KR101228355B1

KR101228355B1 - 당의 분리

Info

Publication number: KR101228355B1
Application number: KR20067005786A
Authority: KR
Inventors: 주호 점프파넨; 빌리 라반코; 하이크키 하이크킬래; 주하 누루미; 니나 누르미; 피아 사아리; 카티야 핵캐; 야리 레반도브스키
Original assignee: 다니스코 스위트너스 오와이
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2013-02-01
Also published as: ZA200602042B; EP1664352A1; AP2020A; JP4831420B2; MY141216A; US7037378B2; KR20060080215A; AP2006003546A0; JP2007506711A; US20050061313A1; WO2005040430A1; EP1664352B1

Abstract

본 발명은 펄프화 공정으로부터 얻어지는 폐액(spent liquor)과 같은 바이오매쓰(biomass) 유도된 용액으로부터 푸코스(fucose)와 같은 데옥시 당의 회수에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이오매쓰로부터 글리코시드의 회수에 관한 것이다. 본 발명은 특정 칼럼 충진재들 및 이들의 조합물과 용출제로서 물을 사용하는 크로마토그래피적 분획화의 사용을 기본으로 한다. 크로마토그래피적 분획화로부터 얻어진 데옥시 당 생성물은 결정화에 의해 추가로 정제시킬 수 있다. 본 발명은 또한 신규한 결정형 L-푸코스 생성물 및 신규한 푸코스 결정화 방법을 제공한다.

푸코스, 크로마토그래피적 분획화, 데옥시 당, 람노스, 글리코시드, 결정화 이온 교환 수지

Description

당의 분리{Separation of sugars}

본 발명은 당 분리 기술 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 데옥시 당과 글리코시드를 함유하는 바이오매쓰(biomass) 유도된 용액으로부터 데옥시 당과 글리코시드를 분리하고 회수하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 푸코스, 특히 L-푸코스의 분리에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 결정형 L-푸코스 생성물 및 푸코스의 결정화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이렇게 얻어진 결정형 L-푸코스의 식품 보충물로서의 용도, 약리학적 용도 및 화장품 용도에 관한 것이다.

데옥시 당은 목재, 해초 및 사탕무우와 사탕수수와 같은 식물 재료에서 소량으로 발견되는 소위 희귀한 당의 예이다. 특정 데옥시 당은, 예를 들면, 감미료 및 약제학적 용도 및 화장품용으로 유용한 것으로 밝혀졌다.

글리코시드, 특히 알킬 글리코시드는 위에서 언급한 데옥시 당과 같은 동일 식물 재료에서 흔히 발견되는 당 유도체이다.

데옥시 당은 L형 및 D형으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 푸코스는 L-푸코스 및 D-푸코스로서 존재한다.

특히 주목되는 데옥시 당의 한 예가 푸코스이고, 이는 6-데옥시갈락토스라고도 한다. 푸코스는 다수의 상이한 공급원으로부터 다양한 천연 산물에서 D형 및 L형 둘 다로 발견된다. 의학 분야에서 이들의 암, 염증 상태 및 사람 면역계와 관련된 질환과 같은 각종 질환 치료 가능성으로 인해, L-푸코스에 대한 관심이 최근에 높아지고 있다. L-푸코스는 또한 화장품 분야에서, 예를 들면, 피부 보습제로서도 사용된다.

머크 인덱스(Merck Index, Twelfth Edition, 1996)에 따르면, 결정형 L-푸코스는 융점이 140℃이고 선광도(optical rotation)가 -75.6°이다.

L-푸코스는, 예를 들면, 몇몇 사람 모유의 올리고당에 존재한다.

식물 재료에서, 푸코스는 종종 다당류 쇄의 말단 또는 다당류 쇄 내에 L-푸코피라노실 단위를 갖는 매우 분지된 구조물인 식물 다당류와 통상적으로 연합되어 있다. 몇몇 경우, 메틸화 푸코피라노실 단위들도 식물 다당류에 존재한다.

L-푸코스 또는 메틸화 L-푸코피라노실 단위는, 예를 들면, 감자, 카사바 덩이줄기 및 키위 과실의 세포벽, 콩의 씨 다당류 및 날개달린 강낭콩 변종 및 캐놀라에 존재한다.

세포간 점액에서 발견되는 해초 다당류는 복잡한 구조를 형성하고 종종 황산화 L-푸코스 중합체(이는 푸코이단이라고 한다)로 이루어진다. 푸코이단의 추출용으로 특히 중요한 해초는 에클로니아 쿠롬(Ecklonia kurome), 라미나리아 안구스타타 바 론지시마(Laminaria angustata var longissima), 푸쿠스 베시쿨로서스(Fucus vesiculosus), 켈마니엘라 크라시폴리아(Kjellmaniella crassifolia), 펠베티아 카날리쿨라타(Pelvetia canaliculata) 및 푸쿠스 세라투스 엘(Fucus serratus L)이다.

또한, 각종 세균, 진균 및 미세 조류로부터 얻어지는 세포외 다당류는 L-푸코스를 함유한다.

L-푸코스는 각종 추출 방법에 의해 조류와 같은 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 푸코스를 회수하기 위해 사용되는 이들 천연 원료는 통상적으로 다성분 혼합물이다. 충분한 순도의 푸코스의 분리는 당해 기술 분야의 현 상태에서 문제점을 보여주고 있다.

L-푸코스는 패오피세애 조류(Phaeophyceae algae)에 존재하는 푸코이단의 가수분해로 얻어진다. 블랙 더블류.에이.피.(Black, W.A.P.) 등은 최적화된 푸코이단 추출방법을 문헌[참조: "Manufacture of algal chemicals. IV. Laboratory-scale isolation of fucoidan from brown marine algae", J. Sci. Food Agric. 3:122-129 (1952)]에 기재하고 있다. 최고 수율은 70℃의 온도에서 1시간 동안 염산으로 추출(pH 2.0 내지 2.5)함으로써 얻어진다. 1단위 조류 대 10단위 액체의 비(w/v)가 최적임을 보여준다. 이러한 과정은 총 L-푸코스의 약 50%를 제공한다. 연속적으로 수행되는 3회의 산 추출로 80% 이상의 L-푸코스를 얻는다. 조 푸코이단을 산 추출액으로부터 중화 및 증발 건조시켜 분리한다.

미국 특허 제3,240,775호(Kelco Co., 1966년 3월 15일자 공개)에는 푸코이단, 진한 염화수소 및 메탄올의 혼합물을 푸코이단이 실질적으로 탈중합되고 탈황산화될 때까지 가열하는 단계, 혼합물로부터 메틸 α-L-푸코시드로 이루어진 분해 생성물을 회수하는 단계, 및 가수분해시켜 L-푸코스를 얻는 단계를 포함하는, α- L-푸코시드와 L-푸코스의 결정을 제조하는 방법이 기재되어 있다.

위에서 언급한 문헌의 실시예 VIII에는 α-L-푸코시드(메틸 α-L-푸코시드)를 제거하고, 이렇게 얻어진 혼합물을 1N 황산으로 처리하고, 황산을 Ba(OH)₂로 침전시키고, 용액을 양이온 교환 수지(Amberite IR-120, H⁺ 형태) 및 활성탄으로 처리하고, 무색 용액을 진공 중에서 시럽으로 농축시키고, 시럽을 고온 메탄올로 희석시킴으로써, 푸코이단 분해 산물을 함유하는 상기 혼합물로부터 결정형 L-푸코스를 얻는 방법이 기재되어 있다. 에테르를 희석된 용액에 가하고, L-푸코스로 씨딩(seeding)한 후, 혼합물을 8 내지 12일 동안 냉장보관한다. 융점이 136 내지 138℃인 결정형 L-푸코스를 얻는다. 실시예 IX에 따르면, 동일한 과정으로 융점이 136 내지 139℃인 결정형 L-푸코스를 제공한다.

일본 특허 공보 제63027496 A2호(Takemura, M et al., Towa Chem. Ind.)에는 초다리아세애(Chordariaceae) 또는 스퍼마토크나세애(Spermatochnaceae)족에 속하는 조류로부터 L-푸코스의 직접 추출이 기재되어 있다. 당해 조류는 물에 분산시키고 진한 황산으로 처리된다. 얻어진 가수분해물을 냉각시키고, 조류 잔류물을 여과하여 제거한다. 여액의 pH를 5로 조정하고, 여액을 숯으로 처리한 후, 여과한다. 효모를 여액에 가하여 L-푸코스 이외의 당을 분해시킨다. 혼합물을 숯으로 처리하고 여과한다. 여액을 양이온 및 음이온 교환 수지로 탈이온화 처리하고 농축시킨다. 농축된 당 용액을 에탄올과 혼합하고, 결정화시킨다. 이런 식으로, 순도 98.7%의 L-푸코스가 얻어진다(분석 방법에 대한 언급 없음). L-푸코스 생성물에 대한 융점 데이터는 제시되어 있지 않다.

에프.엠. 롬부츠(F.M. Rombouts) 및 제이.에프. 씨볼트(J.F. Thibault)는 사탕무우 펄프의 에탄올 불용성 잔류물로부터 펙틴의 분리를 문헌[참조: Carbohydrate Research 1986, 154, pp. 177-187]에 기재하고 있다. 분리된 펙틴은 DEAE-셀룰로즈상의 크로마토그래피 또는 CuSO₄로 침전시켜 정제한다. 펙틴은 중성 당의 함량이 비교적 높다. 각각의 펙틴 속의 주요 중성 당은 아라비노스 및 갈락토스이고, 존재하는 기타 당은 람노스, 푸코스, 크실로스, 만노스 및 글루코스이다. 푸코스는 당/펙틴 혼합물로부터 분리되지 않는다.

브이.에이. 데레비츠카야(V.A. Derevitskaya) 등은 문헌[참조: Dokl. Akad. Nauk. SSSR (1975), 223 (5) 1137-9]에 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 올리고당의 복합 혼합물의 분리를 기재하고 있다. 당해 문헌에 따르면, 2-아미노-2-데옥시글루시톨, 글루코사민, 갈락토스 및 푸코스가 0.2M 보레이트로 완충된 올리고당 혼합물로부터 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 연속적으로 분리된다.

엠.에이치. 시마투팡(M.H. Simatupang)은 문헌[참조: J. Chromatogr. (1979), 178(2), 588-91]에 몇몇 중성 단당류와 우론산의 이온 교환 크로마토그래피를 기술하고 있다. 당해 문헌에는 보레이트 완충 시스템을 사용하는 푸코스, 만우론산 및 굴루론산을 함유하는 우론산과 단당류의 복합 혼합물의 이온 교환 크로마토그래피가 기재되어 있다. 당해 크로마토그래피 시스템은 HA-X4 또는 BA-X4(보레이트 형태) 음이온 교환제 및 다양한 pH 값에서 다양한 보레이트 농도의 완충 시스템을 함유하는 강철 칼럼을 사용한다. 분리 프로필은 데옥시 당과 다른 단당류 간의 중첩이 일어나 분리 결과가 만족스럽지 못함을 보여준다.

에스. 혼다(S. Honda) 등은 문헌[참조: Journal of Chromatography, 291 (1984) 317-325]에서 나트륨 및 칼슘 형태의 양이온 교환 수지와 용출제로서 아세토니트릴을 사용하여 당(알도스) 아노머(anomer)의 분리를 기재하고 있다. 당해 문헌에는 단지 하나의 당을 다른 당으로부터 분리하는 것이 아니라 각각의 당의 아노머들을 상호 분리하는 방법을 기재하고 있다. 데옥시 당은 다른 당과 동시에 용출된다.

맥과이어(McGuire) 등은 단당류의 높은 pH 음이온 교환 크로마토그래피 용출에 대한 pH의 효과에 대해 연구했다[참조: Chromatographia, vol. 49, No. 11/12, June 1999]. 분리시 용출제는 수산화나트륨 용액이었다. 결과는 푸코스가 다른 단당류들로부터 분리되었음을 보여준다. 그러나, 다른 데옥시 당은 언급되어 있지 않다.

일본 특허 공보 제11-035591호(1999년 2월 9일 공개)에는 클라도시폰 아카무라누스 토키다(Cladosiphon okamuranus Tokida) 또는 푸코이단 함유 추출물로부터 제조된 푸코이단으로부터 L-푸코스를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 당해 방법은, 예를 들면, 물 및/또는 산으로 처리하고, 중화시키고, 투석하고, 전기투석 처리하고, 용출제로서 알칼리를 사용하여 이온 교환 처리함을 포함하는 다단계 공정이다. L-푸코스는 최종적으로 알콜로 결정화된다.

디. 발라고바(D. Balaghova) 등은 전가수분해 과정에서 단풍나무의 당 부분의 변화를 연구하였다[참조: Vybrane Procesy Chem. Spracovani Dreva (1996), 187-192 (Publisher: Technicka Univerzita Zvolen, Zvolen, Slovakia]. 단풍나무에서 발견되는 주요 단당류는 D-글루코스, D-크실로스, L-람노스, L-푸코스, L-아라비노스, D-만노스 및 D-갈락토스이다. L-푸코스는 당 혼합물로부터 분리되지 않았다.

L-푸코스는 또한 L-아라비노스[참조: Tanimura, A., Synthesis of L-fucose, Chem. Abstr, 55:12306 (1961)], D-글루코스[참조: Chiba, T. & Tejima, S., A new synthesis of α-L-fucose, Chem. Pharm. Bull. 27: 2838-2840 (1979)], 메틸-L-람노스[참조: Defaye, J., et al., An efficient Synthesis of L-fucose and L-(4-²H) fucose, Carbohydrate Res. 126:165-169 (1984)], D-만노스[참조: Gesson, J-P et al., A short synthesis of L-fucose and analogs from D-mannose, Tetrahedron Lett. 33:3637-3640 (1992)] 및 D-갈락토스[참조: Dejter-Juszynski, M & Flowers, H-M., Synthesis of L-fucose, Carbohydrate Res. 28:144-146 (1973); Kristen, H. , et al., Introduction of a new selective oxidation procedure into carbohydrate chemistry-An efficient conversion of D-galactose into L-fucose, J. Carbohydr. Chem. 7:277-281 (1988); Sarbajna, S. et al., A novel synthesis of L-fucose from D-galactose, Carbohydr. Res. 270: 93-96 (1965)]로부터 화학적 합성을 통해서도 얻어질 수 있다.

효소적 및 미생물적 합성 또한 L-푸코스 제조용으로 사용된다.

씨. 웡(C. Wong) 등은 문헌[참조: J. Org. Chem., 60:7360-7363 (1995)]에 L-푸코스 및 이의 동족체의 효소적 합성을 기재하고 있다. L-푸코스는 L-푸쿨로스-1-포스페이트 알돌라제에 이어, 산 포스파타제 및 L-푸코스 아이소머라제와의 반응에 의해 촉매된 디하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP) 및 DL-락트알데히드로부터 효소적 합성에 의해 생성된다. L-푸코스 생성물은 임의로 실리카 겔 분리와 함께 Dowex 50W-X8(Ba²⁺형) 크로마토그래피에 의해 분리된다.

유럽 특허 제102 535호(Hoecst AG, 1984년 3월 14일 공개)에는 10% 이상의 푸코스 및/또는 람노스를 함유하는 세포외 다당류를 생산하는 알칼리제네스(Alcaligenes) 속, 클레브시엘라(Klebsiella) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 또는 엔테로박터(Enterobacter) 속을 이용한 발효에 의해 푸코스 및 람노스로부터 선택된 데옥시 당을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 푸코스 및/또는 람노스는 발효 생성물의 가수분해물로부터 크로마토그래피, 이온 교환 또는 (예를 들면, 제올라이트를 사용한) 흡착 또는 추가의 발효 처리에 의해 회수될 수 있다고 인용되어 있다. 당해 유럽 특허의 실시예에서, 람노스와 푸코스는 추가의 발효 처리에 의해 회수된다. 당해 문헌에는 크로마토그래피에 의한 데옥시 당의 분리 또는 푸코스와 람노스의 상호 분리는 기재되어 있지 않다.

미국 특허 제4,772,334호(구레하 가가쿠 고교 가부시키가이샤, 1988년 9월 20일 공개)에는 아라비아 고무로부터 고순도 람노스의 제조방법이 기재되어 있다. 당해 방법은 아라비아 고무를 무기 산의 수용액에서 부분 가수분해시키고 중화시킨 후, 극성 유기 용매로 처리하여 아라비아 고무의 가수분해로 형성된 단당류를 함유하는 수용액을 얻고, 이렇게 얻은 수용액을 강산 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시킨 후, 활성탄을 사용한 흡착 및 분리 방법에 적용시킴을 포함한다.

국제공개공보 제WO 02/27038호(Xyrofin Oy, 2002년 4월 4일 공개)에는 탄수화물들을 크로마토그래피적으로 상호 분리하기 위한 약산성 양이온 교환 수지의 용도가 기재되어 있다. 바람직하게는, 약산성 양이온 교환 수지는 데옥시, 메틸 및 무수당과 같은 소수성 단당류 및 당 알콜을 보다 친수성인 사카라이드로부터 분리하는 데 사용된다.

국제공개공보 제WO 02/27039호(Xyrofin Oy, 2002년 4월 4일 공개)에는 약산성 양이온 교환 수지가 크로마토그래피적 분리용으로 사용되는 하나 이상의 단계를 포함하는 다단계 공정에 의해 람노스, 아라비노스 및 이들의 혼합물을 함유하는 용액으로부터 람노스, 아라비노스 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 단당류를 회수하는 방법이 기재되어 있다.

글리코시드의 회수는, 예를 들면, 미국 특허 제4,329,449호(A. E. Staley Manufacturing Company, 1982년 5월 11일 공개)에서 논의되고 있다. 당해 특허 문헌에는 전분으로부터 얻어진 조 글리코시드 혼합물로부터 메틸-α-D-글루코피라노시드의 회수가 기재되어 있다. 당해 특허 문헌의 실시예에서, 메틸-α-D-글루코피라노시드는 메탄올로부터 결정화하여 글리코시드 혼합물로부터 회수된다.

아이. 어게스타드(I. Augestad) 등은 문헌[참조: Acta Chemica Scandinavica (1956), 10, 911-16]에서 아노머성 글리코시드, 특히 L-푸코스, D-리보스 및 L-람노스의 결정형 메틸푸라노시드의 크로마토그래피적 분리에 대해 논의하고 있고, 문헌[참조: Acta Chemica Scandinavica (1954), 8, 251-6]에서는 갈락토스, 아라비노스 및 크실로스의 신규한 결정형 메틸푸라노시드의 분리에 대해 논의하고 있다. 아노머들의 크로마토그래피적 분리는 용출제로서 유기 용매를 사용하는 셀룰로스 칼럼으로 수행된다.

알려진 방법들과 관련된 문제점들 중의 하나는 이들 방법이 목적하는 데옥시 당을 다른 밀접하게 관련된 당과의 혼합물로서 제공하거나 충분한 순도의 푸코스와 같은 데옥시 당을 제공하지 않는다는 것이다. 갈색 조류로부터의 직접 추출은 비용이 많이 들고 공급 부피 및 품질에 있어서 계절적 변화에 영향을 받기 쉽다. 한편, 예를 들면, 다른 당으로부터 화학적 합성을 통한 L-푸코스의 제조는 비용이 많이 들고 수율이 낮다는 문제점이 있을 수 있다. 또한, 순도 99% 이상의 결정형 푸코스 생성물을 얻기 위해 푸코스 결정화용으로 적합한 출발 푸코스 용액을 제조하는 것은 문제가 있다.

또한, 데옥시 당들의 상호 회수율은 이들의 밀접한 관련 구조로 인해 현 상태에서는 문제점이 있다. 다수의 분리 방법에서, 당해 데옥시 당들은 동일한 방식으로 거동하고, 이에 의해 밀접하게 관련된 당들간에 본질적인 분리가 일어나지 않는다. 그 대신, 이들은 종종 동일 분획의 혼합물로서 회수된다.

본 발명에 이르러, 글리코시드 뿐만 아니라 고순도의 푸코스 및 기타 데옥시 당이 데옥시 당과, 예를 들면, 알도스 및 펜토스 당을 함유하는 바이오매쓰 유도된 용액으로부터 신규한 크로마토그래피적 분리방법을 사용하여 효과적으로 회수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 특히 결정적인 불순물의 함량이 특정 임계값 이하인 경우, 융점이 141℃ 이상, 바람직하게는 145℃ 이상인 고순도 푸코스 결정을 푸코스 함량이 DS 기준으로 45% 이상인 불순한 시럽으로부터 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다. 푸코스는 아라비노스 및 람노스와 같은 다른 당에 대해 매우 강한 염석 작용을 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 당해 기술 분야의 현 상태에서는 고순도의 푸코스 결정을 제조하는 것이 매우 어렵다.

발명의 간단한 개요

본 발명의 목적은 푸코스와 같은 데옥시 당 및 글리코시드를 함유하는 바이오매쓰 유도된 용액으로부터 글리코시드 뿐만 아니라 푸코스와 같은 데옥시 당을 분리하고 회수하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 데옥시 당들을 상호 및 다른 단당류들로부터 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 데옥시 당과 단당류로부터 글리코시드를 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법에 의해, 알려진 방법들과 관련된 단점들이 다소 해결될 수 있다. 본 발명의 목적은 독립항에 기재된 사항을 특징으로 하는 방법에 의해 달성된다. 본 발명의 바람직한 양태들은 종속항에 기재되어 있다.

본 발명에 따라서, 위의 목적은 바이오매쓰 유도된 물질로부터 하나 이상의 데옥시 당과 임의로 글리코시드를 분리하고 회수하는 신규하고 다재다능한 방법을 제공함으로써 달성된다. 본 발명에서 유용한 바이오매쓰 유도된 물질은 통상적으로 식물계 바이오매쓰로부터 유도된다. 예를 들면, 데옥시 당과, 예를 들면, 알도스 및 펜토스 당과 글리코시드, 특히 헤미셀룰로스로부터의 알킬 글리코시드를 함유하는 헤미셀룰로스 가수분해물일 수 있다. 예를 들어, 자작나무로부터 유도된 헤미셀룰로스 가수분해물에서, 푸코스와 람노스는 L형으로 존재한다.

본 발명의 방법은 강산성 양이온 교환 수지, 약산성 양이온 교환 수지, 강염기성 음이온 교환 수지 및 약염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재와 크로마토그래피적 분리에서 유일한 용출제로서의 물을 사용하는 크로마토그래피적 분획화를 1회 이상 사용하는 것을 기본으로 한다. 놀랍게도, 용출제로서 물을 사용함으로써 데옥시 당과 글리코시드를 효율적으로 분리할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 크로마토그래피적 분리 후, 목적하는 데옥시 당 또는 글리코시드가 풍부한 분획을 추가로 결정화하여 고순도의 목적하는 데옥시 당 또는 글리코시드를 얻을 수 있다.

본 발명의 크로마토그래피 방법을 사용하는 경우, 예를 들어, 순도가 10 내지 90%, 통상적으로 40 내지 80% 이상인 푸코스 분획이 얻어질 수 있다. 크로마토그래피적 분리로 얻어진 푸코스 분획은 추가로 결정화로 정제될 수 있다. 결정화는 순도가 99% 이상이고 융점이 144℃ 이상인 푸코스 생성물을 제공한다. 본 발명의 통상적인 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 불순물로서 DS 기준으로 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 포함하는 용액으로부터 수행한다. 결정형 푸코스는 통상적으로 람노스, 아라비노스, 갈락토스 및 만노스로부터 선택된 불순물들을 DS 기준으로 0.01 내지 0.1%의 양으로 함유한다.

따라서, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 의학용으로 순도가 충분한 푸코스와 같은 목적하는 데옥시 당을 얻을 수 있다는 장점을 제공한다.

본 발명과 관련된 정의

명세서 및 실시예와 청구의 범위 전반에 걸쳐, 다음 정의가 사용된다.

"데옥시 당"은 알도스 또는 케토스에서 단당류의 하이드록실 그룹을 탈산화시켜 형성된 단당류 유도체를 의미한다. 본 발명과 관련된 데옥시 당의 전형적인 예는 람노스 및 푸코스이다.

글리코시드는 글리코시드 에테르 결합을 포함하는 당 유도체이다. 본 발명과 관련된 글리코시드, 특히 알킬 글리코시드의 한 예는 메틸-α-D-크실로피라노시드(MAX)이다.

MAX는 메틸-α-D-크실로피라노시드를 의미한다.

SAC는 강산성 양이온 교환 수지를 의미한다.

WAC는 약산성 양이온 교환 수지를 의미한다.

SBA는 강염기성 음이온 교환 수지를 의미한다.

WBA는 약염기성 음이온 교환 수지를 의미한다.

DVB는 디비닐벤젠을 의미한다.

ACN은 아세토니트릴을 의미한다.

DS는 칼 피셔 적정법(Karl Fischer titration)으로 측정된 건조 물질 함량(중량%)을 의미한다.

RDS는 굴절률에 따른 건조 물질 함량(중량%)을 의미한다.

순도는 건조 물질을 기준으로 한 화합물의 함량(%)을 의미한다.

SMB는 모의 이동층법(simulated moving bed process)을 의미한다.

본 발명과 관련된 융점은, 달리 언급되지 않는 한, 유럽 약전법(European Pharmacopea method)에 의해 측정된다.

다음 도면은 본 발명의 예시적인 양태이지 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 실시예 1(Na⁺ 형태의 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는, 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화)로부터 얻어진 분리 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 2는 실시예 2(Zn²⁺ 형태의 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는, 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화)로부터 얻어진 분리 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 3은 실시예 3(Na⁺ 형태의 약산성 양이온 교환 수지를 사용하는, 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화)으로부터 얻어진 분리 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 4는 실시예 5(HSO₃ ^- 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하는, 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화)로부터 얻어진 분리 프로필을 나타내는 그래프이다.

도 5는 푸코스의 융점과 푸코스의 순도 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 6은 실시예 11(HSO₃ ^- 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하는, 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화)로부터 얻어진 분리 프로필을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 데옥시 당과, 펜토스 및 헥소스 당과 같은 통상적인 당 및 글리코시드를 함유하는 바이오매쓰로부터 유도된 용액으로부터 하나 이상의 데옥시 당 및 임의로 글리코시드를 분리하고 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 바이오매쓰로부터 유도된 용액을, 용출제로서 물을 사용하는, (1) 강산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계, (2) 약산성 양이온 교환 수지 및 약염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계 및 (3) 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계 중의 하나 이상에 적용시키고, 하나 이상의 데옥시 당 및 임의로 글리코시드가 풍부한 하나 이상의 분획을 단계(1), 단계(2) 및/또는 단계(3)으로부터 회수함을 특징으로 한다.

본 발명의 통상적인 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 푸코스 및 람노스로부터 선택된 데옥시 당과 메틸-α-D-크실로피라노시드로부터 선택된 글리코시드를 상호 또는 다른 당으로부터 분리함을 포함한다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 위의 용액을 단계(1), 단계(2) 및/또는 단계(3) 중의 둘 이상의 단계에 적용함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 위의 용액을 단계(1), 단계(2) 및/또는 단계(3)으로부터 선택된 단계들에 2회 이상 적용함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 단계(1)로부터 람노스가 풍부한 분획을 회수함을 포함한다.

본 발명의 방법의 또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 단계(2)로부터 메틸-α-D-크실로피라노시드가 풍부한 분획을 회수함을 포함한다.

본 발명의 방법의 또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 단계(3)으로부터 푸코스가 풍부한 분획을 회수함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은 단계(3), 즉, 바이오매쓰로부터 유도된 용액을 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 푸코스가 풍부한 분획을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 단계(2)에서, 약염기성 음이온 교환 수지를 사용하는 경우, 통상적으로 약산성 양이온 교환 수지와 동일한 분리 결과를 제공한다. 본 발명에서 유용한 약염기성 음이온 교환 수지는 미공개 핀란드 특허원 제20020592호(국제공개공보 제WO 03/080872호)에 기재되어 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 양태에 있어서, 당해 방법은

(1) 바이오매쓰로부터 유도된 용액을 강산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 람노스가 풍부한 분획 및/또는 푸코스로부터 선택된 데옥시 당과 메틸-α-D-크실로피라노시드로부터 선택된 글리코시드를 함유하는 하나 이상의 분획을 회수하는 단계 및

(2) 메틸-α-D-크실로피라노시드와 푸코스를 함유하는 하나 이상의 분획을 약산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 메틸-α-D-크실로피라노시드가 풍부한 분획 및 푸코스를 함유하는 분획을 회수하는 단계를 순차적으로 포함한다.

위에서 기재한 방법의 한 양태에 있어서, 당해 방법은 푸코스를 함유하는 분획을, 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 푸코스가 풍부한 분획을 회수함을 포함하는 단계(3)을 추가로 포함한다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 또한 WAC(1) + WAC(2) + SAC(3)의 분리 순서를 갖는 방법에 관한 것으로, 여기서, WAC(1)은 알도스 당의 회수율에 대한 것이고, WAC(2)는 MAX의 회수율에 대한 것이고, SAC(3)은 람노스 및 푸코스의 회수율에 대한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한 WAC(1) + SAC(2) + WAC(3)의 분리 순서를 갖는 방법에 관한 것으로, 여기서, WAC(1)은 알도스 당의 회수율에 대한 것이고, SAC(2)는 람노스의 회수율에 대한 것이고, WAC(3)은 MAX 및 푸코스의 회수율에 대한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한 WAC(1) + SBA(2)의 분리 순서를 갖는 방법에 관한 것으로, 여기서, WAC(1)은 알도스 당의 회수율에 대한 것이고, SBA(2)는 MAX, 람노스 및 푸코스의 회수율에 대한 것이다.

본 발명의 방법의 단계(1)에서 칼럼 충진재로서 사용되는 강산성 양이온 교환 수지는 1가 양이온 형태 또는 2가 양이온 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 강산성 양이온 교환 수지는 Na⁺ 형태이다. 당해 수지는 또한, 예를 들면, H⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺ 또는 Zn² ⁺ 형태일 수 있다.

강산성 양이온 교환 수지는 스티렌 또는 아크릴 골격을 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 당해 수지는 설폰화 폴리스티렌-코-디비닐벤젠 수지이다. 다른 알케닐방향족 중합체 수지, 예를 들어, 알킬 치환된 스티렌과 같은 단량체를 기본으로 하는 수지 또는 이들의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 당해 수지는 또한 다른 적합한 방향족 가교결합성 단량체, 예를 들어, 디비닐톨루엔, 디비닐크실렌, 디비닐나프탈렌, 디비닐벤젠, 또는 지방족 가교결합성 단량체, 예를 들어, 이소프렌, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, N,N'-메틸렌 비스-아크릴아미드 또는 이들의 혼합물과 가교결합될 수 있다. 당해 수지의 가교결합도는 통상적으로 디비닐벤젠과 같은 가교결합제의 약 1 내지 20%, 바람직하게는 약 3 내지 8%이다. 당해 수지의 평균 입자 크기는 대개 10 내지 2000㎛, 바람직하게는 100 내지 400㎛이다.

본 발명의 방법의 단계(2)에서 칼럼 충진재로서 사용되는 약산성 양이온 교환 수지는 1가 또는 2가 양이온 형태, 바람직하게는 Na⁺ 형태이다. 당해 수지는 또한, 예를 들면, H⁺, Mg² ⁺ 또는 Ca² ⁺ 형태일 수 있다.

약산성 양이온 교환 수지는 바람직하게는 카복실 작용성 그룹을 갖는 아크릴계 양이온 교환 수지이다. 그러나, 당해 수지는 아크릴계 수지 이외의 수지, 예를 들면, 스티렌 수지일 수 있고, 작용성 그룹은 카복실 그룹 이외의 그룹, 예를 들면, 또 다른 약산일 수 있다. 이러한 아크릴계 수지는 바람직하게는 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트 또는 아크릴로니트릴, 또는 아크릴산 또는 이들의 혼합물로부터 유도된다. 당해 수지는 가교결합제(예: 디비닐벤젠) 또는 위에서 언급된 다른 가교결합제로 가교결합시킬 수 있다. 적합한 가교결합도는 1 내지 20중량%, 바람직하게는 3 내지 8중량%이다. 당해 수지의 평균 입자 크기는 대개 10 내지 2000㎛, 바람직하게는 100 내지 400㎛이다.

본 발명의 단계(2)에서 교호 사용될 수 있는 약염기성 음이온 교환 수지는 바람직하게는 아크릴 골격을 갖는 약염기성 음이온 교환 수지이다. 당해 약염기성 음이온 교환 수지는 바람직하게는 아크릴산 에스테르(H₂=CR-COOR', 여기서, R은 H 또는 CH₃이고, R'는 메틸, 에틸, 이소프로필, 부틸 등과 같은 알킬 그룹이다), 예를 들면, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 아크릴로니트릴 또는 아크릴산 또는 이들의 혼합물로부터 유도된다. 아크릴 매트릭스는, 예를 들어, 방향족형 가교결합제, 예를 들어, 디비닐벤젠(DVB) 또는 지방족형 가교결합제, 예를 들어, 이소프렌, 1,7-옥타디엔, 트리비닐사이클로헥산, 디에틸렌 글리콜 디비닐 에테르, N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, N,N'-알킬렌 비스아크릴아미드, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 기타 디-, 트리-, 테트라-, 펜타크릴레이트 및 펜타메타크릴레이트일 수 있는 적합한 가교결합제로 가교결합시킨다. 디비닐벤젠과의 적합한 가교결합도는 1 내지 10중량% DVB, 바람직하게는 3 내지 8중량%이다. 약염기성 음이온 수지는 가교결합된 폴리아크릴계 중합체를 모노-, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사아민 또는 기타 폴리아민과 같은 적합한 아민으로 아민화하여 제조한다. 예를 들어, 디메틸아민, 디에틸렌 트리아민, 트리에틸렌 테트라민, 테트라에틸렌 펜타민, 펜타에틸렌 헥사민 및 디메틸아미노프로필아민이 적합한 아민이다.

또 다른 약염기성 음이온 교환 수지 구조는 에피클로로하이드린계 중축합 음이온 교환제이다. 에피클로로하이드린의 클로로메틸 및 에폭시 그룹은 폴리아민과 반응하여 가교결합된 겔형 음이온 교환제를 형성한다. 예를 들면, 에피클로로하이드린을 트리에틸렌테트라민과 축합시켜 음이온 수지 구조물을 생성시킨다. 이러한 유형의 음이온 수지는 약염기성 (3급 아민) 및 강염기성 (4급 암모늄) 작용성 그룹 둘 다를 함유한다.

또 다른 부류의 약염기성 음이온 교환 수지는 페놀 및 포름알데히드의 아민화 중축합 생성물이다.

또 다른 잘 알려진 약염기성 음이온 교환 수지 제조방법은 지방족 아민과 암모니아 중축합 수지를 사용하는 것이다. 단량체성 아민 또는 암모니아가, 예를 들면, 포름알데히드와 반응하는 경우, 가교결합된 수지 구조물이 형성된다. 아민과 포름알데히드의 반응으로 메틸올 및/또는 아조메틴 그룹이 형성되고, 이는 추가로 반응하여 중축합물을 형성시킬 수 있다. 잘 알려진 이러한 유형의 구조는 포름알데히드, 아세톤 및 테트라에틸렌펜타민의 반응 수지이다. 방향족 아민 또한 포름알데히드와 가교결합되어 약염기성 음이온 교환제를 생성시킬 수 있다.

피리딘을 작용성 그룹으로서 갖는 상이한 유형의 가교결합된 폴리비닐피리딘계 이온 교환제가 또한 약염기성 음이온 교환제로서 유용하다.

당해 수지의 평균 입자 크기는 대개 10 내지 2000㎛, 바람직하게는 100 내지 400㎛이다.

본 발명의 방법의 단계(3)에서 칼럼 충진제로서 사용되는 강염기성 음이온 교환 수지는 통상적으로 HSO₃ ^- 형태이다. 당해 강염기성 음이온 교환 수지는 스티렌 또는 아크릴 골격을 가질 수 있다. 당해 수지는 디비닐벤젠과 가교결합될 수 있다. 기타 알케닐방향족 중합체 수지, 예를 들면, 알킬 치환된 스티렌과 같은 단량체 또는 이들의 혼합물을 기본으로 하는 수지가 또한 사용될 수 있다. 당해 수지는 또한 기타 적합한 방향족 가교결합성 단량체, 예를 들어, 디비닐톨루엔, 디비닐크실렌, 디비닐나프탈렌, 디비닐벤젠, 또는 지방족 가교결합성 단량체, 예를 들어, 이소프렌, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, N,N'-메틸렌 비스-아크릴아미드 또는 이들의 혼합물과 가교결합될 수 있다. 당해 수지의 가교결합도는 통상적으로 디비닐 벤젠과 같은 가교결합제의 약 1 내지 20%, 바람직하게는 약 3 내지 8%이다. 당해 수지의 평균 입자 크기는 대개 10 내지 2000㎛, 바람직하게는 100 내지 400㎛이다.

본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 단계(1), 단계(2) 및 단계(3)에서 사용되는 수지는 겔형 수지이다.

당해 수지의 제조자는, 예를 들면, 파이넥스 리미티드(Finex Ltd), 다우 케미칼즈(Dow Chemicals), 바이엘 케미칼즈(Bayer Chemicals), 푸롤라이트 캄파니(Purolite Co.) 및 롬 앤드 하스 캄파니(Rohm & Haas Co.)이다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 각각의 수지는 개별 칼럼에 존재한다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 둘 이상의 상이한 수지(SAC, WAC, SBA 및 WBA)는 하나의 칼럼에 부분 충진재 층으로서 포함될 수 있고, 이에 의해 칼럼은 각각 상이한 수지를 함유하는 둘 이상의 부분 칼럼을 포함한다.

크로마토그래피적 분획화 작업에 있어서, 수지의 양이온/음이온은 바람직하게는 시스템의 공급 용액의 양이온/음이온과 실질적으로 평형이다.

본 발명의 방법의 크로마토그래피적 분획화에 사용되는 용출제는 물이다.

크로마토그래피적 분획화의 온도는 통상적으로 20 내지 90℃, 바람직하게는 40 내지 65℃이다. 분획화될 용액의 pH는 통상적으로 2 내지 9이다.

크로마토그래피적 분획화는 배치식으로 또는 모의 이동층법(SMB법)으로 수행될 수 있다. SMB법은 바람직하게는 순차적 또는 연속 공정으로 수행된다.

모의 이동층법에 있어서, 크로마토그래피적 분획화는 통상적으로 직렬로 연결되어 하나 이상의 루프(loop)를 형성하는 3 내지 14개의 칼럼을 사용하여 수행된다. 칼럼은 도관과 연결된다. 칼럼 속에서의 유속은 통상적으로 칼럼 단면적으로 0.5 내지 10m³/(hm²)이다. 칼럼을 위에서 기재한 수지들로부터 선택된 칼럼 충진재로 충전시킨다. 칼럼에 공급 라인과 생성물 라인을 제공하여 공급 용액과 용출제가 칼럼으로 공급되고 생성물 분획이 칼럼으로부터 수집될 수 있도록 한다. 생성물 라인에 온-라인 기기를 제공하여 생성물 유동의 품질/양을 작동 동안 모니터링할 수 있도록 한다.

크로마토그래피적 SMB 분리 동안, 공급 용액을 펌프를 이용해 루프에서 칼럼을 통해 순환시킨다. 용출제를 가하고, 목적하는 데옥시 당을 함유하는 생성물 분획, 기타 임의의 생성물 분획 및 잔류 분획을 칼럼으로부터 수집한다. 칼럼 속에서 용출제를 칼럼 상부로부터 또는 칼럼 기저부로부터 유동시킬 수 있다.

크로마토그래피적 분획화하기 전에 공급 용액을, 예를 들면, 이온 교환 처리 또는 희석에 의한 유연화, 증발에 의한 농축, pH 조정, 여과 및 막 여과로부터 선택된 하나 이상의 전처리 단계에 적용시킬 수 있다. 칼럼으로 공급하기 전에 공급 용액 및 용출제를 위에서 기재한 분획화 온도(예: 50 내지 85℃)로 가열한다.

크로마토그래피적 분획화는 하나 이상의 데옥시 당과 임의로 글리코시드가 풍부한 하나 이상의 분획을 제공한다.

크로마토그래피적 분획화의 수율을 향상시키기 위해서 크로마토그래피적 분획화의 재순환 분획을 또한 사용할 수 있다.

본 발명의 크로마토그래피적 분획화 방법은 막 여과, 이온 교환, 증발 및 여과로부터 선택된 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이들 정제 단계는 크로마토그래피적 분획화 단계 전, 후 또는 단계들 사이에 수행될 수 있다.

크로마토그래피적 분획화로부터 얻어진 목적하는 데옥시 당이 풍부한 분획을 결정화로 추가로 정제하여 결정형 데옥시 당 생성물을 얻을 수 있다.

결정화는 통상적으로 증발 및 냉각 결정화를 사용하여 수행된다. 결정화 용매는 물, 유기 용매, 예를 들면, 알콜, 바람직하게는 에탄올 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

이하에서는, 푸코스의 결정화를 참조하여 데옥시 당의 결정화를 보다 상세히 설명한다.

푸코스의 결정화는 통상적으로 물, 유기 용매, 예를 들면, 알콜, 바람직하게는 에탄올 및 이들의 혼합물, 예를 들면, 물과 에탄올의 혼합물을 사용하여 수행된다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 결정화는 물을 사용하여 수행되거나 물과 에탄올의 혼합물을 사용하여 수행된다.

결정화는 통상적으로 크로마토그래피적 분획화로부터 얻어진 푸코스가 풍부한 용액을 적합한 건조 물질 함량(예: 액체의 용해도 및 조성에 따라 RDS 기준으로 약 70 내지 90%)으로 증발시킴으로써 수행된다. 당해 용액을 푸코스의 씨드 결정을 사용하여 씨딩할 수 있다. 사용되는 경우, 당해 씨드는 건조 형태의 분쇄된 결정이거나, 물, 알콜(예: 에탄올) 또는 이들의 혼합물일 수 있는 결정화 용매에 현탁된다. 전형적인 결정화 용매는 물이다. 결정 성장 포텐셜 및 점도가 허용한다면, 씨딩 후 계속 증발시킬 수 있다. 증발 후, 결정화 매쓰(mass)를, 결정화 매쓰의 결정 함량 또는 점도가 충분히 높을 때까지 동시에 혼합하면서 냉각시킬 수 있다. 이어서, 수율을 증가시키기 위해 추가의 냉각이 필요하거나 결정을 분리하기 위해 낮은 점도가 요구되는 경우, 결정화 용매를 가할 수 있다. 결정화 매쓰는 통상적으로 10 내지 40℃의 온도로 냉각된다. 그 다음, 결정화 매쓰를 최종 온도에서 최대 결정화 수율에 도달하는 시간 동안, 바람직하게는 0.5시간 내지 6일 동안 혼합한 후, 결정을, 예를 들어, 여과하여 분리한다. 여과는 통상적인 원심분리 또는 필터를 사용하여 수행할 수 있다. 여과 케이크를 결정화 용매로 세척하고 건조시킨다. 건조는, 예를 들어, 30 내지 90℃의 온도에서 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 고순도의 푸코스 결정을 얻는다. 결정화는 통상적으로 순도가 DS 기준으로 99% 이상이고 융점이 142.5℃, 바람직하게는 144℃ 이상인 결정형 푸코스를 제공한다.

푸코스의 분별 결정화에 있어서, 결정화는 순도가 60% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상인 결정형 푸코스를 제공한다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 DS 기준으로 45% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행된다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 DS 기준으로 80% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행된다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 다음 불순물 프로필을 추가로 함유하는 용액으로부터 수행된다: DS 기준으로 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 다음 불순물 프로필의 존재하에 45% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행된다: DS 기준으로 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스. 결정화는 통상적으로 물과 에탄올의 혼합물로부터 수행되고, 매쓰의 점도는 통상적으로 5 내지 500Pas이며, 체류 시간은 0.5 내지 10일이고, 온도 범위는 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 푸코스의 결정화는 위에서 기재한 불순물 프로필의 존재하에 80% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행된다. 결정화는 6 내지 80시간 동안 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃의 온도에서 수행되고, 유기 용매의 부재하에 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한, DS 기준으로 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 포함하는 불순물 프로필의 존재하에 45% 이상의 푸코스를 함유하는 바이오매쓰 유도된 용액으로부터 수행되는 푸코스의 결정화 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한, DS 기준으로 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 포함하는 불순물 프로필의 존재하에 80% 이상의 푸코스를 함유하는 바이오매쓰 유도된 용액으로부터 수행되는 푸코스의 결정화 방법을 제공한다.

위에서 기재된 결정화 공급물의 바람직한 불순물 프로필은, 예를 들면, 크로마토그래피적 분획화, 바이오매쓰 가수분해물의 분별 결정화 또는, 바람직하게는 위에서 기재한 단계(1) 내지 단계(3)에서 제조된 상이한 조성의 액체를 혼합함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 방법은 통상적으로 결정화로부터 얻어진 결정을 세척하는 추가 단계를 포함한다. 세척제는 통상적으로 물, 유기 용매(예: 에탄올) 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.

결정화 공급물의 통상적인 건조 물질 함량은 30 내지 70중량%이다. 푸코스 결정화 매쓰의 적합한 점도는 50 내지 300Pas이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 또한 융점이 144℃ 이상, 가장 바람직하게는 145℃ 이상이고 순도가 DS 기준으로 99% 이상인 신규한 결정형 푸코스 생성물을 제공한다. 당해 신규한 결정형 푸코스 생성물은 위에서 기재된 방법으로, 특히 위에서 기재한 불순물 프로필의 존재하에 45% 이상의 푸코스, 통상적으로 80% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 푸코스를 결정화함으로써 얻어질 수 있다.

데옥시 당 회수용 출발 물질은 통상적으로 데옥시 당, 글리코시드, 기타 단당류 및 기타 탄수화물을 함유하는 혼합물이다. 본 발명의 통상적인 양태에 있어서, 데옥시 당은 람노스와 푸코스를 포함하고 글리코시드는 메틸-α-D-크실로피라노시드를 포함한다. 혼합물은 또한 이당류 및 고급 사카라이드를 함유할 수 있다.

데옥시 당 회수용 출발 물질은 바이오매쓰, 바람직하게는 식물계 바이오매쓰, 통상적으로 헤미셀룰로스 함유 식물계 재료, 예를 들면, 침엽수 또는 활엽수, 짚 또는 곡물 깍지, 옥수수 껍질, 옥수수 콥(cop), 옥수수 섬유, 사탕수수 껍질 및 사탕무우로부터 유도될 수 있다. 자작나무 또는 너도밤나무와 같은 활엽수로부터 유도된 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰가 본 발명에서 출발 물질로서 사용하기에 특히 바람직하다.

위에서 언급한 출발물질 속의 데옥시 당의 함량은 통상적으로 매우 낮다. 예를 들면, 푸코스의 함량은 0.01중량% 정도로 낮을 수 있다.

데옥시 당 회수용 출발물질은 통상적으로 위에서 기재한 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰의 가수분해물이다. 가수분해물은 통상적으로 바이오매쓰의 온화한 산 가수분해 또는 효모적 가수분해로부터 얻어진다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 출발 물질은 헤미셀룰로스 가수분해물이거나 헤미셀룰로스 가수분해물로부터 유도된 용액이다.

본 발명에 따르는 데옥시 당 회수용 바이오매쓰 가수분해물은 통상적으로 펄프화 공정으로부터 얻어지는 폐액이다. 폐액은 특히 산성, 염기성 또는 중성 아황산염 펄프화, 바람직하게는 산 아황산염 펄프화로 얻어질 수 있는 아황산염 펄프화 폐액이다. 폐액의 통상적인 푸코스 함량은 0.01 내지 0.05중량%이다. 크로마토그래피적 분획화 단계에서의 폐액 분획의 통상적인 푸코스 함량은 4 내지 6중량%이다. 푸코스의 사전 집적화(pre-enrichment)가 폐액으로부터 크실로스의 크로마토그래피적 분리 및/또는 결정화로 수행될 수 있다.

본 발명에서 유용한 통상적인 폐액은, 바람직하게는 산 아황산염 펄프화로부터 얻어지는 폐액이다. 폐액은 아황산염 펄프화로부터 직접 얻어질 수 있다. 이는 또한 농축된 아황산염 펄프화 액 또는 아황산염 증해(cooking)로 얻어지는 사이드-릴리프(side-relief)일 수 있다. 이는 또한 아황산염 펄프화액으로부터 크로마토그래피적으로 얻어지고 데옥시 당을 함유하는 분획일 수 있다.

데옥시 당 함유 출발 물질은, 예를 들면, 크실로스, 람노스 및/또는 만노스 대부분이 분리된 아황산염 펄프화 폐액, 예를 들면, 국제공개공보 제WO 02/27039호(미국 공보 제02/0120135호)에 기재되어 있는 액일 수 있다.

본 발명의 하나의 통상적인 양태에 있어서, 출발 용액은 데옥시 당 이외에, 통상적인 당, 예를 들어, 통상적으로 바이오매쓰의 헤미셀룰로스로부터 유도되는 알도스 당을 함유한다.

본 발명의 또 다른 통상적인 양태에 있어서, 출발 용액은 크실로스 회수 후 크실로스 회수 공정으로부터 분리되거나 람노스 회수 후 람노스 회수 공정으로부터 분리되고 데옥시 당이 풍부한 부 스트림이다. 이러한 부 스트림은, 예를 들면, 결정화 공정 단계로부터의 모액 또는 크로마토그래피적 분리 공정 단계로부터의 부산물 분획 등일 수 있다. 위에서 언급한 람노스 회수 공정은, 예를 들면, 크실로스를 회수한 후 아황산염 폐액으로부터 람노스를 회수하는 공정을 의미한다(국제공개공보 제WO 02/27039호). 약산성 양이온 교환 수지를 칼럼 충진재로서 사용함으로써, 람노스와 같은 데옥시 당을 헥소스 및 펜토스 당으로부터 분리할 수 있다. Na⁺ 형태의 약산성 양이온 교환 수지를 상승된 pH에서 사용함으로써, 람노스가 헥소스 및 펜토스 당보다 먼저 용출된다.

출발 물질은 또한 사탕무우 또는 사탕수수로부터 유도된 용액일 수 있다.

데옥시 당 및 글리코시드 회수용 기타 원료로서, 예를 들면, 해조류에서 발견되는 푸코이단, 및 감자, 카사바 덩이줄기, 키위 과실, 날개달린 강낭콩 변종 및 캐놀라의 세포벽에서 발견되는 식물 다당류를 언급할 수 있다.

본 발명은 또한 융점이 144℃ 이상이고 순도가 DS 기준으로 99% 이상인, 바이오매쓰에 기초한 결정형 L-푸코스에 관한 것이다. 본 발명의 L-푸코스 결정은 통상적으로 평균 입자 크기가 100 내지 250㎛이고 최소 길이가 50㎛이고 최소 폭이 20㎛이다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 식물계 바이오매쓰에 기초한 결정형 L-푸코스에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 당해 결정형 L-푸코스는 융점이 145℃ 이상이고 순도가 DS 기준으로 99.5% 이상이다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 위에서 기재한 결정화 방법으로, 특히 물로 결정화한 후 세척함으로써 얻을 수 있는 결정형 L-푸코스에 관한 것이다.

본 발명은 또한 식품 보충물, 약제 및 화장품 성분으로서의 본 발명의 결정형 L-푸코스의 용도에 관한 것이다.

다음 실시예는 본 발명을 제한하지 않고 본 발명의 예시적인 양태를 나타낸다.

다음 실시예에서, 람노스 및 푸코스는 L형이다.

실시예 1

Na⁺ 형태의 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화

크로마토그래피적 분리용 공급물로서 사용되는 데옥시 당 함유 용액은 대부분의 크실로스 회수 후 Ca² ⁺계 아황산염 폐액으로부터 분리된 부 스트림이다(국제공개공보 제WO 02/27039호; 미국 공보 제02/0120135호). 자작나무를 아황산염 증해용 원료로서 사용한다. 공급 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다:

공급물 조성
건조 고형물(g/100ml)	42
푸코스(%, RDS 기준)	5.7
람노스(%, RDS 기준)	23.2
MAX(%, RDS 기준)	13.0
기타 물질(%, RDS 기준)	58.1

크로마토그래피적 분획화를 파일럿 스케일(pilot scale) 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행한다. 직경이 1m인 칼럼에 스티렌 골격을 갖는 강산성 양이온 교환 수지(Finex CS11GC, 제조원: Finex Ltd.)를 충전시킨다. 당해 수지는 Na⁺ 형태였다. 수지 층의 높이는 대략 4.8m였다. 당해 수지의 DVB 함량은 5.5중량%였고, 수지의 평균 입자 크기는 0.31mm였다. 칼럼, 공급 용액 및 용출제인 물의 온도는 65℃였다. 칼럼에서의 유속은 550ℓ/h로 조정했다.

크로마토그래피적 분획화를 다음과 같이 수행했다:

단계 1: 공급 용액의 건조 물질을 용액의 굴절률(RI)에 따라서 용액 100g 속의 건조 물질 37g으로 조절한다.

단계 2: 예열된 공급 용액 60ℓ를 수지 층 상부로 펌핑한다.

단계 3: 예열된 이온 교환수를 칼럼의 상부로 공급함으로써 공급 용액을 칼럼의 하류로 용출시킨다.

단계 4: 유출되는 용액 샘플 50ml를 5분 간격으로 수집한다. 샘플의 조성을 굴절률 검출기 및 2배의 아미노 칼럼이 장착된 HPLC로 분석(75% ACN을 용출제로서 사용)한다.

람노스가 푸코스 및 MAX보다 먼저 칼럼으로부터 용출되고 푸코스와 MAX는 거의 동시에 용출되었다. 다음 표에 제시된 순도와 수율을 갖는, 람노스가 풍부한 분획 및 푸코스와 MAX가 풍부한 분획을 분리할 수 있다. 분획 속의 성분의 수율은 재순환 분획 및 잔류 분획도 포함하여, 모든 유출 분획 속의 성분의 총량에 대해 기재한다.

	람노스 분획	푸코스 및 MAX 분획
조성
람노스(%, RDS 기준)	44.9	15.4
푸코스(%, RDS 기준)	0.6	10.4
MAX(%, RDS 기준)	1.3	24.5

수율
람노스(%)	50	27.7
푸코스(%)	3	78.1
MAX(%)	2.7	84.4

람노스가 풍부한 분획을 람노스 추가 처리 공정에 가할 수 있다.

유출물(유출 용액)의 pH는 4 내지 6이었다. 분리 프로필을 도 1에 도시한다.

실시예 2

Zn²⁺ 형태의 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화

크로마토그래피적 분획화용으로 사용되는 공급 용액은 국제공개공보 제WO 02/27039호(미국 공보 제02/0120135호)에 기재되어 있는 람노스 회수 공정으로부터 얻어진다. 공급 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다:

공급물 조성
건조 고형물(g/100ml)	25
푸코스(%, RDS 기준)	13.0
람노스(%, RDS 기준)	9.2
MAX(%, RDS 기준)	37.0
기타 물질(%, RDS 기준)	70.8

크로마토그래피적 분획화를 실험실용 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행한다. 직경이 0.09m인 칼럼에 스티렌 골격을 갖는 강산성 양이온 교환 수지(Finex CS11GC, Finex Ltd.)를 충전시켰다. 수지 층의 높이는 대략 1.5m였다. 수지의 DVB 함량은 5.5중량%였고, 수지의 평균 입자 크기는 0.31mm였다. 당해 수지는 Zn²⁺ 형태로 재생되었다. 칼럼, 공급 용액 및 용출제인 물의 온도는 65℃였다. 칼럼에서의 유속은 50㎖/min으로 조정했다.

크로마토그래피적 분획화를 다음과 같이 수행했다:

단계 1: 공급 용액의 건조 물질을 용액의 굴절률(RI)에 따라서 용액 100g 속의 건조 물질 25g으로 조절한다.

단계 2: 예열된 공급 용액 800ml를 수지 층 상부로 펌핑한다.

단계 4: 유출되는 용액 샘플 10ml를 3분 간격으로 수집한다. 샘플의 조성을 펄스화된 전기화학적 검출기 및 카보팩(CarboPac) PA1™ 음이온 교환 칼럼이 장착된 디오넥스(Dionex) HPLC로 분석(물 및 0.2M NaOH를 용출제로서 사용)한다.

람노스가 푸코스와 MAX보다 먼저 용출되었고, 푸코스와 MAX는 거의 동시에 용출되었다. 다음 표에 제시된 순도와 수율을 갖는 람노스가 풍부한 분획 및 푸코스와 MAX가 풍부한 분획을 분리할 수 있다.

	람노스 분획	푸코스 및 MAX 분획
조성
람노스(%, RDS 기준)	20.2	4.1
푸코스(%, RDS 기준)	7.7	15.4
MAX(%, RDS 기준)	7.3	45.4

수율
람노스(%)	56.6	43.4
푸코스(%)	11.7	88.3
MAX(%)	4.1	95.9

유출물(유출 용액)의 pH는 3 내지 4였다. 분리 프로필을 도 2에 도시한다.

실시예 3

Na⁺ 형태의 약산성 양이온 교환 수지를 사용하는 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화

크로마토그래피적 분획화용으로 사용되는 공급 용액은 실시예 1(Na⁺ 형태의 SAC를 사용한 분리)에 따라서 얻어지는 푸코스, MAX, 람노스 및 기타 단당류를 함유하는 분획이다. 공급 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다:

공급물 조성
건조 고형물(g/100ml)	36.7
푸코스(%, RDS 기준)	12.6
람노스(%, RDS 기준)	14.8
MAX(%, RDS 기준)	21.2
기타 물질(%, RDS 기준)	51.4

크로마토그래피적 분획화를 파일럿 스케일 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행했다. 직경이 0.60m인 칼럼에 아크릴 골격을 갖는 약산성 양이온 교환 수지(Finex CS16GC, 제조원: Finex Ltd.)를 충전시켰다. 당해 수지는 Na⁺ 형태로 재생되었다. 수지 층의 높이는 대략 5.2m였다. 수지의 DVB 함량은 8중량%였고, 수지의 평균 입자 크기는 0.33mm였다. 칼럼, 공급 용액 및 용출제인 물의 온도는 65℃였다. 칼럼에서의 유속은 150ℓ/h로 조정했다.

크로마토그래피적 분획화를 다음과 같이 수행했다:

단계 1: 공급 용액의 건조 물질을 용액의 굴절률(RI)에 따라서 용액 100g 속의 건조 물질 33g으로 조절한다.

단계 2: 예열된 공급 용액 150ℓ를 수지 층 상부로 펌핑한다.

단계 4: 유출되는 용액의 분획 샘플을 8분 간격으로 수집한다. 샘플의 조성을 굴절률 검출기 및 2배의 아미노 칼럼이 장착된 HPLC로 분석(75% ACN을 용출제로서 사용)한다.

용출 순서는 메틸-α-D-크실로스(MAX), 람노스 및 푸코스 순이었고, 이들은 부분적으로 중첩되었다. 기타 단당류 일부가 푸코스 다음에 개별 피크로서 용출되었다. Na⁺형 WAC 수지를 사용하여 위에서 언급한 각각의 성분이 풍부한 분획을 아래 표에 제시된 바와 같이 분리할 수 있었다.

	람노스 분획	푸코스 분획	MAX 분획
조성
람노스(%, RDS 기준)	26.8	9	11.6
푸코스(%, RDS 기준)	17.6	32	2.1
MAX(%, RDS 기준)	4.1	1.3	47.5

수율
람노스(%)	48.6	13.4	35.7
푸코스(%)	35.4	53.1	7.3
MAX(%)	4.6	1.2	91.7

유출물의 pH는 9.2 내지 9.7이었다. 분리 프로필을 도 3에 도시한다.

실시예 4

HSO₃ ^- 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하는 데옥시 당 함유 용액의 예비처리

예비처리 단계를 파일럿 스케일 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행한다. 직경이 0.225m인 칼럼을 아크릴 골격을 갖는 강염기성 음이온 교환 수지(Duolite A 101D)로 충전시켰다. 평균 비드 크기는 0.35mm였다. 수지 층의 높이는 대략 3.5m였다. 수지를 중아황산염(HSO₃ ^-) 형태로 재생시키고 공급 장치를 수지 층 상부에 놓았다. 칼럼 및 공급 용액의 온도는 25℃였다. 칼럼에서의 유속은 20ℓ/h이도록 조정했다. 공급 용액의 pH는 4 내지 4.5였다.

공급물로서 실시예 3으로부터의 시럽(WAC(Na⁺))을 사용했고, 이러한 예비처리의 목적은 크로마토그래피적 분리 수지로부터 HSO₃ ^- 이온을 전위시킬 수 있는 화합물을 제거하기 위한 것이다.

예비처리 단계는 다음과 같이 수행되었다:

단계 1: 짧은 수층을 수지 표면 위에서 볼 수 있을 때까지 용출제인 물 수준을 강하시킨다.

단계 2: 공급 용액 1500 내지 2000ℓ를 칼럼을 통해 유동시킨다.

단계 3: 짧은 용액층을 수지 표면 위에서 볼 수 있을 때까지 공급 용액 수준을 강하시킨다.

단계 4: 생성물에서 건조 물질이 측정되지 않을 때까지 용출제인 물을 칼럼을 통해 유동시킨다.

예비처리 단계는 데옥시 당의 순도를 증가시키지 않으며 분해도 일으키지 않았다. 푸코스 분획으로부터의 색 제거 및 다음 분리에서의 안정성 효과는 유의하다. 유출 용액의 pH는 약 4였다.

실시예 5

HSO₃ ^- 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하는 데옥시 당 함유 용액의 크로마토그래피적 분획화

크로마토그래피적 분획화용으로 사용되는 공급 용액은 실시예 3(Na⁺ 형태의 WAC를 사용한 분리)에 따라서 얻어지는 데옥시 당을 함유하는 분획이다. 공급 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다:

공급물 조성
건조 고형물(g/100ml)	42.5
푸코스(%, DS 기준)	47.9
람노스(%, DS 기준)	10.5
MAX(%, DS 기준)	2.2
기타 물질(%, DS 기준)	39.4

크로마토그래피적 분획화를 파일럿 스케일 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행했다. 직경이 0.6m인 칼럼에 아크릴 골격을 갖는 강염기성 음이온 교환 수지(Finex As 532 GC, 3.5% DVB)를 충전시켰다. 수지 층의 높이는 대략 4.8m였다. 수지의 평균 입자 크기는 0.35mm였다. 당해 수지는 중아황산염(HSO₃ ^-) 형태로 재생되었다. 칼럼, 공급 용액 및 용출제인 물의 온도는 40℃였다. 칼럼에서의 유속은 283ℓ/h로 조정했다.

크로마토그래피적 분획화를 다음과 같이 수행했다:

단계 2: 예열된 공급 용액 100ℓ를 수지 층 상부로 펌핑한다.

단계 4: 유출되는 용액 샘플 50ml를 10분 간격으로 수집한다. 샘플의 조성을 아미노 칼럼이 장착된 HPLC 장치로 분석하고, ACN(79%)을 용출제로서 사용한다.

MAX를 포함하는 기타 단당류 대부분이 푸코스 및 람노스보다 먼저 개별 피크로서 칼럼으로부터 용출되었다. 람노스는 푸코스 다음에 칼럼으로부터 용출되었지만, 이들은 부분적으로 중첩되었다. 중아황산염 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하여 다음 표에 나타낸 바와 같은 푸코스 및 람노스가 풍부한 분획을 분리할 수 있다.

	푸코스 분획	람노스
조성
람노스(%, RDS 기준)	6.4	70.2
푸코스(%, RDS 기준)	82.6	20.8

수율
람노스(%)	39.6	60.4
푸코스(%)	94.7	3.3

유출물(예: 유출 용액)의 pH는 4.0 내지 4.3이었다. 분리 프로필을 도 4에 도시한다.

실시예 6

푸코스의 냉각 결정화

(EtOH와 물의 혼합물 속에서의 결정화에 의해 계속된 수성 결정화)

DS 기준으로 71.8%의 푸코스, 1.4%의 크실로스, 0.9%의 아라비노스, 5.3%의 람노스 및 0.2% 미만의 갈락토스를 함유하는, 크로마토그래피적으로 풍부한 푸코스 시럽으로부터 냉각 결정화를 수행한다. 공급 시럽의 총 55kg의 건조 물질을 감압에서 증발시켜 농축시키고, 100ℓ 냉각 결정화기로 옮긴다. 건조 물질 함량이 89.3중량%인 시럽을 50℃에서 혼합한다. 혼합하는 동안 씨딩이 자발적으로 일어난다. 50℃에서 약 20시간 동안 혼합한 후, 모액의 건조 물질 농도는 85.3중량%이고, 이는 푸코스 결정화 수율 29%에 상응한다. 에탄올 25ℓ를 가하여 점도를 감소시키고, 매쓰를 40시간 이내에 20℃로 냉각시킨다. 결정화 매쓰를 약 20℃에서 3일 동안 혼합하여 최대 푸코스 결정화 수율을 얻는다. 이어서, 통상적인 바스켓 원심분리를 사용하여 결정을 모액으로부터 분리한다. 총 26.5kg의 습윤 결정이 얻어졌다. 결정을 에탄올 20ℓ와 혼합하여 세척하고 원심분리한 후, 건조시킨다. 순도가 99% 이상인 총 24.5kg의 푸코스 결정이 얻어졌다. 푸코스의 수율은 공급 시럽 속의 푸코스의 62%였다. 푸코스 생성물의 융점은 145.1℃였다.

분쇄하기 전후에 유럽 약전법에 따라서 융점 측정을 3회 실시했다. 건조된 결정의 융점은 145.0, 145.0 및 144.6℃였고, 미분된 샘플의 융점은 145.2, 145.4 및 145.4℃였다. 모든 측정치의 평균은 145.1℃였다. 또한, 가열 속도 2℃/min으로 40℃로부터 160℃로 가열하면서 시차주사열량계(Mettler FP84HT)로 열 거동을 측정했다. 서모그램(thermogram)에서 하나의 피크가 보였고 피크 온도는 143.5℃였다.

실시예 7

용매로서 물을 사용하는, 푸코스의 결정화

(수성 비등 결정화 후 물 속에서의 냉각 결정화)

결정화용 출발물질은 실시예 5에 따라서, 즉 3회의 순차적 크로마토그래피적 분획화(Na⁺ 형태의 SAC, Na⁺ 형태의 WAC 및 HSO₃ ^- 형태의 SBA)로부터 얻어진 푸코스가 풍부한 분획이다. 출발 푸코스 용액은 DS 기준으로 86.3%의 푸코스, 0.8%의 크실로스, 0.3%의 아라비노스, 4.5%의 람노스 및 0.2% 미만의 갈락토스를 함유한다. 사전 결정화로부터 얻어진 저순도 중간체 푸코스 결정의 일부를 용해시키고 출발 용액과 혼합하여 결정화 공급 액체를 얻는다. 이렇게 얻어진 공급 액체의 조성은 HPLC(아미노형 수지, +55℃, 50% H₃PO₄ 6ml/l를 함유하는 79% ACN)로 측정된 바에 따르면 DS 기준으로 푸코스 88.3%, 크실로스 1.1%, 아라비노스 0.3%, 람노스 4.1%, 갈락토스 0.2% 및 MAX 0.5% 미만이었다. 공급 용액의 pH는 4.3이었고 건조 물질 함량(DS)은 34.1%(w/w)였다. 공급 시럽의 총 280kg DS를 감압하에 증발 결정화기로 농축시킨다. 54.5℃에서 건조 분쇄된 푸코스 씨드 결정 40g을 사용하여 씨딩을 수행한다. 씨드 결정은 사전 결정화의 생성물을 분쇄하여 제조한다. 씨딩 후, 시럽의 나머지 부분을 공급하고 결정화 매쓰를 감압하에 농축시킴으로써 비등성 결정화 매쓰를 제조한다. 총 240ℓ의 비등성 결정화 매쓰를 통상적인 냉각 결정화기로 옮긴다. 매쓰를 40시간 이내에 55℃로부터 23.5℃로 서서히 냉각시킨다. 23.5℃에서 약 9시간 동안 혼합한 후의 결정화 수율은 푸코스 약 59%였다. 결정화 과정은 다음과 같다:

시간	온도	DS, ml
hrs	℃	% w/w
0	54.5	80.4	증발 결정화기에 씨드 결정 40g의 씨딩
2	55.0	82.1	냉각 결정화 개시(DS, 매쓰 83.0)
22	40.7	75.3
42	23.0	70.8	냉각 종료
51	23.5	70.7	원심분리, 결정 세척 및 건조 시험

실험실용 바스켓 원심분리기 로토 실렌타 II(Roto Silenta II)(7분/3350rpm, 세척수 50ml)로 원심분리 시험을 행한다. 총 483g의 습윤 결정이 결정화 매쓰 1155g으로부터 얻어진다. 원심분리 결과는 다음과 같다:

	총량 (g)	DS (%)	푸코스 (%, DS 기준)	DS (g)
결정화 매쓰	1155	83.0	86.3	958.7
원심분리된 결정	483	97.6	98	471.4

건조(40℃에서 약 6시간)로 인해 건조물이 2.4% 손실된다. 결정 순도는 DS 기준으로 98%이었고, 융점은 136.6℃였다. 푸코스 수율은 이용가능한 푸코스의 양을 기준으로 하여 54.6%였다. 원심분리된 결정의 일부를 99.5% 에탄올과 혼합하여 세척하고, 원심분리한 후, 건조시켰다. 그 결과, 순도가 99% 이상이고 융점이 146.1℃이고 길이가 50㎛ 이상이고 폭이 20㎛ 이상인 입자 크기의 결정형 생성물이 얻어진다. 순도가 99% 이상인 푸코스 결정의 생성물 수율은 약 50%이다. 본 실시예는 공급 액체의 조성이 임계 한도 내에 있고 불순물이 침전되지 않지만 모액을 사용하여 결정으로부터 세척 제거할 수 있는 경우, 수용액으로부터 결정화함으로써 고순도 푸코스 결정을 얻을 수 있음을 입증한다.

실시예 8

물과 에탄올의 혼합물을 용매로서 사용하는 푸코스의 결정화

(수성 비등 결정화 후, EtOH와 물의 혼합물 속에서 냉각 결정화)

결정화용 공급 시럽은 실시예 7에서와 동일한 푸코스 용액이다. 실시예 7에서와 동일한 방식으로 결정화를 개시한다. 실시예 6에서 기재한 비등성 결정화를, 결정 함량이 점도를 높일 때까지 물 용매 속에서 냉각 결정화로 계속한다. 이어서, 99.5% 에탄올 30ℓ를 결정화 매쓰에 혼합하여 점도를 낮추고 15시간 이내에 23.5℃로부터 15.5℃로 냉각시킴으로써 결정화를 계속한다. 그 다음, 통상적인 바스켓 원심분리기를 사용하여 모액으로부터 결정을 분리한다. 총 154.5kg의 습윤 결정이 얻어진다. 결정을 99.5% 에탄올 100ℓ와 혼합하여 세척하고, 원심분리시키고, 건조시킨다. 순도가 99% 이상이고 융점이 145.5℃인 결정형 생성물 총 121.5kg이 얻어졌다. 비선광도 [α]_D ²⁰은 -74.7°였다. 푸코스 생성물의 수율은 약 50%였다. 본 실시예는 공급 액체의 조성이 임계 한도 내에 있는 경우, EtOH와 물의 혼합물로 결정화하여 고순도 푸코스 결정을 얻을 수 있음을 입증한다.

실시예 9

(수성 비등성 결정화 후, EtOH와 물의 혼합물 속에서 냉각 결정화)

결정화용 출발물질은 실시예 7과 실시예 8의 모액과 결정화로부터 얻어진 세척액을 합하여 얻는다. 공급 용액은 DS 기준으로 약 78%의 푸코스, 1.8%의 크실로스, 0.6%의 아라비노스, 7.8%의 람노스, 0.5%의 갈락토스 및 0.5% 미만의 MAX를 함유한다(HPLC로 측정, 아미노형 수지, +55℃, 50% H₃PO₄ 6ml/l를 함유하는 79% ACN). DS함량이 43중량%(w/w)인 공급 시럽의 총 138kg DS를 감압하에 통상적인 증발 결정화기로 농축시킨다. 54.6℃에서 푸코스 씨드 결정 40g을 사용하여 씨딩을 수행한다. 씨딩 후, 시럽의 나머지 부분을 공급하고 결정화 매쓰를 감압하에 농축시킴으로써 비등성 결정화 매쓰를 제조한다. 총 115ℓ의 비등성 결정화 매쓰를 통상적인 냉각 결정화기로 옮긴다. 매쓰를 48시간 이내에 56℃로부터 36℃로 서서히 냉각시키고, 이로 인해, 점도는 높아지고 매쓰는 수용매로부터 결정 분리하기에 적합해졌다. 이 단계에서 결정화 수율은 50% 푸코스였다. 그러나, 99.5% 에탄올을 27ℓ 가하여 점도를 감소시키고 20시간 이내에 36℃로부터 15.5℃로 냉각시켜 계속 결정화시킨다. 이어서, 결정을 분리하고 건조시킨다. 결정화 과정은 다음과 같다:

시간	온도	DS, ml
hrs	℃	% w/w
0	54.6	83.3	증발 결정화기에 씨드 결정 40g의 씨딩
1	56.0	82.1	냉각 결정화 개시(DS, 매쓰 85.0)
20	51.3	79.6
48	36.0	77.8	매쓰는 진해지고 EtOH 첨가 개시
67	15.5	-	원심분리, 결정 세척 및 건조

통상적인 바스켓 원심분리기로 결정을 모액으로부터 분리한다. 총 59.9kg의 습윤 결정이 얻어졌다. 결정을 99.5% 에탄올 30ℓ와 혼합하여 세척하고, 원심분리시키고, 건조시킨다. 순도가 99% 이상이고 융점이 143.7℃인 결정형 생성물 총 48.4kg이 얻어졌다. 비선광도 [α]_D ²⁰은 -72.2°였다. 푸코스 생성물의 수율은 약 48%였다. 본 실시예는 공급 액체의 조성이 임계 한도 내에 있는 경우, 물과 에탄올의 혼합물로 결정화하고 비교적 순도가 낮은 공급 시럽(제1 결정화의 모액)으로부터 직접 결정화하여 고순도 푸코스를 얻을 수 있음을 입증한다.

실시예 10

푸코스 결정화 시험 결과의 결론

융점은 푸코스 결정의 순도의 좋은 지표인 것으로 밝혀졌다. 결과를 다음 표에 기재한다. 결과 중의 선형 적합도(fit)(도 5)는 다음 수학식을 제공한다:

결정 순도(%, DS 기준)= 0.117 × 융점(℃) +73.71 (R²=0.978).

	융점(℃)	순도(%, DS 기준)
실시예 6, 추가 세척 미실시	136.6	98.0
실시예 7	145.5	99.5
실시예 8	143.7	99.2
실시예 9	145.1	99.6
시험 샘플 27052	139.1	98.4
시험 샘플 17052	142.2	98.8

위의 표에서 시험 샘플 27052와 17052는 본 발명에 따라서 제조한 추가의 L-푸코스 샘플이다.

또한, 본 발명의 L- 푸코스 샘플과 통상의 L-푸코스 샘플(Sigma Chemical Co.) 사이의 비교 시험은 다음과 같은 결과를 제공한다:

샘플	융점(℃)	푸코스 순도(%, DS 기준)
실시예 7에 따라서 제조되고 다음 불순물(%, DS 기준)을 함유하는 L-푸코스: 람노스 0.07%, 아라비노스 0.08%, 만노스 0.02%, 갈락토스 0.02%	144.2(144, 144.2 및 144.5)	99.5% 이상
시그마 로트 11K1486	143.2(143.1, 143.3 및 143.2	최소 99%(Sigma)

실시예 11

크로마토그래피적 분획화용 공급액으로서 사용되는 데옥시 당 함유 용액은 대부분의 크실로스를 회수한 후 Ca²⁺계 아황산염 폐액으로부터 분리된 부 스트림이다. 자작나무를 아황산염 증해용 원료로서 사용한다. 공급 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다:

공급물 조성
건조 고형물(g/100ml)	35.2
푸코스(%, RDS 기준)	4.2
람노스(%, RDS 기준)	17.5
MAX(%, RDS 기준)	10.3
기타 물질(%, RDS 기준)	68

크로마토그래피적 분획화를 파일럿 스케일 크로마토그래피적 분리 칼럼에서 배치식 공정으로 수행했다. 직경이 0.1m인 칼럼에 아크릴 골격을 갖는 강염기성 음이온 교환 수지(Finex As 532 GC, 3.5% DVB)를 충전시켰다. 수지 층의 높이는 대략 1.2m였다. 수지의 평균 입자 크기는 0.35mm였다. 수지를 중아황산염(HSO₃ ^-)형태로 재생시켰다. 칼럼, 공급 용액 및 용출제인 물의 온도는 40℃였다. 칼럼에서의 유속은 100ml/분으로 조정했다. 공급 용액의 pH는 6.0이었다.

크로마토그래피적 분획화를 다음과 같이 수행했다:

단계 1: 공급 용액의 건조 물질을 용액의 굴절률(RI)에 따라서 용액 100g 속의 건조 물질 31.5g으로 조절한다.

단계 2: 예열된 공급 용액 800ml를 수지 층 상부로 펌핑한다.

단계 4: 유출되는 용액 샘플 5ml를 5분 간격으로 수집한다. 샘플의 조성을 아미노 칼럼이 장착된 HPLC 장치로 분석하고, 물과 ACN(79%)을 용출제로서 사용한다.

MAX를 포함하는 기타 단당류 대부분이 푸코스 및 람노스보다 먼저 개별 피크로서 칼럼으로부터 용출되었다. 람노스가 푸코스 다음에 부분적으로 칼럼으로부터 용출되었다. 따라서, 중아황산염 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 사용하여 푸코스가 풍부한 분획을 다른 단당류 및 다른 성분으로부터 잘 분리할 수 있다. 유출물(예: 유출 용액)의 pH는 1.9 내지 3.8이었다. 분리 프로필을 도 6에 도시한다.

실시예 12

SMB 공정을 사용하는 푸코스 함유 시럽의 크로마토그래피적 분획화

크로마토그래피적 분획화용 SMB 시험 장치는 직렬 연결된 6개의 칼럼, 공급 펌프, 재순환 펌프, 유출수 펌프 및 다양한 공정 스트림을 위한 유입구 및 생성물 밸브를 포함한다. 각각의 칼럼의 높이는 3.4m였고 직경은 0.2m였다. 칼럼을 Na⁺ 형태의 강산 겔형 양이온 교환 수지(Finex CS11GC)로 충전시킨다. 평균 비드 크기는 0.33mm였고 디비닐벤젠 함량은 5.5%였다.

크로마토그래피적 분획화용 공급물은 국제공개공보 제WO 02/27039호(미국 제 2002/120135호에 상응)에 기재되어 있는 람노스 회수 공정으로부터 얻어지는 시럽이다. 당해 크로마토그래피적 분획화의 목적은 함유된 푸코스 및 람노스를 분리하는 것이다.

공급물의 pH를 50%(w/w) NaOH 용액을 사용하여 6.2로 조정한다. 이어서, 액을 여과 보조제로서 케나이트(Kenite) 300을 사용하는 세이츠 가압 필터(Seitz pressure filter)로 여과(프리코트 1kg/m², 보디피드: DS 기준으로 0.5%)하고, 공급물 농도를 55g/100ml로 조정한다. 공급물 조성을 아래 표에 기재하며, 비율은 건조 물질 중량을 기준으로 한다.

공급물의 조성	%, DS 기준
푸코스	5.7
람노스	19.1
MAX	13.8
크실로스	2.3
기타 물질	59.1

아래 기재된 9단계 SMB 순서에 따라서 분획화를 수행한다. 공급물 및 용출제의 온도는 65℃였다. 물을 용출제로서 사용한다.

단계 1: 공급 용액 16ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제1 칼럼으로 펌핑하고 잔류 분획을 동일 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 27ℓ를 135ℓ/h의 유속으로 제2 칼럼으로 펌핑하고 잔류 분획을 칼럼(4)로부터 수집한다. 동시에 또한 물 16ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 칼럼(5)로 펌핑하고 푸코스 함유 분획을 마지막 칼럼으로부터 수집한다.

단계 2: 공급 용액 10ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제1 칼럼으로 펌핑하고 람노스 함유 분획을 동일 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 19ℓ를 150ℓ/h의 유속으로 제2 칼럼으로 펌핑하고 또 다른 람노스 함유 분획을 칼럼(4)로부터 수집한다. 동시에 또한 물 16ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 칼럼(5)로 펌핑하고 푸코스 함유 분획을 마지막 칼럼으로부터 수집한다.

단계 3: 공급물 30ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제1 칼럼으로 펌핑하고 푸코스 함유 분획을 마지막 칼럼으로부터 수집한다.

단계 4: 물 27ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 마지막 칼럼으로 펌핑하고 잔류 분획을 제2 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 27ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제3 칼럼으로 펌핑하고 잔류 분획을 칼럼(5)로부터 수집한다.

단계 5: 물 20ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 마지막 칼럼으로 펌핑하고 람노스 함유 분획을 제2 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 20ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제3 칼럼으로 펌핑하고 또 다른 람노스 함유 분획을 칼럼(5)로부터 수집한다.

단계 6: 29ℓ를 모든 칼럼으로 형성된 칼럼 세트 루프에서 80ℓ/h의 유속으로 순환시킨다.

단계 7: 물 28ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제1 칼럼으로 펌핑하고 잔류 분획을 제3 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 28ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 칼럼(4)로 펌핑하고 잔류 분획을 마지막 칼럼으로부터 수집한다.

단계 8: 물 20ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 제1 칼럼으로 펌핑하고 람노스 함유 분획을 제3 칼럼으로부터 수집한다. 동시에 물 20ℓ를 80ℓ/h의 유속으로 칼럼(4)로 펌핑하고 또 다른 람노스 함유 분획을 마지막 칼럼으로부터 수집한다.

단계 9: 29ℓ를 모든 칼럼으로 형성된 칼럼 세트 루프에서 80ℓ/h의 유속으로 순환시킨다.

시스템의 평형 후, 다음 분획들을 시스템으로부터 빼낸다: 모든 칼럼으로부터 하나의 잔류 분획, 모든 칼럼으로부터 하나의 람노스 함유 분획 및 마지막 칼럼으로부터 3개의 푸코스 함유 분획. 합한 분획에 대한 HPLC 분석 결과를 아래 표에 기재한다.

	푸코스	람노스	잔류물
용적(ℓ)	62.0	109.0	153.0
건조 고형물(g/100ml)	24.9	11.1	1.7
푸코스(%, DS 기준)	10.9	0.5	1.5
람노스(%, DS 기준)	7.2	37.1	11.7
MAX(%, DS 기준)	26.3	1.2	0.0
크실로스(%, DS 기준)	1.6	3.0	1.3
기타 물질(%, DS 기준)	54.0	58.2	85.5

생성물 분획으로부터 계산된 전체 수율은 푸코스의 경우 94.4%이고 람노스의 경우 76%이다.

본 발명이 다양한 방식으로 구현될 수 있음이 당해 기술분야의 숙련인에게 자명하다. 본 발명 및 이의 양태는 위에서 기재한 실시예에 의해 제한되지 않으며 청구의 범위 내에서 달라질 수 있다.

Claims

데옥시 당과 기타 단당류를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰(biomass) 가수분해물의 용액을, 용출제로서 물을 사용하여

(1) 강산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계,

(2) 약산성 양이온 교환 수지 및 약염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계 및

(3) 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 1회 이상의 크로마토그래피적 분획화 단계 중의 하나 이상에 적용시킨 후,

푸코스가 풍부한 하나 이상의 분획을 단계(1), 단계(2) 및 단계(3) 중의 하나 이상으로부터 회수함을 포함하여, 데옥시 당과 기타 단당류를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물의 용액으로부터 푸코스를 분리 및 회수하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 용액을 단계(1), 단계(2) 및 단계(3) 중 둘 이상에 적용시킴을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 용액을 단계(1), 단계(2) 및 단계(3)으로부터 선택된 단계들에 2회 이상 적용시킴을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계(1)로부터 람노스가 풍부한 분획을 회수함을 추가로 포함하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 단계(3)으로부터 푸코스가 풍부한 분획을 회수함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계(1), 단계(2) 또는 단계(3) 중의 한 단계에서 람노스가 풍부한 분획을 회수함을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물의 용액을 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 푸코스가 풍부한 분획을 회수함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

(1) 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물의 용액을 강산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 람노스가 풍부한 분획 및 푸코스를 함유하는 하나 이상의 분획을 회수하는 단계 및

(2) 푸코스를 함유하는 하나 이상의 분획을 약산성 양이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 푸코스 함유 분획을 회수하는 단계를 순차적으로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 푸코스 함유 분획을 강염기성 음이온 교환 수지로부터 선택된 칼럼 충진재를 사용하는 크로마토그래피적 분획화에 적용하고 푸코스가 풍부한 분획을 회수함을 포함하는 추가의 단계(3)을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 강산성 양이온 교환 수지가 Na⁺ 형태인 방법.
제1항에 있어서, 강산성 양이온 교환 수지가 Zn² ⁺ 형태인 방법.
제1항에 있어서, 약산성 양이온 교환 수지가 Na⁺ 형태인 방법.
제1항에 있어서, 강염기성 음이온 교환 수지가 HSO₃ ^- 형태인 방법.
제1항에 있어서, 크로마토그래피적 분획화가 모의 이동층법(SMB) 분리를 포함하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 데옥시 당과 기타 단당류를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물이 펄프화 공정으로부터 얻어지는 폐액인 방법.
제18항에 있어서, 폐액이 활엽수 펄프화로부터 얻어지는 방법.
제1항에 있어서, 데옥시 당과 기타 단당류를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물이 사탕무우로부터 유도된 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물 및 사탕수수로부터 유도된 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 푸코스가 풍부한 하나 이상의 분획을 결정화에 적용시킴을 추가로 포함하는 방법.
삭제
제21항에 있어서, 푸코스가 물, 알콜, 및 물과 알콜의 혼합물로부터 선택된 용매로부터 결정화되는 방법.
제21항에 있어서, 푸코스의 결정화가 칼 피셔 적정(Karl Fischer titration)에 의해 측정된 건조 물질 함량(DS) 기준으로 45% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행되는 방법.
제24항에 있어서, 푸코스의 결정화가 DS 기준으로 80% 이상의 푸코스를 함유하는 용액으로부터 수행되는 방법.
제24항에 있어서, 푸코스의 결정화가 DS 기준으로 45% 이상의 푸코스, 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 함유하는 용액으로부터 수행되는 방법.
45% 이상의 푸코스, 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물의 용액으로부터 수행되는 푸코스의 결정화 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 생성된 결정화 매쓰(mass)의 점도가 5 내지 500Pas인 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 결정화가 물과 에탄올의 혼합물을 용매로서 사용하여 수행되는 방법.
제27항에 있어서, 푸코스의 결정화가 DS 기준으로 80% 이상의 푸코스, 20% 미만의 람노스, 15% 미만의 크실로스, 3% 미만의 아라비노스 및 1% 미만의 갈락토스를 함유하는 헤미셀룰로스 함유 바이오매쓰 가수분해물의 용액으로부터 수행되는 방법.
제30항에 있어서, 푸코스의 결정화가 6 내지 80시간 동안의 체류 시간으로 수행되는 방법.
제21항에 있어서, 푸코스의 결정화가 분별 결정화로 수행되는 방법.
제32항에 있어서, DS 기준으로 순도가 60% 이상인 결정형 푸코스를 제공하는 방법.
제33항에 있어서, 결정형 푸코스의 순도가 DS 기준으로 90% 이상인 방법.
제33항에 있어서, 결정형 푸코스의 순도가 DS 기준으로 99% 이상인 방법.
제1항에 있어서, 푸코스가 L-푸코스인 방법.
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