KR101220498B1

KR101220498B1 - 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101220498B1
Application number: KR1020110018098A
Authority: KR
Inventors: 장호남; 퀑 페이; 최진달래; 김낙종; 김우현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-01-10
Also published as: US20120219993A1; KR20120098256A

Abstract

본 발명은 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유기성 폐기물 유래의 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다단계 연속 고 균체 생물반응기에서 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법은 (a) 미생물 증식용 생물반응기에서 미생물을 배양하여, 미생물을 증식시키는 단계; (b) 상기 미생물 증식용 생물반응기에서 증식된 미생물을 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 배양하여, 미생물의 체내산물을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 글루코스 대신에 가격이 저렴한 유기산을 탄소원으로 하여 미생물 체내산물중 하나인 미생물 지질을 경제적으로 생산할 수 있으며, 생산된 미생물 지질은 바이오 디젤의 원료로 이용될 수 있어 바이오 디젤의 경제성 향상에도 기여할 수 있다.

Description

유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법 {Method of Producing Microbial Intracellular Products from Volatile Fatty Acids}

본 발명은 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유기성 폐기물 유래의 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본래 바이오 디젤은 대두유, 팜유, 유채유 등의 식물성 기름으로부터 생산되어진다. 식물성 기름은 식물의 재배지역 및 기후에 민감하기 때문에 특정 지역에서 생산해야하며 연중 생산이 가능하지도 않다. 또한 식물 재배를 위한 넓은 토지를 필요로 하기 때문에 토지비용이 높은 지역에서의 생산은 경제성이 없으며, 생산성이 가장 높은 팜유의 경우에도 헥타르당 5톤 정도로 높지 못하다. 이런 이유로 바이오 디젤 생산가의 약 80%가 원료비에 해당한다. 이는 바이오 디젤이 기존 수송용 연료인 디젤과 100% 호환이 가능함에도 보급 확대에 어려움을 겪고 있는 이유이기도 하다.

미생물은 식물보다 성장속도가 매우 빠르며, 일부 미생물은 20~80%의 높은 지질을 함유하는 것으로 알려져 있다. 미생물중 특히 효모와 미세조류에 대한 연구가 가장 활발히 이루어 졌는데, 글루코스 등의 당을 이용한 지질생산에 관여하는 효모로는 Candida (Evans, C. T. and Ratledge, Lipids, 18: 623~629, 1983), Lipomyces (Naganuma, T. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 31: 29~37, 1985), Rhodotorula (Yoon, S., et al., J. Ferment. Technol., 60: 243~246, 1982), Cryptococcus (Fall, R. et al., Appl. Environ. Mircobiol., 47: 1130~1134, 1984) 등이 알려져 있다.

그리고, 미세조류인 클로렐라(Chlorella)는 지질생산을 위하여 이산화탄소 또는 글루코스를 이용한다고 보고되었고, 보트리코크스(Botryococcus)는 지질 생산을 위하여 이산화탄소를 이용한다고 보고된 바 있다.

하지만, 글루코스의 공급원은 대부분 인간 식량으로 이용되는 옥수수, 카사바 등이고, 설탕 또한 특정 지역에서만 생산되며, 식품 첨가물로 널리 사용되고 있으므로 바이오연료 공급원으로서의 한계를 가지고 있다. 또한 목질계 바이오매스 유래의 글루코스, 목당 등도 미생물 지질 생산용 기질로 이용될 수 있으나, 이들을 얻기 위한 당화과정에서는 많은 에너지와 비용이 요구되는 문제점이 있다.

한편, 유기산은 산성을 띠는 유기화합물로서, 주로 카르복시기와 설폰기를 포함하는 유기화합물이다. 이러한 유기산은 단백질, 지방, 탄수화물을 포함하는 유기성 폐기물로부터 쉽게 생성될 뿐만 아니라, 목질 바이오매스 등으로부터도 혐기성 소화를 통해 저렴하게 생산이 가능하다. 그러나, 지금까지 유기산은 당이나 알코올류에 비해 미생물의 배양의 기질로 주목받지 못하였다. 이는 유기산을 효과적으로 이용하는 미생물이 많지 않으며, 유기산 자체가 대부분의 미생물 성장을 저해하기 때문이다.

미생물 발효를 이용하여 각종 유용물질(에탄올, 젖산, 유기산, 페니실린, 단일군 항체, 각종 단백질)을 생산하는 데는 미생물개체의 활성과 더불어 생물반응기내 미생물 균체의 농도가 중요한 역할을 한다. 미생물 발효 산물은 미생물 체외로 산물을 배출하면 체외산물(extracellular product)이라고 하며 에탄올, 젖산, 페니실린, 단일군 항체 등이 있으며, 미생물 체내에서 생산되면 체내산물(intracellular product) 이라고 한다. 체내산물의 대표적인 것은 유전자 재조합 대장균에서 생산되는 단백질, PHB(polyhydroxybutryrate), 미생물 지질 등이 여기에 속한다. 미생물을 활용하는 생물공정에서 가장 중요한 인자는 발효산물의 농도와 생산성이다. 본 발명자는 효모를 이용한 에탄올 생산에 hollow fiber cell recycle 기술을 활용하여 균체농도를 200g/L로 하여 생물반응기를 운영 (Lee,CW and Chang, HN, Biotechnol Bioeng, 29,1105-1112, 1987)함으로써, 생산성을 30배 이상 향상시켰으나, 에탄올 농도가 회분식 반응기의 70%에 머무르는 문제점이 있다는 사실을 확인하였다. 본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위하여 여러 개의 고균체 반응기를 직열로 연결하여 운전함으로써, 고생산성, 고생산물 농도를 얻는 데 성공하였다(US 20100041124A1).

그러나, 고농도 미생물 균체 다단계 연속 생물반응기(multi-stage continuous high cell density culture, MSC-HCDC) 기술을 적용함에 있어서 미생물 체외산물(예: 에탄올)과 미생물의 체내산물(예: 미생물 지질)은 그 전략을 달리한다. 고농도를 유지하는 전략은 같으나 체외산물은 기질이 균체생산에 가는 것을 억제하고 최대한 체외산물에 생산에 가는 것을 극대화 하는 대신, 체내산물은 일단 균체생산을 최대화하고 다시 제 2,3 반응기에서 균체 내 미생물 지질 등 생산물 축적을 최대화 되도록 하는 것이다. 체외 산물은 필요에 따라 반응기가 수개가 될 수도 있지만 체내 산물은 2개, 3개의 고 균체반응기를 직열로 연결하여 미생물 지질을 고생산성으로 생산할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 단일 생물반응기 또는 다단계 연속 고 균체 생물반응기의 미생물 증식용 생물반응기에서 먼저 미생물의 증식을 최대화시킨 후, 단일 생물반응기 또는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 미생물을 배양할 경우, 단일 생물반응기 또는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 탄소원으로 포도당 등 당류를 사용할 수 있음은 물론이고, 유기성 폐기물 또는 저가의 유기물로부터 생산된 유기산을 이용하여도 유기산에 대한 미생물의 저해를 최소화시키고, 미생물의 체내산물 생산을 극대화 시킬 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 포도당 등 당류를 사용할 수 있음은 물론이고, 저가의 기질(탄소원)로 유기산을 이용하면서도, 유기산의 미생물에 대한 저해를 최소화하고, 미생물의 체내산물 생산을 극대화시키고 또한 단일 생물반응기 또는 다단계 연속 세포 고농도 반응기 시스템을 활용하여 미생물 반응기의 생산성을 극대화하여 미생물의 체내산물을 산업적으로 경제성 있게 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물반응기에서 미생물을 증식시킨 다음, 유기산을 기질로 유가배양(Fed-batch)하여 미생물의 체내산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물의 체내산물을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 미생물 증식용 생물반응기에서 미생물을 배양하여, 미생물을 증식시키는 단계; (b) 상기 미생물 증식용 생물반응기에서 증식된 미생물을 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 배양하여, 미생물의 체내산물을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수하는 단계를 포함하는 다단계 연속 고 균체 생물반응기에서 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 글루코스 대신에 가격이 저렴한 유기산을 탄소원으로 하여 미생물 체내산물을 경제적으로 생산할 수 있으며, 생산된 미생물 체내산물중 하나 인 미생물 지질은 바이오 디젤의 원료로 이용될 수 있어 바이오 디젤의 경제성 향상에도 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다단계 연속 고 균체 생물반응기에서 유기산을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법을 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus)의 유기산을 함유한 배지에서의 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 C/N비에 따른 Cryptococcus albidus의 지질 축적의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 시스템 2의 다단계 연속 고균체 생물 반응기의 설명도이다.

본 발명에서는 미생물을 1차 증식시킨 후, 유기산을 함유하는 배지에서 2차 증식시킬 경우, 일반적으로 미생물의 성장을 저해하는 것으로 알려진 유기산을 미생물의 체내산물 생산을 위한 탄소원으로써 유용하게 이용할 수 있을 것으로 예측하였다.

본 발명에서는, 유기산이 함유되지 않거나, 미량 함유된 배지에서 미생물을 성장시킨 후, 유기산을 포함하는 배지에서 미생물을 배양시켰다. 그 결과, 미생물 체내산물중 하나인 미생물 지질의 생산량이 증가되었음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 영양 배지를 포함하는 생물반응기에서 미생물을 증식시킨 후, 유기산을 포함하는 배지를 첨가하면서 미생물을 배양시켰고, 그 결과 미생물 지질의 생산량이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 생물반응기에서 미생물을 증식시킨 다음, 유기산을 기질로 유가배양(Fed-batch)하여 미생물의 체내산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 생물반응기는 통상의 생물반응기를 이용할 수 있으며, 상기 미생물은 체내산물 생산능을 가지는 한 박테리아, 효모, 곰팡이 또는 미세조류를 제한없이 이용할 수 있다.

상기 박테리아로는 Acinetobacter, Actinobacter, Anabaena, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Flexibacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Nostoc, Oscillatoria, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Shewanella, Streptomyces, Vibrio 등을 예시할 수 있고, 상기 효모로는 Lipomyces, Trichosporon, Rhorosporidium, Cryptococcus, Candida, Yarrowia 등을 예시할 수 있고, 상기 곰팡이로는 Aspergillus, Chaetomium, Clodosporidium, Cunninghamella, Emericella, Fusarium, Mortierella, Mucor, Penicillium, Pythium, Rhizopus, Trichoderma 등을 예시할 수 있으며, 상기 미세조류로는 Botryococcus, Brachiomonas, Chlamydomonas, Chlorella, Crypthecodinium, Dunaliella, Euglena, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Nitzschia, Schizochytrium, Sceletonema, Scenedesmus, Tetraselmis, Thraustochytrium, Ulkenia 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물의 체내산물은 체내 단백질, 체내 유기고분자, 미생물 지질 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 미생물 체내 지질에는 올레익산, 팔미틱산, 스테아린산, 리놀레익산, 리노렌틱산 등을 예시할 수 있다.

상기 체내 단백질은 성장호르몬, 인슐린, 페니실린아시라제, 간염백신 등을 예시할 수 있고, 상기 체내 유기고분자는 폴리하이드록시 부틸산, 폴리감마글루탐산, 폴리락산, 폴리아미노산 등을 예시할 수 있다.

상기 미생물을 증식시키기 위한 배지는 탄소원으로써 유기산을 함유하지 않거나, 함유하더라도 미생물 증식에 영향을 미치지 않을 정도 함유하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 다른 실시예에서는 글루코스 또는 설탕을 탄소원으로 하는 배지를 포함하는 미생물 증식용 생물반응기에서 지질 생성능을 가지는 효모인 Cryptococcus albidus ATCC10672를 배양하여 성장시킨 후, 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 배양하였고, 그 결과 미생물 지질의 생산량이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 미생물 증식용 생물반응기에서 미생물을 배양하여, 미생물을 증식시키는 단계; (b) 상기 미생물 증식용 생물반응기에서 증식된 미생물을 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 배양하여, 미생물의 체내산물을 생산하는 단계; 및 (c) 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수하는 단계를 포함하는 다단계 연속 고 균체 생물반응기에서 유기산 혹은 포도당 등 당을 원료로 하여 미생물의 체내산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 도 1에 나타난 바와 같이, 유기산을 이용하여 미생물 체내산물을 생산하기 위하여, 미생물 증식용 생물반응기에서 미생물을 배양하여, 미생물을 증식시키는 단계를 수행한다(S1).

상기 유기산 및 유기산은 앞서 기재한 바와 동일하다.

상기 미생물 증식용 생물반응기에서 미생물을 배양하는 단계는 미생물을 증식시키는 것을 목적으로 하므로, 상기 배지는 탄소원으로써 유기산을 함유하지 않거나, 함유하더라도 미생물 증식에 영향을 미치지 않을 정도 함유하는 것이 바람직하다. 상기 배지의 탄소/질소(C/N) 비율은 세포의 성장속도, 생산물의 생성 속도 및 함량에 영향을 주는 것으로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등 미생물의 종류 및 성장 시기에 따라서 요구하는 C/N비가 조금씩 달라질 수 있으나, 상기 탄소/질소(C/N) 비율은 2~20인 것이 바람직하다. 상기 탄소/질소(C/N) 비율이 2 미만이면 과한 질소농도로 인하여질소가 소모되지 못하므로 비용이 증가하고 환경처리에 대한 부담이 증가하는 문제점이 있고, 20을 초과할 경우 탄소원이 완전히 소모되지 못하고 버려져 비용이 증가하는 문제점이 있다.

즉, 상기 미생물 증식용 생물반응기에서의 미생물은 글루코스, 목당, 아라비노제, 설탕, 알코올, 당알코올, 바이오매스 당화액 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 탄소(C)원 및 암모니아 유래 화합물, 질산화물, 요소, 옥수수 침지액, 음식물쓰레기 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 질소(N)원을 함유하는 배지에서 증식되는 것을 특징으로 한다.

상기 바이오매스 당화액으로는 목질계 및 초본계 바이오매스, 해조류, 수생식물 당화액 등을 예시할 수 있으며, 상기 암모니아 유래 화합물로는 염화암모늄(NH₄Cl), 암모니아수(NH₄OH), 암모늄카보네이트 (NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃등) 또는 산업적으로 활용하는 corn steep liquor (CSL) 등을 예시할 수 있고, 상기 질산화물은 질산성 질소(NO₂, NO₃)를 포함하는 화합물 (HNO₃, KNO₃ 등) 등을 예시할 수 있다.

상기 배지의 탄소/질소(C/N) 비율은 탄소함량 대비 질소량을 변화시킴으로써 조절이 가능하며, 반대로 질소함량 대비 탄소량을 변화시킬 수도 있다. 질소의 함량은 총질소량 및 총탄소원 중 탄소량을 측정하여 그 비를 정할 수 있으나 통상은 탄소원 중 분해가 용이한 글루코스, 설탕 등의 2탄당 이하의 당에 기초하여 결정하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 증식용 생물반응기 및 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기는 다단계 연속 고농도 반응기(MSC-HCDC: multi-stage continuous high cell density culture)로 구성되고, 상기 미생물 증식용 생물반응기는 CSTR(연속교반탱크반응기) 형태로 운전되며, 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기는 여러 개의 CSTR 형태로 운전되거나, 1개의 CSTR의 내부를 여러 개로 분할한 PFR(플러그플로우 반응기) 형태로 운전되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 체내산물 생산능을 가지는 미생물은 진탕배양, 정치배양, 회분 배양, 유가배양, 연속식 배양 등으로 배양시킬 수 있다.

상기 진탕배양은 미생물을 접종한 배양액을 흔들면서 배양하는 방법을, 상기 정치배양은 미생물을 접종한 액체 배양액을 흔들지 아니하고 놓아둔 채로 배양하는 방법을 의미하고, 상기 회분배양은 배양액의 부피를 고정하고 외부에서 새로이 배양액을 첨가하지 아니한 상태에서 배양하는 방법을 의미하고, 상기 유가배양은 원료를 최초에 전부 배양 탱크에 넣어서 배양하는 단일배양(batch)에 대조되는 말로서 먼저 소량의 원소를 넣고 이것에 소량씩 원료를 추가하여 가며 배양하는 방법을 의미하며, 상기 연속식 배양은 새로운 영양배지가 계속 공급되며 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양액이 계속 제거되는 배양방법을 의미한다.

상기 배양시간 산소, pH, 온도 등의 조건은 이용되는 미생물에 따라 적절히 조절할 수 있다.

다음으로, 상기 미생물 증식용 생물반응기에서 증식된 미생물을 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 배양시켜, 미생물 체내산물을 생산하는 단계를 수행한다(S2).

상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 미생물을 배양하는 단계는 유기산을 포함하는 배지를 이용하여 미생물의 체내산물을 생산하는 것을 목적으로 하므로, 상기 배지는 탄소원으로써 유기산을 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 배지의 탄소/질소(C/N) 비율은 미생물 지질의 축적 정도와 미생물 생장속도에 영향을 주는 것으로서, 사용되는 미생물에 따라 달라질 수 있으나, 상기 탄소/질소(C/N) 비율은 10 이상인 것이 바람직하다. 상기 탄소/질소(C/N) 비율이 10 미만이면 미생물 내의 체내산물 축적함량이 적어 회수비용이 늘어나며, 통상 배지내 탄소원의 농도는 미생물이 이용 가능한 농도인 200 g/L를 넘지 않는 것이 보통이다.

상기 유기산은 상기 미생물 증식용 생물반응기 또는 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서의 미생물 배양 이전에 유기성 폐기물 또는 저가의 유기물을 혐기성 발효시켜 10g/L~50g/L 농도로 생산한 후, 별도의 전처리 없이 바로 이용하거나 멸균시킨 후 이용할 수 있다.

상기 유기성 폐기물은 도시 쓰레기, 음식물 쓰레기, 슬러지, 가축 분뇨, 유기성 바이오매스 등을 예시할 수 있고, 저가의 유기물은 초본계, 목본계 등의 목질계 바이오매스, 해조류, 미세조류 등을 예시할 수 있다.

상기 유기산은 초산, 프로피온산, 부틸산, 젖산, 숙신산, 클루콘산, 발레르산, 카프로익산 및 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유기산은 유기성 폐기물 발효에서 약 30~50g/L 정도의 농도로 생성되며, 유기산의 성분은 6(초산):1(프로피온산):3(부틸산) 비율을 갖는다고 보고된 바 있다 (임성진 et al, Bioresource Tech, 99, 7866-7874, 2008).

상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에 포함된 유기산을 함유하는 배지는 유기산 이외에 글루코스, 목당, 아라비노제, 설탕, 알코올, 당알코올, 바이오매스 당화액 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 탄소(C)원 및 암모니아 유래 화합물, 질산화물, 요소, 옥수수 침지액, 음식물쓰레기 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 질소(N)원을 포함할 수 있다.

상기 유기산을 함유하는 배지는 배양 중 유기산의 농도를 1~5g/L로 유지하는 것을 특징으로 한다. 상기 유기산의 함량이 1g/L 미만인 경우에는 탄소원으로서 글루코스를 대체하는 효과가 미미한 문제점이 있고, 5g/L를 초과할 경우에는 미생물의 성장을 저해시킬 수 있는 문제점이 있다. 참고로, 체내 단백질을 축적하는 미생물의 경우는 유기산을 이용하지 못할 수도 있어 당을 활용하며 또한 고부가가치 소량생산 화합물의 경우는 탄소원의 가격이 생산가에 미치는 영향이 크지 않을 수도 있다.

상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서의 배양 역시, 진탕배양, 정치배양, 회분 배양, 유가배양, 연속식 배양 등을 수행할 수 있으며, 배양시간 산소, pH, 온도 등의 조건은 이용되는 미생물에 따라 적절히 조절할 수 있다.

끝으로, 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서 미생물의 배양이 완료되면, 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수하는 단계를 수행한다(S3).

상기 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수하는 방법으로는 여과, 원심분리, 침전, 응집, 흡착 등을 이용할 수 있다.

즉, 미생물의 체내산물이 세포밖으로 배출될 경우 여과액으로부터 원심분리 또는 추출 등으로 분리할 수 있고, 미생물 내부에 축적될 경우 통상적으로 알려진 바와 같이, 클로로포름, 헥산, 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 페트롤륨 에테르 또는 이들을 포함하는 혼합액으로 추출 할 수 있으며, 상기 혼합액으로는 헥산:메탄올(2:1) 혼합액, 클로로포름:아세톤(2:1) 혼합액 등을 예시할 수 있다.

상기 유기용매 중 헥산 등의 소수성 용매를 사용하여 추출하면 디아실글리세롤, 트리아실글리세롤 등의 중성지질을 추출할 수 있으며, 에탄올 등의 친수성 용매를 사용하여 추출하면 인지질 등을 추출할 수 있다.

체내 축적 단백질, 고분자 등의 체내산물은 미생물 세포벽을 분쇄하여 체내산물을 용액 내로 추출할 수 있다. 일단 용액으로 추출된 체내산물은 기존의 잘 알려진 방법에 의해 쉽게 분리할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 체내산물 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물의 체내산물을 회수 후, 잔존하는 미생물은 유기산 생산을 위한 균주로 이용될 수 있다. 즉, 유기산 생산을 위하여 슬러지, 음식물쓰레기, 분뇨 등의 유기성폐기물, 초본계, 목본계 등의 목질계 바이오매스, 해조류, 미세조류 등을 혐기소화 시키기 위한 미생물로, 상기 미생물의 체내산물 회수 후, 잔존하는 미생물을 이용할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 혼합 유기산 성분에 따른 Cryptococcus albidus 미생물의 지질 생산

VFA(유기산)중 초산, 프로피온산, 부틸산의 비율이 지질 생산에 미치는 영향을 살펴보고, 표 1에 나타내었다. 50ml의 modified basal medium (per liter; KH₂PO₄(3.0g); MgSO₄·7H₂0(1.0g); FeCl₃·6H₂0(15mg) 및 ZnSO₄·7H₂0(7.5mg))가 담긴 250ml 플라스크에 Cryptococcus albidus(ATCC 10672)를 10% 넣고, 25℃, pH 6.0의 조건에서 150 rpm의 속도로 96시간 동안 배양하였다. VFA의 최초농도는 2g/L로 하였고, 다양한 VFA 조성에서 실험을 실시한 결과, 가장 좋은 초산, 프로피온산, 부틸산의 배합 비율은 8:1:1로 확인되었다.

Carbon Source	Biomass (g/L)	Lipid (g/L)	Lipid content % (w/w)	Y_X/S(g/g)^a	Y_L/S(g/g)^b
VFAs (4:3:3)	0.642	0.127	19.8	0.321	0.063
VFAs (8:1:1)	1.201	0.334	27.8	0.601	0.167
VFAs (6:1:3)	1.168	0.319	27.3	0.584	0.159
VFAs (7:2:1)	1.115	0.291	26.1	0.558	0.146

Y_X/S:growth yield coefficient, g DCW /g VFAs.

Y_L/S:Lipidyieldcoefficient,glipid/gVFAs.

실시예 2: VFA 함량에 따른 미생물 지질 생산

실시예 1과 같은 배양조건에서 포도당과 유기산 (초산:프로피온산:부틸산=6:1:3)을 배지로 사용하여 C. albidus (ATCC10672)의 지질생산을 비교하였다.

Carbon Source	Biomass (g/L)	Lipid (g/L)	Lipid content % (w/w)	Y_X/S(g/g)	Y_L/S(g/g)
Glucose(18g/L)	8.402	3.3	39.3	0.467	0.183
VFAs(2g/L)	1.155	0.312	27.0	0.578	0.156
VFAs (5g/L)	2.554	0.635	24.9	0.511	0.127
VFAs(8g/L)	0.784	0.093	11.9	0.261	0.031
VFAs (10g/L)	N.D.^c	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.

^c N.D.: not detected.

표 2에 나타난 바와 같이, 유기산의 농도가 2g/L인 경우에 지질 생산량이 최고값을 나타내었고, 초기 유기산의 농도가 10g/L인 경우에는 미생물의 성장이나 지질의 형성이 관찰되지 않았다.

실시예 3: 박테리아를 이용한 유기산으로부터의 미생물 지질 생산

박테리아인 Rhodococcus opacus PD630 (DSM 44193)를 이용하여 유기산으로부터의 지질 생산능을 확인하였다. 배양 배지는 Na₂HPO₄·12H₂O 9g/L, KH₂PO₄1.5g/L, NH₄Cl 0.05g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2g/L, NaHCO₃0.5g, CaCl₂·2H₂O 20mg, 미량원소 2mL로 구성된 MSM 최소배지에 초산, 부틸산, 프로피온산, 글루콘산 등의 유기산을 각각 3g/L 첨가하고 pH를 6.5로 보정시킨 것을 이용하였다. Nutrient broth에서 24시간 배양시킨 R. opacus 배양액을 5% 접종하고, 진탕배양시킨 결과, 도 2의 (B)와 같이 lag time없이 균체가 성장하는 것을 확인하였다. 배양액에 클로로포름과 메탄올 혼합액을 첨가하여 지질을 추출한 결과, 건조 균체 중량의 40-50%가 지질로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

또한, 발효조에서의 혼합유기산을 이용한 지질 생산을 위해 혐기성 소화조에서 흔히 발견되는 조성인 초산:프로피온산:부틸산의 무게비가 6:1:3으로 구성된 유기산 혼합액을 1L 배양액에 pH stat법에 의해 일정 농도의 유기산농도를 유지하면서 fed-batch 배양하였을 때 7일차에 OD₆₀₀=32, 지질 3.2 g/L를 얻어 건조균체의 32%가 지질로 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 4: 미세조류를 이용한 유기산으로부터의 미생물 지질 생산

미세조류인 Chlorella protothecoides(UTEX 25)를 이용하여 유기산으로부터의 지질 생산능을 확인하였다. 지질생산을 위한 배양 배지는 Urea 0.5g/L, KH₂PO₄0.7g/L, K₂HPO₄0.3g/L, MgSO₄·7H₂O 0.3g/L, A5 trace element 1ml을 함유하는 개량된 Endo & Koibuchi 배지에 초산, 프로피온산, 부틸산이 각각 농도별로 첨가된 것을 이용하였다.

개량된 Endo & Koibuchi 배지에 포도당 20g/L을 첨가하여 성장 시킨 C. protothecoides를 10% 접종하고, 진탕배양시킨 결과, C.protothecoides는 초산을 효과적으로 이용할 수 있는 반면, 부틸산은 0.5 g/L 이하의 농도에서만 쉽게 이용할 수 있고, 프로피온산은 거의 이용하지 못하고 성장이 심하게 둔화되는 것을 확인할 수 있었다.

그 결과, 초산 3g/L를 함유하는 배지의 경우, C.protothecoides가 OD₄₅₀=3.2까지 성장하였고, 초산:프로피온산:부틸산의 혼합비가 8:1:1인 유기산 혼합액 2g/L을 함유하는 배지의 경우 OD₄₅₀=1.5까지 성장하였다. 이때 지질 함량은 균체의 25-30%범위에 있었다.

실시예 5: 효모를 이용한 유기산으로부터의 미생물 지질 생산

효모인 Cryptococcus albidus (ATCC 10672)를 이용하여 유기산으로부터의 지질 생산능을 확인하였다. 탄소원을 제외한 배지와 배양조건은 실시예 1과 동일하다.

먼저, 탄소원으로 포도당 30g/L와 NH₄Cl 5g/L가 포함된 modified basal medium을 이용해 30시간 동안 진탕 배양시켜 배양한 효모 C. albidus를 표 3의 배지가 50ml medium이 채워진 250ml Erlenmeyer flasks에 10% (v/v) 접종시킨 후, 같은 배양조건에서 진행하였다.

표 3은 유기산 혼합액 또는 유기산 유래물질들을 이용한 효모 C. albidus로부터 미생물 지질을 생산한 것을 나타낸 결과이다.

Carbon Source	Biomass (g/L)	Lipid (g/L)	Lipid Content (%, w/w)	Y_L/S (g/g)^a
VFAs^b	2.57	0.65	25.1	0.125
Acetic acid	2.85	0.74	25.8	0.123
Ethyl acetate	1.38	0.26	18.5	0.058
Sodium acetate	2.79	0.68	24.5	0.083
Ammonium acetate	2.39	0.58	24.1	0.075
Calcium acetate	N.D.^c	N.D.	N.D.	N.D.
Ethanol	2.11	0.53	24.9	0.114

^a Y_L/S:Lipidyieldcoefficient,glipid/gcarbonsource.

^b VFAs ratio was 6:1:3 of acetic acid : propionic acid : butyric acid

^c N.D.: not detected

표 3으로부터, 유기산 혼합액(VFAs)은 젖산 및 초산과 비슷한 결과를 나타내어 탄소원으로 이용되기에 적당하였으나 지질함량은 25% 정도로 높지 않았고, 또한 수율이 0.125g/g로 높지 않았다.

미생물 성장의 효과적 탄소원인 포도당과 혼합사용의 가능성을 알아보기 위해 초산과 포도당의 비율을 바꾸어가며 미생물 지질을 생산하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

NO.	Biomass (g/L)	Lipid (g/L)	Lipid Content (%, w/w)	Y_L/S (g/g)
#1	2.94	0.68	23.1	0.097
#2	5.17	1.34	25.9	0.122
#3	5.98	1.76	29.3	0.135
#4	6.40	2.15	33.5	0.143
#5	7.75	2.94	37.9	0.173
#6	7.81	3.19	40.9	0.168
#7	8.91	3.68	41.2	0.175

Carbon sources (g/L): aa;acetic acid, G;glucose. #1(7-aa), #2 (5-aa & 6-G), #3 (4-aa & 9-G), #4 (3-aa & 12-G) #5-(2-aa & 15-G)m #6-(1-aa & 18-G), #7 (21-G). 7-aa 는 7g/L 초산을 탄소원으로 사용하였다는 것을 의미함.

표 4에 나타난 바와 같이, 포도당의 농도가 높아질수록 지질의 수율과 함량은 높아지지만 초산과 포도당의 비율이 2:15 (17 g/L)인 경우와 0:21(21 g/L)인 경우의 차이는 크지 않은 것을 알 수 있었다. 이로부터 값싼 유기산을 일부 포도당과 혼합하여 미생물 지질 생산 시 사용할 수 있다는 사실을 확인하였다.

실시예 6: 2단 발효에 의한 미생물 지질 생산

지질생산 효모 Cryptococcus albidus (ATCC 10672)를 이용하여 유기산의 저해를 최소화하면서 효과적인 미생물 지질 생산방법을 확립하기 위해 2단 발효 방법을 수행 하였다. 글루코스는 세포성장 및 지질 축적의 좋은 탄소원이나 그 가격이 비싸다. 따라서 미생물 증식용 생물반응기에서는 글루코스 또는 설탕 등의 당을 포함하는 탄소원을 이용하여 낮은 C/N비의 배지 (NH₄Cl 1g/L 이하)에서 미생물 균체 성장을 최대화하고, 미생물 체내산물 생산용 생물반응기에서는 높은 C/N비의 배지(NH₄Cl 5g/L 이하)에서 지질생산을 극대화하였다.

실시예 1의 modified basal medium에 표 5의 탄소원 및 질소원을 첨가한 배지에서 C. albidus (ATCC 10672)를 1차 배양 및 2차 배양시키고, 그에 따른 지질 생산능을 측정하여 나타내었다.

Carbon Source	1st Stage	2nd Stage
Carbon Source	Glucose	VFAs^a	Acetic acid
Carbon Source Concentration (g/L)	20	9	9
NH₄ClConcentration(g/L)	5	1	1
Cultivation Time (h)	48	60	60
Residual Carbon Source (g/L)	4.24	0.34	1.35
Biomass (g/L)	5.49	7.96	8.14
Lipid Concentration (g/L)	1.18	3.49	3.12
Lipid Content (%, w/w)	21.5	43.8	38.3
Y_L/S(g/g)	0.07	0.27	0.25

^a VFAs ratio was 6:1:3 of acetic acid : propionic acid : butyric acid

표 5로부터, 포도당을 함유하는 배지에서 C. albidus (ATCC 10672)를 1차 배양시킨 후, VFAS 또는 아세트산을 함유하는 배지에서 2차 배양시킬 경우, C.albidus (ATCC10672)의 유기산 저해를 최소화하고, 포도당과 동일한 지질함량을 얻어 경제성을 높일 수 있음을 알 수 있었다.

이는 상기 표 4에서와 같이 처음부터 유기산을 포함하는 배지에서 배양시키면 균체 성장이 둔화될 뿐 아니라, 탄소원으로부터 지질의 수율 또한 0.097 g/g로 낮았으나, 다단계 연속 고균체 생물반응기를 이용하면 수율이 0.27 g/g으로 높아지고, 지질함량도 44% 이상 생산되어 포도당을 이용한 것과 비슷한 효과를 보였다.

실시예 7: C/N비에 따른 지질 축적의 영향

질소원으로 NH₄Cl을 이용하여 C/N 비에 따른 지질 축적의 영향을 검토하였다. Crytococcus albidus (ATCC10672)를 실시예 1과 동일한 배양조건에서, 실시예 1의 modified basal medium에 탄소원으로 VFAS를 질소원으로 NH₄Cl를 사용하여 실험하였다. 도3에 나타난 바와 같이, 지질의 축적량은 C/N 비가 증가할수록 급격히 증가하였으며, 30% 이상의 지질을 축적하기 위해서는 C/N 비가 10 이상이어야 함을 확인하였다.

실시예 8: 미생물 지질의 조성 분석

앞서 실시 예에서 이용된 박테리아(R. opacus), 미세조류(C. protothecoides)및 효모(C. albidus)를 포도당을 포함하는 배지와 유기산을 포함하는 배지에서 각각 배양하여 지질조성을 분석하였다.

효모 C. albidus는 포도당 배지(Glucose 20 g/L, 실시예 1의 modified basal medium)에서 72시간 배양한 시료와 유기산 배지 (유기산 혼합물 (초산:프로피온산:부틸산=6:1:3) 9 g/L, 실시예1 의 modified basal medium))에서 96시간 배양한 시료를 비교하였다.

미세조류(C. protothecoides) 또한 포도당 배지 (glucose 20 g/L, 실시예 4의 Urea 0.5g/L, KH₂PO₄0.7g/L, K₂HPO₄0.3g/L, MgSO₄·7H₂O 0.3g/L, A5 trace element 1ml)에서 108시간 배양한 시료와 유기산 배지 (유기산 혼합액 (초산:프로피온산:부틸산=6:1:3), 실시예 4의 Urea 0.5g/L, KH₂PO₄0.7g/L, K₂HPO₄0.3g/L, MgSO₄·7H₂O 0.3g/L, A5 trace element 1ml)에서 168시간 배양한 시료를 비교하였다.

박테리아, 미세조류 및 효모의 지질을 클로로포름:메탄올(1:2) 용액으로 추출하는 Bligh & Dyer method를 이용하여 추출한 후 용매를 증발시키고 메탄올과 에스터 반응을 통해 메틸에스터를 형성하여 조성을 GC/MS로 분석하였다. R.opacus의 지방은 동물성 지방과 비슷하게 불포화 지방산 함량이 상대적으로 낮았고, 미세조류 C. protothecoides는 유체와 비슷한 불포화지방산 함량을 보여주었으며, 효모 C. albidus는 콩기름과 비슷한 불포화지방산 함량을 보였다. 지질 내의 불포화 지방산의 함량은 지질을 바이오 디젤로 전환하였을 때 저온 유동성을 결정하는 중요한 인자로써 불포화 지방산의 함량이 높을수록 저온유동성이 좋아 추운지방에서도 사용할 수 있다. 또한, 글루코스로 배양된 균과 유기산으로 배양된 균의 지방산 함량의 차이가 크지 않아 유기산 또는 유기산을 포함하는 탄소원을 이용한 미생물 지질 생산의 경제성은 매우 높은 것으로 평가되었다.

Organism	Carbon source	Relative proportion of fatty acids (% w/w)
Organism	Carbon source	C14:0	C15:0	C16:0	C16:1	C17:0	C17:1	C18:0	C18:1	C18:2	C18:3	C19:0	C19:1	C20:0
R. opacus	VFAs	3.8	15.8	20.7	14.4	4.6	5.5	16.4	5.0	-	-	6.1	5.5	2.1
C. protothecoides	Glucose	1.2	-	14.3	-	0.4	-	5.4	57.6	18.6	2.5	-	-	-
C. protothecoides	VFAs	-	-	21.5	-	-	-	21.7	45.9	10.8	-	-	-	-
C. albidus	Glucose	-	-	17.9	0.53	-	-	2.88	19.6	59.1	-	-	-	-
C. albidus	VFAs	-	-	16.1	-	-	-	5.14	17.7	61.1	-	-	-	-

Myristic acid (C14:0), Pentadecylic acid (C15:0), Palmitic acid (C16:0), Palmitoleic acid (C16:1), Margaric acid (C17:0), Heptadenoic acid (C17:1), Stearic acid (C18:0), Oleic acid (C18:1), Linoleic acid (C18:2), Linolenic acid (C18:3), Nonadecylic acid (C19:0), N/A (C19:1) Arachidic acid (C20:0)

표 6으로부터, 글루코스 대신 유기산(VFA)을 탄소원으로 사용하여도, 균주에 따라 다소 차이가 있으나, 지질(fatty acids)의 생산량, 조성 등은 큰 차이가 없다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 배양 미생물의 종류에 따라 지질의 조성을 바꿀 수 있으므로, 다양한 지질을 선택적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

실시예 9: 다단계 연속 고균체 생물 반응기를 이용한 미생물 지질 생산

일반 생물공정에서 원료가격, 전환율, 생산수율, 농도, 반응기 생산성이 중요한 역할을 한다. 실시예 1~8에서 VFA를 사용하여 원료가격을 대폭 낮추고 다단계 발효를 통하여 생산물의 농도를 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나 생산성을 향상시키기 위해서는 각 반응기를 다단계로 구성하고, 각 반응기를 고균체로 하는 다단계 연속 고농도 반응기(MSC-HCDC: multi-stage continuous high cell density culture)시스템으로 활용하는 것이 바람직하다.

고균체 연속반응기는 두 단계의 반응기 시스템으로 구성되며, 첫 번째 반응기는 유가배양식 때와 마찬가지로 균체생산 위주, 두번째 반응기는 균체 체내산물 축적 위주로 운영할 수 있다.

두번째 반응기 시스템에서는 반응기를 완전혼합형(CSTR)으로 운영하느냐, PFR(plug flow reactor)로 운영하느냐가 매우 중요하다. 예를 들어 미생물 체내산물중 하나인 지질 소모율을 일차반응으로 가정시, CSTR: 단독 반응기 C₁=C₀/(1+k₁.Θ_T), 여러개 반응기 C_n=C₀/(1+k₁.Θ_T/n)ⁿ ; PFR: C₁ =C₀exp(-k₁.Θ_T)로 주어진다. 여기서 Θ_T는 총체류시간, k₁는 속도 상수, C₀는 초기농도, C_n은 n번째 반응기의 지질농도이다. C_n이 작을수록 전환율이 높은 것이며 지질의 농도가 높아진다 (화공반응공학 교과서 인용).

CSTR을 여러 개 썼을 때 90% 전환율 (C₁=0.1C₀)일때의 지질 생산성을 이론적으로 예측해 보면 n=1을 100%라고 하면 n=2, 208%, n=3, 260%, PFR=390%가 된다. 생산성은 전환율이 높을수록 반응기 개수를 늘이는 것이 유리하고, 그 최고값은 PFR의 값에 수렴한다.

생산성을 높이는 또 다른 방법은 생산균주를 현재의 C. albidus에서 성장이 빠른 대장균 (E.coli)으로 바꾸는 것이다. 현재 이러한 노력은 Berkeley 대학의 Keasling group에서 진행되고 있는 데 (Steen, E.J. et al, Nature, 463, pp559-562, 2010), 상용화 공정에서 미생물 균체 1g당 0.2g/(L.h)를 얻을 수 있다고 한다.

요약하면 균주자체의 생산성과 반응기 효율이 반응기 전체의 생산성을 결정하게 된다. 표 7은 반응기 총 체류시간을 고정한 조건에서 지질생산반응기의 개수와 전환율에 반응기 시스템의 효율을 보여주고 있다. 이것이 실현되면 생산가격을 0.44$/kg 이하로 낮출 수 있는 것이다. 이 모든 것은 고가의 제조가에 기인하는 것이므로 제조가 저렴한 국가에 공장을 건설하면 다시 경제성을 맞출 수가 있는 것이다.

Lipid productivity (g/L/h)
시스템	균체성장속도(K₁), 지질생산속도(K₂)	전환율	1-CSTR	2-CSTR	3-CSTR	PFR
system 1	k₁=0.1, k₂=0.1	90%	5	10.4	13.0	19.5
system 2	k₁=0.2, k₂=0.1	90%	6	12.4	15.6	23.4
system 3	k₁=0.4, k₂=0.2	90%	12	24.9	31.2	46.8
system 4	k₁=0.8, k₂=0.4	90%	24	49.2	62.4	93.6
system 2-1	k₁=0.2, k₂=0.1	50%	54	64.8	69.12	77.76
system 2-2	k₁=0.2, k₂=0.1	95%	2.82	7.614	10.35	17.77

시스템 설명: R₁(균체생산용), R₂(지질생산용), R₂ 반응기를 여러 개의 CSTR로 연결하여 반응효율을 높힘 (단, 총체류시간 Θ_T는 동일함. k₁=균체성장속도 (1/h), k₂=지질 생산속도 (1/h))

상기 system 1은 R₁(균체생산용 반응기) 1개에 R₂(지질생산용 반응기)가 2개 연결되어 있고, system 2~4는 R₁(균체생산용 반응기) 1개에 R₂(지질생산용 반응기)가 4개 연결되어 있다.

상기 전환율은 유기산이 지질로 전환되는 비율을 나타낸 것이며, 1-CSTR, 2-CSTR, 3-CSTR은 R₂(지질생산용 반응기)가 병렬로 연결된 수에 따라 구분한 것으로서, 도 4에 나타난 바와 같이 n-CSTR까지 구성이 가능하다.

System 2-1 및 2-2는 system 2에서 전환율을 50%, 95%로 변경했을 경우를 의미한다.

도 4는 시스템 2의 다단계 연속 고균체 생물 반응기의 설명도이다. 미생물균체 생성 반응기는 성장률과 희석률(D, dilution rate)이 0.2/h로 동일하며 D₁이 0.05/h 식 나누어져 4개의 R₂(지질 생성 반응기)로 유입된다. 이 4개의 반응기에는 0.05/h 식 지질생산용 유기산 용액이 유입되어 각 반응기는 0.1/h의 유량을 최종 배출한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

생물반응기에서 박테리아, 효모, 곰팡이 및 미세조류로 구성된 군에서 선택되는 지질 생성능을 가지는 미생물을 증식시킨 다음, 초산, 프로피온산, 부틸산, 젖산, 숙신산, 클루콘산, 발레르산, 카프로익산 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 유기산을 기질로 유가배양(Fed-batch)하여 미생물 지질을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
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다음 단계를 포함하는 다단계 연속 고 균체 생물반응기에서 유기산을 원료로 하여 미생물 지질을 생산하는 방법:
(a) 미생물 증식용 생물반응기에서 박테리아, 효모, 곰팡이 및 미세조류로 구성된 군에서 선택되는 지질 생성능을 가지는 미생물을 배양하여, 증식시키는 단계;
(b) 상기 미생물 증식용 생물반응기에서 증식된 미생물을 유기산을 함유하는 배지를 포함하는 미생물 지질 생산용 생물반응기에서 배양하여, 미생물 지질을 생산하는 단계; 및
(c) 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물 지질을 회수하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 미생물 증식용 생물반응기 및 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기는 다단계 연속 고농도 반응기(MSC-HCDC: multi-stage continuous high cell density culture)로 구성되고, 상기 미생물 증식용 생물반응기는 CSTR(연속교반탱크반응기) 형태로 운전되며, 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기는 여러 개의 CSTR 형태로 운전되거나, 1개의 CSTR의 내부를 여러 개로 분할한 PFR(플러그플로우 반응기) 형태로 운전되는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 미생물 증식용 생물반응기는 미생물 증식을 위한 것이고, 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기는 유기산을 기질로 하여 유가 배양식으로 미생물의 체내산물을 생산시키기 위한 것임을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 (a) 단계 또는 상기 (b) 단계 이전에 유기성 폐기물 또는 저가의 유기물로부터 유기산을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제7항에서 있어서, 상기 유기성 폐기물은 도시 쓰레기, 음식물 쓰레기, 슬러지, 가축 분뇨, 유기성 바이오매스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
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제4항에 있어서, 상기 미생물 증식용 생물반응기에서의 미생물 배양배지는 글루코스, 목당, 아라비노즈, 설탕, 알코올, 당알코올, 바이오매스 당화액 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 탄소(C)원 및 암모니아 유래 화합물, 질산화물, 요소, 옥수수 침지액, 음식물쓰레기 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 질소(N)원을 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기에 포함된 유기산을 함유하는 배지는 유기산 이외에 글루코스, 목당, 아라비노제, 설탕, 알코올, 당알코올, 바이오매스 당화액 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 탄소(C)원 및 암모니아 유래 화합물, 질산화물, 요소, 옥수수 침지액, 음식물쓰레기 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 질소(N)원을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 반응기내 유기산 농도를 1~5g/L로 유지하는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 미생물 지질 생산용 생물반응기의 배양액으로부터 미생물 지질을 회수후, 잔존하는 미생물은 유기산 생산을 위한 균주로 이용되는 것을 특징으로 하는 미생물 지질을 생산하는 방법.
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