CN102089434A - 生物燃料原料生产的集成*** - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产藻类生物量包括油脂、蛋白和碳水化合物的培养***。通过并联集成异养过程与自养过程，本***可进行包括寒冷季节在内的全年生产。通过串联集成异养过程与自养过程，本***可提供一个两阶段，互相独立的藻类混合培养工艺，即利用有机碳和营养物质用于异养种子培养，然后所得的种子进行大规模自养培养用于细胞生物量积累。有机碳源包括可用于异养培养的废弃原料。异养和自养过程的生产能力比率可根据季节和相关资源的可用性进行调节。本***用于生产和收集微藻生物燃料原料以及其他高附加值产品。该方法加强了碳和废弃营养物的利用，提供了一种有效的控制污染的方法，增加生产和产品类型的灵活性，由于最大化利用可利用生长表面积从而提供更强的经济力。

Description

生物燃料原料生产的集成***
本专利申请要求书得益于2008年7月30号申请的申请序号为60/084,708的美国临时专利，其相关的完整内容见参考文献。
技术领域
本发明涉及一个生产微藻生物质的培养***用以获得油脂、蛋白质和糖。通过异养和自养并联的培养模式，本培养***可在寒冷的气候全年生产。通过异养和自养串联的培养方式，本***建立了一个两阶段、独立的混合营养微藻培养过程，即利用有机碳源和营养物质异养培养生产营养藻种子，然后将这些微藻种子进行大规模的自养培养以获得细胞生物质。其中有机碳源包括可用于异养培养的废弃物。异养过程和自养过程的生产量比率可根据季节和相关原料的可用性进行调节。本***用于生产和获得藻类生物燃料原料以及其他高附加值产品。此培养方法可以加强碳和有机废营养物的利用，为控制环境污染提供了一个有效的方法，增加生产和可用产品类型的灵活性，并且由于最大化利用可用种植面积从而提供更强的经济力。
背景技术
采用微生物法(如利用藻类和酵母)生产油脂，单位面积比油料作物产量高(Pienkos and Darzins，2009)。研究表明藻类有可能替代相当大一部分的化石燃料而不改变大量土地使用或造成重大影响。据Chisti报道(Chisti，2007)，在美国仅需约1.1％和2.5％的现存种植面积(分别假设油脂占藻类干生物量的70％和30％)即可满足美国50％的交通运输燃料需求。如果用作CO2利用手段，每磅藻类生物量可固定1.6-1.8 lb的CO2(Chisti，2007)。此外，作为一种水产养殖的形式，藻类培养为农业提供了新的机遇，为生产者、加工者和经销商带来经济利益。显而易见，与作为生物燃料生产原料的藻类生产相关的新技术为满足社会对能源安全的需求、应对环境变化以及经济可持续性发展提供了很大机遇。
根据作为能源载体和藻类细胞骨架的碳源种类的差异，藻类培养可分为三种类型。第一种类型是自养培养，CO2作为碳源，太阳光作为能量来源。第二种类型是异养培养，有机碳如葡萄糖或有机酸被用作碳源和能源。第三种类型是混合营养培养，CO2和有机碳均被用作碳源。目前，由于缺乏使能技术和存在于每个环节中的技术障碍，没有一种培养模式被用来商业化生产燃料。
相比而言，考虑到培养规模和投资成本，藻类的自养培养生产率较低(Singh and Ward，1997)(Wen and Chen，2003)生产造价高。此外，由于光线的穿透与细胞浓度成反比，光的限制不能完全克服。光生物反应器培养液中高浓度氧的积累也是另一个未解决的问题。开放池中藻类的自养培养投资成本低，但生产率也较低，并且易受其他微生物及昆虫的污染(Rusch andChristensen，1998；Rusch and Malone，1998)。迄今为止，可用于商业化生产的自养藻类仅仅是用于生产色素、类胡萝卜素和保健品等高附加值产品，大规模的培养自养藻类用于生产生物柴油其投资成本相比产值来说还高很多(Pienkos and Darzins，2009)。
与自养藻类不同的是，含油微生物如油藻或者酵母的异养培养过程中生长不需要光照，并且可在较大容器内进行高密度培养。异养培养的优点还有生长速率快，产量高，易收获。早在20世纪80年代开发的由酵母发酵生产单细胞油脂(SCO)企图利用微生物代替作为人类食物和动物饲料的植物脂类和蛋白，从而进行商业化生产SCO和单细胞蛋白(SCP)(Ward and Singh，2005)。早期的SCO生产集中于可可黄油等高价值油脂，一些酵母的发酵工艺随后也实现了产业化。从20世纪90年代开始，一批异养微藻被用来生产高价值的聚不饱和脂肪酸(PUFA)，如ω-3族脂肪酸用来代替传统的鱼油中的不饱和脂肪酸。其中，一些藻种如裂殖弧菌和隐甲藻(Schizochytrium sp.andCryptocodinium cohnii)被成功的用于工业化生产DHA(Bailey et al.，2003)及婴幼儿配方奶粉。近年来，一些对酵母和异养微藻培养的研究被报道并且表明了该工艺方法具有广阔的应用前景(Easterling et al.，2009；Xiong et al.，2008；Xue et al.，2008)。然而，利用异养微生物生产生物柴油的障碍在于其培养过程投资成本过高以及碳源原料成本过高。糖到脂的转化率约为16.7～25％，取决于酵母或微藻细胞内油脂的含量，这是因为一部分碳源被用来提供能量，而另外一些形式的碳用来形成细胞骨架和生物质(Kyle and Ratledge，1992)。因此，生产1吨油脂约需4～6吨葡萄糖。利用纤维源性糖进行油脂生产是降低原料成本的一种选择，但从纤维素乙醇迟迟不能工业化生产可见，由于某些技术障碍导致成本依然很高。一种可选择的降低成本的解决方法就是通过利用富含糖和/或淀粉的有机废弃物作为碳源用于异养培养(Kapdan and Kargi，2006)。尽管来源有限，但这些有机废弃物作为碳源用于异养种子罐培养(不包括后面的开放池塘自养培养)是充足的、理想的，这两者均是下述的新颖培养模式的核心。
发明内容
本发明的优势在于采用细胞高密度异养培养和低成本大规模自养培养相结合的模式，以及循环利用碳废弃物、营养物和有机废弃物。这种培养方式灵活性强，可以克服季节气候变化的不足，减少污染，降低池塘大小和投资成本的要求。首先，按照不同需要，本***可异养和自养培养并联运行，并且相应地利用有机和无机碳源以扩大生产能力和***的稳定性，尤其在季节性恶劣天气和/或其他生物污染时，藻类自养培养过程将被中断，但异养过程如含油酵母和异养藻类可利用有机废弃物为原料进行生长，产生富含油脂的酵母或藻类生物质，然后被加工成生物燃料。最重要的是，异养和自养培养过程串联集成的***可进行藻类混合营养培养，混合培养中两种培养方式是分别独立进行的，其中异养过程用于培养微藻种子，然后自养过程用于积累生物质和油脂。该串联培养***可通过高产油脂自养兼异养光合藻类来实现，这些藻类包括许多小球藻类(Chlorella sp)(Hermsmeier et al.，1991)，南极冰藻(Chlamydomonas sp.)(Boyle and Morgan，2009)，栅藻(Scenedesmus sp.)(Abeliovich and Weisman，1978)，以及许多硅藻类(Lewin，1953)。这些可双重营养培养的藻类可工业化培养生产藻类生物质，而利用这些双重营养藻类的集成培养***具有如下诸多优势：
1)异养与自养相结合的培养模式可确保藻类在寒冷季节的生产能力以及增强在所选地点的生产稳定性。为了达到相同的目的，异养培养***也同样适用于酵母。
2)种子异养培养优于通常采用的种子自养培养，这是由于异养培养过程可在较短时间内更有效地产生大量的种子菌体。
3)异养培养可利用有机碳和有机废弃物中的有机材料，甚至是回收的废弃甘油，这些有机废弃物通常都是易得到的，有时是省产和加工过程中产生的垃圾。利用有机碳完成部分藻类生物量的生产使得该过程更具灵活性和多样性，即可根据不同的环境和工业CO2的含量，或根据季节和污染的发生重新并联或单独利用特定异养反应器。废弃固体物质最好是可经预处理和水解成藻类培养过程中易利用的有机碳。培养温度为10～40℃，20～35℃更好，30～35℃最好。该培养过程中氧气被通入培养容器中，溶氧控制在发酵液饱和氧浓度的0～90％，5～50％更好。该过程中采用的发酵罐或生物反应器是下列培养容器中的一种或多种：搅拌釜发酵罐、鼓泡塔生物反应器、气升式生物反应器，或者其他任何可用于微生物异养培养的生物反应器。这里，用于异养培养的反应器可以是黑暗封闭的发酵罐、反应器或生物反应器。
4)由于异养培养生产种子的能力在需要的情况下可得到显著的提高，这为控制下游自养培养过程中的生物污染提供了一种解决途径。研究表明经异养培养产生的种子类型、数量及接种量直接影响到开放式自养培养克服污染的能力。
在整个生长过程中，碳和营养物质的利用可通过产生的CO2和异养培养液中残余的营养物质进行优化控制，这些CO2和异养培养液中残余的营养物质可被用于自养培养过程，最终使得化学药品的投入和固体物质及污水处理更高效。
通过一个专门的异养过程进行种子培养，增大了自养培养池表面积生产率，从而使得该过程更具经济性。
该过程及多种碳源的利用使得以前由于温度和/或太阳光密度而不能进行藻类培养的气候区现在可用来培养藻类生物质，即通过该区域内有机碳的利用弥补无机碳利用中的不足。其结果意义重大，该过程从经济上和环境上是可行的，可更有效的回收和利用碳和营养物质，从而提高了***的可持续性。
该异养自养培养过程提供了一种新颖的方法，以前关于藻类生物质用于生物燃料原料的专利均围绕单独的自养培养、单独的异养培养(Chen and Chen，2006)和/或自养-异养培养的各种工艺过程展开，而异养-自养培养模式则未见报道。尤其对于后者，美国专利20080160593-A1(Oyler，2008)(见参考文献)描述了一个藻类生产生物燃料的自养-异养工艺过程。本发明中异养-自养培养过程的核心是自养藻类兼性异养能力的利用。Chen和Johns(1991)在研究某些藻类兼性异养能力时，研究了C/N比和通风对异养Chlorella sorokinina脂肪酸组成的影响，但是对这些藻类或其近缘藻类用于本发明中异养-自养培养过程并没有得出结论。本发明中的顺序培养法的一个显著的特性就是本***可减少下游开放池培养过程中的污染。Theegala等(1999)报道了一种清洗连续液压管式恒化藻类反应器中污染物的方法，利用反应器中流量和停留时间来控制污染物，但并没有提到接种量也可起到相同的作用。
本发明提供了一种生产生物燃料原料的方法。该方法包括以下步骤：利用异养培养藻类或类藻类微生物以生产种子，这些藻类和类藻类微生物具有自养和异养生长的生理机制；然后这些异养培养的种子进行自养培养以积累生物量和脂类。在一个实例中，异养培养阶段包括利用废水和废弃固体物质作为有机碳源来培养具有在不透明发酵罐或生物反应器中可自养和异养生长生理机制的藻类或类藻类微生物。这些废水和废弃固体物质包括但并不局限于农业废弃物、工业纸浆、市政废水的有机成分、藻类生物体残核，或者任何含有可用于微生物培养的有机碳源的有机废弃物。该方法具体包括将异养培养过程中产生的CO2作为碳源进行自养培养。在一些实例中，藻类或类藻微生物如Chlorella sp.，Chlamydomonas sp.，和/或Scenedesmus sp.经异养培养的种子液细胞浓度为107～109个细胞/ml或者更多。该方法具体包括异养培养藻类或类藻微生物以积累生物量和油脂。
本发明还提供了一种生产生物燃料的方法，该方法包括以下步骤：异养培养具有自养和异养生长生理机制的藻类或类藻微生物以生产种子；然后这些异养培养的种子进行自养培养以积累生物量和油脂；从这些藻类或类藻微生物细胞中提取油脂用作生物燃料。在一个实例中，异养培养阶段包括利用废水和废弃固体物质作为有机碳源来培养具有在黑暗发酵罐或生物反应器中可自养和异养生长生理机制的藻类或类藻类微生物。这些废水和废弃固体物质包括但并不局限于农业废弃物、工业纸浆、市政废水的有机成分、藻类生物体残核。在一些实例中，这种方法还可包括利用异养培养过程中产生的CO2作为碳源进行自养培养。这些藻类或类藻微生物包括但并不局限于Chlorellasp.，Chlamydomonas sp.，和/或Scenedesmus sp.经异养培养的种子液细胞浓度约为107～109个细胞/ml或者更多。
本发明还提供了生产生物燃料原料的***。该***包括：至少有一个设备用于异养培养具有自养和异养生长生理机制的藻类或类藻微生物以生产种子；至少有一个开放式池塘或反应器用于自养培养由异养培养得到的藻类或类藻微生物种子以积累生物量和油脂。配置一个开放式池塘或反应器以存储来自至少一个发酵罐的异养培养得到的藻类或类藻微生物种子。该***可包括一个或多个检测设备以检测和提供开放式池塘或反应器内不同生长条件下的产量，还可进一步包括一个或多个控制设备用以根据检测器提供的产量来自动关闭或开启开放式池塘或反应器中的操作。监测的参数(生长条件)包括但不仅限于太阳光的量、温度以及污染物的存在与否。
附图说明
图1为异养-自养藻类培养集成***概述；
图2为异养-自养藻类培养集成***的质量平衡；
图3为利用食品水解废弃物进行的酵母培养***；
图4为利用市政废水进行含油酵母培养时补加葡萄糖培养***；
图5为利用食品废弃物进行C.sorokiniana种子培养的生长动力学；
图6为不同种子生长过程的倍增速率比较；
图7为ChlorellaSorokiniana与EG-1-2的生长曲线；
图8为异养和自养种子液进行开放式池塘培养倍增速率的比较；
图9为异养和自养种子进行自养培养(相同的接种量)时的生物量生长比较(图9a)和工程投资比较(图9b)；
图10为混合培养***与纯自养培养***的经济性比较。
具体实施方式
本发明描述了一个两阶段藻类细胞高密度培养工艺，其中异养过程用于培养藻类种子，然后进行自养培养。生产所用菌种为具有自养和异养生长生理机制的藻类。特别是小球藻类(Chlorella sp.)，南极冰藻(Chlamvdomonassp.)，栅藻(Scenedesmus sp.)，和许多可双重营养培养的硅藻类。这中双重营养培养的能力在工业化培养生产藻类生物质中具有较大优势。
“生物量生产”或“生物量积累”的意思是培养液中生物体数量的增多和/或在培养过程中生成或合成的某一特定物质量的增加。换言之，“生物量”还可指生物体本身的组成，或者是生物体生成的物质。这些物质可在生物体内积累，或者是生物体的一部分，或者是生物体的附属物，或者是生物体分泌到培养液中的物质。这样的物质可包括但不仅限于如脂质、蛋白质、碳水化合物、糖、氨基酸、类胡萝卜素等。这些物质可在生物体生长过程中被生成，其在培养液中生成量随生物体数量的增加而增加。另外，这些物质的生产受培养条件或其他环境因素(如氮缺乏)的影响。特别是生物体中的脂质组分可用作生物燃料。
在一个实例中，废弃碳源首先在异养培养过程中被用作营养源。第一生长阶段的产物作为第二生长阶段的接种体。第一生长阶段结束后，培养液中仍存留有足够的营养物用于第二阶段自养生长，另外产生的CO2可被回收利用(图1)。
在该发明中，一种或多种有机碳源被用于异养培养过程。在一个实例中，有机碳源为废弃物质。这些废弃物可以是废水和/或含有可被异养生物利用的有机碳源的固体废弃物。本实例的优势在于原料成本较低，并且可有效利用废弃物。如果需要的话，废弃有机物(如农业废弃物、工业纸浆、市政废弃物中有机部分、藻类生物体残核、各种废水等)首先于特定设备内经适当的预处理和水解被收集(P-01，图1)，然后用于糖原料的生产(E1)。在一些实例中，水解废弃有机物的一种方案是先用稀酸水解然后进行酶水解。稀硫酸预处理被认为是最经济有效的水解木材和农业废弃物的方法，它可破坏半纤维素的结构，降低纤维素的结晶度，为后面的酶水解创造更大的孔隙度。在酸性条件下，一些蛋白可同时被水解为氨基酸，然后被藻类和酵母所利用。经酸预处理后，利用纤维素酶和半纤维素酶的酶水解过程可用来产生糖。回收的粗甘油和后续酯化过程(E-7)中的残余生物量也可作为碳源和营养物质(P-20和P-19)。糖和/或甘油然后被传送到(P-03和P-04)两个异养发酵罐中(E2和E3)，其中一个用于异养培养生产高附加值产品(P-17)，另一个用于为第二阶段的开放池自养过程(E-5)培养种子(P-07)。此外，非废弃碳源和/或非废水也可用于该过程的补充碳源。
除了生物燃料，异养藻类还可生产高附加值产品如类胡萝卜素、酶，以及DHA和其他ω-3族脂肪酸。该异养培养过程与美国专利12/132,131(见参考文献)中描述的过程类似。异养藻类产生的高附加值产品可作为一种藻类原料被利用和出售，或者进一步被分离提取。在一个分离提取的实例中，藻类生物体(P-18)可通过酯化反应被直接转化为混合脂肪酸甲酯(FAME)(P-21)和其他副产物(P-19)，而不需要油脂提取或干燥(E-7)，如PCT/US08/50799中所描述(见参考文献)。在一些特殊的实例中，高附加值产品由ω-3族脂肪酸组成，混合FAME(P-21)然后可通过蒸馏(E-8)的方法被分离，得到的保健品ω-3FAME和非ω-3FAME可作为生物柴油(P-22)被出售。
大多数自养藻类也是兼性异养藻，它们具有这种特性并且有能力利用并转化有机碳。在本工艺过程中，自养兼性异养藻类分两阶段进行培养。第一阶段是封闭性的异养过程用于培养高细胞密度的种子(如107～109个细胞/ml或者更多)，该过程与美国专利12/132,131方法类似(见参考文献)。第一阶段的营养物和高密度细胞被用于第二阶段的开放池或光反应器自养培养过程。这中两阶段培养工艺通过利用第一阶段培养的高密度细胞接种使得开放池中的污染具有很大的可控性。第一阶段培养的细胞密度约为107～109个细胞/ml或者更大，作为种子这可在第二阶段开放式自养培养过程中保持比其他生物更强的生存能力。许多情况下，藻类种子培养是在光反应器和/或开放池中进行的。然而，这需要一定的照明面积，不但成本高，而且由于高密度培养与光照面积之间的矛盾关系使得封闭式光反应器不能用于商业化生产。异养发酵罐中藻类的生长不像自养培养过程那样需要高的表面积与体积比，因此，更容易扩大规模生产，也不存在高密度培养与光照面积相矛盾的问题。异养种子培养的另一个优势在于具有通过氮源控制种子细胞叶绿素含量的能力。通过细胞叶绿素含量的控制可以不通过基因操作而达到提高培养物光合成能力的目的。
第二阶段自养培养利用封闭式异养过程培养的种子进行(P-07)。在一个具体实例中，在被用于该培养过程的开放式培养池(E-5)或类似的具有大表面积的合金容器中，藻类可完全或部分的与外界环境接触。异养种子培养过程中(P-06和P-10)的发酵液可被用于自养开放池培养的营养源。异养培养过程中用过的发酵液可通过离心的方式浓缩后再利用，也可不经分离，与种子细胞一起被直接输送到开放式培养池中。另外，尽管自养反应器的体积比异养发酵罐大得多，异养发酵液中的浓缩营养物仍然是自养开放池中一种重要的投入物。自养培养池中(P-14)的藻类细胞(E-06)被收集起来。在一个首选的关于下游分离提取的实例中，藻类生物量(P-18)通过酯化反应过程被直接转化为混合脂肪酸甲酯(FAME)(P-21)和其他副产物(P-19)，此过程不需要油脂的提取和干燥(E-7)(PCT/US08/50799)。然而，其他的燃料转化和燃料加工的方法如热解、液化、汽化等可被用于加工回收的藻类生物体(Li et al.，2008)。
在一些被低估的废水制造厂如动物饲养场、食品加工厂或市政污水处理厂附近，进行藻类的培养将会起到非常重要的协同作用。
●采用类似于美国专利12/132,016(见参考文献)中的养分回收***建立一个相关的厌氧消化(AD)单元，也可用来提供营养成分。工业、农业、堆肥或市政废水可通过AD处理产生可转化为具有热量和能量的生物气体和具有原始营养成分(一些有机碳除外)的液体。在本实例中，AD作为一个废弃有机碳的处理单元可产生热量和能量，这些热量和能量部分可用于藻类的培养，富营养化废水也可用于藻类的培养。此外，开放式自养池塘也需要无机碳源CO2(P-13)，这些CO2部分来自AD和相关(E-09)设备产生的废气(P-09和P-11)以及异养培养反应器(P-05)中产生的废气。开放池中的温度可通过利用AD(P-23)中的废物发生器进行部分控制。所需的电力消耗可作为AD(P-24)发生器电力输出的附属负载。从沉淀池(P-16)中收获的浓缩细胞然后经前面提及的原位提取装置(E-07)提取出生物柴油(P-22)。
●异养过程与自养过程相结合的培养模式可利用废气有机碳和其他资源如水、CO2、太阳光等生产藻类生物质，因此提高了生产能力。并且，在恶劣气候或利用有机碳源受到污染导致自养藻类生产率低下时，异养和自养过程可分别独自进行或同时并行运行。
最后，本发明中的集成***可以提供一个或多个检测器(传感器)和/或控制器来监控一个或多个反应器中的情况，并可向操作者提示对生长有利或不利的条件。例如，自养反应器可配备一个可测量或感知太阳光或其他光源量(如流明)的传感器，该传感器可测量或感知任何时刻投射在自养培养液上的太阳光或其他光源的量，或者某一特定时间段内(如一分钟、一小时和一天等)投射到自养培养液上的太阳光的积累量。传感器的设计应有利于操作者可根据输出数据决定自养培养过程是否继续或中断、终止、完全关闭而转入异养培养阶段。此外，传感器的设计可以包括或把信息传递给自动控制器，该自动控制器可自动切换***由自养培养模式到异养培养模式，反之亦然，如切换回自养和异养模式，比如开启自养模式。在一些实例中，只包括自养反应器。然而，在其他实例中，由于条件不同包括自养反应器和/或异养反应器。即使异养反应器不利用太阳光，但它的设计仍可配备监测相关条件的传感器用来记录信息并提供输出数据，以进行自动转换成异养培养或转换回自养培养模式。另外，该检测器可与两个培养模式的反应器通过电子或手动的方式相连接。
除了监测光的水平或感知光，该检测器还可用于监控(跟踪、感知、测量等)其他参数，包括并不仅限于温度、污染物的存在、季节(如在不考虑光照的量和温度的情况下，秋季时自动转换到异养培养模式)，还可反应出一个或者两个反应器中的条件变化(如当异养反应器由于维修和故障等原因不能进行操作时，自养反应器也将被关闭)。该检测器的这种能力将可监控许多有用的参数，这些参数均包括在本发明中。此外，可实现自养异养培养模式之间的自动转换，可以利用计算机***记录输入参数，然后给出相应的输出数据，例如参数信息或者向操作者发出的执行培养模式之间转换的指令。另外，这些检测器和控制器可用于fine-tune反应器，例如监测并告知使用者异养反应器内的情况(如种子生产状况)，以便于调节自养反应器内的生长水平，反之亦然。换言之，依据传感器进行的两个反应器内活动水平的调节不是一次性的，而是通过手动或自动的逐渐调节。事实上，当采用多反应器时，控制器可在给定时间内检测有多少个检测器是可操作的，以及它们以何种模式运行(自养或异养)。例如，在夏季，异养过程的部分功能(30％)用于种子培养，大部分功能(70％)用于藻类生物量生产；当发生污染时，藻类生物量生产将转换为种子生产。在冬季，自养生产可完全停止，种子生产部分将转换为藻类生物量生产。这种操作策略将使设备得到更有效的利用，并保证藻类生物量的全年供应。本发明的该方面内容如图1中描述，其中检测器10与控制器20自动连接。
此外，在一些实例中，异养培养还可用于生物量和脂质累积。例如，为了最大限度的利用检测器，异养反应器或异养培养不再用于种子生产(或从开始就不用于种子生产)，而是用于生物量和脂质的积累，例如，这里描述的异养/自养过程并行运行模式。另外，如果生产了足够的藻类种子(如达到可满足特定季节的***的需要的水平或数量)，异养反应器可转而用于生物量和脂质的积累，同时，自养过程也在进行生物量和脂质的积累。
实例
实例1.给定***的流程图
图1汇总了异养和自养相结合的培养过程，其中包括由藻类到生物燃料的生产设备，表1列出了关键设备和管道。
表1图1中的设备及管道列表
Figure BPA00001299999000121
Figure BPA00001299999000131
图2描述了产1000万加仑生物柴油的该集成过程和已知产量的实验室和中试装置水平的各工艺过程的质量平衡图。由质量平衡图可知，通过该工艺过程生产10MMg/yr生物柴油时，所需的所有营养物和无机碳基本可满足需要的有机碳的投入。进一步的分析表明经水解反应器中处理过的废弃有机物或直接利用粗甘油可满足1/5的有机碳投入。以水解反应器和厌氧消化器形式的额外投入部分可由额外收入包括tipping fees，电力和附加值产品来弥补。
实例2.异养培养
各种有机废弃物可作为异养培养过程的原料。经过不同程度的预处理，可获得含油糖、短链脂肪酸和/或甘油等的产品。异养发酵可利用这些碳源在大规模发酵罐中进行，该发酵罐中pH、溶氧和温度可控以便于提供一个细胞生长和获得最大细胞密度的最佳的条件，这些是技术操作人员所熟知的。大部分碳和一部分氮、磷在该过程中被消耗，然而，一定量的COD、氮和磷还将残留在流出液中。幸运的是，流出液将可作为自养藻类培养的营养源，从而可降低成本，增大体系投入的重复利用。以此类推，最终自养培养过程的流出液将具有更低的COD、氮和磷的水平，这是因为自养藻类可利用和吸收这些物质，因此，改善了下游的水质。该实例中提供了详细的相关信息：(1)藻类和类藻生物具有在生长和异养种子细胞培养过程中利用废弃有机物的能力；(2)整个集成***中各种含碳、氮和磷的有机废弃物可得。
利用市政固体食物废料进行的含油酵母的培养。如图3所示，五种含油酵母被用于异养培养单细胞油脂的生产(图1中的E2)。该过程利用有机废弃物作为原料，其中食物废料就是这种有机废弃物的一个典型例子。食物废料水解液被用作基础培养基(培养基A)，培养基B在此基础上外加5g/L蛋白胨和5g/L酵母膏，培养基C在B的基础上再加入10g/L葡萄糖。用水配制的培养基用作对照，组成5g/L 5g/L蛋白胨、5g/L酵母膏和20g/L葡萄糖。每种含油酵母用这四种培养基进行培养，然后观测它们在食物废料水解液培养基中的生长潜力。仅用食物废料水解液作为培养基，含油酵母Rhodotorulaglutinis生物量为10g/L，Cryptococcus curvatus和Yarrowia lipolytica的生物量均比对照高(图3)，这表明所选的含油酵母，藻类和类藻生物具有很强的利用废弃有机资源进行细胞高密度生长的能力。
利用市政废水进行的含油酵母的培养。数据表明，如果提供足够的碳和氮源，所选的这三种含油酵母(还可能包括其他藻类和类藻生物)均可利用市政废水良好的生长(＞15g/L)(图4)，这表明市政废水外加碳和氮源可作为酵母、藻类和类藻生物生长的具有潜力的培养基。
利用食物废料和市政废水进行的两步含油酵母培养工艺。表2给出了该培养中所用食物废料水解液物的主要成分。
表2食物废料水解物组成成分
Figure BPA00001299999000141
食物废料水解物与市政废水混合用作含油酵母的培养基。第一阶段的培养持续6天，该过程中产生大部分营养物质和含油酵母生物体。该阶段过后，90％产生的酵母生物体被收集，10％被残留在发酵液中用于进一步的生长和后续培养的营养源。更多的生物量在第二阶段培养中获得，第二阶段比第一阶段效率要低，但COD、氮和磷的浓度降至很低的水平。该过程的发酵液然后被用于C.sorokiniana的自养培养过程，因为发酵液中仍然含油较高的氮和磷可用于藻类的生长。该过程生产自养藻类生物量，COD、氮和磷的浓度降至可排放到环境中而不引起污染的水平(表3)。
表3利用食物废料和市政废水进行的两阶段酵母培养过程
Figure BPA00001299999000151
利用食物废料和市政废水进行的C.sorokiniana异养种子细胞培养。食物废料和废水被用作C.sorokiniana的种子细胞的培养基。经过6天的异养培养，C.sorokiniana的细胞浓度可达353和366×106个细胞/ml，该过程中营养物质被消耗(表4)。
表4利用食物废料和废水进行的C.sorokiniana异养种子细胞培养
Figure BPA00001299999000152
然后，异养培养的种子细胞和培养基以1％和0.1％的接种量被接种于自养培养基中。经7天自养培养，分别得到0.16g/L和0.15g/L的藻类生物量(表5)。
表5利用食物废料进行的C.sorokiniana自养种子培养
Figure BPA00001299999000161
C.sorokiniana的生长动力学如图5所示。数据表明只有C.sorokiniana(可双重营养培养生物的代表之一)可有效地利用食物废料进行异养种子生产，而且这些种子细胞还可继续进行营养转化，并且在自养过程中有效的生长。
实例3.可应用于该过程的其他藻类菌种
除了实例2，4和5中的Chlorella sorokiniana，很多其他种类的微藻菌种也可在异养和自养条件下进行培养，并且可用于实例1和2描述的过程中。尽管这里没有提供这些微藻菌种通过该过程培养的试验数据，但是这些微藻可用作生产菌种，因为它们具有自养异养生长的能力。
表6可在异养和/或自养条件下生长的藻类
Figure BPA00001299999000162
Figure BPA00001299999000171
实例4.异养和自养种子培养的生长速率比较
本发明的一个关键概念就是进入开放式自养培养池中的种子通过异养过程培养的能力明显强于自养培养过程。C.sorokiniana(UTEX 1602)，作为用于一个该过程的典型生物之一，被以相同的接种量接种于250ml装有Kuhl培养基的摇瓶中，然后分别进行自养和异养培养(表7)。
表7Kuhl培养基组成
Figure BPA00001299999000172
异养种子培养在黑暗处于27℃下进行，自养种子培养在连续通CO2的情况下于27℃光照下进行。培养6天后，生长速率比较如图6所示。自养种子培养的倍增时间是每天增长1倍，而异养种子培养是每天增长2倍。该结果表明异养种子培养过程的效率是自养过程的2倍。这种异养培养的优势只有在自养放大规模(光照限制)以及应用大规模发酵罐时被增强(由于通气和搅拌其能力增强)。
实例5.通过异养种子培养(实验室培养)进行污染控制
对于大规模微藻培养来说，开放池培养成本低，但是通常很难做到单种藻类培养。一些杂菌如其他藻类、细菌等可能会进入开放式培养池以较低浓度生长但可与微藻竞争消耗营养物质和其他资源，从而引起污染，最终以较具优势的生长速率破坏单藻培养***。一种控制开放式培养***污染、保持特定藻种生长优势的方法可加速藻种的生长，并且在其他杂菌生长至一定密度时就可收集藻种细胞。在一些实例中，增加藻种的接种量可缩短延滞期从而较早开始进入指数生长期，然后在其他杂菌达到有害细胞密度时更快进入稳定期。在这些实例中，上述描述的异养培养体系可提供足够的高细胞密度的种子以达到控制污染的目的。试验设计为了测定异养种子培养的程度及其密度，适当的细胞大小可有效地预防污染。
C.sorokiniana(CS)(UTEX 1602)作为欲培养的藻种，西北太平洋原生藻种EG-1-2和E.coli被用作污染杂菌。CS和EG-1-2被接种到相同的摇瓶中进行自养培养。EG-1-2的接种量为1×106个细胞/ml，而改变CS的接种量。CS和E.coli共培养试验设计与此相同。结果如图7-8所示，由图中可知，当CS的接种量仅为0.1×106个细胞/ml时，EG-1-2的生长占有优势，然而当CS接种量增加时，EG-1-2逐渐失去生长优势。这些结果表明通过增加欲培养藻种的接种量可以控制其他杂菌的污染，特别是利用异养种子加大接种量更有利于污染的控制。细菌E.coli作为杂菌被引入是由于异养培养的藻类种子液被接种到开放式池塘时可带入一定的有机碳。如图8所示，当CS接种量仅为0.1×106个细胞/ml时(带入的有机碳最少)，E.coli生长较弱。随着CS接种量的增加，E.coli的细胞密度也随之增加，然而，E.coli只能在第一天保持生长，此后，它的细胞密度降至一个很低的水平。另外，不管接种量多大，E.coli对CS的生长没有明显的负作用。这些结果对于大接种量和上述描述的异养种子培养策略仍然适用。
实例6.集成***的生长速率和生产率
用于大规模微藻培养的种子细胞对于该***的成功培养至关重要。集成***的一个主要目标是通过利用废物和一个***的产品应用于另一个***的方法降低相关单个***的生产成本。在本发明中，利用其他***的废弃有机物进行种子异养培养，不但可增强接种量还可增强抗污染能力，但重要的是在保持终产品产量和生产率相当的情况下可降低操作成本。图9描述了通过异养或自养生长培养的种子接种于50L开放池中进行培养的情况以及生长速率的比较。
实例7.微藻混合营养培养和单独自养培养***的成本比较
计算机模拟可很大程度上帮助工业上对理论产量和实际产量、培养措施、收集效率、提取效率、营养物质回收、分段措施、成本等的分析。本实例在已有的有关设备成本、操作费用、生产率的文献数据基础上对两种培养***(混合培养和单独自养培养)进行了经济评价。其计算是针对一个拥有24个开放池(每个开放池的面积为80,000m2，深度为0.15m)的工厂实际情况进行的。图10给出了最终的分析，由图可知，相比而言，尽管这两个***的设备投入和其他间接成本稍有差异，但实际总投资成本相当。
虽然本发明中的描述有文献支持给出的实例，但是本领域的技术人员可以在所附权利要求的基础上进行修改。
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Claims (22)

1.一种生产生物燃料原料的方法，包括以下步骤：
利用异养培养藻类或类藻菌种用于生产种子，所述的藻类或类藻菌种具有可自养和异养生长的生理机制；然后
利用经上述异养培养得到的种子进行自养培养以积累所述的藻类或类藻菌种的生物量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的生物量包括脂质。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的异养培养包括利用废弃原材料作为有机碳源，在不透明发酵罐或生物反应器中自养和异养培养所述的具有可自养和异养生长生理机制的藻类或类藻菌种。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的废弃原材料选自废水和废弃固体物质。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的废水和废弃固体物来源于农业废弃物，工业纸浆，市政垃圾的有机成分和微藻生物体残核以及任何其他含有微生物可利用的有机碳的有机废弃物。
6.如权利要求1所述的方法，具体步骤还包括输入所述的异养培养过程中产生的二氧化碳至所述的自养培养步骤。
7.如权利要求1所述的方法，所述藻类或类藻菌种来源于Chlorella sp.，Chlamydomonas sp.，和Scenedesmus sp.
8.如权利要求1所述的方法，来自所述的异养培养过程的种子细胞浓度为107～109个细胞/ml或者更大。
9.如权利要求1所述的方法，具体步骤包括采用所述的藻类或类藻菌种进行异养培养以积累生物量。
10.一种生产生物燃料的方法，具体包括以下步骤：
利用异养培养藻类或类藻菌种以生产种子，所述的藻类或类藻菌种具有可自养和异养生长的生理机制；然后
利用经上述异养培养得到的种子进行自养培养以积累所述的藻类或类藻菌种的生物量；然后
从藻类或类藻菌种生物体中回收油脂用作生物燃料。
11.如权利要求10所述的方法，其中，异养培养步骤包括利用废物原料作为有机碳源在黑暗发酵罐或生物反应器中培养所述的具有可自养和异养生长生理机制的藻类和类藻菌种。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述的废弃原料来自于废水和废弃固体物质。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的废水和废弃固体物质来自于农业废弃物、工业纸浆、市政垃圾的有机成分以及微藻生物体残核。
14.如权利要求10所述的方法，具体步骤包括输入所述的异养培养过程中产生的二氧化碳至所述的自养培养步骤。
15.如权利要求10所述的方法，所述藻类或类藻菌种来源于Chlorella sp.，Chlamydomonas sp.，和Scenedesmus sp.
16.如权利要求10所述的方法，其中，来自所述的异养培养过程的种子细胞浓度为107～109个细胞/ml或者更大。
17.一个生产生物燃料原料的***，包括：
至少一个用于异养培养藻类或类藻菌种的设备用于种子生产，其中所述的藻类或类藻菌种具有可自养和异养生长的生理机制；然后
至少一个开放池或反应器用于自养培养异养种子以积累所述的藻类或类藻菌种的生物量，其中所述的至少一个开放池或反应器用于接收来自于所述的异养培养设备中培养的藻类或类藻菌种种子。
18.如权利要求17所述的***，具体包括至少一个用于异养培养藻类或类藻菌种的设备用于这些菌种的生物量积累。
19.如权利要求17所述的***，其中所述的生物量包括油脂。
20.如权利要求17所述的***，具体包括一个或多个检测器以提供所述的至少一个开放池或反应器中相关的生长条件数据输出。
21.如权利要求20所述的***，具体包括一个或多个控制器用以根据所述的由检测器提供的输出进行自动关闭或启动所述的至少一个开放池或反应器中的操作。
22.如权利要求20所述的***，其中所述的生长条件包括光照量、温度和污染物的存在。
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