증명된 상태이다. 따라서, 물질 1은 당뇨병이 발병될 잠재성을 갖는 건강인에 대해서는 예방적 효과를, 또한 초기 당뇨병환자에 대해서는 병태의 진전을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

시험예 7

브롬화칼륨 유발 랫트 급성 신장 장애 모델에 대한 비교 실험

물질 1이 다른 항산화 폴리페놀 물질과 비교하여 어느 정도의 항산화능을 가지고 있는가를 알아보기 위하여 브롬화칼륨(potassium bromate) 유발 랫트 급성 신장 장애 모델에서 비교시험을 시행하였다.

[방법]

위스타 랫트(수컷, 12주령)를 이하와 같이 그룹으로 나누었다.

음성대조군: 브롬화칼륨 (-) (n = 5)

양성대조군: 브롬화칼륨 (+) (n = 5)

물질 1 군(포도씨 유래): 브롬화칼륨 (+) + 물질 1 (n = 5)

물질 5 군(소나무 수피 유래): 브롬화칼륨 (+) + 물질 5 (n = 5)

비교물질 2 군(카테킨): 브롬화칼륨 (+) + 비교물질 2 (n = 5)

비교물질 3 군(은행엽 추출물): 브롬화칼륨 (+) + 비교물질 3 (n = 5)

비교물질 4 군(소나무 수피 추출물): 브롬화칼륨 (+) + 비교물질 4 (n = 5)

비교물질 5 군(코코아 추출물): 브롬화칼륨 (+) + 비교물질 5 (n = 5)

브롬화칼륨을 65 mg/체중kg 의 용량으로 복강으로 일회 투여하였다. 물질 1, 물질 5 및 각 비교물질들은 브롬화칼륨 투여 개시일(0일째) 1주일 전(-7일째)부터 0일째의 다음날까지 10 mg/체중kg 의 용량으로 매일 1회 경구투여하였다. 브롬화칼륨 투여일에는 브롬화칼륨 투여 전후 30분이내에 투여하였다. -7일째, 0일째 및 2일째에 경정맥을 통하여 채혈하고, 혈중 폴리페놀 농도, 과산화지질 농도, TEAC, 뇨요소질소 및 크레아티닌(creatinine) 농도를 측정하였다.

[결과]

물질 1 및 각 비교물질의 브롬화칼륨 유발 급성 신장 장애에 대한 효과는 항산화작용에 의한 것이므로, 항산화 지표로서 혈중 폴리페놀 농도, 혈중 항산화능(TEAC) 및 혈중 과산화지질 농도를 측정하였고, 신장 장애 상태의 지표로서 혈중뇨소질소 농도 및 혈중 크레아티닌 농도를 측정하였으며, 그 결과를 도 15 내지 도 19에 나타내었다.

(1) 항산화지표

(1-1) 혈중 폴리페놀 농도

도 15에 나타난 바와 같이, 브롬화칼륨 투여전의 혈중 폴리페놀 농도의 초기치는 각군 모두 일정하였으나, 물질 1 및 각 비교물질을 7일간 투여한 후, 즉 브롬화칼륨 투여 0일째에서는 물질 1군이 최고치를 나타내었고, 그 다음이 비교물질 2군이었다. 이로써 물질 1의 투여로 혈중 폴리페놀 농도가 상승되었으며, 그 상승율은 각 비교물질에 비하여 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.

(1-2) 혈중 항산화능(TEAC)

도 16에 나타난 바와 같이, 물질 1 및 각 비교물질을 7일간 전투여함으로써 혈중 항산화능이 상승하는 경향을 나타내었고, 물질 1의 투여에 의한 항산화능의 상승이 각 비교물질투여군에 비하여 유의적으로 높았다.

(1-3) 혈중 과산화지질 농도

물질 1 및 각 비교물질의 일주일간의 전투여는 브롬화칼륨 투여에 의한 혈중 과산화지질 농도의 상승을 억제하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 그 효과는 물질 1군이 가장 좋았으며, 각 비교물질에 비하여 유의적으로 낮은 수치를 보였다.

(2) 병태 지표

(2-1) 혈중 요소질소 농도

도 18에 나타낸 바와 같이 브롬화칼륨의 투여에 의하여 혈중 요소질소 농도는 무처리에 비하여 유의적으로 상승하였다. 물질 1 및 각 비교물질의 투여는 브롬화칼륨 투여에 의한 혈중 요소질소 농도의 상승을 억제하였고, 물질 1은 각 비교물질군에 비하여 혈중 요소질소 농도의 상승을 유의적으로 억제하였다.

(2-2) 혈중 크레아티닌 농도

도 19에 나타낸 바와 같이 브롬화칼륨의 투여에 의하여 혈중 크레아티닌농도는 무처리에 비하여 유의적으로 상승하였다. 물질 1 및 각 비교물질의 투여는 브롬화칼륨 투여에 의한 혈중 크레아티닌 농도의 상승을 억제하였고, 물질 1은 각 비교물질군에 비하여 혈중 크레아티닌 농도의 상승을 유의적으로 억제하였다.

[요약]

비교물질 3, 비교물질 4 및 비교물질 5는 프로안토시아니딘 폴리머(고분자)가 풍부한 물질이고, 시험관내(in vitro)에서 높은 항산화 활성을 보인다. 그러나 생체내 투여시 항산화 활성은 저분자화된 물질 1쪽이 더 높았다. 또한 단량체(카테킨)로 된 비교물질 2에 비교하더라도 물질 1이 더 높은 활성을 나타내었다. 혈중 폴리페놀량으로 볼때 저분자화 됨으로써 생체 흡수가 우수해지고, 생체내에서 항산화 활성도 높은 것을 알 수 있었다. 물질 1의 전투여는 혈중 항산화능을 높이고, 항산화 활성을 발휘하였다. 그 결과, 브롬화칼륨의 투여로 인한 혈중 과산화지질 농도의 상승을 억제하고, 신장 장애를 억제하며, 이로써 혈중으로의 요소질소 및 크레아티닌의 유출을 억제하였다. 이 효과는 각 비교물질에 비교하여 상당히 높았고, 지금까지 알려져 있는 고분자 폴리페놀을 기초로 한 폴리페놀 물질 및 단량체(카테킨)보다도 생체내 섭취시 우수한 항산화 활성을 나타내었다.

[본 발명 물질의 안전성]

일회투여 독성시험에 의하여 안전성을 평가하였다. 즉, 물질 1을 체중kg 당 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0g의 투여량으로 각각 8, 7, 3 및 18마리의 ddY계 마우스(9주령, 수컷)에 강제 경구투여하였다. 투여후의 행동변화 및 사망례를 관찰하여 LC₅₀ 을 산출하였다. 그 결과 물질 1의 50% 치사농도(LC₅₀)는 5.0g/체중kg이었다(95% 신뢰한계: 3.5~6.4g/체중kg). 또한, 투여후에 행동 이상이 나타나지 않았으며, 시험종료시의 해부소견시에도 이상이 없었다. 따라서, 물질 1은 식품으로서 극히 안전성이 높은 물질임을 확인할 수 있었다.

상기 시험예 4(인간에 대한 모니터 시험)에서, 앙케이트 방식으로 피검자의 코멘트를 수집하였다. 그 중 수면에 관한 것을 표 10에, 피로감, 두중감(clear-headedness), 위기능(stomach function)에 대한 5단계 평가 결과를 11에 나타내었다.

<표 10>

군	연령	성별	사용감에 대한 코멘트
물질 1	49	남	일어나기가 쉬어졌다.
물질 1	43	남	수면의 질이 좋아졌다.
물질 1	57	남	아침 기상시 기분이 좋아졌다.
비교물질 1	27	여	아침 기상시에 피로감.
비교물질 1	34	남	졸립고 아침에 일어나기가 힘들다.
비교물질 1	43	남	아침에 일어나기가 어려워졌다.

<표 11>

	5단계 평가에 의한 앙케이트 평균 점수
	피로감	두중감	위기능
비교물질 1	2.8(3.1)	3.7(3.3)	3.9(3.5)
물질 1	3.2(2.9)	3.7(3.3)	3.8(3.5)

(수치가 클수록 상태가 좋은 것을 의미하며, 괄호속의 수치는 투여전 수치를 의미함)

Claims (21)

1. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH기 함유 펩티드 및 이들의 염류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 SH기 함유 화합물과 반응시킨 반응액을 농축 및 건조하여 얻어지는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 주요성분으로 함유하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고머가 프로안토시아니딘의 2 내지 5량체인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물이 과채류, 차류, 허브ㆍ스파이스류 및 목재ㆍ수피류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
4. 삭제
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 고지혈증, 고콜레스테롤, 고혈압, 당뇨병, 뇌질환 및 다장기장애(multi organ failure)로 이루어진 군에서 선택되는 질병의 치료 또는 예방용의 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 노화 예방용의 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 고지혈증, 고콜레스테롤, 고혈압, 당뇨병, 뇌질환 및 다장기장애(multi organ failure)로 이루어진 군에서 선택되는 질병의 개선 또는 예방용의 건강 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 노화 예방용의 건강 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물.
9. 제 1항의 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 SH기 함유 화합물과 반응시켜 얻은 황함유 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 성분을 분획하여 얻어지는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머.
10. 제 9항에 있어서, 상기 올리고머가 프로안토시아니딘의 2 내지 5량체인 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머.
11. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH기 함유 펩티드 및 이들의 염류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 SH기 함유 화합물과 산성 조건하에서 반응시키고, 반응액을 농축 및 건조하는 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머 조성물의 제조 방법.
12. 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 이의 추출물을 시스테인, 시스틴, 글루타티온, SH기 함유 펩티드 및 이들의 염류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 SH기 함유 화합물과 산성 조건하에서 반응시키고, 반응액을 농축시키고, 분획처리하는 것을 특징으로 하는 황함유 프로안토시아니딘 올리고머의 제조 방법.
13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 이 과채류, 차류, 허브ㆍ스파이스류 및 목재ㆍ수피류로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
14. 삭제
15. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 무기산, 유기산 또는 이들의 혼합물을 이용하여 산성 조건으로 하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
16. 제 15항에 있어서, 염산, 황산, 질산, 아세트산, 시트르산, 아스코르브산 및 말산(malic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
17. 하기 식 (4)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

    

    (4)
18. 하기 식 (5)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

    

    (5)
19. 하기 식 (6)으로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

    

    (6)
20. 하기 식 (7)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

    

    (7)
21. 하기 식 (8)로 표시되는 프로안토시아니딘 화합물.

    

    (8)

Images